О биотехнологии - важно знать!

Биотехнология концентрированных заквасок и биологически активных  добавок на основе пробиотических микроорганизмов

*Более подробную информацию о результатах исследований в области описанной биотехнологии, а также о перспективах  развития данного направления прикладной науки Вы можете узнать из материалов, размещенных в разделе "СТАТЬИ" и "ПАТЕНТЫ" нашего сайта 

В настоящее время проблема изучения микробной экологии человека выдвигается в разряд наиболее актуальных и перспективных. Разработка и массовое использование пробиотиков и пробиотических продуктов, оптимизирующих микробиоценоз пищеварительного тракта, в первую очередь детей, а затем и взрослого человека, является эволюционно обоснованным микроэкологическим базовым приемом поддержания физического и духовного здоровья, увеличения продолжительности и активности жизни населения и важнейшей предпосылкой появления нового здорового поколения.

В связи с этим в XXI веке стоит перспективная научно-техническая проблема – на базе достигнутого уровня биотехнологии развить новые направления, отвечающие современной концепции «здорового питания», одним из которых является совершенствование и выход на новый качественный уровень по производству и использованию микроорганизмов-пробиотиков.

Микроорганизмы, входящие в состав пробиотиков, хорошо приживаются в естественной  среде и продуцируют биологически активные вещества: витамины, антибиотики, ферменты и другие метаболиты, нормализуют физиологические процессы, предотвращают дисбактериоз и другие расстройства органов пищеварения, что способствует улучшению усвоения пищи и повышают резистентность организма.

Известно, что доминирующей микрофлорой кишечника здорового человека являются бифидобактерии. Именно бифидофлоре принадлежит ведущая роль в нормализации микробиоценоза кишечника и поддержании неспецифической резистентности организма. Обладая высокими адгезионными свойствами и антагонистической активностью, они защищают организм от кишечных инфекций.

В настоящее время в России и за рубежом производится достаточно большой ассортимент кисломолочных пробиотических продуктов на основе бифидобактерий и лактобацилл. В большей части кисломолочных продуктов пробиотический эффект достигается путем обогащения готовых кисломолочных продуктов концентратами бифидобактерий. В таких кисломолочных продуктах отсутствуют продукты метаболизма пробиотических микроорганизмов, антимикробные и антимутагенные  вещества, витамины, аминокислоты, экзополисахариды и другие полезные для организма соединения, продуцируемые бифидобактериями.

Концентрированные закваски бифидобактерий, предлагаемые различными фирмами на российском рынке содержат высокое количество жизнеспособных  клеток, но не ферментируют молоко с образованием сгустка (геля). Они рекомендуются для обогащения кисломолочных продуктов или используются в сочетании с лактобактериями.

В последние годы большое внимание привлекают к себе пропионовокислые бактерии. Эти бактерии обладают уникальными иммунностимулирующими и антимутагенными свойствами, они приживаются в кишечнике людей и способны к снижению геннотоксического действия ряда химических соединений и УФ-лучей. Бактерии, как источники антибиомутагенов или десмутагенов могут быть использованы для предобработки пищевых продуктов и кормов с целью нейтрализации мутагенных (канцерогенных) веществ, а также как пробиотики. Известно, что положительная роль пропионовокислых бактерий как пробиотиков обусловлена образованием ими пропионовой кислоты, минорных органических кислот, бактериоцинов, ферментов и витаминов.

Пропионовокислые бактерии синтезируют большое количество витамина В12, который регулирует основные обменные процессы в организме, способствуют повышению иммунного статуса организма, улучшают общее самочувствие за счет активизации белкового, углеводного и жирового обмена, повышают устойчивость к инфекционным заболеваниям. Однако синтез витамина В12  кишечной флорой человека незначителен.  При недостатке витамина В12 возникают желудочно-кишечные заболевания, дисбактериоз, анемия. Поэтому важную роль в профилактике и лечении этих заболеваний могут играть кисломолочные продукты, содержащие пропионовокислые бактерии.

Сложность изготовления таких продуктов связана с тем, что пропионовокислые бактерии обладают слабой кислотообразующей способностью и не ферментируют молоко. В этой связи разработка концентрированных заквасок бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, обладающих высокой биохимической активностью представляет большой интерес для науки и практики.

Создание препаратов на основе живых микроорганизмов является одним из самых сложных направлений в биотехнологии и успех их получения в значительной мере определяется факторами, непосредственно влияющими на физиолого-биохимические свойства и структуру клеток. Что касается бифидобактерий и пропионовокислых бактерий,  то вопросы подготовки их к консервированию остаются малоизученными.

На основании многолетних фундаментальных исследований по изучению физиолого-биохимических свойств бифидобактерий нами разработан эффективный биотехнологический способ их активизации в молоке, который позволил создать принципиально новую технологию получения жидких замороженных и сухих концентратов пробиотических микроорганизмов.

Особенностью предлагаемого нами технического решения является использование в качестве инокулята для получения концентрированных заквасок (DVS) активизированной культуры бифидобактерий, обладающей высокой биохимической активностью и ферментирующей молоко и пищевые среды без стимуляторов роста.

В наших дальнейших исследованиях биотехнологический способ активизации бифидобактерий в молоке был положен в основу конст­руирования заквасок с использованием различных штаммов бифидо­бактерий. Культуры бифидобактерий в заквасках выбирали с учетом видового состава бифидофлоры детей раннего возраста, для которых характерны виды B.bifidum и  B.longum.

Следует отметить, что проведенное российскими исследователями изу­чение видового состава бифидобактерий, изолированных от 66 детей грудного возраста и 58 взрослых людей, позволило выявить, что у здоровых детей на грудном вскармливании в 51,9% случаев выявлялись В. bifidum, В. parvulorum, В. infantis, в 34,8% случаев - В. longum. Представители В. adolescentis не обнаруживались у грудных детей. Однако перевод детей на ранний прикорм или ис­кусственное вскармливание сопровождался уменьшением в их кишечнике В. bifidum и появлением в 20,8% случаев В. adolescentis. Преобладающими видами бифидобактерий у взрослых людей являлись В. longum и В. adolescentis, которые выделялись из фекалий у 75 и 56,3% обследо­ванных соответственно. В 25,9% случаев от взрослых здо­ровых людей выделяли В. bifidum. В кишечном содержимом человека одновременно могут обнаруживаться от 1 до 5 видов или биоваров бифидобактерий. У 60% здоровых детей при грудном вскармливании в фекалиях в монокультуре выявлялись В. bifidum, В. longum или В. breve. У детей более старшего возраста и взрослых наиболее часто в фека­лиях выявлялись сочетания B. longum и В. adolescentis - в 20-33% случаев, помимо этой пары видов бифидобактерий в фекалиях присутствовали штаммы В. bifidum.

Проведенная российскими исследователями статистическая обработка данных о видовом составе бифидофлоры у различных возрастных групп населения России показала, что у здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, В. bifidum, В. longum; В. breve, В. infantis встречаются в  соотношении 35%,; 42%, 17%, 12%. Штаммы В. adolescentis выявляются в 1,5% случаев или отсутствуют в фекальном содержимом. У детей на искусственном вскармливании содержание доминирующих видов бифидобактерий падает до 3-5%, в то время как представители вида В. adolescentis обнаруживаются у 22%, детей. У взрослых в толстом кишечнике обнаруживаются преимущественно представители В. bifidum, В. longum и В. adolescentis. В кишечнике лиц старше 35 лет представите­ли вида В. adolescentis начинают превалировать в бифидофлоре достигая 60-75% в пожилом возрасте.

Основываясь на этих данных, авторы полагают, что в пробиотиках, предназначенных для детей до 3-х лет, видовое соотноше­ние бифидобактерий должно соответствовать количествен­ному содержанию этих микроорганизмов в кишечнике здо­ровых детей. При этом вид В. adolescentis не следует вводить в пробиотики и продукты функционального пита­ния, предназначаемые для этой возрастной группы росси­ян.

При разработке пробиотиков на основе бифидо- и лактофлоры соотношение между этими микроорганизмами в пре­паратах  и продуктах должно составлять 9:1, что соответствует таковому в составе микрофлоры толстой кишки здо­ровых людей. Именно бифидофлоре принадлежит ведущая роль в поддержании и нормализации микробиоценоза кишечника, сохранении неспецифической резистентности организма, улуч­шении белкового, витаминного и минерального обмена и др.

Антагонистическая активность бифидобактерий, связанная с продукцией органических кислот (ацетата лактата) и бактериоцинов с широким спектром антими­кробного действия (ингибирование роста кишечных палочек, клостридий, сальмонелл, шигелл, листерий, кампилобактеров, вибрионов и других микроорганизмов), так же как и блокирование рецепторов на слизистой кишечника, предотвращающие фиксацию на них потенци­ально патогенных микроорганизмов, определяют важней­шую роль этих микроорганизмов в колонизационной резистентности. Снижение количества бифидобактерий или даже их полное исчезновение является одним из патогенети­ческих механизмов длительных кишечных дисфункций у детей и взрослых. Оно ведет к нарушению минерального обмена, процессов кишечного всасывания, белкового и жирового обмена, к формированию хронических расстройств пищеварения. Имеются сведения, что бифидобактерии являются "поставщиком" ряда незаменимых аминокислот, в том числе триптофана, витаминов, установлена их антиканцерогенная и антимутагенная активность, спо­собность снижать уровень холестерина в крови и. др. Все эти положительные эффекты в свое время позволили рассматривать бифидобактерий как эффективный биокор­ректор и основу для создания препаратов, обладающих многофакторным регулирующим и стимулирующим воздей­ствием на организм, а позднее и как одну из основных категорий функционального питания.

Оптимальное соотношение культур бифидобактерий в многоштаммовых заквасках подбирали с учетом органолептических свой­ств, продолжительности сквашивания, количества жизнеспособных клеток бифидобактерий, содержания молочной кислоты, летучих ки­слот, антибиотической, протеолитической и собственной b-галактозидазной активности бифидобактерий.

На основании проведенных исследований разработаны заквас­ки с использованием монокультур бифидобактерий B.bifidum  шт.1 и B.longum В 379 М   и многоштаммовые: двухштаммовая, состо­ящая из B.longum В 379 М   и B.bifidum шт.791 в соотношении 2:1 и трехштаммовая, включающая B.longum В 379 М, B.bifidum шт. 1 и B.bifidum  шт. 791 в соотношении 1:1:1. Закваски об­ладают достаточно высокой биохимической активностью, содержат 10⁹-10¹⁰  в 1 см³ жизнеспособных клеток бифидобактерий и ферментируют молоко без стимуляторов роста.

Известно, что пропионовокислые бактерии и бифидобактерии относятся к одной группе микроорганизмов – коринеформным бактериям (сводной группе грамположительных неспорообразующих палочковидных бактерий неправильной, нерегулярной формы - ред.). В связи с этим разработанный биотехнологический метод нами был применен для активизации пропионовокислых бактерий в молоке. Полученные результаты исследований, касающиеся биотехнологического способа активизации бифидобактерий были полностью подтверждены на различных видах и штаммах пропионовокислых бактерий. В дальнейших исследованиях они использовались в качестве инокулята для получения концентрированных заквасок.

В результате проведенных исследований установлено, что исследуемые штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freundenreichii subsp freudereichii АС-2500, P. cyclohexanicum Kusano АС-2259, P.  freudereichii subsp. shemanii AC–2503, P. cyclohexa-nicum Kusano АС-2260, P. freudereichii subsp. shermanii – КМ 186, активизированные биотехнологическим методом обладают высокой  биохимической активностью, о чем свидетельствует быстрая ферментация молока и максимальное количество жизнеспособных клеток в заквасках – 10^9-10 кое/см³. Отмечено, что исследуемые штаммы проявили устойчивость к высокой концентрации желчи (40%), NaCl (6%) и развивались в среде с низким рН (4,5), что указывает на высокую выживаемость данных культур в неблагоприятных условиях ЖКТ человека. Установлен значительный синтез корриноидов, гемсодержащих ферментов (каталазы,  пероксидазы)  и  супероксиддисмутазы.

Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены защитные функции синтезируемых пробиотическими стартерными культурами экзополисахаридов, которые обеспечивают гибкую адаптацию бактерий и предохраняют отдельные клетки и популяцию в целом от неблагоприятных факторов внешней среды (изменение температуры, низкие значения рН, замораживание и обезвоживание). Показано, что при совместном культивировании экзополисахариды, синтезируемые пропионовокислыми бактериями, стимулируют рост бифидобактерий. Отмечен активный рост пропионовокислых  бактерий в консорциуме микроорганизмов кефирной закваски при утилизации лактата, образуемого молочнокислой микрофлорой, что свидетельствует о симбиотических взаимоотношениях микроорганизмов. Установлена наиболее высокая когезивность у бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, клетки которых взаимодействуют между собой с образованием субколониальных ассоциаций, контактирующих с молочнокислыми бактериями, отражая закономерность развития популяций в консорциуме как самоорганизующихся многоклеточных систем.

Установлена антимутагенная активность бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, а также некоторых заквасочных культур молочнокислых бактерий. Показано, что жизнеспособные клетки пробиотических микроорганизмов проявляют более высокий антимутагенный эффект в отношении мутагенеза, индуцируемого азидом натрия, чем культуральная жидкость. Особое внимание было уделено антимутагенной активности бактериальных концентратов бифидобактерий (B. longum В379М) и пропионовокислых бактерий (P. shermanii – КМ 186), которые нашли широкое практическое применение при производстве кисломолочных продуктов. Наиболее эффективными носителями антимутагенной активности были пропионовокислые бактерии P. shermanii – КМ 186, которые в ферментированном молоке на 70% снижали мутагенность азида натрия. Антимутагенность концентрата бифидобактерий B. longum В379М также была весьма высокой и составила 60%. Антимутагенез вероятно связан с дисмутагенной активностью микроорганизмов, хотя не исключается механизм биоантимутагенеза. Антимутагены пробиотических бактерий можно отнести к наиболее физиологичным и эффективным природным источникам, так как они синтезируются при производстве кисломолочных продуктов и усиливают их пробиотический эффект.

Таким образом, полученные результаты исследований свидетельствуют, что изученные штаммы пропионовокислых бактерий обладают ценными биотехнологическими свойствами и могут быть рекомендованы для создания пробиотических продуктов.

Выявлены основные закономерности влияния условий культивирования пробиотических микроорганизмов на сохранение их высокой ферментативной активности после обезвоживания, регидратации и при хранении.

Разработанный способ активизации бифидобактерий и пропионовокислых бактерий в молоке позволил создать принципиально новую технологию получения жидких, замороженных и сухих концентрированных препаратов из монокультур бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, активно ферментирующих молоко и пищевые среды без стимуляторов роста.

Высокая b-галактозидазная  и протеолитическая активность инокулята позволяют исключить дорогостоящие компоненты и способствует накоплению в питательной среде естественных протекторов, что обуславливает максимальную выживаемость пробиотических микроорганизмов и высокую активность ферментации молока и других пищевых сред.

Технология концентрированных заквасок, разработанная в ВСГУТУ,  по сравнению с отечественными и зарубежными аналогами имеет следующие преимущества:

• бактериальные концентраты бифидобактерий и пропионовокислых бактерий (закваски прямого внесения) активно ферментируют молоко и пищевые среды;
• для получения биомассы пробиотических микроорганизмов при изготовлении концентратов используется дешевая питательная среда на основе творожной сыворотки;
• использование бактериальных концентратов в условиях производства позволяет интенсифицировать технологический процесс и гарантирует высокое качество готового продукта;
• внеклеточные метаболиты (витамины, экзополисахариды, антимикробные и антимутагенные вещества) синтезируемые пробиотическими микроорганизмами в процессе ферментации молока повышают пробиотический эффект кисломолочных продуктов.

На основе анализа биотехнологических свойств пробиотических микроорганизмов созданы различные варианты заквасок прямого внесения, состоящих из: монокультур бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, а также их сочетаний; комплексных заквасок бифидобактерий и молочнокислых бактерий; пропионовокислых бактерий и молочнокислых бактерий, позволяющие в максимальной степени реализовать физиолого-биохимический и технологический потенциал микроорганизмов.

Теоретически обоснована роль внеклеточных факторов адаптации (ВФА) в стабилизации по­пуляции пропионовокислых бактерий при изменении условий культивирова­ния, их высокая устойчивость к поваренной соли, нитриту натрия и другим пищевым ингредиентам, формирующим потребительские свойства мясных продуктов.

На основе исследования ВФА разработаны новые подходы к регуляции активности и численности пробиотических микроорганизмов при производстве мясных продуктов.

Изучены механизмы адаптации пропионовокислых бактерий к высоким концентрациям поваренной соли и нитрита натрия. Показано, что межклеточ­ные контакты, агрегация клеток с повышением концентрации соли в питатель­ной среде поддерживают жизнеспособность клеток и обеспечивают адаптацию пропионовокислых бактерий к неблагоприятным факторам внешней среды.

С учетом биотехнологических свойств, антимутагенной активности бифидобактерий и пропионовокислых бактерий подобраны моно- и поликультуры, отвечаю­щие специфическим требованиям технологических процессов производства пищевых продуктов.

Выявлена высокая биохимическая активность пропионовокислых бакте­рий в мясном субстрате, позволяющая ускорить биотехнологические процессы при посоле и созревании мяса. Доказана высокая выживаемость пропионовокислых и бифидобактерий в процессе сушки, копчения и длительного хранения сырокопченых колбас, что свидетельствует о пробиотических свойствах готового продукта.

Методом газовой хроматографии установлено, что при использовании бакконцентрата на основе пропионовокислых и бифидобактерий в роли старто­вых культур значительно повышается количество терпенов и лактонов, влияю­щих на формирование вкуса и аромата сырокопченых колбас.

Разработана технология сырокопченых колбас, обладающих пробиотическими свойствами с регламентированным содержанием пропионовокислых и бифидобактерий в готовом продукте в количестве не менее 10⁷ КОЕ/г к концу срока годности.

Доказана возможность применения бифидобактерий в качестве заквасочной культуры при приготовлении хлеба из ржаной и смеси ржаной и пшеничной муки. Установлено, что заварка из ржаной муки является хорошей питательной средой для развития бифидобактерий. Высокомолекулярные полисахариды и пищевые волокна, содержащиеся в заварке, стимулируют рост бифидобактерий и обеспечивают высокую биохимическую активность.

С целью повышения степени удовлетворения потребностей и пожеланий потребителей были разработаны инновационные биологически активные добавки нового поколения на основе пробиотических микроорганизмов, обогащенных микроэлементами для  профилактики йод, селен и железодефицитных состояний. Подобраны оптимальные дозы иодида калия и селенита натрия при культивировании пробиотических микроорганизмов. Установлено, что пропионовокислые бактерии  обладают более высокой устойчивостью к селениту натрия и иодиду калия.  Отмечено, что с повышением концентрации селенита натрия в питательной среде увеличивается содержание экзополисахаридов, вязкость культуральной жидкости, антимутагенная активность и выход биомассы. Выявлено, что пробиотические бактерии обладают способностью накапливать селен в высоких концентрациях и противостоять токсическому действию микроэлемента, тогда как иодид калия при более низких концентрациях задерживает их рост. Полученные результаты свидетельствуют, что пробиотические бактерии являются перспективными объектами биотехнологического получения органических форм йода и селена.

Использование пропионовокислых бактерий для ферментативного йодирования и селенирования позволяет получить БАДы с полифункциональными свойствами. Высокая ферментативная активность пробиотических микроорганизмов способствует более эффективному протеканию реакций йодирования и селенирования аминокислот в питательной среде, что повышает биодоступность микроэлементов.

Известно, что железо в организме может всасываться только в виде Fe²⁺. Однако двухвалентное железо подвергается быстрому химическому окислению, переходя в нерастворимую, неусвояемую организмом трехвалентную форму. Для сохранения биодоступности железа привлекательной представляется роль хелатирующих «агентов», которые способствуют солюбилизации минералов, сохраняя их в растворимом состоянии. Одним из представителей такого рода хелаторов являются казеиновые фосфопептиды (СРРs).  Следует отметить, что до сих пор казеиновые фосфопептиды недостаточно изучены и как хелатирующие «агенты» для минералов, и как потенциальные нутрицевтики в питании человека.

В результате проведенных исследований установлено, что с повышением концентрации железа в среде увеличивается синтез внеклеточных метаболитов, способствующих адаптации культур к металлу. Определены оптимальные технологические параметры выделения казеиновых фосфопептидов. Доказана высокая способность казеиновых фосфопептидов солюбилизировать двухвалентное железо. Установлена взаимосвязь между концентрацией железа и степенью солюбилизации. Отмечено, что железо, хелатированное казеиновыми фосфопептидами, сохраняется в двухвалентной форме в течение длительного срока хранения. Теоретически обоснован и экспериментально подтвержден состав оптимизированной сульфатом железа и водным раствором казеиновых фосфопептидов питательной среды, обеспечивающий наибольшую эффективность биологически активной добавки.

Практическую реализацию результаты исследований нашли в разработке широкого спектра пробиотических продуктов и биологически активных добавок: «Бифивит», «Тараг обогащенный», «Паста бифидная», «Творог бифидный», «Целебный», «Целебный, обогащенный селеном», «Пропионикс кефирный», «Бифисанус», «Кремовит», «Биотараг» и другие. ВСГУТУ является держателем подлинников нормативной документации на производство пробиотических молочных продуктов (Бифивит, Целебный), заквасок прямого внесения бифидобактерий и пропионовокислых бактерий (Бифивит и Пропионикс) и биологически активных добавок (Концентрат бифидобактерий жидкий, Йодпропионикс, Селенпропионикс, Бификардио, Курунгин), действующих в Российской Федерации.

Концентраты пробиотических микроорганизмов и БАДы имеют удостоверения о государственной регистрации. Широкое использование разработанных БАД: «Йодпропионикс», «Йодбифивит», «Селенпропионикс», «Селенбифивит», «Гемопропиовит», «Бифидоферин» для профилактики алиментарных заболеваний, обусловленных дефицитом микроэлементов позволит не только восполнить дефицит йода, селена и железа в организме, но также нормализовать микробиоценоз кишечника человека.

Полученные результаты дают важные импульсы для дальнейших фундаментальных исследований: теоретическое обоснование стимулирующего действия β-галактозидазы на развитие бифидобактерий и разработанный биотехнологический принцип конструирования заквасок открывают широкие перспективы для расширения сферы применения различных видов и штаммов бифидобактерий и пропионовокислых бактерий при производстве пробиотических продуктов в пищевой промышленности.

Фундаментальные исследования в области антимутагенеза пробиотических микроорганизмов и поиск штаммов с выраженной антимутагенной, иммуногенной и холестериндеградирующей активностью и изучение возможных механизмов их действия позволит создать комплексные пробиотические мультиштаммовые препараты и пищевые продукты нового поколения, использование которых в здоровом питании позволит повысить качество жизни, обеспечит устойчивость организма к вредным воздействиям окружающей среды и различным инфекционным заболеваниям.

_______________________________________________________________________

д.т.н., проф., член-корр. СО АН Высшей школы,
заслуженный деятель науки и техники Республики Бурятия,
лауреат Государственной премии в области науки и техники РБ
Хамагаева Ирина Сергеевна

ИПИБ ВСГУТУ

ШКОЛА НАУЧНЫХ РАЗРАБОТОК ИННОВАЦИОННОЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ ООО "ПРОПИОНИКС"

• Улан-Удэнские закваски