Получение биокефира

РАЗРАБОТКА УНИКАЛЬНОГО БИОКЕФИРА

ПРОПИОНИКС КЕФИРНЫЙ

Речь идет об изобретении настоящего (!) биокефира. Задачей является значительное повышение потребительских и пробиотических свойств указанного кисломолочного продукта, т.е. его лечебно-профилактических свойств. Изобретение относится к пищевой промышленности. В подготовленное молоко вносят комбинированную закваску кефирных грибков и пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii в количестве 3-5%, взятых в соотношении 1:1, перемешивают, сквашивают, охлаждают и осуществляют розлив. Изобретение позволяет повысить антибиотическую и антимутагенную активность, увеличить количество витаминов B1, В2, B6, обогатить продукт витамином B12.

О ЧЕМ РЕЧЬ?

Дело в том, что ранее на нашем сайте мы обосновали преимущества приготовления кисломолочных напитков с бифидобактериями и пропионовокислыми бактериями на монокультурных заквасках. Пробиотические свойства таких продуктов оказались на порядок выше своих конкурентов, приготовленных с дополнительным использованием молочнокислых бактерий. И это преимущество очевидно, т.к молочнокислые бактерии являются по сути метаболическими "инвалидами", нуждающимися в дополнительных факторах роста. Поэтому они конкурируют с пробиотическими, подавляют их рост и используют метаболиты соседей как ростовые вещества. На выходе в готовых продуктах может получится не только снижение количества жизнеспособных клеток полезных бактерий, но и значительно уменьшиться количество продуктов их метаболизма.

Другое дело если речь идет о симбиозе микроорганизмов. В конце раздела об особенностях ферментирования мы уже давали информацию, что симбиотические отношения между бифидо- и пропионовокислыми бактериями позволяют создавать комбинированные закваски более ценные по своим пробиотическим и биотехнологическим свойствам. Но есть также моменты, когда и другие полезные микроорганизмы, проявляя синергизм с вышеуказанными пробиотиками, позволяют получить высокое качество кисломолочных продуктов. Речь идет о таких продуктах, как кефир, сметана, мягкие сыры, биотараг и т.д., чей спрос определяется как раз не пробиотическими культурами, а традициями потребления. Здесь технологии повышения лечебно-профилактических свойств продуктов за счет комбинации микробных культур не должны снижать исходные потребительские свойства, обусловленные традиционным составом, более того, они должны быть улучшены.  В этом и есть одна из основных задач т.н. «умной биотехнологии».

Дополнительно по теме разработки продуктов смешанного брожения см.:

• Разработка технологии бактериального концентрата для продуктов гетероферментативного брожения

• Способ получения бактериального концентрата и применение его в качестве БАД или закваски прямого снесения для курунги

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЕФИРНОГО ПРОДУКТА

описание изобретения к патенту РФ № 2461204

Предлагаемое изобретение относится к молочной промышленности и может быть использовано при производстве кисломолочной продукции.

Известен способ производства кефира, предусматривающий очистку, нормализацию, гомогенизацию, внесение лимоннокислых солей натрия и калия, термообработку, охлаждение до температуры заквашивания, внесение закваски кефирных грибков, сквашивание, охлаждение с последующей выдержкой и розливом (а.с. 1680031, кл. А23С 9/12, 1987).

Недостатком известного способа является сложность приготовления кефира и его низкие лечебно-профилактические свойства.

Наиболее близким способом к заявляемому изобретению по совокупности признаков является способ производства кефира, включающий очистку, нормализацию, гомогенизацию молока, пастеризацию, охлаждение до температуры заквашивания, внесение закваски кефирных грибков, сквашивание до достижения кислотности, охлаждение, розлив, созревание и хранение (ГОСТ Р 52093-2003. Кефир. Технические условия).

Однако недостатком данного способа является излишне острый вкус и недостаточно высокие пробиотические свойства продукта.

Задачей изобретения является повышение потребительских и пробиотических свойств кисломолочного продукта.

Совместное культивирование кефирных грибков и пропионовокислых бактерий позволит повысить функциональные свойства кефирного продукта.

Технический результат, обеспечиваемый при осуществлении предлагаемого изобретения, заключается в повышении антимутагенной активности, увеличении количества витаминов B1, В2, B6, что повышает пробиотические свойства продукта.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в способе приготовления кефирного продукта, включающем очистку, нормализацию, гомогенизацию, пастеризацию молока, выдержку, охлаждение его до температуры заквашивания, внесение закваски, перемешивание, сквашивание, охлаждение и розлив, согласно изобретению молоко заквашивают комбинированной закваской кефирных грибков и пропионовокислых бактерий в количестве 3-5%, взятых в соотношении 1:1.

Отличительными признаками заявляемого способа являются использование закваски кефирных грибков и пропионовокислых бактерий, подбор оптимального их соотношения, совместное использование которых для ферментации молока повышает потребительские и пробиотические свойства готового продукта.

Для осуществления заявляемого способа были проведены экспериментальные исследования, в ходе которых были подобраны оптимальные технологические параметры получения кефирного продукта.

На первом этапе исследований была изучена сочетаемость микрофлоры кефирной закваски и пропионовокислых бактерий.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СИМБИОТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ

Многочисленными исследованиями доказано, что при подборе заквасок для кисломолочных продуктов очень важно, чтобы входящие в состав микроорганизмы находились в прочных симбиотических взаимоотношениях. Поэтому первостепенной задачей при составлении заквасок является выявление взаимоотношений между микроорганизмами. Известно, что молочнокислые бактерии находятся в антагонистических и симбиотических взаимоотношениях. При антагонизме наблюдается угнетение роста, т.е. культуры- антагонисты не способны сочетаться с культурами другого вида, а симбиотический характер взаимоотношений ведет к взаимному усилению роста. Учитывая вышесказанное, исследуемые культуры сначала были проверены на антагонизм по методике Романович. Полученные результаты представлены в таблице 1

Таблица 1. Исследование взаимоотношений между микроорганизмами

Вид микроорганизма	Фильтрат чистой культуры
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii KM 186	Реакция отрицательная
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii AC-2500	Реакция отрицательная
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii AC-2503	Реакция отрицательная
Кефирная грибковая закваска	Реакция отрицательная

Следует отметить, что изменение окраски метиленовой сини в присутствии пропионовокислых бактерий, а также в сочетании пропионовокислых бактерий с кефирной грибковой закваской не происходило в течение 2-3 часов. А через 4-4,5 часа начиналось постепенное обесцвечивание метиленовой сини одновременно с контролем (без пропионовокислых бактерий). Полное обесцвечивание наступало через 8-10 часов, что свидетельствует об отсутствии явления антагонизма. Следовательно, исследуемые культуры могут быть рекомендованы для составления комбинированной закваски.

---

Далее для более детального выяснения характера взаимоотношений между микроорганизмами исследовали влияние пропионовокислых бактерий на развитие микрофлоры кефирной закваски. Результаты представлены в таблице 2 (для исследований был взят штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii KM 186).

Таблица 2 – Исследование влияния фильтратов культуральной жидкости на рост пропионовокислых бактерий

Фильтраты культуральной жидкости	Рост Pr.Shermanii в разведениях
	1:4	1:8	1:16
Кефирная грибковая закваска	+++	++++	++++
Pr.  shermanii KM 186 и кефирная грибковая закваска 1:1	+++	++++	++++
Pr.  shermanii KM 186 и кефирная грибковая закваска 1:0,8	++++	++++	++++
Pr.  shermanii KM 186 и кефирная грибковая закваска 1:0,5	+++	++++	++++

++++ - стимуляция роста, +++ - нормальный рост

Анализ данных, представленных в табл.2, показывает, что пропионово-кислые бактерии стимулируют рост микроорганизмов кефирной грибковой закваски. В процессе своего роста пропионовокислые бактерии обогащают среду рядом продуктов своего метаболизма, особенно витаминами группы В. Микроорганизмы кефирной грибковой закваски используют для своего развития данные факторы роста. Отмечен активный рост пропионовокислых бактерий в консорциуме микроорганизмов кефирной грибковой закваски при утилизации лактата, образуемого молочнокислой микрофлорой, что свидетельствует о симбиотических взаимоотношениях микроорганизмов.

Таким образом, приведенные выше результаты свидетельствуют о сочетаемости пропионовокислых бактерий с микрофлорой кефирной грибковой закваски.

ПОДБОР ОПТИМАЛЬНОГО СООТНОШЕНИЯ КУЛЬТУР В КОМБИНИРОВАННОЙ ЗАКВАСКЕ

Для получения закваски с хорошими биотехнологическими свойствами необходимо подобрать оптимальное соотношение заквасочных культур. Для выбора соотношения культур составляли различные варианты заквасок и изучали их свойства. В качестве контроля была взята кефирная грибковая закваска. При составлении комбинированной закваски прежде всего учитывали количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий, количество продуцируемого ими витамина B₁₂, продолжительность образования сгустка и органолептические свойства. Полученные результаты представлены в таблице 3.

В результате проведенных исследований установлено, что уменьшение содержания клеток пропионовокислых бактерий приводит к резкому снижению содержания витамина B₁₂ в заквасках. Результаты исследований показали, что динамика кислотообразования во всех образцах достаточно равномерная. В закваске с соотношением культур 1:1 сгусток формируется быстрее, чем в других образцах. Из анализа данных табл.3 видно, что уменьшение дозы пропионовокислых бактерий в закваске приводит к снижению содержания витамина B₁₂, летучих жирных кислот и CO₂. При этом количество клеток пропионовокислых бактерий в конце ферментации достигает 10 к.о.е. в см³, что свидетельствует об активном росте пропионовокислых бактерий в консорциуме микроорганизмов. В результате проведенных исследований выбрано оптимальное соотношение кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий 1:1. Данные соотношения комбинированной закваски характеризуются наиболее высоким содержанием жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий - 5·10⁹ и витамина В_{1 2} - 536,3 мкг/мл, а также хорошими органолептическими свойствами.

Таблица 3 – Выбор оптимального соотношения культур в комбинированной закваске

Показатель	Характеристика комбинированной закваски при различном соотношении культур (кефирных грибков : пропионовокислых бактерий)
	Варианты комбинированной закваски
	1:1	1:0,8	1:0,5	контроль
1	2	3	4	5
Консистенция и внешний вид	Однородная, нежная, сметанообразная	Однородная, в меру вязкая	Жидкая, однородная	Однородная с нарушенным сгустком
Вкус и запах	Кисломолочный, освежающий	Вкус и запах чистые, кисломолочные	Выраженный кисломолочный, излишне «кефирный», слегка острый	Кисломолочный освежающий
Цвет	Молочно-белый
Продолжительность сквашивания, час.	5,5-6,0	6,5-7,0	7,0-7,5	10-12
Титруемая кислотность, 0Т	72	74	74	85
pH	4,83	4,75	4,75	4,35
Количество витамина В12, мкг/мл	536,3	467,5	96,3	0,75
Летучие жирные кислоты, мл 0.1 н. NaOH	1,0	0,8	0,6	0,5
Наличие диацетила	+	+	+	+
Наличие ацетоина	+	+	+	+
Наличие CO2, мм	10	8	6	5
Количество жизнеспособных клеток Pr. shermanii, к.о.е/см3	5х109	2х109	1х109	-

ПРОБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ КОМБИНИРОВАННОЙ ЗАКВАСКИ

В дальнейших исследованиях были изучены пробиотические свойства комбинированной закваски. Рост и метаболическая активность бактерий служат фундаментальными факторами для получения биомассы и промышленно ценных продуктов. К этим факторам следует добавить еще одно важное свойство бактерий: биосинтез соединений, обладающих антимутагенным и антиканцерогенным действием. Под антимутагенезом понимают снижение частоты спонтанной и индуцированной мутации. Антимутагены регулируют скорость спонтанных мутаций, стабилизируют мутационный процесс.

В целом, проблема антимутагенеза и антимутагенных свойств бактерий имеет большое будущее, ибо включает в себя как вопросы здоровья людей, так и фундаментальные вопросы биологии. Изучение антимутагенеза важно именно в отношении тех бактерий, которые используют при изготовлении кормовых добавок и пищи. Бактерии-пробиотики как источники антибиомутагенов или десмутагенов могут быть использованы для предобработки пищевых продуктов и кормов с целью нейтрализации мутагенных (канцерогенных) веществ.

Пропионовокислые бактерии известны выраженным антимутагенным действием. Поскольку в естественных условиях микроорганизмы постоянно подвергаются действию мутагенов, у них сформировался эндогенный и экзогенный защитные механизмы: у всех живых существ образуются молекулы, способные к осуществлению антимутагенеза. Антимутагены пропионовокислых бактерий повышают активность ферментных систем, участвующих в детоксикации поступающих в клетку веществ, оказывая влияние на окислительно-восстановительный потенциал организма -эти процессы приводят к снижению мутаций. Однако антимутагенез кефирных грибков до сих пор не изучен. В связи с этим была исследована антимутагенная активность комбинированной закваски. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4 – определение антимутагенной активности комбинированной закваски

Вид микроорганизмов	Время культивирования, час	Среднее число ревертантов на чашку	Ингибирование, %
Кефирная грибковая закваска	48	885	30,0
Пропионовокислые бактерии Pr. shermanii KM 186	48	502	47,2
Комбинированная закваска	48	532	57,8

Примечание: Ревертант — мутант, у которого в результате обратной, супрессорной или компенсаторной мутации полностью или частично восстанавливаются признаки исходного (дикого) организма.

В результате экспериментальных исследований установлено, что кефирная грибковая закваска обладает достаточно высокой антимутагенной активностью в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолин-N-оксидом. Следует отметить, что степень ингибирования на 17% ниже, чем у пропионовокислых бактерий. Следует отметить, что наиболее сильное ингибирующее действие обнаружено у комбинированной закваски. Вероятно, более высокая антимутагенная активность комбинированной закваски объясняется тем, что микроорганизмы закваски синтезируют значительные количества антиокислительных ферментов: супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы. Одновременное присутствие этих ферментов позволяет клетке удалять супероксидные и пероксидные радикалы, образованные в окислительных реакциях. 

Таким образом, установлено, что кефирная грибковая закваска обладает выраженной антимутагенной активностью. Кроме того, введение пропионовокислых бактерий в консорциум микроорганизмов кефирной грибковой закваски повышает антимутагенные свойства комбинированной закваски.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНИЗИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ КОМБИНИРОВАННОЙ ЗАКВАСКИ

Изучение пробиотических свойств комбинированной закваски наряду с другими показателями предусматривает получение данных о содержании в ней витаминов. Молоко является хорошим источником витаминов. Известно, что содержание витаминов может значительно изменяться в процессе технологической обработки и при хранении пищевых продуктов. В связи с этим практическое решение основных проблем в области получения высококачественных продуктов питания невозможно без осуществления контроля за качественным и количественным содержанием в них витаминов.

Из всех технологических операций при производстве молочных продуктов на изменение содержания витаминов наибольшее влияние оказывает термическая обработка. По мнению ряда исследователей тепловая обработка приводит к уменьшению большинства витаминов и тем в большей степени, чем выше температура и продолжительность выдержки. Однако последующая ферментация молока может привести к увеличению содержания витаминов, но данные литературных источников по этому вопросу неоднозначны.

Витамин B₁ известен как «витамин бодрости духа», так как он положительно влияет на нервную систему, умственные способности, а также улучшает переваривание пищи, особенно углеводов. Витамин B₁ имеет важное значение для обмена углеводов, жиров и белков. При недостатке витамина В₁ накапливается пировиноградная кислота, избыточное количество которой отрицательно действует на нервную ткань. Недостаток тиамина вызывает расстройство нервной системы и возникает заболевание «бери-бери». Ведущими симптомами «бери-бери» является мышечная слабость, бессонница, быстрая утомляемость, полиневрит и тахикардия.

Витамин В₂ входит в состав активных групп клеточных элементов, обеспечивающих нормальное течение процессов генерации энергии. Рибофлавин присутствует во всех живых клетках, воздействуя на белковый обмен, синтез и распад жирных кислот, окислительно-восстановительные процессы. Помимо этого, витамин В₂ улучшает зрение, уменьшает утомляемость глаз. Рибофлавин не накапливается в организме и должен регулярно восполняться через продукты питания. При недостатке витамина В₂ нарушается процесс окисления органических веществ, прекращается рост и т.д.

Витамин В₆ (пиридоксин) способствует должному усвоению белков, жира, для образования соляной кислоты, антител, а также правильному синтезу нуклеиновых кислот, препятствующих старению.

Нами изучено изменение тиамина, рибофлавина и витамина В₆ в процессе производства кефирного продукта. Поскольку при производстве кефирного продукта используется комбинированная закваска, проводили сравнительные исследования содержания витаминов при сквашивании молока кефирной грибковой закваской и комбинированной закваской. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Содержание витаминов в молочных продуктах

Молоко	Количество витаминов, мкг/кг
	Тиамин (витамин В1)	Рибофлавин (витамин В2)	Пиридоксин (витамин В6)
Молоко пастеризованное	317± 0,41	1358± 0,25	263± 0,32
Молоко, сквашенное кефирными грибками	375± 0,15	1741± 0,11	315± 0,17
Молоко, сквашенное пропионовокислыми бактериями	391± 0,32	1795± 0,19	332± 0,12
Молоко. Сквашенное комбинированной закваской	420± 0,52	1835± 0,27	367± 0,25

В ходе исследований установлено, что в готовом продукте, выработанном как с использованием кефирной грибковой закваски, так и с использованием комбинированной закваски, содержание тиамина, рибофлавина и витамина B₆ возрастает. Результаты исследований, представленные в табл.5, показывают, что в результате введения пропионовокислых бактерий в кефирную грибковую закваску в кефирном продукте увеличивается содержание витаминов группы В. 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОЙ ДОЗЫ ВНОСИМОЙ КОМБИНИРОВАННОЙ ЗАКВАСКИ

Как было отмечено, комбинированная закваска обладает высокими пробиотическими свойствами. Особое внимание в процессе ферментации уделяется дозе вносимой закваски, поскольку она влияет на активность молочнокислого брожения и позволяет управлять технологическим циклом производства кисломолочного продукта.

Для приготовления кисломолочного продукта нормализованное молоко пастеризовали при температуре (92-95)°С с выдержкой 20 минут и охлаждали до температуры (30±1)°С. Затем в подготовленное молоко вносили разные массовые доли комбинированной закваски в объеме 3, 5, 10%. Для оценки кислотообразующей активности заквасочных культур определяли энергию кислотообразования, оцениваемую по приросту титруемой и активной кислотности ферментируемого молока за определенный промежуток времени. Определяли зависимость кислотообразования и развития клеток пропионовокислых бактерий от продолжительности сквашивания молока. Результаты представлены на фиг.1 и 2.

Примечание о кислотности для потребителей:

Общая (титруемая) кислотность — выражается в градусах Тернера и определяется титрованием 0,1 н раствором щелочи 100 мл молока в присутствии индикатора фенолфталеина до нейтральной реакции. Кислотность является критерием оценки качества заготовляемого молока по ГОСТ 13264-88 «Молоко коровье» требования при закупках.

рН (активная кислотность) — это концентрация водородных ионов. Она выражается отрицательными логарифмом концентрации ионов водорода, обозначается рН. Чем выше концентрация ионов Н2, тем ниже значение рН. Для нормального свежего молока рН составляет 6,47—6,67. Такая кислотность благоприятна для устойчивости коллоидной системы молока и развития бактерий. При повышенной активности кислотности развитие микроорганизма замедляется, а при значительность снижении рН прекращается.

Итак, результаты, свидетельствуют, что с увеличением дозы комбинированной закваски повышается кислотообразующая способность микроорганизмов и интенсифицируется процесс молочнокислого брожения. С увеличением массовой доли закваски от 3 до 5% продолжительность сквашивания молока пропорционально сокращается. При дальнейшем повышении дозы закваски от 5 до 10% продолжительность сквашивания сократилась незначительно и составила всего лишь 1 час.

При изучении роста пропионовокислых бактерий в процессе сквашивания молока комбинированной закваской обнаружено интенсивное их развитие, что свидетельствует о хорошей сочетаемости пропионовокислых бактерий с микрофлорой кефирной грибковой закваски (фиг.2). Количественный учет пропионовокислых бактерий показал, что при всех дозах закваски в конце ферментации количество жизнеспособных клеток составляет 10⁹ к.о.е. всм³. С целью уменьшения затрат на приготовление кисломолочного продукта наиболее целесообразным является внесение 3-5% комбинированной производственной закваски.

Обобщая полученные результаты можно сделать вывод, что пропионовокислые бактерии хорошо растут в консорциуме микроорганизмов кефирной грибковой закваски, что позволяет получить в кисломолочных продуктах высокое содержание клеток пропионовокислых бактерий. Таким образом, кефирная грибковая закваска и закваска пропионовокислых бактерий в симбиозе обеспечивают синергетический эффект, выражающийся в увеличении количества витаминов B1, В2, В6, антимутагенной активности заквасок.

По материалам:

• СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЕФИРНОГО ПРОДУКТА (патент РФ № 2461204)

P.S.  В зависимости от используемых в комбинированной закваске различных штаммов пропионовокислых бактерий заявленный способ осуществляют несколькими методами. Подробнее об этом, а также многом другом из мира пищевой биотехнологии можно узнать также в специальном разделе нашего сайта, где собраны некоторые описания изобретений к наиболее актуальным  патентам.

Для расширения кругозора см. также: 

Бактериальные популяции в международных кустарных кефирах

Будьте здоровы!