Главная \ 1. Закваски пробиотические \ Бактериальные закваски для сыров \ Сыры с пропионовокислым брожением \ Сыр Эмменталь усиливает стрессоустойчивость пропионовокислых бактерий

Сыр Эмменталь усиливает стрессоустойчивость молочных пропионибактерий

Сыр Эмменталь усиливает стрессоустойчивость пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii

Выявление механизмов толерантности молочных пропионовокислых бактерий к стрессу, запускаемых во время роста в сырной среде

Переведено из статьи: Gagnaire V, Jardin J, Rabah H, Briard-Bion V, Jan G (2015) Emmental Cheese Environment Enhances Propionibacterium freudenreichii Stress Tolerance. PLoS ONE 10(8); исследование проведено на базе Национального института сельскохозяйственных исследований Франции (Institut national de la recherche agronomique, INRA)

Содержание:

1. Краткий обзор темы	Протеомные исследования
2. Введение	4. Результаты
Цель исследования	Замедление роста и повышение выживаемости P. freudenreichii в EJ по сравнению с CdM
3. Материалы и методы	Различия между EJ и CdM в используемых субстратах и продуктах, продуцируемых P . freudenreichii
Микроорганизмы и условия роста	Сверхэкспрессия белков ранней стресс-адаптации в EJ по сравнению с CdM
Водная фаза экстракции сыра Эмменталь	Более высокая пищеварительная толерантность к стрессу после роста P . freudenreichii в EJ по сравнению с CdM
Биохимический анализ культуральных супернатантов	Влияние осмоадаптации на стрессоустойчивость P. freudenreichii
Осмолярность	5. Обсуждение
Стрессовые проблемы	6. Литература

КРАТКИЙ ОБЗОР ТЕМЫ

Молочные пропионовокислые бактерии - это актиномицеты, содержащиеся в различных ферментированных пищевых продуктах. Основной вид, Propionibacterium freudenreichii, обычно считается безопасным и используется как пробиотик и как сырная закваска. Его пробиотическая эффективность тесно зависит от его устойчивости к пищеварительным стрессам, которые могут быть в значительной степени модулированы принимаемым средством доставки. Действительно, стрессоустойчивость этой бактерии повышается, когда она потребляется в ферментированном молочном продукте, по сравнению с высушенным пробиотическим препаратом. Мы исследовали как стрессоустойчивость, так и неосинтез белков при росте в 1) химически определенных или 2) водных фазах сыров Эмменталь. Хотя в обеих средах был достигнут один и тот же конечный уровень популяции, более медленный рост и повышенная выживаемость штамма CIRM BIA 1 P. freudenreichii subsp. shermanii наблюдалась в соке Эмменталь по сравнению с химически определенной средой. Это сопровождалось различиями в используемых субстратах и высвобожденных продуктах, а также сверхэкспрессией различных белков ранней адаптации к стрессу в соке Эмменталь по сравнению с химически определенной средой, что выражалось в свертывании белков, в катаболизме аспартата, в биосинтезе валина, лейцина и изолейцина, в метаболизме пирувата в цитратном цикле (цикле трикарбоновых кислот), в метаболизме пропионата, а также в оксидоредуктазах. Все эти изменения привели к повышенной толерантности P. freudenreichii к пищеварительному стрессу после роста в соке Эмменталь. Механизмы адаптации к стрессу индуцировались в этой среде в соответствии с повышенным выживанием. Это открывает перспективы для использования твердых и полутвердых сыров в качестве средства доставки пробиотиков с повышенной эффективностью.

ВВЕДЕНИЕ

Propionibacterium freudenreichii - это полезная бактерия, принадлежащая к отряду actinomycetales, группе грамположительных бактерий, известных своей эффективной продукцией различных ценных метаболитов [1]. P. freudenreichii, первоначально присутствовавшая в сыром молоке, в настоящее время добавляется в качестве закваски для производства твердых сыров, таких как Эмменталь. Действительно, P. freudenreichii отвечает за специфические органолептические свойства таких сыров за счет производства короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) и сложных эфиров, а также за их раскрытие, то есть образование дырок за счет образования углекислого газа в сырном колесе (голове) [2]. Технологический процесс сыра Эмменталь состоит из последовательности абиотических стрессов, включая варку, подкисление, перемешивание, формование, посолку и созревание в помещениях при различных температурах [3]. Однако P. freudenreichii адаптируется, выживает и достигает повышенной популяции свыше 10⁹ живых бактерий на 1 г созревшего сыра, в то время как молочнокислые бактерии, которые сначала растут в сыре и осуществляют подкисление во время приготовления сыра, впоследствии подвергаются массовому лизису клеток [4]. Это свидетельствует о способности адаптироваться к последовательности термических, осмотических и других стрессов в процессе производства сыра.

потребление сыра Эмменталь

Среднее потребление сыра Эмменталь во Франции, около 30 г в день на человека, представляет собой массовое поглощение P freudenreichii, 10¹⁰живых бактерий в день на человека. Таким образом, его влияние на здоровье человека является актуальной проблемой. Соответственно, его пробиотические способности также рассматриваются [5], включая модуляцию микробиоты кишечника [6], воспаления кишечника [7,8] и баланс пролиферации / апоптоза [9]. Пробиотические пищевые добавки, содержащие P. freudenreichii, имеются в продаже [5].

Пробиотические возможности P. freudenreichii связаны с его специфической метаболической активностью. Он может модулировать важные параметры на уровне кишечника, благодаря выделению полезных метаболитов, ранее описанных как нутрицевтики [10]. Его обязательный гомоферментативный метаболизм, пропионовая ферментация, основанная на цикле Вуда и Веркмана, приводит к образованию ацетата и пропионата - короткоцепочечных жирных кислот (SCFA), независимо от используемого источника углерода. В соответствии с широко известными положительными эффектами SCFA [11], метаболиты P. freudenreichii действительно продемонстрировали модулирование баланса пролиферации / апоптоза в контексте канцерогенеза как in vitro [12,13], так и in vivo [9]. Его метаболиты также включают 1,4-дигидрокси-2-нафтоевую кислоту (DHNA), промежуточное звено в синтезе витамина К, которая, как было показано, увеличивает популяцию бифидобактерий толстой кишки у людей [14] и модулирует воспаление кишечника in vivo [15,16]. Такой иммуномодулирующий эффект дополнительно усиливается за счет производства поверхностно экстрагируемых белков [7,17]. Чтобы оказывать положительное влияние на эти полезные метаболиты, P freudenreichii должен достигать толстой кишки живым и метаболически активным.

Следовательно, поддержание как выживания, так и активности этого пробиотика является критическим моментом в его применении. Физиологическое состояние этой пробиотической бактерии во время приема внутрь представляет собой решающий параметр эффективности. In vitro было показано, что инкапсуляция полимера или включение в ферментированный молочный продукт обеспечивает защиту P. freudenreichii от стресса, связанного с кислотой и солями желчных кислот, и их комбинации [18]. Соответственно, потребление йогурта, содержащего P. freudenreichii, привело к повышению выживаемости и активности [19] по сравнению с потреблением того же штамма в лиофилизированной пищевой добавке [20]. Сыр Эмменталь также придает P. freudenreichii повышенную устойчивость к пищеварительному стрессу [21]. Было показано, что ферментированные молочные продукты, включая ферментированное молоко и сыр Эмменталь, обеспечивают молочные пропионибактерии с повышенной устойчивостью к стрессу и стабильной популяцией без лизиса. Однако механизмы, приводящие к повышению выживаемости при стрессе в результате включения в сыр, до сих пор неизвестны. Стрессоустойчивость может быть обеспечена защитным и буферным эффектом матрицы сыра. Действительно, липиды и белки, присутствующие в сыре, могут оказывать буферное действие на кислые выделения, соли желчных кислот и гидролитические ферменты. Однако адаптация к сырной среде с точки зрения физико-химических свойств (pH, осмолярность) также может запускать экспрессию защитных молекулярных механизмов.

Целью данного исследования было выявление механизмов толерантности к стрессу, запускаемых во время роста в сырной среде.

Для решения этого вопроса тот же штамм P. freudenreichii, CIRM BIA1 культивировали либо в лабораторно-химически определенной среде (CdM - chemically defined medium) [22], либо в водной фазе сыра Эмменталь, также называемой соком Эмменталь (EJ). Этот сок был извлечен из сыра гидравлическим прессованием, без разбавления водной фазы каким-либо растворителем или дополнительной водой, в начале созревания в теплой комнате, после роста молочнокислых бактерий, когда пропионибактерии обычно начинают расти [23]. Эта среда содержит источники углерода и азота, необходимые для роста пропионибактерий, а также другие метаболиты, умеренно кислые условия pH и ионную среду, встречающуюся в сыре [24]. Мы исследовали модуляцию P. freudenreichii CIRM BIA1, который является типичным штаммом, выделенным из Emmental, и чей геном секвенирован [25]. В этом штамме мы исследовали метаболическую активность (потребление субстратов, производство метаболитов) и адаптацию к стрессу в водной фазе сыра EJ по сравнению с CdM.

Это исследование показывает адаптацию к субстратам, присутствующим в сыре, повышенную выживаемость в стационарной фазе, повышенную устойчивость к пищеварительному стрессу и повышенную экспрессию ключевых белков адаптации к стрессу в водной фазе сыра. Эта работа открывает новые перспективы для разработки оптимизированных ферментированных функциональных пищевых продуктов, способствующих пробиотическому потенциалу выбранных бактериальных штаммов.

Материалы и методы

Микроорганизмы и условия роста

Штамм P. freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1, использованный в этом исследовании, был любезно предоставлен международным микробным ресурсным центром CIRM BIA (INRA, Ренн, Франция). Его культивировали в химически определенной среде (CdM) [22], содержащей на литр: 12,8 г лактата натрия, 0,6 г KH₂PO₄, 0,4 г ацетата калия, 50 мг MgSO₄,7H₂O, 5 мг MnSO₄,4H₂O, 2,5 мг FeSO₄,7H₂O , 2,5 мг CuSO₄, 2,5 мг NaCl, 0,25 мг ацетата кобальта, 15 мкг ZnSO₄, 1 мкг H₃BO₃, 1 мкг Na₂MoO₄, 50 мкг тиамина, 100 мкг пиридоксаля, 50 мкг пантотената кальция, 50 мкг рибофлавина, 100 мкг никотинамида, 10 мкг пара-аминобензойной кислоты (ПАБК), 4 мкг биотина, 20 мкг фолиевой кислоты, 2 мкг цианокобаламина.

Аминокислоты поставлялись в следующих концентрациях (L-1): 50 мг L-Ala, 160 мг L-Arg, 150 мг L-Asn, 250 мг L-Asp, 140 мг L-Cys, 80 мг Gly, 190 мг L -Glu, 150 мг L-Gln, 100 мг L-His, 180 мг L-Ile, 300 мг L-Leu, 220 мг L-Lys, 60 мг DL-Met, 460 мг L-Pro, 170 мг L-Phe 180 мг L-Ser, 150 мг L-Thr, 50 мг L-Trp, 60 мг L-Tyr и 480 мг DL-Val. Пять миллиграмм каждого из оснований аденина, гуанина, урацила и ксантина были также добавлены. PH среды доводили до 7,0 перед стерилизацией на фильтре (0,22 мкм, Sartorius, Goettingen, Germany). Рост проводили при 24°С без встряхивания при анаэробиозе (Anaerocult, Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Кривые роста были получены путем мониторинга КОЕ (колониеобразующих единиц, то есть серийного разведения и подсчета чашек в YELA (дрожжевой экстракт с лактатной средой), как описано ранее [22,26]. Физиологический статус пропионибактерий оценивали в экспоненциальной и стационарной фазах с использованием живого/мертвого окрашивания (Invitrogen, Carlsbad, США).

Вкратце, бактерии центрифугировали, ресуспендировали в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) и дважды окрашивали йодидом пропидия и SYTO 9 в соответствии с инструкциями производителя комплекта Live Dead Light перед наблюдением под контролем. Флуоресцентный микроскоп Optiphot (Nikon, Шампиньи-сюр-Марн, Франция).

В качестве альтернативы, водную фазу EJ сыра Эмменталь использовали в качестве ростовой среды, и продолжительность мониторинга роста адаптировали в тех же условиях инкубации роста, что и в CdM. Три независимые культуры были выполнены на одной партии EJ или CdM.

Водная фаза экстракции сыра Эмменталь

Водная фаза сыра Эмменталь (далее именуемый соком Эмменталь, или EJ) была извлечена из нескольких секторов сыра весом 2–2,5 кг с разных экземпляров сыров, когда сырные головы помещались в теплую комнату, что соответствует началу периода роста пропионибактерий. Сырные секторы замораживали до использования при -20 °С. Сырные секторы затем оттаивали в течение 15–20 ч при 4°C до экстракции водной фазы сыра с помощью гидравлического пресса, согласно Salvat-Brunaud et al [23]. EJ (~150 мл) последовательно фильтровали через ватманскую бумагу 541 (Prolabo, Bruchet Dano, Rennes, France), затем через фильтры с целлюлозно-ацетатной мембраной с размером пор 1,2 и 0,45 мкм (Sartorius, Palaiseau, France). После стерилизации на фильтре EJ хранили при -20°C до использования. Полученный таким образом сок представлял собой среднее из разных сыров, и общий состав сока был в соответствии и в диапазоне соков, полученных в предыдущих исследованиях [4,23].

Биохимический анализ культуральных супернатантов

Прим.: Супернатант - жидкость, располагающаяся над твердым слоем (осадком, седиментом) после центрифугирования или седиментации.

P. freudenreichii CIRM BIA 1 культивировали в CdM или в EJ при 24°C, как описано выше. При разных временных интервалах культивирования, указанных в соответствующем разделе результатов, супернатанты культур из EJ и CdM готовили центрифугированием (8000×g, 4°C, 10 мин) для удаления бактериальных клеток с последующей стерилизацией на фильтре (0,22 мкм, Sartorius, Goettingen, Германия) и консервировали при -20°С до использования. Как органическая кислота, так и свободный аминокислотный состав были определены следующим образом.

Анализ органических кислот.

Стерилизованные культуральные супернатанты наполовину разбавляли 0,02 N H₂SO₄ и центрифугировали при 8000×g в течение 30 минут при 4°C для удаления осадка белка, супернатант фильтровали и сахар и органические кислоты разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). с использованием ионообменной колонки Aminex A-6 (Dionex, Саннивейл, Калифорния) при 55°C с 0.01N H₂SO₄ в качестве элюента при скорости потока 1 мл мин^-1. Были использованы как УФ (210 нм), так и рефрактометрические детекторы.

Прим. ред.: Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии.

Свободный аминокислотный состав.

Содержание свободных аминокислот в стерилизованных культуральных супернатантах определяли после депротеинизации. Сначала к 1 мл образцов добавляли 10 мкл трифторуксусной кислоты (Sigma-Aldrich). Подкисленные образцы встряхивали в течение 15 с и центрифугировали 1000 г в течение 10 мин при 4°С, белки осаждали путем добавления 30 мг сульфосалициловой кислоты (Merck-Eurolab, Grosseron SA, Saint Herblain, France) к первому супернатанту, встряхиваемому 15 с и выдерживаемому в течение 1 ч при 4°С. Образцы центрифугировали при 8000×g в течение 15 минут при 4°С. Полученные конечные супернатанты фильтровали через мембрану с размером пор 0,45 мкм (Sartorius, Palaiseau, France), и фильтрат разбавляли литий-цитратным буфером 0,2 моль L-1 (pH 2,2) до соответствующей концентрации. Разбавленные фильтраты вводили в катионообменную колонку автоматического аминокислотного анализатора Biochrom 30 Plus (Biochrom Ltd, Кембридж, Великобритания - SERLABO Technologies, Trappes, Франция), как впервые описано Spackman et al [27], используя литиево-цитратный буфер для элюирования и цветной реакции с нингидрином на выходе из колонки для количественного определения аминокислот при двойной длине волны 570 нм и 440 нм.

Осмолярность

Осмолярность CdM и EJ измеряли в трех экземплярах с помощью осмометра с точкой замерзания (Osmomat 030-D, Gonotec, Berlin, Germany).

Стрессовые проблемы

Кислотный вызов.

Пропионибактерии собирали центрифугированием (8000×g, 24°C, 10 минут) и извлекали в равном объеме CdM при pH 2,0, как описано ранее [22]. Количество жизнеспособных клеток определяли через 30 минут после введения кислоты. Образцы разбавляли в пептонной воде (0,1% пептический переваривание мяса, Biokar Diagnostics, Beauvais, France), pH 7,0, содержащий 0,9% NaCl, и выливали в среду YEL (дрожжевой экстракт лактата), содержащую 1,5% агара, для максимального извлечения. КОЕ определяли после 6 дней анаэробной инкубации при 30°С. Три независимые культуры были выполнены из одной и той же партии CdM или EJ.

Соли желчных кислот.

Пропионибактерии собирали центрифугированием (8000×g, комнатная температура, 10 минут) и извлекали в равном объеме CdM при pH 7,0, содержащем 1,0 г солей желчных кислот, как описано ранее [3]. Количество жизнеспособных клеток определяли через 30 минут после введения соли желчных кислот путем подсчета КОЕ, как описано в разделе «Микроорганизмы и условия роста».

Статистический анализ

Дисперсионный анализ (ANOVA) проводился с уровнем значимости, установленным на P≤0,05, с использованием ростовой среды в качестве одного фактора с FactoMineR, пакета R [28] или двух факторов с использованием среды культивирования и стадии роста. Тест Ньюмена Кеулса был выполнен как пост-ANOVA-анализ.

Протеомные исследования

Радиоактивная маркировка и выделение цельных клеток.

Пропионибактерии были помечены по существу, как описано ранее [22]. Предварительную культуру экспоненциальной фазы в CdM использовали для инокуляции (1/100) либо свежего CdM, либо EJ, к обоим добавляли 500 μCi (микрокюри) смеси [³⁵S] метионин / цистеинового белка (175 кюри / ммоль, ICN Pharmaceuticals, Orsay, France). Таким образом, маркировка происходила непрерывно между инокуляцией и сбором урожая в разное время, указанное в соответствующем разделе результатов. Во время сбора, инкорпорация была остановлена быстрой промывкой бактерий в PBS (Phosphate buffered saline - натрий-фосфатный буфер). Экстракты цельных клеток SDS были немедленно приготовлены в соответствии с процедурой, модифицированной по сравнению с ранее описанной [29].

Прим. ред.: SDS (sodium dodecyl sulfate - додецилсульфат натрия) - анионоактивное поверхностно-активное вещество.

Промытые бактерии собирали центрифугированием (10000×g, 10 мин, 4°C) перед ресуспендированием в буфере для лизиса SDS (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.3% SDS, 200 mM DTT) до конечной OD₆₅₀, равной 20.

Прим. ред.: OD₆₅₀ - оптическая плотность на длине волны 650 нм. OD (optical density) - Оптическая плотность [лат. optos — видимый, зримый] — мера непрозрачности слоя вещества для световых лучей, которая равна десятичному логарифму отношения потока излучения (F₀), падающего на слой, к ослабленному в результате поглощения и рассеяния потоку (F), прошедшему через этот слой: OD = lg(F₀/F). Оптическая плотность измеряется для определения концентрации веществ в растворе.

После 3 циклов замораживания / оттаивания бактерии разрушали ультразвуком с использованием ультразвукового аппарата Vibra Cell (Bioblock Scientific, Illkirch, France), снабженного коническим микрочипом (4 всплеска по 1 минуте с интервалами в 1 минуту, выход 2,5). Нерастворимые материалы удаляли центрифугированием (10000×g, 10 минут, комнатная температура). Полученный экстракт цельноклеточного белка SDS использовали для протеомных исследований.

Двумерный электрофорез.

Белки осаждали и промывали с помощью набора 2-D Clean-Up kit (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Высушенные на воздухе белковые гранулы солюбилизировали в пробном растворе, содержащем 7М мочевины, 2М тиомочевины, 25 mM DTT, 4% 3-[(3-Холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропан-сульфоната (CHAPS) и 2% IPG-буфера (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Upsalla, Швеция). Равные количества радиоактивности (106 dpm – распады в минуту) были загружены на гель в первом измерении. Изоэлектрическая фокусировка проводилась с использованием сухих полосок Иммобилина с рН 4-7 на Многофазовой системе электрофореза II (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Двумерное разделение было выполнено в соответствии с нашей стандартизированной процедурой [22].

Анализ изображений.

Гели с радиоактивной меткой высушивали на фильтровальной бумаге в вакууме. Радиоактивность в высушенных гелях определяли с использованием Storm Phosphorimager (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Нерадиоактивные гели окрашивали с использованием Bio-Safe Coomassie G-250 (Bio-Rad laboratories, США) перед сканированием на ImageScanner III (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Молекулярные массы и изоэлектрические точки были откалиброваны с помощью стандартов совместной миграции (GE Healthcare Bio-Sciences AB).

Анализ изображений, сопоставление геля и количественную оценку радиоактивности в отдельных точках (пятнах) проводили с использованием программного обеспечения Progenesis SameSpot 3.1 (Nonlinear Dynamics Newcastle on Tyne, UK). Все гели сравнивали, группируя их в подгруппы EJ и CdM, вычисляя сложение и p-значения всех точек (пятен), используя односторонний анализ ANOVA и анализ основных компонентов (PCA), как описано Morris et al [30]. Для дальнейшей идентификации были отобраны и выделены представляющие интерес пятна, экспрессия белка которых существенно отличается между обеими группами, выше в 1,2 раза.

Прим. ред.: P-значение (англ. P-value), p-уровень значимости, p-критерий — вероятность получить для данной вероятностной модели распределения значений случайной величины такое же или более экстремальное значение статистики (среднего арифметического, медианы и др.), по сравнению с ранее наблюдаемым, при условии, что нулевая гипотеза верна.

Идентификация белка с помощью Nano-LC в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.

Куски геля промывали раствором ацетонитрила и бикарбоната аммония и затем сушили в вакууме в концентраторе SpeedVac (SVC100H-200; Savant, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Расщепление трипсина в геле проводили в течение ночи при 37°С и останавливали с помощью спектрофотометрической трифторуксусной кислоты (TFA) (Sigma-Aldrich), как описано ранее [29]. Супернатанты, содержащие пептиды, затем сушили в вакууме в концентраторе Speed-Vac и хранили при -20°C до масс-спектрометрического анализа.

Анализ нано-LC-MS/MS проводился с использованием интерактивной жидкостной хроматографической тандемной масс-спектрометрии (MS/MS) с использованием нано-LC-системы Dionex U3000-RSLC, установленной на QSTAR XL (MDS SCIEX, Онтарио, Канада), оборудованной с наноэлектрораспылительным источником ионов (ESI) (Proxeon Biosystems A / S, Оденсе, Дания).

Прим. ред.: Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) – это метод обнаружения, идентификации и количественного определения веществ в биологическом образце, основанный на отношении массы к заряду ионов, которое это вещество может образовывать под влиянием ионизирующих факторов. Этот метод масс-спектрометрического анализа (масс-спектрометрия масс-спектрометрии, МС/МС) особенно эффективен при анализе смесей. Смесь, вводимая в ионный источник, подвергается ионизации одним из "мягких" методов ионизации, когда, в основном, образуются молекулярные ионы с небольшой энергией возбуждения.

Образцы сначала концентрировались на колонке обратной фазы PepMap 100 (C18, размер частиц 5 мкм, внутренний диаметр 300 мкм по длине 5 мм) (Dionex, Амстердам, Нидерланды). Пептиды были разделены на обращенно-фазовой колонке PepMap 100 (С18, размер частиц 3 мкм, 75 мкм внутренний диаметр на 150 мм длины) (Dionex) при температуре 35°С, используя растворитель solvent A (2% Ацетонитрил, 0,08%. муравьиная кислота и 0,01% TFA (трифторуксусной кислоты) в деионизированной воде) и растворитель solvent B (95% ацетонитрила, 0,08% муравьиной кислоты и 0,01% TFA в деионизированной воде).

Для элюирования применяли линейный градиент от 10 до 40% растворителя B за 17 мин при скорости потока 0,3 мкл мин^-1.

Прим. ред.: Элюирование (elution) [лат. eluo (elutum) — вымывать, удалять] — извлечение вещества из твердого носителя вымыванием его подходящим растворителем.

Элюированные пептиды непосредственно электрораспыляли в масс-спектрометре, работающем в положительном режиме. Было проведено полное непрерывное сканирование MS, после чего было выполнено три зависящих от данных сканирования MS/MS. Спектры собирали в выбранном диапазоне масс от 300 до 2000 м/z для MS и от 60 до 2000 м/z для спектров MS/MS. Заряженные ионы от 2+ до 4+ рассматривались для анализа MS/MS, когда интенсивность ионов превышала 10 cps. Масс-спектрометр работал в режиме, зависящем от данных, автоматически переключаясь между MS и MS/MS, используя программное обеспечение Analyst QS 1.1. Прибор был откалиброван путем многоточечной калибровки с использованием фрагментных ионов, которые возникли в результате коллизионного разложения пептида из β-казеина, β-CN (193–209).

Для идентификации пептидов все данные (MS и MS/MS) отправлялись в X! Тандем с помощью X! Тандемного трубопровода, разработанного PAPPSO (Plateforme d'Analyse Protéomique de Paris Sud-Ouest - Платформы Анализа Протеомики Парижа на Юго-Западе), INRA, Jouy-en-Josas, France.

Поиск проводился по базе данных, состоящей из (I) домашней базы данных, содержащей все предсказанные белки штамма P. freudenreichii CIRM-BIA 1, использованной в этом исследовании, и (II) части базы данных UniProtKB, соответствующей P. freudenreichii.

Параметры поиска в базе данных были определены следующим образом: использовалось расщепление трипсином, и толерантность к массе пептида была установлена на уровне 0,2 Da (Da – дальтон, атомная единица массы) для MS и MS/MS. Окисление метионина и дезамидирование остатков аспарагина и глутамина были включены в качестве переменных модификаций. Идентификации белка были автоматически проверены, когда они показали по крайней мере два уникальных пептида с e-значением ниже 0,05.

Прим. ред.: e-значение (E-value) - это значение показывает, насколько случайно полученное выравнивание. Это количество находок с таким же или большим весом при поиске в базе данных случайных последовательностей. Например, если для находки e-value = 10, то это значит, что в базе данных случайных последовательностей найдётся 10 находок с таким же или большим весом. Чем меньше e-value, тем более статистически значима эта находка.

Результаты

Замедление роста и повышение выживаемости штамма CIRM BIA 1 пропионибактерий P. freudenreichii subsp. shermanii в EJ по сравнению с CdM

При сравнении роста в EJ и CdM бактерии штамма CIRM BIA 1 P. freudenreichii subsp. shermanii достигли одинакового максимального уровня популяции на ранней стационарной фазе в обеих средах, то есть 1,60x10¹⁰ КОЕ мл^-1 и 9,83x10⁹ КОЕ мл^-1 для EJ и CdM соответственно (рис. 1). Однако скорость роста была значительно снижена в EJ по сравнению с CdM, поскольку время удвоения было в два раза выше в EJ (22,58 ч), чем в CdM (10,34 ч). Более медленный рост в CdM по сравнению с предыдущим исследованием на той же среде [22] был обусловлен ростом при 24°C вместо оптимальной температуры 30°C. В CdM красные флуоресцентные клетки пропионибактерий, считающиеся мертвыми, наблюдали в ранней и поздней стационарной фазе в соответствии со снижением способности к культивированию, наблюдаемым после 4 дней культивирования (фиг. 1B). В отличие от этого очень мало мертвых клеток наблюдались в EJ (рис. 1B).

Рис. 1. Рост и выживание P . freudenreichii subsp. shermanii CIRMBIA 1 в EJ и CdM

(A) кривая роста бактериальных клеток - в CdM (черная точка на графике), в EJ (белая точка на графике) и (B) живое/мертвое окрашивание бактериальных клеток в экспоненциальной (Exp), ранней стационарной (E. Stat) и поздней стационарной фазе (L. Stat) роста. В CdM красные флуоресцентные клетки пропионибактерий считаются мертвым.

Различия между EJ и CdM в используемых субстратах и продуктах, продуцируемых P . freudenreichii subsp. shermaanii CIRM BIA 1

Органические кислоты (Рис 2) и свободные аминокислоты (Рис 3) были специфически проконтролированы как в EJ, так и в CdM во время роста клетки propionibacteria. Осмолярность составила 1368 ± 14 мосмоль L ^-1в EJ и 367 ± 1 мосмоль L ^-1в CdM.

Рис. 2. Деградация и производство различных органических кислот в процессе роста P . freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1 в (A) CdM и (B) EJ.

Линии: голубой квадрат - молочная кислота; белый+зеленый треугольник - уксусная кислота; зеленый треугольник - пропионовая кислота и пурпурный квадрат - лимонная кислота. Стрелки указывают основные стадии роста, соответствующие каждой инкубационной среде: экспоненциальная (Exp), ранняя стационарная (E. Stat) и поздняя стационарная фаза (L. Stat). Лактат был почти полностью потреблен в обеих средах - менее чем 3% осталось в конце времени культуры. Плато в CdM наблюдалось в поздней стационарной фазе (деградация 98% лактата). В случае EJ цитрат (лимон. кисл.) присутствовал одновременно с лактатом и использовался P. freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1 как источник углерода после того как лактат был исчерпан, т.е. на ранней стационарной фазе.

Рис. 3. Относительное изменение концентрации свободных аминокислот при росте P . freudenreichii subsp. shermanii CIRMBIA 1 в CdM (A, C и E) и EJ (B, D и F).

(A и B) Аллифатические аминокислоты; (C и D) основные, кислотные + амидные аминокислоты; (E и F) ароматические, гидроксильные и серосодержащие аминокислоты. Стрелки указывают основные фазы роста, соответствующие каждой инкубационной среде: экспоненциальная (Exp), ранняя стационарная (E. Stat) и поздняя стационарная фаза (L. Stat).

Содержание лактата в CdM и EJ составило соответственно 120 mM и 400 mM (Рис.2). Более высокое содержание EJ согласуется с исходным содержанием лактозы в молоке, которое используется молочнокислыми бактериями в качестве первого углеводного субстрата и преобразуется в лактат при производстве сыра, который, в свою очередь, используется P . freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1.

Что касается аминокислот (Рис .3), то начальные значения концентрации аминокислот в CdM или EJ представлены в Таблице 1. Большинство аминокислот потреблялось в CdM, а некоторые из них полностью в виде глицина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, цистеина и серина.

Действительно, аланин, глицин, аспартат, аспарагин, глутамин и серин были главным образом уничтожены в CdM одновременно с лактатом. Аспарагин, аспартат, глицин и серин также потреблялись наиболее интенсивно по сравнению с другими свободными аминокислотами в EJ. В отличие от CdM, большинство других аминокислот увеличивалось со временем.

Таблица 1. Исходный состав свободных аминокислот в EJ и CdM.

Сверхэкспрессия белков ранней стресс-адаптации в EJ по сравнению с CdM

Для определения того, какие белки неосинтезируются в CdM и EJ, было проведено протеомное исследование (Рис.4).

Рис. 4. Двумерный анализ экспрессии белка при росте P. freudenreichii subsp. shermanii CIRMBIA 1 в EJ и в CdM.

(A) Неосинтезированные белки были радиомаркированы аминокислотами 35S в обеих средах в течение указанной продолжительности: лаговая фаза (ранняя), начало экспоненциальной фазы (ранняя экспоненциальная), экспоненциальная и ранняя стационарная фазы. (B) клеточные белки, накопленные во время роста, были окрашены в синий цвет Кумасси.

Белки, которые были дифференциально выражены в EJ или в CdM, были обнаружены из 2D-гелей и идентифицированы с помощью nano LC, связанного в режиме онлайн с тандемной масс-спектрометрией. Выявленные белки представлены в таблице 2 .

Таблица 2. Белки дифференцированно экспрессируются после роста P. freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1 в EJ и в CdM и идентифицируется с помощью линейной связи NanoLC-ESI-Q-TOF тандемной масс-спектрометрии.

Сначала клетки подвергали импульсной маркировке путем инкубации клеток с аминокислотами 35S для контроля раннего неосинтеза белков при различной продолжительности адаптации к обеим средам (рис.4А). Белки ранней адаптации были четко различимы при сравнении обеих сред. Существенные различия в профилях выражений сохранялись до стационарной фазы. Это подтверждается различным накоплением клеточных белков, выявленных окрашиванием Coomassie (синий цвет Кумасси) в конце роста в CdM и EJ (рис.4B). Белки, которые были дифференциально экспрессированы с кратными изменениями выше 1,2 в CdM и в EJ, были обнаружены (рис.4В), идентифицированы с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-тандемной спектрометрией и представлены в таблице 2.

Белки, которые были сверхэкспрессированы в CdM, участвуют в свертывании белков с идентификацией трех белков-шаперонов (dnaK1, groES1 и cypB), в реакциях оксидоредукции с цитохромом P450, тиоредоксином и одной редуктазой (mer), а также в транспорте с одним белком, принадлежащим к ABC-олигопептидному транспортеру и ферменту, участвующему в синтезе ДНК.

В EJ, другие белки-шапероны были сверхэкспрессированы, clpB1, clpC и hsp20, а также оксидоредуктазы. Основные различия заключались в большом количестве белков, участвующих в катаболизме аспартата (аспартат-аммиачная лиаза, дезаминирующая аспартат в фумарат [25]; L-аспартатоксидаза, 4-аминобутират аминотрансфераза для превращения сукцинатного полуальдегида в ГАМК), в биосинтезе валина, лейцина и изолейцина (ilv C и E белки), в метаболизме пирувата (pta, mdh, ppdk и ackA), в цитратном цикле и в метаболизме пропионата с известной метилмалонил-КоA-карбокситрансферазой.

Более высокая пищеварительная толерантность к стрессу после роста P . freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1 в EJ по сравнению с CdM

После роста P . freudenreichii subsp. shermanii CIRM-BIA1 в обеих средах (Рис.5). Клетки, выращенные в CdM, претерпели значительную тяжелую смертность по сравнению с EJ как для кислых (рис. 5А), так и для желчных солей (рис. 5Б).

Рис. 5. Толерантность P. freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1 к стрессам пищеварения.

Пропионибактерии собирали на разных стадиях роста в черном квадрате CdM или в белом квадрате EJ перед воздействием кислотой (A, pH 2) или желчными солями (B, 1 g L^-1). Выжившие бактерии затем подсчитывали путем подсчета КОЕ. Значения с разными строчными надстрочными буквами (a-b) значительно различаются (P<0,05) в группах курсива для CdM и в группах нормальных случаев для EJ.

Для обеих культуральных (питательных) сред толерантность к кислоте различалась в зависимости от фазы роста, с которой клетки собирали перед тестом на кислотную стимуляцию. В CdM наблюдалось увеличение выживаемости от экспоненциальной до поздней стационарной фазы. В EJ максимальная выживаемость была достигнута уже на ранней стационарной стадии.

Что касается стимулирующего стресса с желчными солями (рис. 5B), наблюдалось меньшее выживание клеток по сравнению со стрессом, вызываемым кислотой, для обеих культуральных сред, причем максимум в 10% наблюдался для EJ в поздней стационарной фазе, тогда как процентное содержание для CdM было ниже, чем 0,001%. Для обеих сред толерантность к солям желчных кислот также зависела от фазы роста (рис. 5В). При CdM толерантность уменьшалась, тогда как в EJ она увеличивалась, когда клетки входили в стационарную фазу, демонстрируя значительно улучшенное приобретение толерантности в этой среде (P <0,05).

Влияние осмоадаптации на стрессоустойчивость P. freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1

Рис. S1. Толерантность P. freudenreichii subsp. shermanii CIRM BIA 1 к пищеварительным стрессам в CdM и в CdM с добавлением 0,45М NaCl или 0,45М NaCl и 10 г дрожжевого экстракта L^-1.

Пропионибактерии заготавливали в стационарной фазе роста в CdM до появления кислых (A, pH 2) или желчных солей (B, 1 g L ^-1), как описано в разделе материала и метода. Выжившие бактерии были затем подсчитаны методом KOE.

Осмолярность CdM была намного ниже, чем у EJ, поэтому мы исследовали роль осмолярности и осмоадаптации в приобретении толерантности P. freudenreichii CIRM BIA 1. Как видно на рис. S1, добавление 0,45М NaCl к CdM для достижения такой же осмолярности, как в EJ (>1000 мосмоль L^-1), на самом деле вызывает повышенную подверженность к стрессу по отношению к кислотам и солям желчи. Однако добавление 10 г дрожжевого экстракта L^-1 подсоленого CdM восстановило стрессоустойчивость.

Обсуждение

Стрессоустойчивость является ключевой характеристикой для пробиотического применения бактерий. Для достижения оптимальной эффективности пробиотиков они должны выживать в пробиотическом продукте во время хранения, чтобы переносить пищеварительные стрессы, в том числе кислотный стресс в желудке и стресс от солей желчных кислот в двенадцатиперстной кишке, чтобы достичь прямой кишки. Действительно, ожидаемые положительные эффекты пробиотических бактерий, как правило, зависят от синтеза полезных метаболитов in situ, таких как короткоцепочечные жирные кислоты и бифидогенные соединения, как у P. freudenreichii [5]. Предыдущие исследования показали, что преадаптация может вызывать высокий уровень толерантности у P. freudenreichii [3,22,29,31]. Условия, встречающиеся в средстве доставки пробиотика, играют ключевую роль в его эффективности. Было показано, что сырная среда обеспечивает повышенную переносимость и выживаемость по сравнению с лабораторными средами [21]. Таким образом, мы исследовали рост и толерантность как в лабораторных CdM, так и в натуральных средах EJ. EJ не полностью отражает длительное пребывание в сыре Эмменталь, а скорее позволяет расти с субстратами, которые P. freudenreichii использует при выращивании в сыре. Он был разработан для того, чтобы обеспечить рост пропионибактерий в окружающей среде, максимально приближенной к тем, которые преобладают в сыре [23,32]. Среда EJ, использованная в этом исследовании, была подготовлена из разных секторов различных колес сыра Эмменталь, находящихся уже в теплом помещении, чтобы представлять среднее значение водной фазы сыра на этой стадии.

CdM, ранее разработанный для изучения молекулярных механизмов P. freudenreichii [22], содержит все необходимые факторы роста, а также лактат, предпочтительный источник углерода пропионибактерий и нейтральный pH. Напротив, EJ, извлеченный из сыра, с высоким содержанием соли вызывает повышение осмотического воздействия, имеет кислотный pH в диапазоне 5,4-5,7, в основном содержит лактат (35–37 г кг^-1 EJ, т.е. 380–410 мМ), аминокислоты (22–30 г кг^-1), натрий (316–430 мМ) и кальций (171–200 мМ) [32 ] в более высоком количестве, чем в CdM, а также в другие компоненты, такие как цитрат, пептиды (22–30 г/кг), другие второстепенные компоненты, уже присутствующие в молоке до изготовления сыра [23,24,32]. EJ также содержит бактериальные метаболиты, в том числе ферменты, возникающие в результате начального роста молочнокислых бактерий, высвобождаемых путем лизиса в сыре перед экстракцией EJ [24], которых нет в CdM.

В этом исследовании мы четко показали, что P. freudenreichii subsp. shermanii CIRM-BIA1 росли по-разному в CdM и в EJ, хотя одинаковая конечная популяция клеток была достигнута в ранней стационарной фазе для обеих сред (рис. 1). После использования лактата в EJ использовались два других способа подачи энергии в клетки: аспартат / аспарагин и метаболизм цитрата. Это было подтверждено как на уровне метаболизма, так и на уровне белка (рис. 3 и таблица 2).

Ацетат и пропионат были получены из лактата в соответствии с хорошо известным теоретическим уравнением Фитца [33], т.е. 3 моля лактата превращаются в 1 моль ацетата, 2 моля пропионата и 1 моль диоксида углерода (этот последний не измерен в нашем исследовании). Количество пропионата, продуцируемого в обеих средах, соответствовало уравнению. Однако было отмечено, что молярное отношение пропионата к ацетату было ниже теоретического соотношения, поскольку эффективное соотношение пропионат: ацетат составляло 1,34 в EJ и 1,40 в CdM. Это уже наблюдалось в сырах швейцарского типа из-за сопутствующего производства ацетата из других метаболических путей, таких как катаболизм аминокислот из аспартата, серина, аланина и глицина [34–36]. Действительно, аланин, глицин, аспартат, аспарагин, глутамин и серин в основном использовались в CdM одновременно с лактатом. Аспарагин, аспартат, глицин и серин были также наиболее интенсивно потребляемыми по сравнению с другими свободными аминокислотами в EJ, и многие белки из метаболизма аспартата (аспартат-аммиак-лиаза, аргининосукцинатсинтаза, L-аспартатоксидаза) были сверхэкспрессированы в EJ (таблица 2). Примечательно, что выработка ацетата и пропионата все еще незначительно возрастала после истощения лактата и аспартата, вероятно, при использовании аланина и серина в соответствии с результатами Кроу [34]. Катаболизм разветвленных аминокислот, проявляемый кетокислотной редуктоизомеразой и аминокислотной аминотрансферазой с разветвленной цепью, был сверхэкспрессирован в EJ по сравнению с CdM, в соответствии со способностью P. freudenreichii производить высокий уровень летучих соединений с разветвленной цепью в сырах швейцарского типа. Такие ферменты также участвуют в синтезе жирных кислот с разветвленной цепью, которые образуются в результате катаболизма валина, лейцина и изолейцина и которые могут помочь укрепить липидные мембраны, чтобы справиться с холодным стрессом во время хранения сыра [35,36].

В отличие от CdM, большинство других аминокислот увеличивалось со временем в EJ из-за присутствия активных пептидаз [4,24]. Высокое содержание глутаминовой кислоты, пролина, лизина, лейцина, валина и аланина в EJ до и во время роста пропионибактерий также отражало состав полученных из казеина пептидов.

Повышенная толерантность к стрессу в этой работе является основным физиологическим следствием роста в EJ по сравнению с CdM. В самом деле, наблюдалась повышенная выживаемость в условиях стресса, как при кислотной среде, так и при желчных солях. Толерантность к определенному стрессу (кислоте, солям желчи, теплу) обычно достигается гомологичной сублетальной предварительной обработкой в P. freudenreichii [3,22,29,31], что здесь не так. Общая стрессоустойчивость также может быть вызвана голоданием в результате перехода в стационарную фазу у P. freudenreichii [18] и других бактерий [37]. Соответственно, было показано, что P. freudenreichii приобретает устойчивость к стрессу при переходе в стационарную фазу (рис. 5). Однако в нашем исследовании более высокая толерантность наблюдалась в EJ, независимо от фазы роста. Даже в экспоненциальной фазе среда EJ придавала повышенную стрессоустойчивость. Основным стимулом, ответственным за эту адаптацию, может быть осмотическое давление. Действительно, EJ, главным образом из-за соли, добавленной к сыру, обнаружила более высокую осмолярность, 1368 ± 14 мосмоль L^-1 в EJ, в соответствии с результатами Salvat-Brunaud et al [32] по сравнению с 367±1 мосмоль L^-1 в CDM. Сообщалось, что осмотический стресс запускает перекрестную защиту от других стрессов, включая стресс из солей желчных кислот [38,39]. В нашей работе было показано, что осмотический стресс снижает толерантность к стрессу при CdM, в то время как добавление дрожжевого экстракта в соленую среду CdM повышает солеустойчивость, показывая, что совместимые с внешним организмом растворенные вещества в сочетании с осмоадаптацией играют решающую роль в устойчивости к стрессу, как описано для других бактерий. [38,40]. Мы предполагаем, что такие растворенные вещества могут содержаться в более высокой концентрации в EJ, чем в дрожжевом экстракте CdM +, или что EJ обеспечивает другие сильные осмопротекторы, которых нет в дрожжевом экстракте. Действительно, известно, что молоко и / или созревшие сыры содержат холин, бетаин, пролин, карнитин [41,42] и диметилсульфониопропионат, известный как предпочтительный осмопротектор P. freudenreichii [43].

В соответствии с этим аминокислоты пролин и глицин являются сильнодействующими осмопротекторами, применяемыми в системе транспорта осмопротекторов P. freudenreichii subsp. shermanii CIRM-BIA1 [25], было показано, что они доступны в EJ, а не в CdM, на протяжении роста и даже во время стационарной фазы.

Основная роль осмопротекторов, независимо от того, взяты ли они из внешней среды (глицин-бетаин) или синтезированы de novo внутриклеточно (трегалоза), заключается в восстановлении повышающегося давления в результате внутриклеточного накопления, важнейшего параметра для роста и деления [44]. Другая роль связана с «шаперон» эффектом осмопротектора, который защищает макромолекулы от вызванной солью денатурации и способствует нормальным клеточным и молекулярным процессам [44]. Сообщалось, что P. freudenreichii накапливает в результате осмоадаптации высокие уровни глицина бетаина, глутамата, трегалозы и гликогена [35,43]. Такие накопленные молекулы защитника могут хорошо объяснить наблюдаемое повышение выживаемости, о чем свидетельствует подсчет КОЕ и физиологическое окрашивание после нескольких дней в стационарной фазе (рис. 1). Согласно этому наблюдаемому ответу на стрессоустойчивость, клеточное накопление белков адаптации к стрессу наблюдалось здесь при росте в EJ. Эти белки были ранее идентифицированы у P. freudenreichii как вовлеченные в адаптацию кислотных и / или желчных солей. Например, белки, участвующие в укладке белков, такие как ClpB, ClpC и Hsp20, участвуют в адаптации кислоты и желчи у P. freudenreichii и других бактерий [29,45]. То же относится и к аспартат-аммиак-лиазе, вызываемой кислотой и желчью у P. freudenreichii, которая участвует в катаболизме аминокислот и адаптации к кислотным условиям в кишечных бактериях [46]. Кроме того, было показано, что две субъединицы метилмалонил-СоА-карбокситрансферазы, ключевого фермента пропионовой ферментации, участвуют в адаптации in vitro к кислоте и солям желчи в P. freudenreichii [29] и экспрессируются в пищеварительном тракте человека [19]. В соответствии с повышенной устойчивостью к стрессу в EJ, водная фаза сыра пропионибактерии, как известно, остается жизнеспособной и пригодной для выращивания в сырах Эмменталь даже после нескольких месяцев созревания [47], в то время как их жизнеспособность постоянно снижается в CdM (данные не показаны).

Таким образом, условия роста определяют толерантность к стрессу и, следовательно, эффективность пробиотика P. freudenreichii. Рост в сыре является многообещающим в этом отношении и накладывает сублетальные дозы стресса, запускающие реакцию на толерантность к стрессу. Таким образом, сыры с хорошо усвоенной микрофлорой и физико-химическими и технологическими параметрами следует рассматривать как эффективные биофункциональные пищевые носители [48].

К разделу: Закваски пропионовокислых бактерий в сыроделии

По теме см. также:

Кислотоустойчивость пропионовокислых бактерий (о ЖКТ)

Устойчивость ПКБ к поваренной соли

Литература

Jan G, Lan A, Leverrier P Dairy propionibacteria as probiotics. In: Saarela M, editors. Functional dairy products. Cambridge CB21 6AH: Woodhead Publishing Limited, Abington Hall, Abington; 2007. pp. 165–194.
Thierry A, Falentin H, Deutsch SM, Jan G Propionibacterium spp. In: Fuquay JW, Fox PF, Mc Sweeney PLH, editors. Encyclopedia of dairy sciences, Vol 1. San Diego, USA: Elsevier Academic Press, London, UK; 2011. pp. 403–411.
Leverrier P, Dimova D, Pichereau V, Auffray Y, Boyaval P, Jan G. Susceptibility and adaptive response to bile salts in Propionibacterium freudenreichii: Physiological and proteomic analysis. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69: 3809–3818. pmid:12839748
Gagnaire V, Lortal S, Léonil J. Free active peptidases are detected in Emmental juice extracted before ripening in the warm room. J. Dairy Res. 1998; 65: 119–128.
Cousin FJ, Mater D, Foligné B, Jan G. Dairy propionibacteria as human probiotics: A review of recent evidence. Dairy Sci. Technol. 2011; 91: 1–26.
Bouglé D, Roland N, Lebeurrier F, Arhan P. Effect of propionibacteria supplementation on fecal bifidobacteria and segmental colonic transit time in healthy human subjects. Scand. J. Gastroenterol. 1999; 34: 144–148. pmid:10192191
Foligné B, Deutsch SM, Breton J, Cousin FJ, Dewulf J, Samson M et al. Promising immunomodulatory effects of selected strains of dairy propionibacteria as evidenced in vitro and in vivo. Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76: 8259–8264. pmid:20971874
Foligné B, Breton J, Mater D, Jan G. Tracking the microbiome functionality: Focus on Propionibacterium species. Gut 2013; 62: 1227–1228. pmid:23389969
Lan A, Bruneau A, Bensaada M, Philippe C, Bellaud P, Rabot S et al. Increased induction of apoptosis by Propionibacterium freudenreichii TL133 in colonic mucosal crypts of human microbiota-associated rats treated with 1,2-dimethylhydrazine. Br. J. Nutr. 2008; 100: 1251–1259. pmid:18466653
Hugenholtz J, Hunik J, Santos H, Smid E. Nutraceutical production by propionibacteria. Lait 2002; 82: 103–112.
Havenaar R. Intestinal health functions of colonic microbial metabolites: A review. Benef. Microbes. 2011; 2: 103–114. pmid:21840809
Jan G, Belzacq AS, Haouzi D, Rouault A, Metivier D, Kroemer G et al. Propionibacteria induce apoptosis of colorectal carcinoma cells via short-chain fatty acids acting on mitochondria. Cell Death Differ. 2002; 9: 179–188. pmid:11840168
Lan A, Lagadic-Gossmann D, Lemaire C, Brenner C, Jan G. Acidic extracellular pH shifts colorectal cancer cell death from apoptosis to necrosis upon exposure to propionate and acetate, major end-products of the human probiotic propionibacteria. Apoptosis. 2007; 12: 573–591. pmid:17195096
Isawa K, Hojo K, Yoda N, Kamiyama T, Makino S, Saito M et al. Isolation and identification of a new bifidogenic growth stimulator produced by Propionibacterium freudenreichii ET-3. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 2002; 66: 679–681.
Okada Y, Tsuzuki Y, Miyazaki J, Matsuzaki K, Hokari R, Komoto S et al. Propionibacterium freudenreichii component 1.4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) attenuates dextran sodium sulphate induced colitis by modulation of bacterial flora and lymphocyte homing. Gut 2006; 55: 681–688. pmid:16299037
Okada Y, Hokari R, Kato S, Mataki N, Okudaira K, Takebayashi K et al. 1.4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) shows anti-inflammatory effect on NSAID-induced colitis in IL-10-knockout mice through suppression of inflammatory cell infiltration and increased number of genus Bifidobacterium. Gastroenterology 2006; 130: A313.
Le Marechal C, Peton V, Ple C, Vroland C, Jardin J, Briard-Bion V et al. Surface proteins of Propionibacterium freudenreichii are involved in its anti-inflammatory properties. J. Proteomics 2015; 113: 447–461. pmid:25150945
Leverrier P, Fremont Y, Rouault A, Boyaval P, Jan G. In vitro tolerance to digestive stresses of propionibacteria: Influence of food matrices. Food Microbiol. 2005; 22: 11–18.
Hervé C, Fondrevez M, Cheron A, Barloy-Hubler F, Jan G. Transcarboxylase mRNA: A marker which evidences P. freudenreichii survival and metabolic activity during its transit in the human gut. Int. J. Food Microbiol. 2007; 113: 303–314. pmid:17156879
Jan G, Leverrier P, Roland N. Survival and beneficial effects of propionibacteria in the human gut: In vivo and in vitro investigations. Lait 2002; 82: 131–144.
Jan G, Rouault A, Maubois JL. Acid stress susceptibility and acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Lait 2000; 80: 325–336.
Jan G, Leverrier P, Pichereau V, Boyaval P. Changes in protein synthesis and morphology during acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67: 2029–2036. pmid:11319077
Salvat-Brunaud D, Maubois JL, Maillard MB, Corre C, Thierry A. Extraction et analyse de la phase aqueuse de l'emmental à 4 stades d'affinage. Lait 1995; 75: 239–249.
Gagnaire V, Thierry A, Léonil J. Propionibacteria and facultatively heterofermentative lactobacilli weakly contribute to secondary proteolysis of Emmental cheese. Lait 2001; 81: 339–353.
Falentin H, Deutsch SM, Jan G, Loux V, Thierry A, Parayre S et al. The complete genome of Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA1^T, a hardy actinobacterium with food and probiotic applications. Plos One 2010; 5.
Cousin FJ, Louesdon S, Maillard MB, Parayre S, Falentin H, Deutsch SM et al. The first dairy product exclusively fermented by Propionibacterium freudenreichii: A new vector to study probiotic potentialities in vivo. Food Microbiol. 2012; 32: 135–146. pmid:22850385
Spackman DH, Stein WH, Moore S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino-acids. Anal. Chem. 1958; 30: 1190–1206.
R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing 2014; http://www.R-project.org: Vienna, Austria.
Leverrier P, Vissers JP, Rouault A, Boyaval P, Jan G. Mass spectrometry proteomic analysis of stress adaptation reveals both common and distinct response pathways in Propionibacterium freudenreichii. Arch. Microbiol. 2004; 181: 215–230. pmid:14730419
Morris JS, Clark BN, Wei W, Gutstein HB. Evaluating the performance of new approaches to spot quantification and differential expression in 2-dimensional gel electrophoresis studies. Proteome Res. 2010; 9: 595–604.
Anastasiou R, Leverrier P, Krestas I, Rouault A, Kalantzopoulos G, Boyaval P et al. Changes in protein synthesis during thermal adaptation of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Int. J. Food Microbiol. 2006; 108: 301–314. pmid:16473425
Salvat-Brunaud D, Thierry A, Maubois JL. Development of a medium simulating Emmental juice for propionibacteria growth. J. Dairy Res. 1997; 64: 573–580.
Fitz A. Über Spaltpilzgährungen. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft 1878; 11: 1890–1899.
Crow VL. Metabolism of aspartate by Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii: Effect on lactate fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 1986; 52: 359–365. pmid:16347135
Dalmasso M, Aubert J, Briard-Bion V, Chuat V, Deutsch SM, Even S et al. A temporal-omic study of Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA1^T adaptation strategies in conditions mimicking cheese ripening in the cold. Plos One 2012; 7: e29083. pmid:22253706
Thierry A, Maillard MB. Production of cheese flavour compounds derived from amino acid catabolism by Propionibacterium freudenreichii. Lait 2002; 82: 17–32.
Rallu F, Gruss A, Maguin E. Lactococcus lactis and stress. Anton. Leeuw. Int. J. G. 1996; 70: 243–251.
Flahaut S, Hartke A, Giard JC, Benachour A, Boutibonnes P, Auffray Y. Relationship between stress response towards bile salts, acid and heat treatment in Enterococcus faecalis. FEMS Microbiol. Lett. 1996; 138: 49–54. pmid:8674969
Wu R, Zhang W, Sun T, Wu J, Yue X, Meng H et al. Proteomic analysis of responses of a new probiotic bacterium Lactobacillus casei Zhang to low acid stress. Int. J. Food Microbiol. 2011; 147: 181–187. pmid:21561676
Begley M, Gahan CGM, Hill C. Bile stress response in Listeria monocytogenes LO28: Adaptation, cross-protection, and identification of genetic loci involved in bile resistance. Appl. Environ. Microbiol. 2002; 68: 6005–6012. pmid:12450822
Fröhlich-Wyder MT, Bachmann HP Cheeses with propionic acid fermentation. Cheese. Chemistry, Physics and Microbiology: major cheese groups. London: Elsevier; 2004. pp. 141–156.
Le Boucher C, Courant F, Jeanson S, Chereau S, Maillard MB, Royer AL et al. First mass spectrometry metabolic fingerprinting of bacterial metabolism in a model cheese. Food Chem. 2013; 141: 1032–1040. pmid:23790883
Boyaval P, Deborde C, Corre C, Blanco C, Begue E. Stress and osmoprotection in propionibacteria. Lait 1999; 79: 59–69.
Wood JM. Bacterial osmoregulation: A paradigm for the study of cellular homeostasis. Annu. Rev. Microbiol. 2011; 65: 215–238. pmid:21663439
Lee S, Ahn S, Lee H, Kim WI, Kim HY, Ryu JG et al. Gene-related strain variation of Staphylococcus aureus for homologous resistance response to acid stress. J. Food Prot. 2014; 77: 1794–1798. pmid:25285500
Hu Y, Lu P, Zhang Y, Li L, Chen S. Characterization of an aspartate-dependent acid survival system in Yersinia pseudotuberculosis. FEBS Lett. 2010; 584: 2311–2314. pmid:20371246
Thierry A, Deutsch SM, Falentin H, Dalmasso M, Cousin FJ, Jan G. New insights into physiology and metabolism of Propionibacterium freudenreichii. Int. J. Food Microbiol. 2011; 149: 19–27. pmid:21620505
Castro JM, Tornadijo ME, Fresno JM, Sandoval H. Biocheese: A food probiotic carrier. Biomed. Res. Int. 2015; 2015:723056. Epub; 2015 Feb 23: 723056. pmid:2580286

Будьте здоровы!

ОСНОВНЫЕ ПОДРАЗДЕЛЫ

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСКАХ