Кислотоустойчивость пропионовокислых бактерий

ИССЛЕДОВАНИЕ КИСЛОТНОГО СТРЕССА У ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Cохранение выживаемости пропионовокислых бактерий при низких значениях pH

В статье приведены результаты исследования устойчивости пропионовокислых бактерий к кислотному стрессу. Объект исследований выбран в связи с тем, что пропионовокислые бактерии рассматриваются как перспективные пробиотики, положительное влияние которых на здоровье человека общепризнано. Они подавляют активность патогенных микроорганизмов, образуют витамины группы В и в большом количестве витамин В12, обладают антимутагенными свойствами, обеспечивают защиту от кишечных инфекций, некоторые штаммы вызывают торможение роста раковых клеток. Установлено, что наиболее высокой устойчивостью к кислотному стрессу обладают пропионовокислые бактерии P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2. Выживаемость данного штамма через 1,5 ч инкубации при рН 2 составляет 64%, а наименее устойчивого штамма P. freudenreichii subsp. shermanii AC-2503 ‒ 36%. Высокая жизнеспособность пропионовокислых бактерий при низких значениях рН объясняется системой антиокислительной защиты, которая характеризуется реакцией толерантности к кислоте, что обеспечивает им повышенную выживаемость при низкой кислотности.

Введение

Любое стрессовое воздействие приводит к изменению функционирования бактериальной клетки. Во-первых, смена благоприятных условий на неблагоприятные вызывает переход популяции к несбалансированному росту, когда в результате изменения физико-химических условий меняются скорость реакции биохимического синтеза и, как следствие, соотношение макромолекулярных компонентов в клетках [1].

Во-вторых, сложная система, состоящая из множества сенсорных компонентов, генных регуляторных сетей, воспринимает сигналы среды и реагирует на них, запуская те или иные механизмы физиологической адаптации [2, 3]. Оба процесса в итоге приводят к тому, что множество клеток популяции сталкиваются с необходимостью выбора стратегии выживания.

Одна стратегия стрессовых ответов направлена на нейтрализацию и избежание стрессового удара. Такие ответы уникальны для каждого стресса. Стрессовые ответы такого типа называют специфическими. К ним относят голодовый, окислительный, кислотный стрессы.

Если воздействие стресса не удается избежать, то это может привести к повреждению молекул (ДНК, белки, клеточные покровы), поэтому существует вторая стратегия, направленная на предотвращение и репарацию повреждений клетки, что делает ее устойчивой не только к данному стрессу, но и к другим. Она называется глобальным стрессовым ответом. Глобальный стрессовый ответ возникает при летальных воздействиях [4, 6, 7].

Известно, что кислотность среды является важным фактором, определяющим биохимическую активность пропионовокислых бактерий. Концентрация ионов водорода в окружающей среде действует на микроорганизмы прямо (путем непосредственного воздействия Н+) или косвенно ‒ через влияние на стабильность макромолекул, равновесие электрических зарядов.

Пропионовокислые бактерии предпочитают расти в нейтральном диапазоне рН, но необходимо отметить, что эти бактерии подвергаются кислотному стрессу в желудочно-кишечном тракте. Кислотный стресс определяется как комбинированный биологический эффект низкого значения рН и слабых органических кислот, являющихся продуктами ферментации – ацетата, пропионата. Органические кислоты в своей протонированной, т.е. незаряженной форме при низких значениях рН могут диффундировать через клеточную мембрану, затем диссоциируя внутри клетки, и снижать цитозольный рН.

Следует отметить, что вопросы кислотного шока пропионовокислых бактерий изучены недостаточно и для их практического использования необходимы детальные исследования.

Материалы и методы исследования

Целью данной работы является исследование устойчивости пропионовокислых бактерий к кислотному стрессу. Экспериментальная часть исследований проводилась в лаборатории кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» ВСГУТУ.

Объектами исследований служили чистые культуры пробиотических бактерий: Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii АC 2503, P. freundenreichii subsp. freu-denreichii АC 2500, P. cyclohexanicum Kusano AC 2559, P. cyclohexanicum Kusano AC 2560, полученных из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (г. Москва); P. Freundenreichii Ш85, P. Freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2, Propionibacterium freundenreichii subsp. freudenreichii 216 II, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика», P. fredenrichii subsp. shermanii KM 186, приобретенный из коллекции проф. Л.И. Воробьевой (МГУ).

Активизировали штаммы биотехнологическим методом, разработанным в Восточно-Сибирском государственном университете технологий и управления [5].

Питательной средой для наращивания биомассы пропионовокислых бактерий служила осветленная творожная сыворотка с добавлением ростовых факторов. После наращивания биомассы кислотность среды регулировали соляной кислотой.

Количественный учет клеток пропионовокислых бактерий проводили методом предельных разведений по ТУ 10-10-02-789-192-95 на среде ГМК.

Результаты исследования и их обсуждение

Среди штаммов пропионовокислых бактерий, полученных из различных источников, был проведен скрининг с целью изучения их устойчивости к кислой реакции среды и отбора наиболее перспективных штаммов. Полученные данные представлены в таблице.

Таблица Сводные данные кислотоустойчивости пробиотических микроорганизмов

Название штамма	Контроль рН=6 (КОЕ/см³)	Опыт (рН=2) КОЕ/см³
		продолжительность (ч)
		1,5	2,5	3,5
Propionibacterium freundenreichii subsp. freudenreichii AC-2500	2х10¹¹	1х10⁷	4х10⁶	5х10⁴
P.cyclohexanicum Kusano AC-2260	1х10¹¹	3х10⁶	2х10⁶	3х10⁴
P.cyclohexanicum Kusano AC-2259	2х10¹¹	6х10⁸	1х10⁷	2х10⁵
P. freudenreichii subsp. shermanii AC-2503	4х10¹¹	1х10⁶	3х10⁴	1х10³
P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 II	1x10¹¹	2x10⁷	2x10⁶	3х10⁴
P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2	5x10¹¹	1x10⁸	3x10⁸	3х10⁴
P. freundenreichii Ш85	1х10¹¹	1х10⁸	7х10⁷	3х10⁴
P. fredenrichii subsp. shermanii KM 186	2х10¹¹	5x10⁸	3x10⁷	2x10⁴

Анализ данных таблицы 1 свидетельствует о том, что пропионовокислые бактерии достаточно устойчивы к низким значениям рН. Наиболее высокой устойчивостью обладает штамм P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2, где через 2,5 ч инкубации при рН 2 количество жизнеспособных клеток составляет 10⁸ КОЕ в 1 см³ .

Следует отметить, что у пропионовокислых бактерий P. freundenreichii Ш85 и P. fredenrichii subsp. shermanii KM 186 количество жизнеспособных клеток ниже всего на один порядок, что также свидетельствует о хорошей выживаемости данных культур в кислой среде. Дальнейшая выдержка в течение 3,5 ч приводит к гибели культур.

Выживаемость наиболее и наименее устойчивых культур пропионовокислых бактерий при воздействии кислой реакции среды представлена на рисунке.

Рисунок ‒ Выживаемость пропионовокислых бактерий при рН 2

Из рисунка видно, что с увеличением времени инкубации происходит заметное снижение количества жизнеспособных клеток. Через 1 ч инкубации при рН 2 выживаемость пропионовокислых бактерий P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2 составляет 83%, тогда как у пропионовокислых бактерий P. freudenreichii subsp. shermanii AC-2503 сохраняется 56% количества жизнеспособных клеток.

Вероятно, у пропионовокислых бактерий имеется система антиокислительной защиты, обладающая индуцибельным гомеостазом в отношении рН. Они характеризуются реакцией толерантности к кислоте (РТК), что обеспечивает им повышенную выживаемость при низкой кислотности. При низких значениях рН синтезируются белки кислотного шока, которые вовлекаются в защиту макромолекул. При этом аварийные системы рН гомеостаза стремятся поддерживать внутриклеточный рН не ниже 5,0.

Выводы

Установлено, что сохранение выживаемости на более высоком уровне наблюдается у пропионовокислых бактерий P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2, которые являются более устойчивыми к кислотному стрессу. При этом через 2,5 ч инкубации у пропионовокислых бактерий P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2 оставалось 64% жизнеспособных клеток, а выживаемость P. freudenreichii subsp. shermanii AC-2503 составила 36%.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что пропионовокислые бактерии обладают адаптивными системами к кислотному стрессу и могут выживать в желудочно-кишечном тракте человека в зонах с кислой реакцией среды.

Источник:

I.S. Khamagaeva, Dr. Sc. Engineering, Prof.; N.A. Tsyrempilova, Cand. Sc. Veterinary, PhD; I.V. Boyarineva, Cand. Sc. Engineering; L.N. Darmazhapova, Cand. Sc. Engineering

THE STUDY OF THE ACID STRESS OF THE PROPIONIC ACID BACTERIA

Вестник ВСГУТУ / 2015 / № 6

Библиография

Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Новикова Т.М. и др. Антистрессовое перекрестное действие внеклеточных метаболитов бактерий, архий и дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. ‒ 2013. - Т. 49, № 4 - С. 333‒344.
Магданова Л.А., Голясная Н.В. Гетерогенность как адаптивное свойство бактериальной популяции // Микробиология. - 2013. ‒ Т. 82, № 1. - С. 3‒13.
Бирюкова Е.Н., Аринбасарова А.Ю., Меденцев А.Г. Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к этанолу // Микробиология. - 2007. ‒ Т. 76, № 2.
Бирюкова Е.Н., Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю. и др. Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к тепловому стрессу // Микробиология. - 2007. ‒ Т. 76, № 2. - С. 184‒190.
Хамагаева И.С., Качанина Л.М., Тумурова С.М. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий: монография. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. - 172 с.
Bjedov I., Tenaillon O., Gerard B. et al. Stress – Induced mutagenesis in bacteria // Science. - Vol. 300. 5624. ‒ P. 1404‒1409.
Kivisaar M. Stationary phase mutagenesis mechanisms that accelerate adaptation of microbiai populations under environmental stress // Environ. Microbiol. ‒ 2003. ‒ Vol. 5. ‒ P. 814‒827.

См. дополнительно:

Сыр Эмменталь усиливает стрессоустойчивость пропионибактерий P. freudenreichii

Устойчивость пропионовокислых бактерий к поваренной соли

Будьте здоровы!

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ