Антимутагенная активность бифидобактерий и пропионовокислых бактерий

АНТИМУТАГЕННЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ПРОБИОТИКОВ

По теме см. также:

Исследование антимутагенной активности бифидобактерий

Антимутагенность пропионовокислых бактерий

Мутагены, антимутагены и пробиотики

Живущие на Земле существа подвергаются действию химических, физических и биогенных мутагенов в значительно большем масштабе, чем их предки. Широкая химизация промышленности и сельского хозяйства, все большее проникновение химических препаратов в быт, наряду с известными преимуществами, несут с собой опасность, связанную с увеличением мутационного груза в популяциях растений, животных и людей. В процессе эволюции живые существа сформировали различные приспособления, направленные на сохранение видовой и индивидуальной специфики. Важная роль в защите организма от генотоксических воздействий принадлежит покровным тканям, способности печени и других органов осуществлять специфические физиологические реакции детоксикации мутагенов и, конечно, репарации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) – главной мишени действия мутагенов.

Однако компенсаторные механизмы у живых существ, действующие против мутаций, ограничены. Поэтому один из подходов к снижению губительного действия химических мутагенов и ультрафиолетовых (УФ) – лучей на организмы является использование веществ с антимутагенными свойствами.

К настоящему времени известно более 300 соединений антимутагенов, главным образом растительного, животного происхождения, или синтезированных химическим путем.

Известно, что бактерии, эволюционно наиболее древние существа, выжившие при высоких уровнях УФ, который имел место до образования озонового слоя, и в течение более 3,5 млрд. лет подвергаются воздействию различных других мутагенных и инактивирующих факторов. Это обстоятельство предполагает, что бактерии должны обладать надежными средствами защиты для сохранения стабильности своего генома: кроме системы репарации ДНК, они могли выработать защиту путем синтеза веществ с протекторными, реактивирующими и антимутагенными свойствами.

Полученные на сегодня данные демонстрируют перспективность и актуальность изучения прокариот как источников антимутагенов

Антимутагенез - биологическое явление подавления мутационного процесса, выражающееся в снижении уровня спонтанного и индуцированного мутирования под действием природных и синтетических соединений. Антимутагенез как явление был открыт в 1952 г. благодаря работам А. Новика и Л. Сцилларда, показавшим, что пуриновые рибонуклеотиды снижают спонтанное и индуцированное мутирование у Escherichia coli. Термин «антимутаген» предложен для описания агента, снижающего число спонтанных и/или индуцированных мутаций, независимо от вовлекаемого механизма действия. Антимутагены могут быть представлены как комплексом природных веществ, содержащихся, например, в экстракте чая, в морских животных, сыворотке крови, слюне людей, так и индивидуальными соединениями, такими как спермин, аденозин, гуанозин, кофеин, акридин, марганец-, селен-, кобальт – ионы, аскорбиновая и мочевая кислота, карнизин, интерфероны, ретинол, токоферолы и многие другие.  

Антимутагены подразделяются на десмутагены, которые осуществляют химические и биохимические модификации мутагена вне клетки (до повреждения ДНК), и биоантимутагены, снижающие частоту мутаций, вовлекаясь в клеточные процессы фиксации мутаций. Десмутагены включают восстановительные агенты, антиоксиданты (например, антиоксидантные ферменты), процессы десмутагенеза могут быть связаны с энзиматическими модификациями и прямой адсорбцией мутагена. Некоторые антимутагены могут ингибировать метаболическую активацию промутагенов, проявляя опосредованное подавление мутаций. Биоантимутагены оказывают влияние на процессы репарации и репликации ДНК пораженных клеток. Причем незначительные повреждения ДНК репарируются системой эксцизионной репарации, которая осуществляется комплексом ферментов вырезания (эксцизии) поврежденных участков ДНК до ее репликации и контролируется uvrA – и uvrC – генами. Восстановление исходной структуры  ДНК  происходит  при  использовании  второй нити ДНК как матрицы.

К биоантимутагенам относят, например, соли кобальта, добавление которых к инкубационной смеси снижает высокую частоту ошибок дефектной полимеразы III у сенной палочки, а также частоту мутаций, индуцированных   N-метил-N´-нитро-N-нитрозогуанидином (МННГ) у кишечной палочки. Многие биоантимутагены, например полиамины, образующие комплексы с ДНК, стабилизируют двойную спираль ДНК.

Считается, что ежедневное употребление антимутагенов и антиканцерогенов может оказывать наибольший эффект на предотвращение рака и генетических заболеваний, а защита от мутаций может быть полезной как в ранней, так и на поздней стадии развития рака.

Больших количеств антимутагенов, по-видимому, можно ожидать в семенной жидкости, яйцах, семенах, спорах, бактериях, то есть в биологических жидкостях и структурах, предназначенных природой для появления потомства и потому обеспеченных особо надежной антимутагеной защитой для поддержания оптимального состояния генома клеток. Если речь идет о бактериях, изучение антимутагенеза важно, прежде всего, в отношении бактерий, используемых при изготовлении пищи, кормов, кормовых добавок и пробиотиков. Введение антибиотиков снижает синтез мутагенов, но сопровождается побочными реакциями. Более безопасный путь – использование кисломолочных продуктов и культур, называемых пробиотиками. К числу таких бактерий принадлежат молочнокислые, пропионовокислые, бифидобактерии и Enterococcus faecalis. Способы культивирования бактерий имеют определенные преимущества перед культивированием растений. Бактерии можно выращивать на дешевых средах за короткое время путем направленного регулирования их метаболизма.

Молочнокислые, пропионовокислые и бифидобактерии применяются в самых разнообразных традиционных процессах пищевого брожения при изготовлении молочных и  мясных продуктов, а также в производстве специфических ферментированных изделий и при силосовании кормов для животных. Антибиотик низин, образуемый Lactococcus lactis, применяют как природный консервант в сырах, в мясных, рыбных и овощных консервах.

Бифидобактерии, например, играют важную роль в жизнедеятельности макроорганизма за счет поддержания определенного значения рН в толстом кишечнике, выделения молочной, уксусной и масляной кислот, ограничивающих рост многих патогенов и гнилостных бактерий. То же можно сказать и о пропионовокислых бактериях, которые отличаются синтезом пропионовой кислоты, а также стимулируют рост самих бифидобактерий.

Антимутагенные свойства ферментированного молока и других молочных продуктов связаны главным образом с присутствием в молоке молочнокислых бактерий и других ферментирующих пробиотических микроорганизмов. Неферментированное молоко десмутагенностью не обладает, что указывает на образование антимутагенов в процессе брожения полезных бактерий.

В настоящее время изучение антимутагенности кисломолочных продуктов направлено на выявление активных штаммов, спектра их антимутагенного действия и возможных механизмов антимутагенеза. Доказано, что молоко, сброженное каждым из 71 штамма бактерий, относящихся к родам Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus и Bifidobacterium, оказывало антимутагенное действие при коинкубации с МННГ, причем наибольшая активность была обнаружена при использовании L. acidophilus LA106. 76 испытанных штаммов молочнокислых бактерий в результате ферментации молока придавали ему дезактивирующую способность также в отношении мутагенного пиролизата триптофана (Trp-P2). И снова L. acidophilus выделяется наиболее высокой ингибиторной активностью. Коинкубация 4НХО и акриламида АФ2 (канцероген, вызывает сдвиг рамки считывания ДНК) с молоком, ферментированным  L. bulgaricus и Streptococcus thermophilus приводит к утрате мутагенных свойств указанных соединений за счет восстановления их до гидроксиламинов бактериальными редуктазами в результате чего мутагенная активность указанных соединений не проявляется.

Таким образом, в качестве антимутагенного фактора могли выступать белки-ферменты. Кроме химической и энзиматической инактивации мутагенов среды, бактерии обладают и другими способами «расправы» с генотоксическими соединениями. Так, гомолактатные бактерии Lactobacillus helveticus L89 осуществляют десмутагенез в отношении 4НХО-индуцированных мутаций путем образования активного пептида в результате протеолитического расщепления казеина молока. Непротеолитический штамм антимутагеной активностью не обладает. Существенно, что L. helveticus, в отличие от L. bulgaricus, хорошо приживается в кишечнике людей и подавляет рост гнилостных бактерий, образующих канцерогены, путем снижения активности ферментов, которые участвуют в превращении промутагенов в мутагены и канцерогены. Антимутагенное действие бактерий может быть связано с подавлением активности ферментов микросомальной фракции S9.

Не только метаболиты, но и клетки пропионовокислых, молочнокислых и бифидобактерий, проявляют высокую десмутагенную активность в отношении мутагенов широкого спектра действия. Доказано, что живые клетки прочно связывают все мутагены в отличие от убитых, которые на (80-95)% связанных мутагенов освобождают при экстракции диметилсульфоксидом. Рассмотрев роль продуктов брожения в ингибировании мутагенеза, пришли к выводу, что значительное десмутагенное действие проявляет масляная кислота, уксусная кислота проявляет антимутагенное действие в отношение 3 из 8 рассмотренных мутагенов. Стоит отметить, что наиболее эффективно антимутагенную активность проявили пропионовокислые бактерии (в частности, P. shermanii – КМ 186), которые в ферментированном молоке на 70% снижали мутагенность азида натрия. Антимутагенность концентрата бифидобактерий B. longum В379М также была весьма высокой и составила 60%.

Бифидобактерии обладают способностью к детоксикации потенциальных канцерогенов и задерживают рост образовавшейся  опухоли. Введение клеток B. bifidum и их компонентов в опухоли экспериментальных животных (саркомы 180 и Lewis легочной карциномы мышей) тормозили рост опухолей. Высокой антиопухолевой активностью обладает пептидогликан, извлеченный из клеток без использования физической деструкции.

Антимутагенные свойства классических (молочных) пропионовокислых бактерий P. freudenreichii

У всех организмов есть эндогенные и экзогенные защитные механизмы. Антимутагенез – это снижение  частоты спонтанных или индуцированных мутаций. Более 200 веществ обладают свойствами десмутагенов (разрушают или нейтрализуют вещества-мутанты) и биоантимутагенов (стимулируют процессы репарации ДНК). Цистеин, например, полностью нейтрализует действие нитрозогуанидина. Пуриновые нуклеозиды – на 60-70% подавляют спонтанные мутации.

Основной механизм антимутагенеза точковых мутаций (замены, делеции, вставки пар нуклеотидов) – репарации (фотореактивация, эксцизионная репарация, пострепликативная рекомбинационная репарация, SOS-репарация).

Изучение антимутагенных свойств бактерий началось с 1986 года. До этого в этом качестве рассматривались только растения (цитрусовые). Вместе с тем в этом плане важны прокариоты, используемые в пищевых биотехнологиях и как пробиотические препараты.

В 1989 г. профессор МГУ Воробьева Л.И. с соавторами с использованием теста Эймса впервые обнаружили антимутагенность пропионовокислых бактерий против азида натрия и нитрозогуанидина (НГ) (Воробьева и др., 1990). С этого момента появилось новое перспективное направление — изучение бактериального антимутагенеза.

Экстракты клеток и культуральная жидкость P. freudenreichii обладают биоантимутагенными и десмутагенными свойствами (антиканцерогенными). В качестве мутагенов в экспериментах использовали 4-нитрохинолин, N-нитро-N-нитрозогуанидин, а также 9-аминоакридин и 2-нитрофлуорен (мутации со сдвигом рамки считывания) (Воробьева и др., 1996; Vorobjeva et al., 2000; Воробьева - и др., 2001)

Антимутагенное действие оценивалось с помощью теста Эймса по гистидиновым ревертантам Salmonella typhimirium (his^-). Факторами антимутагенеза экстрактами клеток ПКБ служат полипептиды, возможно ферменты, с различной молекулярной массой. Активность проявляли 4 фракции белков экстрактов клеток P. freudenreichii. Предполагают, что одним из активных ферментов антимутагенеза является внутри- и внеклеточная цистеинсинтаза, синтез которой индуцируется стрессом.

Низкомолекулярные полипептиды и тиолсодержащие соединения могут служить как десмутагены, так и сигнальными молекулами для процессов репарации ДНК; они также выделяются в среду (по результатам диализа, обработки протеазами и прогревания 10 мин при 92⁰С). Это свойство является пробиотически значимым.

Показано, что антимутагенная активность пропионовокислых бактерий против 4НХО и МННГ (точковые мутации) коррелирует (взаимосвязана) с накоплением в среде тиоловых соединений  (Воробьева и др., 1995; Vorobjeva, 1999). Максимальная антимутагенная активность соответствует максимальной аккумуляции в среде тиолов. Подобным, восстанавливающим свойством обладают многие серосодержащие соединения, в том числе глутатион, цистеин, цистеамин.

Коинкубация культуральной жидкости указанных бактерий с мутагенами перед внесением в среду, инокулированную сальмонеллой Salmonella typhimurium, приводит к ингибированию (торможению активности) мутагенеза на 99 и 75% в случае применения 4НХО и МННГ соответственно. При этом имеет место десмутагенез, обусловленный модификацией (конъюгацией с тиолом) 4НХО и электрофильных продуктов разложения МННГ. Штаммы P. shermanii отличаются наиболее высокой антимутагеной активностью в отношении мутагенов, вызывающих как точковые мутации, так и мутации сдвига рамки считывания (9-аминоакридин).

Дополнительно см.:

Антистрессовые и антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий

По предложенной выше ссылке представлена работа от 2004 г., выполненная на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. (АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук - Специальность 03.00.07 — микробиология, автор - Варюхина С.Ю.), посвященная изучению молочных пропионовокислых бактерий (Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii), как потенциальных источников антимутагенов. Опуская подробности работы приведем некоторые выводы по ней:

• Показана антимутагенная активность культуральной жидкости,  «живых» и «мертвых» клеток пропионовокислых бактерий (ПКБ) при изучении широкого спектра мутагенных веществ, вызывающих мутации замены пар оснований и сдвига рамки считывания у бактерий.
• Показано, что «живые» клетки ПКБ проявляют более высокий антимутагенный эффект, чем «мертвые», что не исключает участия дополнительных механизмов антимутагенеза наряду с физической сорбцией.
• Антимутагенез связан с дисмутагенной активностью бактерий, хотя не исключен механизм биоантимутагенеза.
• Установлено, что основоной ингибитор мутаций представлен относительно термоустойчивым веществом белковой природы.
• Полученные результаты демонстрируют, новые дополнительные свойства пропионовокислых бактерий как пробиотиков и как новых источников антимутагенных веществ.

ВЫВОД

Таким образом, клетки и метаболиты многих полезных бактерий проявляют высокий ингибиторный эффект в отношении мутаций, индуцированных мутагенами различного механизма действия. Бактерии как источники антимутагенов представляют несомненный интерес как профилактические пищевые добавки для активизации естественных систем репарации и для создания медицинских препаратов нового типа с антимутагенными свойствами, что, в принципе, возможно, если иметь в виду биологическую универсальность свойств ДНК.

См. также: Антиокидантные ферменты микроорганизмов

Будьте здоровы!