Транспортировка пробиотиков без терморежима

УСТОЙЧИВОСТЬ ТИТРА И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК БИФИДО- И ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ТРАНСПОРТИРОВКЕ

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ

Начиная с 2013 года, микробиологическая продукция ООО «Пропионикс» транспортируется по всей территории РФ вне температурного режима, установленного для хранения, что обусловлено свойствами бактериальных концентратов. Такое решение принято для того, того, чтобы наши клиенты не переплачивали за услугу температурного режима в связи усточивостью продукции к непродолжительному (до 2 недель) пребыванию вне холодильника.

ТРАНСПОРТИРОВКА ПРОБИОТИКОВ БЕЗ ТЕРМОРЕЖИМА

Покупатели иногда задают вопрос, не погибнут ли бактерии в наших пробиотических концентратах при их транспортировке без соблюдения температурного режима хранения. Отвечаем - не погибнут (активность и концентрация останутся в пределах нормы). С чем это связано? Постараемся ответить.

Пробиотики в жидкой форме не надо путать с вакцинами. Вакцины являются очень термолабильными продуктами, и когда вакцина подвергается воздействию повышенных температур, может нарушаться белковая структура антигенов, из-за чего в вакцине остается меньше антигенного материала. Пробиотики же - это прежде всего живые клетки, и при повышении температур они сразу не гибнут, иначе бы они просто не присутствовали в кишечнике, где температура ±37º С. Речь идет о концентрации жизнеспособных клеток, которая со временем снижается ввиду ограниченного содержания питательных веществ. При этом время транспортировки позволяет доставлять продукт покупателю с сохранением свойств пробиотика, находящегося в штатной упаковке вне холодильника. 

Немного теории.

Бактерии находятся во флаконе в жидкой консервирующей среде (осветленной творожной сыворотке) в стационарной фазе с оптимальным кол-вом питательных веществ для поддержания их жизнеспособности. При хранении в холодильнике пробиотические микроорганизмы находятся в своеобразном «анабиозе», при котором метаболизм внутри клеток замедлен, поэтому питательные вещества для роста и развития клеток бактерий практически не расходуются. Если идет повышение температуры, то повышается и активность бактерий, а соответственно они начинают нуждаться в факторах роста (мы не рассматриваем температуру от +40^оС и выше, т.к. речь уже будет идти о тепловом стрессе (шоке).

В первую очередь, бактерии нуждаются в азоте, углероде (для этого служит лактоза сыворотки) и водороде для построения собственных белков. Водород для клеток поставляет вода. Как правило, источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения, а также белковые гидролизаты, пептиды, пептоны. Осветленная творожная сыворотка в этом плане – идеальная среда для  нормального роста бактерий. В ней есть необходимые витамины, следы сывороточных белков (пептиды), немного лактозы и т.д.

Объем питательных веществ ограничен, и при дальнейшем нахождении микроорганизмов в тепле часть бактерий начинает переходить  в фазу отмирания, их клетки разрушаются. Происходит т.н. автолиз – саморастворение живых клеток под действием их собственных гидролитических ферментов, разрушающих структурные молекулы. Общей причиной автолиза для микроорганизмов любого таксона является исчерпание источников питания и энергии.

Индукция автолиза происходит при:

• Экстремальном изменении физиологических условий, необходимых для роста и развития клеток;
• Исчерпании источников углерода;
• Накоплении токсических метаболитов.

Именно поэтому происходит снижение концентрации жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов. Это общее количество всех микроорганизмов, находящихся в 1 мл или 1 см³ пробы. Его значение выражают в колониеобразующих единицах: КОЕ/мл или КОЕ/см³. Колониеобразующая единица – это микроорганизм, образующий колонию в ходе размножения. К слову, показатель КОЕ/см³ снижается и при длительном хранении в холодильнике, т.к. полного анабиоза нет.

Защитные факторы.

Однако снижение показателя КОЕ/см³ при хранении биоконцентратов вне холодильника происходит не сразу и не быстро, т.к. эволюционно клетки бактерий (бифидо- и пропионовокислых) имеют адаптационные механизмы защиты от голода (исчерпания источников питания и энергии), а также от других стрессовых факторов, таких как изменение температуры, низкие значения рН, замораживание и обезвоживание.

Рассмотрим для примера защитные свойства молочных (классических) пропионовокислых бактерий (ПКБ) вида P. Freudenreichii. Что касается ПКБ, то защитными факторами у них выступают такие метаболиты, как полифосфаты, гликоген, трегалоза, экзополисахариды, а также способность к синтезу  реактивирующих белков теплового шока (шаперонов).

Полифосфаты, гликоген и трегалоза - запасные источники энергии и углерода пропионовокислых бактерий в стрессовых условиях субстратного голодания, а также защитные факторы при кислотном и осмотическом стрессах

• Интересным свойством ПКБ является образование ими в большом количестве такого полимера, как гликоген, свойственный клеткам живого организма. Накопление и гидролиз гликогена в клетках – также физиологическая особенность ПКБ. По сути – это запасание глюкозы для переживания голодания и стрессов. При этом использование экзогенного гликогена не происходит. У прокариот биосинтез гликогена  - редкое явление.

• В отличие от других бактерий, которые используют только АТФ, штаммы P. Freudenreichii аккумулируют также неорганические полифосфаты в качестве энергетического резерва. Полифосфаты образуются из пирофосфата и АТФ под действием полифосфаткиназы, которая катализирует перенос терминальной фосфатной группы от АТФ на пирофосфат или полифосфат. Пирофосфат является одним из продуктов пропионовокислого брожения. Полифосфаты как энергетический резерв позволяет ПКБ долгое время выживать в условиях субстратного голодания, например, в стационарной фазе роста, осуществляя основной (поддерживающий) обмен.

• Трегалоза – специфический нередуцирующий дисахарид, который служит запасным источником углерода и энергии, а также осмопротектором (compatible solute) и антистрессовым фактором клеток ПКБ. В клетках P. freudenreichii  синтез трегалозы осуществляется двумя альтернативными путями: из глюкозы и пирувата или из мальтозы. Синтез и аккумуляция трегалозы усиливаются в стационарной фазе и при окислительном, кислотном и осмотическом стрессах.

Реактивирующие факторы

Также стоит отметить, что представители разных видов классических пропионовокислых бактерий выделяют в среду белковые соединения - реактивирующие факторы, способные повышать или воссстанавливать жизнеспособность клеток, подвергнутых стрессорному воздействию (ультрафиолет, этанол, ионы тяжелых металлов, прогревание). Предполагается, что механизм реактивации клеток связан с индукцией у них синтеза антистрессорных белков, особенно шаперонов, после взаимодействия реактивирующих факторов со специальными рецепторами цитоплазматической мембраны.

Экзополисахариды

Наши пробиотики обладают повышенным экзополисахаридным потенциалом. Для тех, кто интересуется устойчивостью пробиотических бактерий к замораживанию и высушиванию, рекомендуем ознакомиться с материалами в разделе о внеклеточных метаболитах пробиотических микрооранизмов - экзополисахаридах или ЭПС (именно ЭПС не дают погибнуть клеткам бактерий в биоконцентратах при их случайном замораживании). Следует отметить, что бифидобактерии в наших пробиотических препаратах, также как и пропионовокислые бактерии, тоже обладают высоким ЭПС-потенциалом. Отдельную информацию об этом можно получить в работе «Исследование устойчивости микроорганизмов к стрессу», где объектом исследования, в частности, являлся штамм Bifidobacterium longum B379M (присутствует в «Концентрате бифидобактерий жидком»).

Эксперименты

Из практики

В результате исследований было установлено, что при хранении жидких пробиотиков в закрытых флаконах (в штатной упаковке) при температуре окружающей среды ±25^оС в течении 10 дней величина показателя КОЕ/г остается неизменной, а после 2-х недель количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий снижается всего на 1-2 порядка (что вполне допускается по нормам). Таким образом, при условии средней продолжительности транспортировки продукции по территории всей России транспортными компаниями всего от 1 до 10 дней (и даже в случае непредвиденной задержки в пути), свойства продукции гарантированно останутся в пределах допустимой нормы. Данный вывод дополнительно подтверждается экспериментом от производителей аналогичной (пробиотической) продукции (см. ниже):

Из аналогии

В качестве аналогии мы предлагаем ознакомиться с документальными данными об испытании подобной продукции  микробиологического производства, а именно о данных проверки, которую проводили в отношении Бифидум №791БАГ (там есть штамм бифидобактерий лонгум, примерно, как в нашем КБЖ) - см. протокол.

Как следует из протокола ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН от 13.10 2005 г., по результатам эксперимента (хранение Бифидум №791БАГ при комнатной температуре (t +21⁰С) в течении 10 суток) начальный титр 10¹² жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов данного препарата сохранялся все 10 суток проверки. То есть даже не изменился!

Домашняя проверка

И последнее. Можно произвести проверку качества продукции самостоятельно. Активность бактериальных культур в пробиотических препаратах можно проверить в домашних условиях – сквашиванием молочного сырья - появление сгустка покажет норму. За всю историю отправок продукции ООО «Пропионикс» по России, даже при летних отправках в жаркую погоду (от +30^оС и выше) в штатной упаковке (без прямого попадания солнечных лучей), в т.ч. почтой России, наши клиенты всегда отмечали, что сквашивание молока (как альтернативный способ проверки) всегда происходило нормально в соответствии с инструкциями, размещенными на сайте нашей компании. Это показательно, т.к. в биоконцентратах нет т.н. заквасочных молочнокислых бактерий, а только пробиотические (активные бифидо- или пропионовокислые бактерии). 

Транспортировка жидких пробиотиков по России допустима вне температурного режима (установленного для длительного хранения) в штатной упаковке и в стандартные сроки, установленные транспортными компаниями.

Будьте здоровы!