Пробиотическое лечение болезни Крона с помощью разрушения полимикробных биопленок

Перспектива лечения болезни Крона с помощью пробиотического препарата, разрушающего полимикробные биопленки

В недавнем исследовании, опубликованном 24 января 2023 года в журнале Gastroenterology, американские ученые представили модуляцию кишечной микробиоты с помощью пробиотиков как вероятный вариант лечения таких заболеваний, как болезнь Крона (БК). Команда охарактеризовала кишечную микробиоту, включающую грибы и бактерии среди пациентов с БК и их здоровых родственников первой степени родства. Бактериальные и грибковые ДНК были извлечены из образцов стула от участников исследования и подвергнуты секвенированию. Затем был проведен анализ основных компонентов, численности и разнообразия микробиоты.

Краткое описание результатов исследования

(предыстория исследования представлена ниже ↓)

Проведен анализ in vitro способности микробов к образованию биоплёнок как по отдельности, так и при взаимодействии друг с другом. Были выполнены конфокальная микроскопия и электронная микроскопия (просвечивающая электронная микроскопия и сканирующая электронная микроскопия). Для выявления полезных микробов, способных разрушать биоплёнки, образованные патогенными грибами и бактериями, был проведен корреляционный анализ, в результате которого были выделены четыре лечебных штамма: Lactobacillus acidophilus 16axg, Bifidobacterium breve 19bx, Saccharomyces boulardii 16mxg и Lactobacillus rhamnosus 18fx – эти штаммы были включены в пробиотический препарат-кандидат для лечения болезни Крона (БК).

Штаммы препятствовали повреждению эпителия, вызванному S. marcescens, C. tropicalis и E. coli. Кроме того, в пробиотический препарат был добавлен фермент амилаза для лучшего разрушения полимикробной биопленки. Далее были проведены валидационные анализы (фаза 3) путем оценки влияния комбинации пробиотиков на предотвращение/разрушение патогенных биопленок (фаза 3а).

Впоследствии был проведен доклинический анализ in vivo для оценки воздействия пробиотика-кандидата на спонтанную хроническую болезнь Крона, подобную илеиту, у мышей SAMP (прим. ред.: мышиный штамм SAMP представляет собой модель илеита, подобного болезни Крона (БК), который идеально подходит для исследования патогенеза хронического воспаления кишечника). Мышей разделили на три группы: одна группа получала пробиотик-кандидат (с амилазой) ежедневно в течение 56 дней, вторая группа получала пробиотик-кандидат без амилазы, а третья группа получала только фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Впоследствии ткани подвздошной кишки мышей подвергали гистологическому анализу. Кроме того, образцы фекалий анализировали с помощью секвенирования 16S рРНК и ГХ/МС (газовой хроматографии/масс-спектрометрии).

Наконец, препарат вводили 46 людям-добровольцам (фаза 4) один раз в день в течение четырех недель, а оценку проводили через четыре недели после введения. Микробиота добровольцев сравнивалась с теми, которые были задокументированы проектом HMP (human microbiome project).

Полученные результаты

По сравнению со здоровыми людьми у пациентов с БК было снижено количество Bacteroidetes и Faecalibacterium prausnitzii, а также повышено количество Ruminococcus gnavus, E. Coli, S. marcescens и C. tropicals, что привело к воспалению и разрушению слизистого слоя. S. marcescens, C. tropicalis и E. coli взаимодействовали друг с другом, образуя специфичные для Candida биопленки повышенной толщины и массы. E. coli оказалась слитой с клеточной стенкой C. tropicalis, тогда как S. marcescens взаимодействовала с C. tropicalis и E. coli при помощи фимбрий.

Биопленкообразующие способности трех микробов (E. coli, S. marcescens и C. tropicals) были подтверждены в экспериментах in vivo. Как оказалось, состав пробиотика-кандидата может предотвращать образование биопленки и эффективно разрушать патогенные биопленки, при этом значительно снижается образование зародышевых трубок C. albicans, что указывает на снижение вирулентности грибкового организма (прим. ред.: зародышевая трубка - это вырост, образованный спорами спорообразующих грибов во время прорастания).

У мышей, получавших пробиотик-кандидат (с амилазой), наблюдался значительно менее тяжелый илеит, чем в других группах. Результаты анализа ГХ/МС и секвенирования показали повышенную численность видов Lachnoclostridium и видов Mucispirillum schaedleri среди мышей, получавших пробиотики (и амилазу), что связано с выработкой короткоцепочечных жирных кислот. Кроме того, у мышей, получавших пробиотик с амилазой, наблюдалась повышенная экспрессия 27 генов, которые способствуют развитию В-лимфоцитов памяти и инфильтрации Т-лимфоцитов, и сниженная экспрессия 17 генов.

Микробные штаммы в препарате-кандидате представляли собой микроорганизмы GRAS (обычно считающиеся безопасными). Среди людей-добровольцев пробиотик значительно снизил количество видов Candida и Bacteroidetes и увеличил количество Firmicutes. Пониженное количество Candida может помочь предотвратить образование биопленки и связанное с этим воспаление при болезни Крона.

В целом, результаты исследования показали, что пробиотик-кандидат (патентуемый препарат) вызывал функциональные изменения, приводящие к уменьшению тяжести илеита, подобного болезни Крона. Кроме того, амилаза сыграла решающую роль в уменьшении воспаления кишечника. Комбинированная терапия пробиотиками и амилазами может изменить соотношение Firmicutes / Bacteroidetes и восстановить микробный баланс кишечника. Полученные данные показали, что изменение состава кишечного микробиома с использованием пробиотических микробов может регулировать дисбактериоз, обеспечивая жизнеспособный подход к лечению заболеваний с основным микробным дисбалансом.

Предыстория

Влияние новой комбинации пробиотиков на патогенные бактериально-грибковые полимикробные биопленки (ПМБ)

Ранее мы уже об этом писали - ред.

2 апреля 2019 г. в журнале mBio была опубликована исследовательская статья специалистов из Медицинского факультета Университета Кейс Вестерн Резерв (США) о влиянии пробиотиков на патогенные полимикробные биопленки в свете поиска методов лечения воспалительных заболеваний кишечника. Заявлялось, что разработанный в результате исследований и ожидающий патента пробиотик может разрушить биопленки болезни Крона

Ранее, в сентябре 2016 г. авторы работы продемонстрировали, что C. tropicalis, Escherichia coli и Serratia marcescens были значительно более распространены у пациентов с болезнью Крона, чем у их здоровых родственников первой степени родства. В этом же исследовании обилие каждого из этих отдельных микроорганизмов (т. е. C. tropicalis, E. coli и S. marcescens) было положительно связано друг с другом. Помимо повышенной численности, эти микроорганизмы при совместном росте образовывали патогенные полимикробные биопленки (ПМБ), способные инициировать воспалительную реакцию и значительно более толстые, чем биопленки, формируемые этими микроорганизмами по отдельности или в паре друг с другом. (например, C. tropicalis/E.coli, C. tropicalis/S.marcescens или E.coli/S. marcescens).

Поскольку совместное взаимодействие грибов и бактерий, а также бактерий и бактерий в дисбиотическом состоянии часто приводит к образованию биопленки в кишечнике (называемой пищеварительными бляшками) и, как было показано, оказывает вредное воздействие на хозяина, логично предположить, что коррекция этого дисбактериоза путем ингибирования образования биопленки может принести пользу хозяину. Одним из способов исправить этот дисбактериоз может быть использование пробиотиков.

Недавно некоторые пробиотические бактерии изучались как потенциальный метод предотвращения оппортунистических инфекционных заболеваний путем стимуляции иммунной системы хозяина (7, 8, 9). Кроме того, в предыдущих исследованиях сообщалось о положительных эффектах пробиотиков при кандидозе слизистых оболочек, таких как кандидозный вагинит и вульвовагинальный кандидоз, кандидоз полости рта и желудочно-кишечные инфекции (10, 11, 12, 13). Однако на сегодняшний день было проведено очень мало исследований о влиянии пробиотиков на болезнь Крона (БК). Большинство из проведенных исследований были относительно небольшими испытаниями с небольшим числом включенных пациентов (14).

Кроме того, важно помнить, что разработка пробиотика, способного уменьшать кишечный дисбактериоз, требует выбора соответствующих микробных видов, нацеленных на патогенные бактериальные и грибковые виды, вызывающие желудочно-кишечные заболевания, и в то же время поддерживающих полезные. Чтобы идентифицировать такой состав, авторы провели корреляционный анализ взаимодействий бактерия-бактерия, грибок-гриб и бактерия-гриб в качестве прелюдии к исследованию 2019 г. и смогли идентифицировать пробиотические виды бактерий и грибков, которые способны противодействовать патогенным микробам ЖКТ, одновременно поддерживая полезные (15).

Кроме того, учитывая предыдущие собственные выводы о биопленках, авторы смогли идентифицировать пробиотические виды, обладающие антибиопленочной активностью, что важно, учитывая роль образования биопленок в микробной патогенности.

Кроме того, в пробиотическую смесь была включена амилаза на основании ее продемонстрированной антибиопленочной активности (16).

Основываясь на предварительных результатах, ученые разработали новый пробиотический препарат, состоящий из Saccharomyces boulardii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium breve, который содержит амилазу в качестве гидролитического фермента, который предотвращает и уничтожает полимикробные биопленки (ПМБ).

Поскольку в предыдущей публикации ученые показали, что C. tropicalis может образовывать прочные биопленки с E. coli и S. marcescens, а другие исследования показали, что C. albicans также повышен у пациентов с БК, авторы хотели определить, является ли это взаимодействие специфичным для грибков Candida.

Поэтому они оценили способность C. albicans и C. tropicalis образовывать ПМБ по сравнению с Trichosporon inkin и Saccharomyces fibuligera. Эти два контрольных вида дрожжей были выбраны потому, что T. inkin в равной степени присутствовал как у пациентов с болезнью Крона, так и у их здоровых родственников, в то время как S. fibuligera является непатогенным дрожжевым грибком, который использовался ранее в качестве сравнения с C. tropicalis (17, 18). Затем исследователи определили способность разработанного пробиотика предотвращать и разрушать ПМБ, образованные C. tropicalis и C. albicans в сотрудничестве с S. marcescens и E. coli. Также оценивалась способность пробиотика ингибировать прорастание C. albicans…

Рис. 1. Влияние пробиотика на предотвращение образования полимикробной биопленки (ПМБ), образованной C. tropicalis, E. coli и S. marcescens. Не зрелую ПМБ подвергали воздействию пробиотического фильтрата на ранней стадии формирования. Эффекты были исследованы с использованием CSLM- и SEM-микрофотографий: (A) CSLM-микрофотография необработанной ПМБ, показывающая биопленку, состоящую из дрожжей и структур гиф. (B) CSLM-микрофотография обработанной пробиотиками ПМБ, показывающая отсутствие матрицы биопленки и уменьшенное количество грибковых клеток. (C) СЭМ-микрофотография необработанной ПМБ, показывающая плотную биопленку с дрожжевыми и гифальными структурами, а также бактериальные агрегаты (стрелка). (D) SEM-микрофотография обработанной пробиотиками ПМБ, показывающая отсутствие матрицы, очень мало дрожжевых клеток и отсутствие видимых бактерий. Увеличение CSLM, ×100; Увеличение СЭМ, ×1000.

Рис. 2. Влияние пробиотика на разрушение зрелой ПМБ, образованной C. tropicalis, E. coli и S. marcescens. Зрелую ПМБ подвергали воздействию пробиотического фильтрата и инкубировали в течение дополнительных 24 часов. (A) CSLM-микрофотография необработанной ПМБ, показывающая неповрежденную биопленку, состоящую из дрожжей и гифальных структур. (B) CSLM-микрофотография обработанной пробиотиком ПМБ, показывающая отсутствие матрицы биопленки и уменьшенное количество грибковых клеток.

Рис. 3. Влияние пробиотика на образование зародышевой трубки C. albicans. Способность C. albicans образовывать зародышевые трубки оценивали в присутствии или отсутствии (контроль) пробиотического фильтрата. Воздействие пробиотика привело к ингибированию образования зародышевой трубки C. albicans. (A) CSLM-изображение контрольного необработанного грибка C. albicans, показывающее обильное образование зародышевой трубки. (B) CSLM-изображение грибка C. albicans, обработанного пробиотиками, показывающее только морфологию дрожжей без зародышевых трубок. (C) Количественный анализ темпа образования зародышевых трубок обработанных и необработанных пробиотиками клеток C. albicans, показывающий значительное снижение процента прорастания.

Дополнительная информация:

• Болезнь Крона, диета и микробиом
• Дивертикулез, дивертикулит, пробиотики и кишечная микробиота
• Иммунитет и диета при воспалительных заболеваниях кишечника
• Микробные метаболиты при воспалительных заболеваниях кишечника
• Микробиом, метаболом и воспалительное заболевание кишечника
• Пребиотики, пробиотики, синбиотики, парапробиотики и постбиотики при воспалительных заболеваниях кишечника
• ВЗК, микробиота и иммунитет слизистой оболочки
• Слизистый слой кишечника, микробиом и воспалительные заболевания кишечника
• Роль кишечной микробиоты при этиопатогенезе ВЗК
• Возможные методы модулирующей микробиомной терапии для профилактики или лечения ВЗК
• Роль микробиоты в иммунитете и воспалении (+ видео)
• Эффективность пропионовокислых бактерий в лечении колита
• Польза пропионибактерий из сыра в отношении ВЗК
• Диетические простые сахара вызывают кишечный дисбиоз и способствуют развитию колита у мышей
• Микробная сигнатура в жировой ткани пациентов с болезнью Крона
• Диета с высоким содержанием жиров и использованием антибиотиков связана с воспалением кишечника
• Серотонин и кишечник. Роль 5-HT при ВЗК
• Пробиотики могут разрушать микробные биопленки при воспалительных заболеваниях кишечника
• Влияние дрожжей Saccharomyces cerevisiae на воспалительные заболевания кишечника
• Роль бактерий и аутофагии в клетках Панета при воспалительных заболеваниях кишечника
• Прецизионное редактирование кишечных бактерий: потенциальный способ лечения колита
• Рецидивирующая инфекция постепенно отключает защиту хозяина против воспаления кишечника
• Бифидобактерии B. longum в лечении синдрома раздраженного кишечника с диареей
• Синдром раздраженного кишечника и кишечный микробиом

Будьте здоровы!