Главная \ 1. Закваски пробиотические \ Закваски прямого внесения \ Бактериальные акваски для кисломолочки \ Биотехнология кисломолочных продуктов \ Кустарный кефир и бактерии

Кустарный кефир, кефирные зёрна и бактерии

Бактериальные популяции в международных кустарных кефирах

МИКРОБИОЛОГИЯ ДОМАШНЕГО КЕФИРА С АКЦЕНТОМ НА ГЕОГРАФИЮ

Abrar Sindi, Md. Bahadur Badsha and Gülhan Ünlü

Bacterial Populations in International Artisanal Kefirs

Microorganisms 2020, 8(9), 1318

Кефир кустарный - это традиционный кисломолочный продукт, приготовленный из кефирных зерен. Кефир документально подтвердил естественную антимикробную активность и пользу для здоровья. Типичное микробное сообщество кефира включает молочнокислые бактерии (LAB), уксуснокислые бактерии и дрожжи среди других видов в симбиотической матрице. В представленной работе секвенирование гена 16S рРНК было использовано для выявления бактериальных популяций и выяснения разнообразия и численности видов LAB в международных кустарных кефирах из Fusion Tea, Великобритании, Кавказа, Ирландии, Литвы и Южной Кореи. Бактериальные виды, обнаруженные в большом количестве в большинстве кустарных кефиров, включали Lactobacillus kefiranofaciens, Lentilactobacillus kefiri, Lactobacillus ultunensis, Lactobacillus apis, Lactobacillus gigeriorum, Gluconobacter morbifer, Acetobacter orleanensis, Acetobacter pasteurianus, Acidocella aluminiidurans и Lactobacillus helveticus. Некоторые из этих видов бактерий представляют собой LAB, о которых сообщалось из-за их способности продуцировать бактериоцины и / или способствовать укреплению здоровья.

1. Введение

Кефир кустарный - старинный кисломолочный напиток, получаемый путем ферментации молока кефирными зернами [1]. Кефирные зерна представляют собой комбинацию дрожжей, бактерий и бактериальных полисахаридов [2]. В кустарных кефирах обнаружено до 50 различных видов бактерий и дрожжей [1,3,4]. Многочисленные комбинации этих микроорганизмов на уровне видов приводят к получению домашних кефиров с уникальными характеристиками. Важно определить конкретный микробный состав кустарных кефиров и их зерен различного происхождения [5], чтобы лучше понять кефир как функциональный молочный продукт. Ранние попытки изолировать кефир-ассоциированные микроорганизмы были затруднены из-за привередливой природы этих микроорганизмов. Молочнокислые бактерии (LAB), обнаруженные в кефире, требуют определенных питательных веществ и условий для роста, поэтому некоторые LAB в кефире, возможно, были незамечены с помощью культурально-зависимых методов [6]. Культурально-независимые методы обычно используются для выявления микробного разнообразия в ферментированных пищевых продуктах и напитках. Среди этих методов секвенирование гена 16S рРНК было предложено в качестве подходящего метода для идентификации бактерий на видовом уровне [7].

Как упоминалось ранее, типичное микробное сообщество кефира включает LAB, уксуснокислые бактерии и дрожжи среди других видов в симбиотической матрице [8]. Секвенирование гена 16S рРНК было успешно использовано для идентификации видов бактерий в кефире [9,10]. Например, Gulitz et al. идентифицировали Lactobacillus nagelii (Liquorilactobacillus nagelii), Lactobacillus hordei (Liquorilactobacillus hordei), Bifidobacterium psychraerophilum, Lactobacillus hilgardii (Lentilactobacillus hilgardii), Lactobacillus satsumensis (Liquorilactobacillus satsumensis), Acetobacter orientalis, Clostridium tyrobutyricum и Leuconostoc citreum из кефира родом из Германии с использованием секвенирования гипервариабельных областей от V1 до V4 гена 16S рРНК [10]. Другое исследование выявило Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus sunkii (Lentilactobacillus sunkii) с обилием 77-78%, 10-11% и 2-4% соответственно в двух турецких зернах кефира с использованием цельногеномного и 16S рРНК дробового секвенирования [2].

Известно, что LAB производят один или несколько из следующих продуктов с противомикробными свойствами: органические кислоты, свободные жирные кислоты, диацетил, перекись водорода и бактериоцины. Бактериоцины - это белки или пептиды, синтезируемые рибосомами, которые секретируются бактериями и подавляют близкородственные грамположительные и некоторые грамотрицательные бактерии, используя различные механизмы действия [11]. Кефир содержит LAB, которые, как известно, вырабатывают бактериоцины. Например, лактицин 3147, бактериоцин, продуцируемый Lactococcus lactis DPC3147, выделенным из бразильских кефирных зерен, подавлял рост Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium и Salmonella enteritidis [12].

ФАО / ВОЗ (Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций и Всемирная организация здравоохранения) определяют пробиотики как «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью хозяина» [13]. Недавно Международная научная ассоциация пробиотиков и пребиотиков рекомендовала, чтобы «термин «пробиотик» использовался только в отношении продуктов, доставляющих живые микроорганизмы с подходящим количеством жизнеспособных четко определенных штаммов с разумным ожиданием пользы для благополучия хозяина» [14]. Кефир, который некоторые исследователи называют натуральным пробиотическим напитком [1], содержит LAB-виды с задокументированными полезными свойствами. Например, L. kefiranofaciens XL10, который представляет собой гомоферментативную LAB, продуцирующую молочную кислоту в качестве основного продукта, обладает пробиотическими свойствами как в исследованиях in vitro, так и in vivo [15,16]. Lactobacillus kefiri (Lentilactobacillus kefiri) - это гетероферментативная LAB, которая продуцирует молочную кислоту, уксусную кислоту, этанол и углекислый газ, и, как сообщалось в исследованиях in vivo и in vitro, она обладает пробиотическими свойствами, такими как адгезия к слизи, извлеченной из тонкого кишечника и толстой кишки, сильная ассимиляционная способность холестерина и снижение секреции IL-8, вызванного инфекцией Salmonella enterica [17,18].

В нашей недавно опубликованной работе [19] была исследована антимикробная активность кустарных кефирных продуктов из Fusion Tea, Великобритании, Кавказского региона, Ирландии, Литвы и Южной Кореи в отношении отдельных патогенов пищевого происхождения. Было подтверждено, что продукция бактериоцинов является основной причиной антимикробной активности этих кефиров [19]. В представленной работе секвенирование гена 16S рРНК было использовано для выявления бактериальных популяций и выяснения разнообразия и обилия видов LAB в этих международных кустарных кефирах. Другие исследователи сообщили, что некоторые виды LAB, идентифицированные в представленной работе, обладают способностью продуцировать бактериоцин и/или свойствами, способствующими укреплению здоровья. Основываясь на наших результатах, производящие бактериоцин и / или потенциально полезные LAB выделяются из избранных кустарных кефиров и исследуются в нашей лаборатории.

2. Материалы и методы

2.1. Генетические подходы к идентификации бактерий в кефире

2.1.1. Приготовление кефира

Шесть кустарных зерен кефира из Южной Кореи (K; [20]), Ирландии (I; Etsy Inc.), Литвы (L; Etsy Inc.), Великобритании (B; Etsy Inc.), Кавказа (C; Etsy Inc.), а также сборник смешанных зерен мировых производителей (A; Fusion Tea, Amazon) были использованы в этом исследовании. Зерна кефира инокулировали (10% мас. / об.) в цельное пастеризованное молоко и инкубировали при 22–24 °C в течение 24 часов. В конце процесса ферментации (pH 3,9–4,1) для отделения кефирных зерен от кефирных продуктов использовались чистые пластиковые фильтры с размером пор 1 мм. Для каждого кефирного продукта / зерен использовались специальные пластиковые фильтры, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Кефирные продукты центрифугировали (Eppendorf Microcentrifuge 5415D, Hauppauge, NY, USA) при 16000 g в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления липидного слоя. Отделенные зерна кефира трижды промывали стерилизованной деионизированной водой. Зерна кефира смешивали со стерильной деионизированной водой (3 мл), гомогенизировали с помощью Stomacher 400 (Seward Limited, Уортинг, Западный Суссекс, Великобритания) в течение 60–120 с на высокой скорости, а затем центрифугировали при 16000 g в течение 10 минут при комнатной температуре до удаления липидного слоя. Полученные гранулы использовали для экстракции ДНК.

2.1.2. Извлечение ДНК

Универсальный набор патогенов E.Z.N.A (Omega Biotech, Norcross, GA, USA) использовался для экстракции ДНК из всех международных кустарных кефиров и их зерен. В соответствии с руководством пользователя набора были проведены две дополнительные стадии промывки с включенными в комплект буферами промывки ДНК. Концентрацию препаратов ДНК определяли с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии (Spectra MAX 190). Значения поглощения 260/280 от 1,8 до 2,0 считались приемлемыми. Качество препаратов ДНК определяли, прогоняя образцы ДНК на 1,2% (мас. / об.) агарозных гелях с буфером TAE (1X) и используя погружные системы горизонтального гель-электрофореза PowerPac 200 от Bio-Rad (Геркулес, Калифорния, США). Два образца ДНК, один из которых представляет определенный кефирный продукт, а другой - зерна кефира в этом продукте, были отправлены в Omega Bioservices (Норкросс, Джорджия, США) для секвенирования гена 16S рРНК. Используя два образца ДНК, представляющих данный кустарный кефир, Omega Bioservices секвенировала в общей сложности 12 образцов ДНК, представляющих шесть международных кустарных кефиров.

Коммерческие кефиры, приготовленные из известных культур, указанных на их этикетках, были куплены в местных (Moscow, Айдахо, США) продуктовых магазинах и использовались в качестве контролей: Lifeway – «Образ жизни» (простой), The Greek Gods – «Греческие боги» (простой), Wallaby «Валлаби» (органический простой) и Maple Hill – «Кленовый холм» (органическая равнина). ДНК из коммерческих образцов кефира была извлечена Omega Bioservices с использованием их универсального набора патогенов E.Z.N.A.

2.1.3. Секвенирование гена 16S рРНК

Секвенированиена платформе Illumina MiSeq было использовано для секвенирования гена 16S рРНК (≈200K считываний на образец) компанией Omega Bioservices. Наборы праймеров V1 – V3 и V3 – V4 использовались для ПЦР-амплификации компанией Omega Bioservices. Области V1 и V2 исторически использовались для идентификации LAB [21]. Сообщалось, что все вариабельные области гена 16S рРНК эффективны для идентификации бактериальных сообществ в кефире с помощью секвенирования гена 16S рРНК [22]. Тип подготовки библиотеки - KAPA HiFi PCR согласно Omega Bioservices. Данные были доставлены через веб-сайт Illumina BaseSpace.

2.2. Анализ секвенирования гена 16S рРНК

Показания секвенирования гена 16S рРНК были получены от Omega Bioservices для областей V1 – V3 и V3 – V4. Общее количество считываний (часто называемое глубиной считывания) было преобразовано в относительное количество и округлено до 0,1%. Относительная численность в процентах была рассчитана путем деления количества считываний для каждого типа, рода или вида на общее количество считываний для каждого кефира и умножения результата на 100. Круговые диаграммы были созданы для относительного количества видов бактерий в кефирных продуктах и их зерна, основанные на областях V1 – V3 и V3 – V4 генов 16S рРНК. На основе участков V1 – V3 и V3 – V4 генов 16S рРНК в кефирных продуктах и их зернах были созданы многослойные гистограммы для средней численности 21 наиболее распространенного рода бактерий. Дополнительные столбчатые диаграммы с накоплением были созданы для средней относительной численности 10 наиболее распространенных видов бактерий на основе максимального процента между областями V1 – V3 и V3 – V4 генов 16S рРНК и масштабирования (0–100) вклада видов. Также были созданы многослойные гистограммы для процентного вклада видов LAB, обнаруженных в образцах кефира и известных как продуцирующие бактериоцины, на основе максимального процента между областями V1 – V3 и V3 – V4 генов 16S рРНК и масштабирования (0– 40) видового вклада. Канонические корреляции были выполнены с использованием агрегированных списков таксонов для изучения взаимосвязи между кефирными продуктами и их зернами. Чтобы понять, насколько сильно связаны кефирные продукты и их зерна, были использованы графики корреляции. Коэффициент корреляции Пирсона (r) дает информацию о силе и направлении взаимосвязи между данным кефирным продуктом и его зернами. Линия регрессии описывает, как изменяются кефирные продукты при изменении кефирных зерен. Тепловые карты были созданы с использованием корреляций Пирсона между кефирными продуктами и их зернами. Результаты иерархической кластеризации (HC) с использованием метода полного расстояния между сцеплениями, представленные дендрограммой, были включены, чтобы показать таксономические отношения между международными кустарными кефирами. Коэффициенты корреляции Пирсона, линии регрессии и дендрограмма были созданы с помощью программирования R-3.5.1 (R Studio Inc., Бостон, Массачусетс, США).

3. Результаты

3.1. Генетические подходы к идентификации бактерий в образцах кефира

3.1.1. Бактериальные типы и роды в кустарных кефирах и их зернах

Основываясь на данных секвенирования 16S рРНК, полученных в этой работе, было определено, что в кустарных кефирных продуктах и их зернах присутствуют различные группы бактерий из разных регионов мира. В частности, относительное количество типов бактерий и родов бактерий на основе областей V1 – V3 и V3 – V4 генов 16S рРНК было определено для кефирного продукта из Литвы (LP), кефирных зерен из Литвы (LG), кефирного продукта из Южная Корея (KP), кефирных зерен из Южной Кореи (KG), кефирного продукта из Ирландии (IP), кефирных зерен из Ирландии (IG), кефирного продукта из Кавказского региона (CP), кефирных зерен из Кавказского региона (CG), кефирного продукта из Великобритании (BP), кефирных зерен из Великобритании (BG), кефирного продукта из Fusion Tea (AP, Amazon) и кефирных зерен из Fusion Tea (AG, Amazon) (рис. 1). Тип Firmicutes был самым распространенным среди всех кустарных кефирных продуктов, за ним следовали типы Proteobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes и Nitrospirae (рис. 1). Тип Firmicutes был наиболее распространенным типом у кефирных зерен, особенно для CG, с 97,9% (на основе V1 – V3) и 97,7% (на основе V3 – V4) (рис. 1), за ним следовали BG, LG, AG, KG и IG для областей V1 – V3 (Рисунок 1). Судя по регионам V3 – V4, Firmicutes был самым распространенным типом в CG, за ним следовали LG, BG, AG, KG и IG (Рисунок 1). Следующие роды были определены в качестве основных родов кустарных кефиров: Lactobacillus, Lentilactobacillus, Lacticaseibacillus, Acetobacter, Swaminathania, Gluconobacter, Streptococcus, Pediococcus, Pseudomonas, Acidocella, Cohnulphinella, Pseudomonas, Acidocella, Cohnulphinella, Pepshoraphishoraphilus, Bifidobacterium и Lactococcus (рис. 1).

Рис. 1. Относительное количество типов бактерий (круговые диаграммы) и агрегирование 21 наиболее распространенного рода бактерий (столбчатые диаграммы) для областей V1 – V3 (A) и V3 – V4 (B) генов 16S рРНК. Кефирный продукт из Литвы (LP), кефирные зерна из Литвы (LG), кефирный продукт из Южной Кореи (KP), кефирные зерна из Южной Кореи (KG), кефирный продукт из Ирландии (IP), кефирные зерна из Ирландии (IG), кефирный продукт из Кавказского региона (CP), кефирные зерна из Кавказского региона (CG), кефирный продукт из Великобритании (BP), кефирные зерна из Великобритании (BG), кефирный продукт из Fusion Tea (AP, Amazon), кефирные зерна из Fusion Tea (AP, Amazon).

Секвенирование гена 16S рРНК, нацеленного на области V1 – V3 и V3 – V4, привело к различным процентным соотношениям относительной численности для обозначений на уровне типа и рода во всех кустарных кефирах (рис. 1). Например, у LP Firmicutes составляет 67% на основе региона V1 – V3, тогда как у него 64,6% Firmicutes на основе региона V3 – V4. IP имеет 65,6% и 69,7% Firmicutes на основе регионов V1 – V3 и V3 – V4 соответственно. AP имеет самую высокую относительную численность для видов Lactobacillus, от 75% (на основе V1 – V3) до 75,5% (на основе V3 – V4), в то время как LP имеет самую низкую численность для видов Lactobacillus от 61,6% (на основе V3 – V4) до 64,2% (на основе V1 – V3). Было обнаружено, что род Lentilactobacillus находится в самом высоком обилии в IG, от 7,7% (на основе V1–V3) до 7,4% (на основе V3–V3), по сравнению со всеми другими кефирными зернами и продуктами. По–видимому, комбинация областей V1–V3 и V3-V4 для идентификации бактерий на уровне типа и рода в кефирных продуктах и их зернах работала хорошо. В качестве исключения область V3 – V4 идентифицировала род Swaminathania во всех кефирных продуктах и во всех кефирных зернах (рис. 1B), тогда как область V1 – V3 не была идентифицирована (рис. 1A).

Имеются коммерческие кефиры, приготовленные с использованием закваски LAB и видов дрожжей, как указано на упаковке. Поэтому секвенирование гена 16S рРНК проводили на коммерческих кефирах в качестве контролей для проверки точности идентификации. Было установлено, что коммерческие кефиры, используемые в исследовании, содержат точные пробиотические бактерии, как на уровне рода, так и на уровне видов, как указано на их этикетках (Рисунок S1).

3.1.2. Виды бактерий, присутствующие в кустарных кефирах и их зернах

К 10 наиболее многочисленным видам бактерий, обнаруживаемых в кустарных кефирах, относятся L. kefiranofaciens, Lentilactobacillus kefiri, Lactobacillus ultunensis, Lactobacillus apis, Lactobacillus gigeriorum, Gluconobacter morbifer, Acetobacter orleanensis, Acetobacter pasteurianus, Acidocella aluminiidurans и Lactobacillus helveticus (рис. 2). L. kefiranofaciens был определен как самая многочисленная бактерия во всех кустарных кефирах с относительной численностью от 48,22% до 93,76% (Рисунок 2). Относительное обилие Lentilactobacillus kefiri варьировалось от 2,94% (KP) до 7,3% (AP) среди кефирных продуктов и от 3,7% (AG) до 7,86% (IG) среди кефирных зерен (рисунок 2). Было обнаружено, что L. ultunensis более богаты KP и KG по сравнению со всеми другими кустарными кефирами и их зернами. A. pasteurianus было больше (17,1%) в KP, а G. morbifer было больше (5,8%) в LP по сравнению с их относительной численностью во всех других кустарных кефирах.

Рис. 2. Агрегация 10 наиболее распространенных видов бактерий с использованием рассчитанной относительной численности и масштабного (0–100) вклада видов. Кефирный продукт из Литвы (LP), кефирные зерна из Литвы (LG), кефирный продукт из Южной Кореи (KP), кефирные зерна из Южной Кореи (KG), кефирный продукт из Ирландии (IP), кефирные зерна из Ирландии (IG), кефирный продукт из Кавказского региона (CP), кефирные зерна из Кавказского региона (CG), кефирный продукт из Великобритании (BP), кефирные зерна из Великобритании (BG), кефирный продукт из Fusion Tea (AP, Amazon), кефирные зерна из Fusion Tea (AP, Amazon).

Существуют различия в кустарных кефирах относительно микроорганизмов, присутствующих в кефирных продуктах, и их зернах. Например, L. kefiranofaciens демонстрирует более высокое относительное содержание во всех зернах кефира по сравнению с их соответствующими продуктами (рис. 2). Аналогично Lent. kefiri имеет более высокое относительное содержание в зернах кефира B, I, K и L по сравнению с их соответствующими продуктами (рис. 2). С другой стороны, Lent. kefiriпоказывает более низкое относительное содержание (3%) в AG по сравнению с (6%) в AP (рис. 2).

3.1.3. Бактериоциногенные и полезные бактерии в кустарных кефирах

Несколько видов LAB, признанных продуцентами бактериоцина в текущей литературе, были идентифицированы во всех кустарных кефирах, подвергнутых этой работе, хотя и в различной относительной численности (Рисунок 3). В кустарных кефирах обнаружены следующие бактериоциногенные виды: Lent. kefiri, L. helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei), Lacticaseibacillus casei (Lactobacillus casei), Lacticaseibacillus rhamnosus (Lactobacillus rhamnosus), L. apis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, and Lactococcus lactis (Рисунок 3). Было установлено, что все кустарные кефиры, кроме кефира К, содержат Lent. kefiri как наиболее распространенную LAB с известной способностью продуцировать бактериоцин. Lent. kefiri был третьим видом по распространенности LAB с известной продукцией бактериоцина в кефире K (Рисунок 3).

Рисунок 3. Результаты секвенирования гена 16S рРНК, показывающие процентный видовой вклад молочнокислых бактерий (LAB). IP и IG находятся на одном уровне с CP: L. apis, L. helveticus, L. acidophilus и L. crispatus. CG разделяет с IP, IG и CP один и тот же рейтинг только для L. crispatus и L. acidophilus. LG имеет самую высокую относительную численность S. thermophilus и самую низкую относительную численность L. helveticus по сравнению с LP, а также другими кустарными кефирами.

Кефир К был самостоятельным кефирным продуктом в соответствии с рейтингом видов с известным производством бактериоцина: L. helveticus, L. crispatus, Lent. kefiri, L. apis и L. acidophilus. Самыми многочисленными LAB с известной способностью продуцировать бактериоцин были L. helveticus в KP с относительной численностью 21,8% и в KG с относительной численностью 17,8% (рис. 3). L. helveticus был обнаружен в других кефирных продуктах кустарного производства с относительным содержанием от 0,26% (BP) до 4,11% (CP) и в зернах домашнего (кустарного) кефира с относительным содержанием от 0,13% (LG) до 3,34% (IG).

Lactobacillus crispatus, другой вид Lactobacillus с известной продукцией бактериоцина, последовал за L. helveticus в KP и KG с относительной численностью 3,44% и 2,93% соответственно (рис. 3). Относительное содержание L. crispatus в других кефирных продуктах кустарного производства и кефирных зернах варьировалось от 0,07% (BP) до 0,6% (CP) и от 0,045% (BG) до 0,51% (IG), соответственно.

Было установлено, что Lactobacillus apis, менее известный вид Lactobacillus, обладающий способностью продуцировать бактериоцин, присутствует во всех кефирных продуктах местного производства и их зернах. Относительное содержание L. apis находилось в диапазоне от 1,79% (LP) до 2,17% (IP) в кефирных продуктах и от 2,21% (CG) до 2,54% (AG) в кефирных зернах (Рисунок 3). Было установлено, что L. apis занимает второе и третье место по относительной численности среди других бактериоцин-продуцирующих LAB в кефирных продуктах A, B, I и L и кефирном продукте C соответственно (рис. 3). Этот организм занял второе место по численности среди других бактериоцин-продуцирующих LAB в кефирных зернах A, B, C, L, в то время как рейтинг был третьим по численности в зерне кефира I и четвертым по содержанию в кефире K (Рисунок 3).

Lactobacillus acidophilus, организм, по имеющимся данным, способный продуцировать бактериоцин, занял пятое место среди наиболее распространенных бактериоциногенных видов LAB во всех кустарных кефирных продуктах. L. acidophilus присутствовал в KP с относительной численностью 0,7% и в KG с относительной численностью 0,5% (рис. 3). Все другие кустарные кефиры (A, B, C, I и L), как продукты, так и их зерна, были определены как содержащие гораздо меньше L. acidophilus с относительным содержанием 0,01–0,1% (рис. 3).

Некоторые виды LAB с известной способностью продуцировать бактериоцин отсутствовали в некоторых кефирных продуктах и их зернах (рис. 3): S. thermophilus в кефире A; L. delbrueckii в кефире А; Lacti. paracasei в кефирах А и Б; Lacti. casei в кефирах A, B, C, I и K; Lacti. rhamnosus в кефире К; Lac. lactis в кефирах B, C и K; и Leu. mesenteroides в кефирах A, B, I и L. Lacti. casei, хотя и в небольшом относительном количестве, присутствует только в зернах кефира L (рис. 3).

3.1.4. Корреляция кустарных кефирных продуктов с их зерном и таксономические отношения между международными кустарными кефирами

Зерна кефира показали высокую корреляцию с их продуктами по содержанию видов (рис. 4A – C). Кефир А показал самую высокую корреляцию между зерном и продуктом (r = 0,994), за ним следуют кефиры I, C, B и L со следующими значениями r, соответственно: r = 0,986, 0,986, 0,981 и 0,976. Самая низкая корреляция наблюдалась для кефира К (r = 0,948) (Рисунок 4B). Созданная тепловая карта (Рисунок 4C) подтвердила, что KG и KP имеют самую низкую корреляцию друг с другом и самую низкую корреляцию со всеми другими кефирами (Рисунок 4C). С другой стороны, AP, по-видимому, имел самую высокую корреляцию со всеми зернами кефира (r = 1), за исключением KG. AG не сильно коррелировал с другими кефирными продуктами (рис. 4С).

Рисунок 4. (A) График канонической корреляции с линией регрессии между всеми зернами кефира (ось x для каждого графика) из Литвы (LG) и Южной Кореи (KG), Ирландии (IG), Кавказского региона (CG), Великобритании (BG) и Fusion Tea (AG, Amazon), а также всеми кефирными продуктами (ось Y для каждого участка) из Литвы (LP) и Южной Кореи (KP), Ирландии (IP), Кавказского региона (CP), Великобритании. (BP) и Fusion Tea (AP, Amazon) на уровне видов. (B) Графики корреляции с линией регрессии между каждым кефирным зерном и его продуктами. R указывает коэффициент корреляции Пирсона для каждого графика. (C) Тепловая карта, показывающая корреляцию Пирсона между каждым зерном кефира и их продуктами.

Дендрограмма иерархической кластеризации (HC) (Рисунок 5) показывает таксономические отношения между международными кустарными кефирами. KP, по-видимому, представляет собой отдельный кефирный продукт с точки зрения таксономии на уровне видов. KP имеет свой собственный самый высокий кластер, в то время как AP является кефиром, наиболее связанным с KP по сравнению со всеми другими кефирными продуктами. Кроме того, IP и CP связаны с таксономией на уровне вида, как LP и BP, которые также связаны друг с другом (Рисунок 5).

Рисунок 5. Дендрограмма на основе иерархической кластеризации (HC), показывающая таксономическое родство на уровне видов для всех кефирных продуктов (ось X) из Литвы (LP) и Южной Кореи (KP), Ирландии (IP), Кавказского региона (CP), Великобритании. (BP) и Fusion Tea (AP, Amazon). Метод полной связи используется для вычисления расстояния между кластерами для определения сходных кластеров.

4. Дискуссия

В представленной работе секвенирование гена 16S рРНК было успешно применено к шести международным кустарным кефирам и выявило микробные популяции на уровне типов, родов и видов в международных кустарных кефирах. Всего было идентифицировано шесть типов: Firmicutes Proteobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes и Nitrospirae в изученных кустарных кефирах. Насколько нам известно, ни для одного кустарного кефира не сообщалось о наличии комбинации шести типов. Это могло быть связано со сложностью кустарных кефиров, исследованных в нашей работе, и / или с эффективностью секвенирования гена 16S рРНК и анализа последовательностей. Тип Firmicutes был самым распространенным типом среди всех других типов кефирных зерен и продуктов из них, которые обычно встречаются в кустарном кефире. Lactobacillus был самым многочисленным родом с самой высокой относительной численностью AG и самой низкой относительной численностью IP. Это хорошо согласуется с относительной численностью лактобацилл в кустарных кефирах, описанной в литературе. Род Lactobacillus недавно был переклассифицирован в 25 новых родов, включая Lactobacillus, Lentilactobacillus и Lacticaseibacillus [23]. Эта реклассификация была полностью учтена в нашей работе.

Наша цель состояла в том, чтобы использовать несколько вариабельных областей гена 16S рРНК для успешной идентификации всех родов и видов, присутствующих в международных кустарных кефирах. Одним из интересных результатов нашего исследования была идентификация рода Swaminathania с использованием области V3 – V4 гена 16S рРНК, но не с помощью области V1 – V3. Поскольку секвенирование гена 16S рРНК четырех коммерческих кефиров, используемых в качестве контролей для проверки точности идентификации, определило точные пробиотические бактерии, указанные на их этикетках на уровне видов, мы уверены в результатах секвенирования гена 16S рРНК. Интересный результат можно объяснить тем фактом, что различные вариабельные области в гене 16S рРНК могут быть менее или более подходящими для идентификации бактерий на уровне рода или вида. Возможно, область V1 – V3 менее подходит для идентификации рода Swaminathania, чем область V3 – V4.

Исследование Marsh et al. для кефиров, полученных из Великобритании, Канады и США, сообщили, что считывание 16S рРНК для области V4 – V5 выявило три бактериальных типа: Actinobacteria, Firmicutes и Proteobacteria [24]. Как Proteobacteria, так и Firmicutes были подтверждены как самые распространенные типы. Тип Proteobacteria в целом был больше в зернах, чем в продуктах для всех исследованных кефиров. Тип Firmicutes был в большем количестве в продукте, чем в зернах. Обилие актинобактерий в целом было низким как в зерне, так и в продуктах. Marsh et al. обнаружили, что наиболее доминирующим родом был Zymomonas с относительной численностью 87–49%, за ним следуют Lactobacillus с относительной численностью от 38,8% до 12% [24]. Различия, наблюдаемые между нашей работой и работой Marsh et al. можно объяснить различиями между используемыми кефирами и областями, на которые было направлено секвенирование 16S рРНК.

Lentilactobacillus kefiranofaciens была самой распространенной лактобациллой среди всех кустарных кефиров. Наши результаты совпадают с данными Wang et al., которые сообщили о L. kefiranofaciens как единственном доминирующем и стабильном виде в тибетском кефире [25]. Сообщалось, что L. kefiranofaciens обладает пробиотическими свойствами полезными для здоровья [26,27]. Исследование с использованием компонентов как in vivo, так и in vitro показало, что L. kefiranofaciens M1 может применяться в ферментированных молочных продуктах в качестве альтернативной терапии кишечных расстройств [26]. Увеличение продукции регуляторных Т-клеточных цитокинов наблюдалось, когда L. kefiranofaciens M1 культивировали совместно с клетками селезенки [27].

Среди других очень распространенных видов бактерий, идентифицированных в кустарных кефирах в представленной работе, были следующие организмы: Lenti. kefiri, L. ultunensis, L. apis, L. gigeriorum, G. morbifer, A. orleanensis, A. pasteurianus, Acid. aluminiidurans и L. helveticus. Из них L. ultunensis и L. apis, как сообщалось, присутствовали в зернах кефира из разных регионов Турции [28]. На основании наших знаний о L. gigeriorum не сообщалось о кефире до представленной работы, однако сообщалось, что этот организм был тесно связан с L. acidophilus [29]. Кроме того, наша работа является первым исследованием, в котором сообщается о наличии Acidocella aluminiidurans в кефире. Acidocella aluminiidurans - это толерантная к алюминию, кислотам и сульфатам бактерия, первоначально выделенная из водорослей во Вьетнаме [30].

Lentilactobacillus kefiri был обнаружен в более высоком относительном количестве в зернах кефира B, I, K и L по сравнению с их соответствующими продуктами. Возможно, Lenti. kefir внедряется во внешние слои кефирных зерен А и во время кефирного брожения попадает в кефирный продукт больше, чем в кефир B, I, K и L. Исследование Korsak et al. оценили микробиоту образцов кефира из Бельгии с помощью пиросеквенирования 16S и выявили присутствие L. kefiranofaciens, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Gluconobacter frateurii, Lenti. kefiri, A. orientalis, Leu. mesenteroides и Acetobacter lovaniensis [31]. В этом исследовании некоторые образцы показали, что L. kefiranofaciens наиболее многочисленны - как и в нашей работе, - в то время как другие образцы показали Lac. lactis как самую многочисленную, составляющую ≈80% бактериальной популяции. Korsak et al. [31] не сообщали о встречаемости в образцах L. ultunensis, L. apis, L. gigeriorum, G. morbifer, A. orleanensis, A. pasteurianus, Acid. aluminiidurans и L. helveticus, о которых сообщается в представленном исследовании. Как и ожидалось, между международными кустарными кефирами существуют сходства и различия в отношении их бактериальных популяций на уровне видов.

Сообщалось, что уксуснокислые бактерии способствуют образованию экзополисахаридов и увеличению биомассы кефирного зерна, не оказывая отрицательного воздействия на сенсорные свойства и другую микрофлору кефира [32]. Acetobacter fabarum, A. lovaniensis и A. orientalis были обнаружены в кефире итальянского происхождения [33]. A. orleanensis, A. orientalis, Acetobacter malorum и A. pasteurianus были обнаружены во всех кустарных кефирах в представленной работе. Следовательно, похоже, что разные виды уксуснокислых бактерий занимают разные кустарные кефиры. Род Gluconobacter является членом семейства уксуснокислых бактерий. Исследования показали симбиотическую связь между LAB, выделенными из кефира, и Gluconobacter spp. [34]. G. frateuii был обнаружен в кефире из Бельгии [31]. G. morbifer и Gluconobacter kondonii были обнаружены во всех кустарных кефирах, исследованных в представленной работе.

Сообщается, что кефир является напитком, способствующим укреплению здоровья. Многочисленные исследования показали, что кефир полезен для здоровья с точки зрения улучшения переваривания лактозы [35], защиты от патогенов пищевого происхождения, противоракового действия [36], иммуномодулирующего действия [37] и пробиотической активности [5]. Эти преимущества для здоровья, по-видимому, связаны с микробиотой кефира и / или их метаболитами [5].

Потенциальные пробиотики должны проявлять функциональные свойства, такие как жизнеспособность и устойчивость в желудочно-кишечном тракте, иммуномодуляция, антагонистические и антимутагенные свойства [38]. Антагонистические способности пробиотиков включают агрегацию и коагрегацию, адгезию к кишечнику, ингибирование адгезии патогенных бактерий к кишечнику, а также выработку антимикробных веществ, таких как бактериоцины [39]. Сообщалось о появлении LAB с пробиотическим потенциалом в кефире. L. acidophilus LA15, Lactobacillus plantarum (Lactiplantibacillus plantarum) и L. kefiri (Lentilactobacillus kefiri) D17, выделенные из тибетского кефира, были предложены в качестве полезных пробиотиков [17]. Сообщается, что L. rhamnosus (Lacticaseibacillus rhamnosus) является пробиотическим организмом, обнаруженным в кефире [40]. L. paracasei (Lacticaseibacillus paracasei) MRS59 проявляет значительную антиоксидантную активность и адгезию к клеткам Caco-2, что указывает на его пробиотический потенциал [41]. L. kefiranofaciens 8U, Lactobacillus diolivorans (Lentilactobacillus diolivorans) 1Z и L. casei (Lacticaseibacillus casei) 17U, выделенные из бразильского кефира, были описаны как потенциальные пробиотики [5]. Кроме того, 11 Lac. lactis, выделенные из бразильского кефира, показали пробиотические свойства, такие как антагонистическая активность и антиоксидантная активность [41]. Сообщается, что L. acidophilus Z1L, L. helveticus Z5L и L. casei (Lacticaseibacillus casei) Z7L, выделенные из турецких домашних кефиров, обладают пробиотической активностью [42]. L. helveticus был обнаружен во всех кустарных кефирах в представленной работе. Наши результаты показали, что L. helveticus в кефирном продукте К и зернах кефира К было в 5–84 раза и в 5–137 раз больше, чем в других кустарных кефирах и кустарных зернах кефира, соответственно. В этом исследовании сообщалось, что все бактерии, обнаруженные в кефире с известной способностью продуцировать бактериоцин, обладают полезными свойствами, за исключением L. apis. Насколько нам известно, L. apis не упоминается как полезная бактерия. L. plantarum Lp27, выделенный из тибетского кефира, проявлял эффективную способность снижать уровень холестерина [43]. L. plantarum не был обнаружен ни в каких кефирных зернах или продуктах в текущем исследовании.

Секвенирование гена 16S рРНК, описанное в представленной работе, позволило нам определить LAB, которые могут быть ответственны за продукцию бактериоцинов, которые были связаны с ингибированием патогенных бактерий пищевого происхождения в нашем ранее опубликованном исследовании [19]. Lenti. kefiri - это бактерия, выделенная из кефира и показывающая, что она подавляет как грамм (+), так и грамм (-) патогены [44,45]. Lenti. kefiri была второй по численности лактобациллой среди всех кустарных кефиров, кроме кефира K. В тайваньских кефирных зернах, Lenti. kefiri была определена как самый распространенный вид Lactobacillus [46,47]. L. helveticus, вид, который, как известно, продуцирует бактериоцины, оказался наиболее многочисленными лактобациллами в кефире К. Сообщалось, что эта бактерия вырабатывает термолабильные пептиды с большой молекулярной массой (> 30 кДа) лизостафин, энтеролизин А и гельветицин J с антимикробным действием [48,49]. L. acidophilus, как сообщается, влияет на проницаемость мембран и формирование клеточных стенок своих организмов-мишеней, продуцируя пептиды ацидоцина B, энтереоцина P и реутерина 6 [50,51]. L. crispatus, как сообщалось в исследованиях in vivo и в клинических исследованиях, обладал антимикробной активностью против бактериального вагиноза и уропатогенной Escherichia coli [52,53]. В представленной работе было обнаружено, что L. crispatus в 5,7–49 раз и в 5,7–65 раз больше в KP и KG, соответственно, по сравнению с другими продуктами из домашнего кефира и их зернами. Leu. mesenteroides в нашей работе была обнаружена в кефирах К и С. Сообщалось, что этот организм вырабатывает лейкоциклицин Q, новый циклический бактериоцин, который проявляет антимикробную активность против грамположительных бактерий, таких как Bacillus coagulans [54]. Lacti. casei, которая была обнаружена только в кефире L в представленной работе, быал эффективна против Lis. monocytogenes, Listeria innocua, Corynebacterium difterium и Bacillus cereus. Lacti. rhamnosus была обнаружена в небольшом количестве в кефире C, I и L. Сообщалось, что этот микроорганизм подавляет Staphylococcus aureus, Lis. monocytogenes, Lis. innocua, C. diphtheriae и B. cereus [55].

Исследовательский проект, посвященный микробному разнообразию зерен тибетского кефира различного происхождения, не обнаружил Lac. lactis в кефирных зернах, но в нашел в кефирных продуктах [56,57]. Другое опубликованное исследование показало, что Lac. lactis и S. thermophilus были доминирующими микроорганизмами, составляя 53–65% от общей микрофлоры зерен тибетского кефира и составляя 74–86% от общей микрофлоры кефирных продуктов [58]. Кефиры кустарного производства, испытанные в нашей работе, демонстрируют очень низкое относительное содержание этих организмов, и поэтому они не похожи на тибетский кефир с преобладанием Lac. lactis и S. thermophilus. Различия в распределении бактерий в кефирных продуктах по сравнению с их зернами могут быть связаны с повышением температуры, вызванным активным брожением, или наличием этих бактерий в кефирном зерне [4] среди других факторов.

Поскольку кефир А представляет собой смесь зерен из разных географических регионов, неудивительно, что он родственен кефиру К и всем другим кефирам в таксономии на уровне видов. Интересным результатом для таксономии на уровне видов является то, что ирландский кефир не имеет близкого родства с британским кефиром - хотя Ирландия географически близка к Великобритании - но родственен кефиру с Кавказа. Установлено, что британский кефир тесно связан с литовским кефиром. С другой стороны, кефир К, по-видимому, является самым уникальным кефиром с точки зрения его таксономии на уровне видов и его состава, состоящего из LAB, которые, как сообщается, производят бактериоцины. В нашей предыдущей работе [19] кефир К проявлял антимикробную активность в отношении разнообразной группы патогенных индикаторов пищевого происхождения. Благодаря высокой антимикробной активности кефира К и его уникальной таксономии на уровне видов, наша цель состоит в том, чтобы провести дополнительные исследования кефира К с акцентом на выделение и характеристику LAB и их бактериоцинов, а также наприменение этих бактериоцинов в качестве природных биоконсервантов для защиты срока годности и обеспечения микробиологической безопасности пищевых продуктов.

5. Выводы

Географическое происхождение кефирных зерен и методы производства кефира влияют на микробный состав кустарных кефиров. Типы молока, температура инкубации, время инкубации и соотношение зерен кефира и молока играют важную роль в микробном составе кефира [1,59,60]. Было показано, что для зерен кефира характерны региональные различия в микробном составе, отчасти из-за того, что местные LAB находят нишу в зернах [6]. Независимый от культуры метод, использованный в нашей работе, секвенирование гена 16S рРНК, успешно выявил микробные популяции в шести международных кустарных кефирах и продемонстрировал разнообразие и обилие LAB, обнаруженных в каждом протестированном кефире, многие из которых, как сообщается, обладают способностью продуцировать бактериоцины и потенциальными преимуществами для здоровья. В большинстве кустарных кефиров обнаружено большое относительное изобилие видов, включая L. kefiranofaciens, Lenti. kefiri, L. ultunensis, L. apis, L. gigeriorum, G. morbifer, A. orleanensis, A. pasteurianus, Acid. aluminiidurans и L. helveticus. LAB с документально подтвержденными возможностями производства бактериоцина, Strep. thermophilus, Lenti. kefiri, L. helveticus, L. delbrueckii, Lacti. paracasei, Lacti. casei, Lacti. rhamnosus, L. crispatus, Leu. mesenteroides, L. acidophilus и Lac. lactis, были обнаружены в различных относительных количествах в кустарных кефирах, исследованных в этом исследовании. Виды LAB с документально подтвержденной пользой для здоровья в литературе и идентифицированные в кустарных кефирах, испытанных в этой работе, были Lenti. kefiri, L. helveticus, L. delbrueckii, Lacti. paracasei, Lacti. casei, Lacti. rhamnosus, L. crispatus, L. acidophilus, S. thermophilus, Leu. mesenteroides и Lac. lactis.

См. дополнительно: Получение биокефира

Литература

Nejati, F.; Junne, S.; Neubauer, P. A Big World in Small Grain: A Review of Natural Milk Kefir Starters. Microorganisms 2020, 8, 192. [Google Scholar] [CrossRef]
Nalbantoglu, U.; Cakar, A.; Dogan, H.; Abaci, N.; Ustek, D.; Sayood, K.; Can, H. Metagenomic analysis of the microbial community in kefir grains. Food Microbiol. 2014, 41, 42–51. [Google Scholar] [CrossRef]
Prado, M.R.; Blandón, L.M.; Vandenberghe, L.P.; Rodrigues, C.; Castro, G.R.; Thomaz-Soccol, V.; Soccol, C.R. Milk kefir: Composition, microbial cultures, biological activities, and related products. Front. Microbiol. 2015, 6, 1177. [Google Scholar] [CrossRef]
Bourrie, B.C.; Willing, B.P.; Cotter, P.D. The Microbiota and Health Promoting Characteristics of the Fermented Beverage Kefir. Front. Microbiol. 2016, 7, 647. [Google Scholar] [CrossRef]
Zanirati, D.F.; Abatemarco, M., Jr.; Sandes, S.H.C.; Nicoli, J.R.; Nunes, Á.C.; Neumann, E. Selection of lactic acid bacteria from Brazilian kefir grains for potential use as starter or probiotic cultures. Anaerobe 2015, 32, 70–76. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Nielsen, B.; Gurakan, G.C.; Unlu, G. Kefir: A multifaceted fermented dairy product. Probiotics Antimicrob. Proteins 2014, 6, 123–135. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Delfederico, L.; Hollmann, A.; Martínez, M.; Iglesias, N.G.; De Antoni, G.; Semorile, L. Molecular identification and typing of lactobacilli isolated from kefir grains. J. Dairy Res. 2006, 73, 20–27. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Neve, H.; Heller, K.J. The microflora of water kefir: A glance by scanning electron microscopy. Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 2002, 54, 337–349. [Google Scholar]
Dobson, A.; O’Sullivan, O.; Cotter, P.D.; Ross, P.; Hill, C. High-throughput sequence-based analysis of the bacterial composition of kefir and an associated kefir grain. FEMS Microbiol. Lett. 2011, 320, 56–62. [Google Scholar] [CrossRef]
Gulitz, A.; Stadie, J.; Wenning, M.; Ehrmann, M.A.; Vogel, R.F. The microbial diversity of water kefir. Int. J. Food Microbiol. 2011, 151, 284–288. [Google Scholar] [CrossRef]
Montville, T.J.; Matthews, K.R.; Kniel, K.E. Food Microbiology an Introduction, 3rd ed.; ASM Press: Washington, DC, USA, 2012. [Google Scholar]
da C. P. Miguel, M.G.; Cardoso, P.G.; Magalhães, K.T. Profile of microbial communities present in tibico (sugary kefir) grains from different Brazilian States. World J. Microbiol. Biotechnol. 2011, 27, 1875–1884. [Google Scholar] [CrossRef]
FAO/WHO. Evaluation of Health and Nutritional Properties of Powder Milk and Live Lactic Acid Bacteria; FAO/WHO: Córdoba, Argentina, 2001; pp. 1–4. [Google Scholar]
Hill, C.; Guarner, F.; Reid, G.; Gibson, G.R.; Merenstein, D.J.; Pot, B.; Morelli, L.; Berni Canani, R.; Flint, H.J.; Salminen, S.; et al. Expert consensus document. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2014, 11, 506–514. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Yamane, T.; Sakamoto, T.; Nakagaki, T.; Nakano, Y. Lactic Acid Bacteria from Kefir Increase Cytotoxicity of Natural Killer Cells to Tumor Cells. Foods 2018, 7, 48. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Xing, Z.; Tang, W.; Geng, W.; Zheng, Y.; Wang, Y. In vitro and in vivo evaluation of the probiotic attributes of Lactobacillus kefiranofaciens XL10 isolated from Tibetan kefir grain. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2017, 101, 2467–2477. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Zheng, Y.; Lu, Y.; Wang, J.; Yang, L.; Pan, C.; Huang, Y. Probiotic properties of Lactobacillus strains isolated from Tibetan kefir grains. PLoS ONE 2013, 8, e69868. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Slattery, C.; Cotter, P.D.; O’Toole, P.W. Analysis of Health Benefits Conferred by Lactobacillus Species from Kefir. Nutrients 2019, 11, 1252. [Google Scholar] [CrossRef]
Sindi, A.; Badsha, M.B.; Nielsen, B.; Ünlü, G. Antimicrobial Activity of Six International Artisanal Kefirs Against Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serovar Enteritidis, and Staphylococcus aureus. Microorganisms 2020, 8, 849. [Google Scholar] [CrossRef]
Kim, D.H.; Jeong, D.; Kim, H.; Kang, I.B.; Chon, J.W.; Song, K.Y.; Seo, K.H. Antimicrobial Activity of Kefir against Various Food Pathogens and Spoilage Bacteria. Korean J. Food Sci. Anim. Resour. 2016, 36, 787–790. [Google Scholar] [CrossRef]
Balcázar, J.L.; de Blas, I.; Ruiz-Zarzuela, I.; Vendrell, D.; Gironés, O.; Muzquiz, J.L. Sequencing of variable regions of the 16S rRNA gene for identification of lactic acid bacteria isolated from the intestinal microbiota of healthy salmonids. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2007, 30, 111–118. [Google Scholar] [CrossRef]
Gulitz, A.; Stadie, J.; Ehrmann, M.A.; Ludwig, W.; Vogel, R.F. Comparative phylobiomic analysis of the bacterial community of water kefir by 16S rRNA gene amplicon sequencing and ARDRA analysis. J. Appl. Microbiol. 2013, 114, 1082–1091. [Google Scholar] [CrossRef]
Zheng, J.; Wittouck, S.; Salvetti, E.; Franz, C.; Harris, H.M.B.; Mattarelli, P.; O’Toole, P.W.; Pot, B.; Vandamme, P.; Walter, J.; et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int. J. Syst. Evol Microbiol. 2020, 70, 2782–2858. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Marsh, A.J.; O’Sullivan, O.; Hill, C.; Ross, R.P.; Cotter, P.D. Sequence-based analysis of the microbial composition of water kefir from multiple sources. FEMS Microbiol. Lett. 2013, 348, 79–85. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Wang, X.; Xiao, J.; Jia, Y.; Pan, Y.; Wang, Y. Lactobacillus kefiranofaciens, the sole dominant and stable bacterial species, exhibits distinct morphotypes upon colonization in Tibetan kefir grains. Heliyon 2018, 4, e00649. [Google Scholar] [CrossRef]
Chen, Y.P.; Hsiao, P.J.; Hong, W.S.; Dai, T.Y.; Chen, M.J. Lactobacillus kefiranofaciens M1 isolated from milk kefir grains ameliorates experimental colitis in vitro and in vivo. J. Dairy Sci. 2012, 95, 63–74. [Google Scholar] [CrossRef]
Hong, W.-S.; Chen, H.-C.; Chen, Y.-P.; Chen, M.-J. Effects of kefir supernatant and lactic acid bacteria isolated from kefir grain on cytokine production by macrophage. Int. Dairy J. 2009, 19, 244–251. [Google Scholar] [CrossRef]
Dertli, E.; Çon, A.H. Microbial diversity of traditional kefir grains and their role on kefir aroma. LWT Food Sci. Technol. 2017, 85, 151–157. [Google Scholar] [CrossRef]
Sylvie, C.; Marie-Laure, G.; Laurence, M.; Catherine, G.; Christiane, B.; Dominique, C.; Chantal, B. Lactobacillus gigeriorum sp. nov., isolated from chicken crop. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2012, 62, 330–334. [Google Scholar]
Kimoto, K.I.; Aizawa, T.; Urai, M.; Bao Ve, N.; Suzuki, K.I.; Nakajima, M.; Sunairi, M. Acidocella aluminiidurans sp. nov., an aluminium-tolerant bacterium isolated from Panicum repens grown in a highly acidic swamp in actual acid sulfate soil area of Vietnam. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010, 60 (Pt 4), 764–768. [Google Scholar] [CrossRef]
Korsak, N.; Taminiau, B.; Leclercq, M.; Nezer, C.; Crevecoeur, S.; Ferauche, C.; Detry, E.; Delcenserie, V.; Daube, G. Short communication: Evaluation of the microbiota of kefir samples using metagenetic analysis targeting the 16S and 26S ribosomal DNA fragments. J. Dairy Sci. 2015, 98, 3684–3689. [Google Scholar] [CrossRef]
Özdemir, N.; Kök Taş, T.; Guzel-Seydim, Z. Effect of Gluconacetobacter spp. on Kefir Grains and Kefir Quality. Food Sci. Biotechnol. 2015, 24, 99–1116. [Google Scholar] [CrossRef]
Garofalo, C.; Osimani, A.; Milanović, V.; Aquilanti, L.; De Filippis, F.; Stellato, G.; Di Mauro, S.; Turchetti, B.; Buzzini, P.; Ercolini, D.; et al. Bacteria and yeast microbiota in milk kefir grains from different Italian regions. Food Microbiol. 2015, 49, 123–133. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Yang, Z.; Zhou, F.; Ji, B.; Li, B.; Luo, Y.; Yang, L.; Li, T. Symbiosis between microorganisms from kombucha and kefir: Potential significance to the enhancement of kombucha function. Appl. Biochem. Biotechnol. 2010, 160, 446–455. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Hertzler, S.R.; Clancy, S.M. Kefir improves lactose digestion and tolerance in adults with lactose maldigestion. J. Am. Diet. Assoc. 2003, 103, 582–587. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Ts, L.; MaryPramela, P.; Iyer, P. Anti-microbial, anti-fungal and anti-carcinogenic properties of coconut milk kefir. Int. J. Home Sci. 2017, 3, 365–369. [Google Scholar]
Güven, A.; Güven, A.; Gülmez, M. The effect of kefir on the activities of GSH-Px, GST, CAT, GSH and LPO levels in carbon tetrachloride-induced mice tissues. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health 2003, 50, 412–416. [Google Scholar] [CrossRef]
Saarela, M.; Mogensen, G.; Fondén, R.; Mättö, J.; Mattila-Sandholm, T. Probiotic bacteria: Safety, functional and technological properties. J. Biotechnol. 2000, 84, 197–215. [Google Scholar] [CrossRef]
Choi, A.-R.; Patra, J.K.; Kim, W.J.; Kang, S.-S. Antagonistic Activities and Probiotic Potential of Lactic Acid Bacteria Derived From a Plant-Based Fermented Food. Front. Microbiol. 2018, 9, 1963. [Google Scholar] [CrossRef]
Lim, P.L.; Toh, M.; Liu, S.Q. Saccharomyces cerevisiae EC-1118 enhances the survivability of probiotic Lactobacillus rhamnosus HN001 in an acidic environment. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015, 99, 6803–6811. [Google Scholar] [CrossRef]
Leite, A.M.; Miguel, M.A.; Peixoto, R.S.; Ruas-Madiedo, P.; Paschoalin, V.M.; Mayo, B.; Delgado, S. Probiotic potential of selected lactic acid bacteria strains isolated from Brazilian kefir grains. J. Dairy Sci. 2015, 98, 3622–3632. [Google Scholar] [CrossRef]
Sabir, F.; Beyatli, Y.; Cokmus, C.; Onal-Darilmaz, D. Assessment of potential probiotic properties of Lactobacillus spp., Lactococcus spp., and Pediococcus spp. strains isolated from kefir. J. Food Sci. 2010, 75, M568–M573. [Google Scholar] [CrossRef]
Huang, Y.; Wu, F.; Wang, X.; Sui, Y.; Yang, L.; Wang, J. Characterization of Lactobacillus plantarum Lp27 isolated from Tibetan kefir grains: A potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects. J. Dairy Sci. 2013, 96, 2816–2825. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Carasi, P.; Diaz, M.; Racedo, S.M.; De Antoni, G.; Urdaci, M.C.; Serradell Mde, L. Safety characterization and antimicrobial properties of kefir-isolated Lactobacillus kefiri. Biomed. Res. Int. 2014, 2014, 208974. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Bosch, A.; Golowczyc, M.A.; Abraham, A.G.; Garrote, G.L.; De Antoni, G.L.; Yantorno, O. Rapid discrimination of lactobacilli isolated from kefir grains by FT-IR spectroscopy. Int. J. Food Microbiol. 2006, 111, 280–287. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Chen, H.C.; Wang, S.Y.; Chen, M.J. Microbiological study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent methods. Food Microbiol. 2008, 25, 492–501. [Google Scholar] [CrossRef]
Gao, X.; Li, B. Chemical and microbiological characteristics of kefir grains and their fermented dairy products: A review. Cogent Food Agric. 2016, 2, 1272152. [Google Scholar] [CrossRef]
Parada, J.L.; Caron, C.R.; Medeiros, A.B.P.; Soccol, C.R. Bacteriocins from lactic acid bacteria: Purification, properties and use as biopreservatives. Braz. Arch. Biol. Technol. 2007, 50, 521–542. [Google Scholar] [CrossRef]
Mahrous, H.; Mohamed, A.; El-Mongy, M.A.; El-Batal, A.I.; Hamza, H.A. Study bacteriocin production and optimization using new isolates of Lactobacillus spp. isolated from some dairy products under different culture conditions. Food Nutr. Sci. 2013, 4, 342–356. [Google Scholar] [CrossRef]
Suskovic, J.; Kos, B.; Beganovic, J.; Pavunc, A.L.; Habjanic, K.; Matosic, S. Antimicobial activity- the most important property of probiotic and starter lactic acid bacteria. Food Technol. Biotechnol. 2010, 48, 296–307. [Google Scholar]
Mokoena, M.P. Lactic Acid Bacteria and Their Bacteriocins: Classification, Biosynthesis and Applications against Uropathogens: A Mini-Review. Molecules 2017, 22, 1255. [Google Scholar] [CrossRef]
Bulgasem, B.Y.; Hassan, Z.; Abdalsadiq, N.K.A.; Yusoff, W.M.W.; Musa, E.M.M.T.; Lani, M.N. Anti-adhesion activity of lactic acid bacteria supernatant against human pathogenic Candida species biofilm. Health Sci. J. 2015, 9, 1–9. [Google Scholar]
Griffin, C. Probiotics in obstetrics and gynaecology. Obst. Gynaecol. 2015, 55, 201–209. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Masuda, Y.; Ono, H.; Kitagawa, H.; Ito, H.; Mu, F.; Sawa, N.; Zendo, T.; Sonomoto, K. Identification and characterization of leucocyclicin Q, a novel cyclic bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides TK41401. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, 8164–8170. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Simova, E.; Beshkova, D.; Dimitrov, Z. Characterization and antimicrobial spectrum of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from traditional Bulgarian dairy products. J. Appl. Microbiol. 2009, 106, 692–701. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Zhou, J.; Liu, X.; Jiang, H.; Dong, M. Analysis of the microflora in Tibetan kefir grains using denaturing gradient gel electrophoresis. Food Microbiol. 2009, 26, 770–775. [Google Scholar] [CrossRef]
Liu, B.F.; Fan, M.T.; Jin, D. Isolation of lactic acid bacteria from Tibetan kefir grains and study on its fermentation performance. J. Northwest. Sci. Technol. Univ. Agric. Forrest 2004, 32, 83–86. [Google Scholar]
Simova, E.; Beshkova, D.; Angelov, A.; Hristozova, T.; Frengova, G.; Spasov, Z. Lactic acid bacteria and yeasts in kefir grains and kefir made from them. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2002, 28, 1–6. [Google Scholar] [CrossRef]
Barao, C.E.; Klososki, S.J.; Pinheiro, K.H.; Marcolino, V.; Valarini, J.O.; Cruz, A.G.; Da Silva, T.T.; Tatiana, P. Growth Kinetics of Kefir Biomass: Influence of the Incubation Temperature in Milk. Chem. Eng. Trans. 2019, 75, 499–504. [Google Scholar]
Gul, O.; Mortas, M.; Atalar, I.; Dervisoglu, M.; Kahyaoglu, T. Manufacture and characterization of kefir made from cow and buffalo milk, using kefir grain and starter culture. J. Dairy Sci. 2015, 98, 1517–1525. [Google Scholar] [CrossRef]

Будьте здоровы!

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ