Польза пропионибактерий из сыра в отношении ВЗК

Противовоспалительные эффекты пропионовокислых бактерий из швейцарского сыра

Полезные пропионибактерии в Пробиотическом сыре Эмменталь: влияние на Декстран сульфат натрия-индуцированный колит у мышей

Примечание редактора. Не секрет, что пропионовокислые бактерии (ПКБ), входящие в состав пробиотических концентратов ООО "Пропионикс", выделены из твердого сыра и во многом обеспечивают пользу этого ферментированного молочного продукта. ПКБ являются относительно "молодыми" пробиотиками - т.н. пробиотиками нового поколения, но их оздоровительный потенциал уже продемонстрирован во многих исследованиях. Помимо сверхсинтеза витамина В12, синтеза антиоксидантных ферментов (SOD, каталаза, пероксидаза), наличия бифидогенных свойств (стимуляция роста бифидобактерий) и противораковой эффективности, эти уникальные микроорганизмы обладают выраженными иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами. Эти свойства подтверждены рядом исследований, одно из которых (изучение влияния ПКБ из сыра на DSS-индуцированный колит у мышей) представлено ниже. 

Резюме

Предпосылки и цели. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), в том числе язвенный колит (ЯК), совпадают с изменениями в микробиоте кишечника. Потребление иммуномодулирующих штаммов пробиотических бактерий может индуцировать или продлевать ремиссию у больных ЯК. Ферментированные продукты, включая сыры, являются основными переносчиками бактерий. Новые данные выявили противовоспалительные эффекты у отдельных штаммов Propionibacterium freudenreichii. Таким образом, мы предположили, что потребление функционального сыра, сбраживаемого (ферментируемого) таким штаммом, может оказать положительное влияние на ВЗК.

Методы. Мы исследовали влияние сыра, ферментированного P. freudenreichii, на воспаление кишечника. Мы разработали экспериментальный сыр с одним штаммом, ферментированный исключительно иммуномодулирующим штаммом P. freudenreichii, CIRM-BIA 129. Кроме того, мы произвели в промышленных условиях Эмментальский сыр с использованием того же штамма в сочетании с Lactobacillus delbrueckii CNRZ327 и Streptococcus thermophilus LMD-9 в качестве стартеров. Потребление обоих сыров было исследовано с точки зрения профилактики вызванного декстраном сульфата натрия (DSS) колита у мышей.

Результаты. Потребление экспериментального сыра одного штамма или промышленного Эмменталя, ферментированного P. freudenreichii CIRM-BIA 129, уменьшало тяжесть последующего DSS-индуцированного колита, потерю веса, индекс активности заболевания и гистологическую оценку. Оба метода лечения в профилактических целях снижали секрецию иммуноглобулина А (IgA) тонкой кишки, восстанавливали экспрессию генов окклюдина и предотвращали индукцию фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), интерферона гамма (IFN-y) и интерлейкина-17 (IL-17).

Выводы. Комбинация иммуномодулирующих штаммов стартерных бактерий может быть использована для изготовления противовоспалительного сыра, как это было показано на животной модели колита. Это открывает новые перспективы для персонализированного питания в контексте ВЗК.

1. Вступление

Функциональные продукты питания определяются как «ингредиенты, которые благотворно влияют на одну или несколько целевых функций в организме, помимо адекватных питательных эффектов, таким образом, что это имеет отношение либо к улучшению состояния здоровья и благополучия и/или снижению риска заболевания» [1,2]. Молочные ферментированные продукты, включая сыры, составляют большую часть нашего ежедневного рациона. Несколько исследований недавно показали, что специфические штаммы бактерий закваски, обычно используемые в молочных ферментированных продуктах, могут оказывать пробиотические свойства, такие как модуляция микробиоты, противоопухолевое и противовоспалительное действие, в зависимости от штамма. В этой перспективе разработка функциональных кисломолочных ферментированных продуктов с использованием пробиотических заквасочных бактерий может представлять собой перспективный способ снижения риска заболеваний, связанных с образом жизни и питанием. Некоторые штаммы молочнокислых бактерий и молочных пропионибактерий характеризовались своими иммуномодулирующими свойствами, особенно при воспалительных заболеваниях кишечника (ВЗК) [3,4]. Считается, что ВЗК, включая язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона, являются результатом дисрегуляции врожденного и адаптивного иммунного ответа к микробиому кишечника у генетически восприимчивого хозяина [5,6,7]. Проглоченные пробиотические микроорганизмы могут играть благоприятную роль в лечении ЯК [8,9]. Показано, что потребление специфических пищевых микроорганизмов, отобранных по их иммуномодулирующим свойствам, самостоятельно или в комбинации с обычными лекарственными препаратами индуцирует и/или усиливает ремиссию у больных ЯК [10].

Новые данные [11,12] выявили противовоспалительный потенциал отдельных штаммов Propionibacterium freudenreichii, который является стартером созревания сыра, обычно используемым в сочетании с молочнокислыми бактериями при производстве сыров швейцарского типа, таких как Эмментальский сыр [13]. P. freudenreichii вносит свой вклад в характерный вкус и аромат Эмменталя. Он продуцирует ценные метаболиты с противовоспалительными свойствами, такие как короткоцепочечные жирные кислоты, 1,4-дигидрокси-2-нафтойная кислота (DHNA), конъюгированные жирные кислоты и поверхностные белки, которые образуются в пищевых матрицах, таких как сыр [3]. Было показано, что отобранные штаммы P. freudenreichii индуцируют выработку IL-10 в мононуклеарных клетках периферической крови человека [12,14]. Это иммуномодулирующее свойство in vivo коррелирует со способностью этих отобранных штаммов защищать от индуцированного тринитробензолсульфокислотой (TNBS) колита у мышей [14]. Этот противовоспалительный эффект опосредуется специфическими поверхностными белками, обнаруживаемыми только на поверхности специфических штаммов P. freudenreichii [15,16]. Было показано, что молочная пищевая матрица защищает такие иммуномодулирующие поверхностные белки от пищеварительного протеолиза [17,18]. Кроме того, потребление экспериментального сыра, ферментированного P. freudenreichii, отдельно или с Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, защищал мышей от острого колита, вызванного TNBS [19,20]. Это привело к ограниченной индукции маркеров колита, таких как сывороточный IL-6, сывороточный амилоиид А, активность миелопероксидазы толстой кишки, а также уровень экспрессии мРНК толстой кишки → IL-6, TNFa, IL-1b, IL-10, COX2 и HMOX. Напротив, уровень экспрессии мРНК толстой кишки → ZO-1, PPARG и IFNy, подавленный TNBS, был восстановлен при потреблении P. freudenreichii CIRM-BIA 129 [14,19,20]. В соответствии с нашими предыдущими результатами, недавно было сообщено, что пропионибактерии обогащаются в микробиоте младенцев в результате грудного вскармливания, что снижает частоту развития некротического энтероколита. Эти авторы выделили Propionibacterium UF1, тесно связанного с P. freudenreichii, от здоровых детей и описали его как commensal Propionibacterium, смягчающий воспаление кишечника, посредством регуляции клеток Th17 и регуляции кишечного иммунитета новорожденных [11,21].

Аналогичные свойства были описаны для молочнокислых бактерий, которые могут быть использованы для производства сыра Эмменталь [22]. В отношении всех этих данных мы предположили, что отбор специфических штаммов молочнокислых бактерий и молочных пропионибактерий, обладающих противовоспалительными свойствами, может привести к получению потенциально пробиотического препарата Эмменталь, способствующего лечению ВЗК [19,20,23,24]. Таким образом, целью данного исследования было оценить благотворное влияние Эмменталя, созданного с использованием трех выбранных противовоспалительных штаммов P. freudenreichii CIRM-BIA 129 [20], Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CNRZ327 [23] и Streptococcus thermophilus LMD-9 [25] в контексте вызванного декстраном сульфата натрия (DSS) колита у мышей.

2. Материалы и методы

2.1. Бактериальные штаммы

Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CNRZ327, Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA 129 (эквивалент штамма ITGP20) и Streptococcus thermophilus LMD-9 были предоставлены международным микробиологическим ресурсным центром CIRM-BIA (Центр международных исследований микробиологии, Bactéries d’Intérêt Alimenire). Лактобактерии культивировали в среде MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) (бульон MRS DifcoTM Lactobacilli, Difco Laboratories, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA), как описано [26]. Термофильные стрептококки в М-17, как описано [27]. Молочные пропионибактерии в YEL (дрожжевой экстракт лактата), как описано [28]. За исключением MRS (Difco Laboratories), все бактериальные реагенты были от Biokar Diagnostics, Beauvais, Франция.

2.2. Производство сыров для исследований на животных

Для исследований на животных были изготовлены два вида сыров: 1) экспериментальный сыр с одним штаммом, ферментированный только P. freudenreichii, и 2) промышленный Эмментальский сыр, ферментированный Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Streptococcus thermophilus и P. freudenreichii.

(1) Экспериментальный 1-штаммовый сыр, ферментированный исключительно P. freudenreichii CIRM-BIA 129, был приготовлен так, как было описано ранее [19,20]. Короче говоря, этот пробиотический штамм был выращен в стерилизованном коровьем молоке, дополненном молочными белками, молочными сливками и казеиновым пептоном, чтобы получить экспериментальный предварительный сыр, достигающий 10⁹ КОЕ/мл, рН 5,5. Затем его подвергли коагуляции (chy-max ® Extra, Chr. Hansen, Hørsholm, Дания), резке, нагреву (10 мин, 40°C), формованию, прессованию (2 ч, 37 °C), сушке и упаковке. Все эти шаги были выполнены в условиях ламинарного течения. Биохимический состав сыра, определенный как описано ранее [29,30], составлял: сухое вещество 58г /100г, липиды 28 г/100г, Белки 29 г/100г, Углеводы 0 г/100г и кальций 840 мг/100г. В качестве контроля без микробов была приготовлена стерильная Контрольная сырная матрица таким же образом, как и сыр с одним штаммом, но без добавления стартовых бактерий. С этой целью стерилизованное коровье молоко, дополненное молочными белками, молочными сливками и казеиновым пептоном, подкисляли с помощью Глюконо Дельта-лактона (GDL) перед той же самой процедурой производства сыра, как описано ранее [20]. Пропионибактерии были подсчитаны на дрожжевом экстракте-лактат-агаре (YELA). Кишечные палочки, мезофильная флора, термофильная флора, дрожжи и плесень, все менее 10 КОЕ/г, также были подсчитаны соответственно по методу KF, NF ISO 4832, NF ISO 4833, NF V 08–059, и NF V 08–059 (таблица S1).

(2) Пробиотический сыр Эмменталь был изготовлен в промышленном масштабе (сырное колесо весом 80 кг) компанией Entremont Alliance © (Malestroit, Франция) с использованием стандартного процесса производства. Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CNRZ327, Streptococcus thermophilus LMD-9 и P. freudenreichii CIRM-BIA 129, все 3 предоставлены CIRM-BIA, были использованы в качестве стартеров. Лактобактерии были подсчитаны с помощью КОЕ в пересчете на MRS-агар при 42 °C при анаэробиозе [30], стрептококки на M17-агаре при 42 °C [30] и пропионибактерии на литий-глицерол-агаре при 30 °C при анаэробиозе [31] как описано ранее. Чтобы проверить, что штамм пропионибактерий, полученный после приготовления сыра, идентичен тому, который использовался в качестве закваски, для изолированных колоний применялся штамм-специфический анализ PFGE, как описано ранее [31,32,33]. Вкратце, образцы хромосомной ДНК готовили в соответствии с Gautier et al. [32] и расщепляли с использованием рестриктазы Xba I. Электрофорез проводили при 14 °C на 1% агарозном геле в системе Chef DR II (Bio-rad, Richmond, UK) со следующими параметрами: начальное время 2 с, конечное время 20 с, время миграции 20ч, напряжение 6В.см^-1 = 200В. Для термофильных лактобацилл параметры были следующими: фермент AscI [34], начальное время 1 с, конечное время 10 с, время миграции 16 ч, напряжение: 6 В.см^-1 = 200 В. Для термофильных стрептококков параметры были следующими: фермент SmaI [35], начальное время 2 с, конечное время 20 с, время миграции 24 ч, напряжение: 6 В.см^-1 = 200 В. Гели представлены на рисунках S1 – S3. В качестве стандартного контроля в Entremont Alliance © Company, отсутствие E. coli, коагулазы + стафилококков, листерий и сальмонелл было проверено с использованием, соответственно, следующих сред: RAPID'E.coli (Sanofi Diagnostics Pasteur, NF (Normes Francaise) ISO (Международная организация по стандартизации), норма 16649-2), Baird Parker + RPF (плазменный фибриноген кролика) (норма NF ISO 6888-2 / A1), RLM (Rapid'L Mono, NF ISO 11290-2) и XLD (Ксилоза-Лизин-Дезоксихолат) + compass Salmonella (норма NF ISO 6579-1 / 2017).

2.3. Животные, процедура кормления и декстран сульфат натрия-индуцированный колит

Экспериментальная установка исследования на животных представлена на рисунке 1. Самки мышей C57BL6 (возраст 8 недель) были получены из федерального университета Минас-Жерайс (UFMG–Белу-Оризонти, Бразилия). Исследование было одобрено (11/03/2019) бразильским Комитетом по этике использования животных (CEUA-UFMG, Бразилия, протокол 364/2018). Они были случайным образом разделены на группы по шесть особей и помещены в контролируемую среду (с температурой 25 °C, 12-часовым циклом света/темноты и свободным доступом к пище и воде). Для проведения эксперимента in vivo животные были разделены на 5 групп по 18 мышей C57BL6. Одна контрольная группа не получила декстран сульфат натрия (DSS) (наивный контроль), а четыре другие группы получили DSS. Мышам ежедневно давали 400 мг (в день на животное) сыра, приготовленного, как описано выше, или PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор). Сыры суспендировали в буфере PBS с рН 7,4. Сначала 400 мг сыра ресуспендировали в 500 мкл PBS и гомогенизировали с помощью зонда-гомогенизатора Ika T 10 Basic Ultra Turrax (IKA ® - Werke GmbH & Co. Кг, Штауфен, Германия) в течение 2-3 мин. Мышей кормили внутрижелудочным кормом в течение семи последовательных дней: 500 мкл буфера PBS, или 400 мг свободной бактерий молочной матрицы, или 400 мг сыра с одним штаммом, или 400 мг сыра Эмменталь. Это количество сыра было установлено, чтобы обеспечить 10⁹ КОЕ P. freudenreichii, для сыра с одним штаммом и сыра Эмменталь, как описано ранее [19,20]. Максимальный объем, вводимый ежедневно через желудочный зонд, был установлен в соответствии с руководством по эффективной практике введения веществ [36]. Затем DSS-колит был вызван добавлением 3% декстрансульфата натрия (DSS) (36–50 кДа, CAT 260110, LOT Q5756 MP Biomedicals, Illkirch-Graffenstadenn, France) в питьевую воду в течение 7 дней. В каждой группе из 18 мышей все мыши были проанализированы на потерю веса, длину толстой кишки и DAI (индекс активности заболевания), как указано ниже. Из каждой группы из 18 мышей 6 мышей были случайным образом отобраны для гистологического анализа с использованием техники Swiss-Roll, 6 других мышей были случайно отобраны для анализа экспрессии генов методом RT-PCR (обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция), и 6 других мышей были случайным образом выбрано для количественного определения цитокинов иммуноферментным анализом ELISA.

Рисунок 1. Экспериментальная разработка оценки противовоспалительного эффекта профилактического вмешательства, реализуемого P. freudenreichii-ферментированными сырами, в условиях DSS-колита. Мыши C57BL6 были разделены на 5 групп, получавших различные предварительные обработки в течение 5 дней, до индукции колита. Затем колит индуцировали с помощью 3% DSS в питьевой воде в течение 7 дней до эвтаназии. Для изучения степени тяжести колита был проведен мониторинг различных параметров заболевания (на рисунке PBS - Фосфатно-буферный физиологический раствор).

В качестве отрицательного контроля для каждой профилактической обработки (контроль матрицы сыра без микробов, одностадийный сыр P. freudenreichii или промышленный сыр Эмменталь) одну группу, состоящую из 6 мышей, подвергали соответственно желудочному зондированию и оставляли без DSS перед эвтаназией.

2.4. Оценка DSS-индуцированного колита

Тяжесть колита оценивали за 7 дней до умерщвления животного. Были оценены потеря веса, консистенция стула и содержание крови. Оценка DAI (индекс активности заболевания) была рассчитана на основе этих маркеров, как описано ранее [37]. Для каждого параметра была дана оценка: отсутствует (0), умеренная (1), средняя (2) и тяжелая (3). Индекс активности заболевания соответствует сумме различных баллов.

2.5. Гистология

Гистоморфологические анализы проводились следующим образом. Короче говоря, дистальная часть толстой кишки мышей была собрана после эвтаназии и аккуратно промыта PBS. Образцы тканей толстой кишки погружали в раствор формальдегида (4% v/v) для фиксации тканей (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, США). Затем материал был погружен в парафин, и сечение 4 мкм каждого образца помещалось на стеклянный предметный столик и окрашивалось гематоксилин-эозином (Sigma-Aldrich). Слайд-изображения из каждой экспериментальной группы были сняты (с использованием объектива с 20-кратным увеличением) на цифровой камере Spot Insight Color, прикрепленной к микроскопу Olympus BX-41 с использованием программного обеспечения захвата SPOT® версии 3.4. Оценка была определена в соответствии с McCafferty et al. [38], в качестве следующих признаков: степень разрушения нормальной архитектуры слизистой оболочки (0: нормальная; 1: легкая; 2: умеренная; 3: обширное повреждение), наличие и степень клеточной инфильтрации (0: нормальная; 1: легкая ; 2: умеренная и 3: трансмуральная инфильтрация), степень утолщения мышц (0: нормальная; 1: легкая; 2: умеренная; 3: обширное утолщение), наличие или отсутствие абсцессов склепа (0: отсутствует; 1: присутствует) и наличие или отсутствие истощения бокаловидных клеток (0: отсутствует; 1: присутствует). Мышей забивал вслепую опытный патологоанатом.

2.6. Количественное определение секреторного IgA в содержимом тонкой кишки

После умерщвления мышей тонкую кишку собирали. Содержимое промывали с использованием 10 мл PBS. Содержимое кишечника затем встряхивали и центрифугировали (850 × g, 30 мин, 4 °C), как описано ранее [39]. Осадок отбрасывали, а в супернатанте количественно определяли IgAs. Измерение уровней секреторного IgA (sIgA) определяли методом иммуноферментного анализа (ELISA) в кишечной жидкости тонкой кишки. Микротитровые пластины Nunc-Immuno Plates, MaxiSorpTM (Nunc, Роскилле, Дания) покрывали козьими антителами, направленными против мышиного IgA, разбавляли 1:2000 в покровных буферных антителах (Southern Biotechnology, Бирмингем, AL, США) в течение 18 ч при 4 °C. Пластины промывали физиологическим раствором (NaCl 0,9%), добавляли Твин 20 (0,05%) (Vetec, Рио-де-Жанейро, Бразилия) и блокировали 200 мкл PBS-казеина (0,05%) в течение 1 ч при комнатной температуре. Образцы кишечной жидкости разводили в PBS-казеине (0,25%) и затем добавляли в пластину. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре лунки промывали и конъюгированное с биотином антитело против мышиного IgA (Southern Biotechnology Associates, Inc., Бирмингем, Алабама, США) разводили в PBS-казеине (0,25%) (1: 10000) и выдерживали в течение 1 ч при 37 °С. Затем добавляли конъюгированный с пероксидазой стрептавидин (1:10000) (Southern Biotechnology Associates, Бирмингем, Алабама, США). После 1 ч инкубации в каждую лунку добавляли 100 мкл ортофенилендиамина (OPD) (Sigma-Aldrich) и H₂O₂ (0,04%). Пластинки держали подальше от света, пока не проявилась окраска. Реакция была остановлена добавлением 2N H₂SO₄. Считывание проводилось на Микропланшетном считывателе модели 450 (Bio-Rad, Филадельфия, Пенсильвания, США) при поглощении 492 Нм. Результаты были измерены в концентрации sIgA (мкг) на мл кишечной жидкости, согласно стандартной кривой.

2.7. Анализ экспрессии генов в дистальном отделе толстой кишки

Дистальный отдел толстой кишки разрезали на фрагменты длиной 1 см, которые собирали и хранили в реагенте RNAlater при температуре -80 °C до извлечения РНК в соответствии с [40]. Тотальную РНК выделяли с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Остаточную ДНК расщепляли путем добавления не содержащей РНК ДНКазы I (Thermofisher Scientific, Бордо, Франция). Образцы затем обрабатывали Turbo DNA free Kit® (Thermofisher Scientific). кДНК для каждого образца получали с использованием набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Thermofisher Scientific). Количественную ПЦР (полимеразную цепную реакцию) проводили с использованием универсального супермикса SYBR iTaq green (Thermofisher Scientific) и с использованием геноспецифических праймеров для клеток толстой кишки (таблица S3). Гены актина и GAPDH использовали в качестве хозяйственных генов. Реакции амплификации проводились на системе обнаружения последовательностей ABI PRISM 7900HT (Thermofisher Scientific). Цикл амплификации состоял из следующих этапов: 95 °С в течение 30 С и 40 циклов 95 °С в течение 15 С и 60 °С в течение 30 С. Результаты экспрессии гена контрольной группы (без обработки) использовали в качестве данных калибровки. Уровни экспрессии представлены в виде кратных изменений (2^−∆∆Ct) с использованием среднего значения и стандартного отклонения генов-мишеней.

2.8. Подготовка тканей и количественное определение цитокинов методом ELISA

Фрагменты толстой кишки (100 мг для каждой мыши) гомогенизировали в 1 мл буфера PBS, содержащего 0,05% твин-20 (Vetec, Рио-де-Жанейро, Бразилия), 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида (MP Biomedicals, Solon, Ohio, USA), 0,1 мМ хлорид бензетония (Sigma-Aldrich), 10 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (Synth, Бразилия) и 20 KIU апротинина A (Sigma-Aldrich). Смеси тканей центрифугировали (3000 × g, 10 мин) и супернатанты собирали для иммуноферментного анализа ELISA с использованием набора для ELISA DuoSet (R & D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). Пластины (Nunc ® , Sigma-Aldrich) покрывали очищенными моноклональными антителами против IL-10, IL-1β, IL-12p70, IL-17, IFN-γ, TGF-β, TNF-α и IL-6 в течение ночи при 4 °C. Пластинки (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp) промывали TBS (трис-буферным солевым раствором) и добавляли супернатант из гомогенизированных тканей толстой кишки. Затем пластинки инкубировали в течение ночи при 4 °С. После промывания пластин в пластины с покрытием добавляли биотинилированные моноклональные антитела против различных цитокинов и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Выявление проводили путем добавления 100 мкл / лунку цитратного буфера, содержащего ортофенилдиамин (Sigma-Aldrich) (1 мг / мл) и 0,04% (v/ v) H₂O₂. Затем добавляли раствор 2N  H₂SO₄, чтобы остановить реакцию. Поглощение измеряли при 492 нм с использованием устройства для считывания ELISA (Bio-Rad, Philadelphia, PA, USA).

2.9. Статистический анализ

Защитный эффект различных сыров в данных по профилактике колита, индуцированного DSS, был проанализирован с использованием двухстороннего (мониторинг веса) и одностороннего (мониторинг всех других биомаркеров) ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Tukey. Статистическая значимость была установлена на уровне Р < 0,05. Статистический анализ проводился в GraphPad Prism версии 7.00 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США.). Все данные были выражены в виде средних значений и стандартного отклонения (SD).

3. Результаты

3.1. Как экспериментальные, так и промышленные Эмментальские сыры содержат P. freudenreichii CIRM-BIA 129

Микробиологические анализы показали, что P. freudenreichii CIRM-BIA 129 вырос до 1x10¹⁰ и до 4x10⁹ КОЕ/г соответственно в экспериментальном сыре с одним штаммом и в промышленном сыре Эмменталь (таблица S1). Экспериментальный сыр с одним штаммом содержал P. freudenreichii CIRM-BIA 129 в качестве единственной бактерии. В Эмментале молочные пропионибактерии составляли основную популяцию бактерий, превышая 10⁹ КОЕ/г, в то время как лактобациллы и стрептококки были значительно ниже, приближаясь к 10⁶ КОЕ/г. В Эмментале идентичность молочных пропионибактерий проверяли методом импульсно-полевого гель-электрофореза (PFGE) (таблица S2 и рисунок S1). P. freudenreichii CIRM-BIA 129 был единственным штаммом пропионибактерий, присутствовавшим в Эмментальском сыре. При изучении термофильных лактобацилл были выявлены различные штаммы, но преобладал L. delbrueckii CNRZ327, используемый в качестве стартера (60%). Для S. thermophilus было обнаружено четыре различных штамма, и стартовый штамм LMD-9 не был преобладающим (таблица S2 и рисунки S2 и S3). Это не стартерные молочнокислые бактерии.

3.2. Эмментальский сыр смягчает DSS-индуцированный колит у мышей

В этих экспериментах мы оценивали профилактический эффект P. freudenreichii, употребляемого либо в одиночку в экспериментальном сыре с одним штаммом, либо вместе с S. thermophilus и L. delbrueckii в промышленном сыре Эмменталь, в контексте DSS-индуцированного колита у мышей. Мыши получали 400 мг сыра в сутки, что соответствует дозе, близкой к 10⁹ живым пропионибактериям в сутки. Рисунок 1 иллюстрирует экспериментальную установку эксперимента. Общие биомаркеры тяжести DSS-индуцированного колита были смягчены, как описано ниже, в контексте колита. Как и ожидалось, различные сыры (сырная матрица без бактерий, сыр с одним штаммом или Эмментальский сыр) не смогли модифицировать эти биомаркеры у здоровых мышей в отсутствие DSS (данные не показаны).

3.3. Индекс активности заболевания, потеря массы тела, длина толстой кишки и гистологический показатель у мышей с DSS-колитом

DSS-индуцированный колит вызвал значительную потерю массы тела во всех группах мышей по сравнению со здоровой группой (PBS) на 6 и 7 дни (фиг. 2А). Однако потребление сыра с одним штаммом и сыра Эмменталь уменьшило потерю массы тела по сравнению с PBS-DSS и с группами сырного матрикса-DSS (рис. 2А). Действительно, на 7-й день вес мышей, потребляющих оба сыра, значительно отличался от веса мышей контрольного колита, в то время как потребление сырной матрицы плацебо не могло ограничить потерю веса. Точнее, потребление сыра Эмменталь значительно ограничивало потерю веса: -5,882% ± 3,275 (р <0,05), по сравнению с DSS контрольной группы: -11,65% ± 5,368 (рис. 2В). Напротив, сырная матрица не смогла ограничить потерю веса (рис. 2В). Как и ожидалось, вызванный DSS колит увеличил индекс активности заболевания (DAI), который учитывает потерю массы тела, тяжесть диареи и наличие крови в фекалиях (рис. 3А). Сырная матрица не снижала DAI, тогда как потребление сыра с одним штаммом или сыра Эмменталь значительно снижало DAI по сравнению с группой PBS-DSS (рис. 3А). DSS-вызванный колит вызвал укорочение толстой кишки во всех группах мышей (рис. 3В). Потребление сырной матрицы, сыра с одним штаммом или сыра Эмменталь не предотвращало укорочение толстой кишки (рис. 3В). Что касается гистологического анализа толстой кишки мышей, наблюдалось изменение гистопатологического показателя в зависимости от лечения. Воздействие DSS резко повлияло на архитектуру слизистой оболочки с изъязвлениями и степенью утолщения мышц толстой кишки, а также инфильтрацией воспалительных клеток, отеком и истощением бокаловидных клеток. Гистопатологический показатель был нулевым в контрольных условиях, в то время как он был сильно увеличен после лечения DSS (p <0,0001) (Рисунок 4). Потребление сыра Эмменталь до индукции колита значительно снизило (p <0,05) этот показатель (рисунок 4), о чем свидетельствует ограниченное разрушение архитектуры слизистой оболочки и ограниченная степень клеточной инфильтрации по сравнению с контрольной группой PBS-DSS (рисунок 4). В целом, эти результаты показывают, что сыр Эмменталь уменьшал тяжесть вызванного DSS колита.

Рисунок 2. Влияние сырной матрицы, сыра с одним штаммом и сыра Эмменталь на потерю веса, вызванную колитом. (A) Время наблюдения за весом тела мышей и различия между группами. (B) Потеря массы тела, наблюдаемая на 7-й день индукции колита DSS, и различия между группами. Группы были следующими. PBS: здоровая группа, которой вводили gavaged с использованием буфера PBS в качестве фиктивного; PBS-DSS: DSS-обработанная контрольная группа колита, которой вводили желудочный зонд с использованием буфера PBS в качестве фиктивного; Сырный матрикс-DSS: обработанная DSS группа, получавшая желудочный зонд с использованием молочной матрицы без микробов; Сыр с одним штаммом DSS: группа, обработанная DSS, получала желудочный зонд с использованием экспериментального сыра с одним штаммом, содержащего P. freudenreichii CIRM-BIA 129 в качестве единственной бактерии; Эмменталь-DSS: группа, обработанная DSS, подвергалась желудочному контролю с использованием промышленного сыра Эмменталь, полученного с использованием P. freudenreichii CIRM-BIA 129 в качестве дозревателя для созревания. Данные представляют собой среднее значение ± SD для 18 мышей на группу. Было проведено несколько сравнений, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 **** p < 0.0001.

Рисунок 3. Влияние сырной матрицы, сыра с одним штаммом и сыра Эмменталь на тяжесть вызванного DSS колита. Через семь дней после индукции колита определяли индекс активности заболевания (DAI) (A) и длину толстой кишки (B). Группы были как и в предыдущих сравнениях (см. пояснение к рис.2). Данные представляют собой среднее значение ± SD для 18 мышей на группу. Было проведено несколько сравнений, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 **** p < 0.0001.

Рисунок 4. Влияние сырной матрицы, сыра с одним штаммом и сыра Эмменталь на DSS-индуцированные гистопатологические повреждения. Представлены репрезентативные изображения срезов слизистой оболочки толстой кишки мышей, окрашенных гематоксилином. Фаза получения изображения была сделана с 20-кратным увеличением. Шкала бар = 50 мкм. Гистопатологические оценки были определены. Группы были как и в предыдущих сравнениях (см. пояснение к рис.2). Данные представляют собой среднее значение ± SD для 6 мышей на группу. Было проведено несколько сравнений, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 **** p < 0.0001.

3.4. Секреторная продукция IgA кишечника мышей

Концентрацию секреторного IgA в тонкой кишке всех групп мышей определяли количественно с помощью иммуноферментного анализа ELISA. Колит, вызванный DSS, значительно увеличивает секрецию IgA, с 8,63 ± 1,11 до 15,63 ± 1,02 мкг / мл (рис. 5 и дополнительная таблица S4). Потребление контрольного сырного матрикса не ослабляло секрецию IgA, тогда как потребление сыра с одним штаммом или сыра Эмменталь значительно уменьшало его (7,59 ± 1,71 и 5,51 ± 3,15) по сравнению с группой мышей PBS-DSS (рис. 5). Не было значительной разницы в отношении секреции IgA между сыром с одним штаммом и сыром Эмменталь (рис. 5).

Рисунок 5. Влияние сырной матрицы, сыра с одним штаммом и потребления сыра Эмменталь на секрецию тонкого кишечника IgA. Концентрацию секреторного IgA в содержимом тонкой кишки определяли методом количественного определения ELISA. Данные представляют собой среднее значение ± SD для 18 мышей на группу. Группы были как и в предыдущих сравнениях (см. пояснение к рис.2). Было проведено несколько сравнений, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 **** p < 0.0001.

3.5. Мышиный оксидативный стресс толстой кишки и эпителиальный барьер

Ранее было показано, что потребление чистой культуры P. freudenreichii модулирует колическую экспрессию маркеров воспаления, окислительного стресса и целостности эпителиального барьера кишечника у мышей с TNBS-колитом [19,20]. Мы искали здесь такую модуляцию, как результат действия сыра, содержащего P. freudenreichii, у мышей с DSS-колитом. Экспрессию генов различных маркеров окислительного стресса толстой кишки и целостности эпителиального барьера оценивали методом количественной RT-PCR. Никаких существенных изменений в отношении экспрессии генов, участвующих в целостности эпителиального барьера, таких как гены claudind1, mucin 2, zonula occludens1 и zonula occludens2, не наблюдалось (данные не приведены). Однако DSS-индуцированный колит вызвал значительное снижение экспрессии гена окклюдина, что было предотвращено потреблением сыра Эмменталь, но не сырного матрикса (рис.6А). DSS-индуцированный колит вызвал окислительный стресс в клетках толстой кишки, о чем свидетельствует индукция экспрессии гена синтазы оксида азота (iNOS) (рис.6B). Все молочные продукты, испытанные здесь, включая сырную матрицу, экспериментальный сыр с одним штаммом и эмментальский сыр, предотвратили эту индукцию iNOS.

Рисунок 6. Влияние сырной матрицы, сыра с одним штаммом и сыра Эмменталь на экспрессию в толстой кишке маркеров клеточного барьера и окислительного стресса. Были проанализированы уровни экспрессии мРНК толстой кишки генов (A) Ocln и (B) iNOS. Данные представляют собой среднее значение ± SD для 6 мышей на группу. Группы были как и в предыдущих сравнениях (см. пояснение к рис.2). Было проведено несколько сравнений, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 **** p < 0.0001.

3.6. Провоспалительная и противовоспалительная экспрессия генов в толстой кишке мышей

Сообщалось также, что потребление P. freudenreichii модулирует колическую экспрессию цитокинов у мышей. Мы искали такую модуляцию в результате применения сыра, содержащего P. freudenreichii, у мышей с DSS-колитом. Во всех группах мышей оценивали экспрессию генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в клетках толстой кишки. Существенной модификации экспрессии Tgfß1 или IL21 не наблюдалось (данные не приведены). DSS-индуцированный колит не изменял экспрессию IL10 (рис. 7. А). Точно так же потребление сырной матрицы и сыра с одним штаммом не изменило экспрессию IL10 и Tgfβ1 (данные не представлены). Однако потребление сыра Эмменталь усиливало экспрессию IL10 в группе, вызванной DSS-колитом, по сравнению со всеми группами мышей (фигура 7А). DSS-индуцированный колит не вызывал значительных изменений в экспрессии IL1β и Tnfα в клетках толстой кишки по сравнению со здоровой группой (фигура 7B, C). Тем не менее, потребление сыра из одного штамма усиливало экспрессию IL1β при колите DSS по сравнению со здоровой группой (фигура 7B). Сырная матрица, сыр с одним штаммом и сыр Эмменталь значительно снизили экспрессию Tnfα по сравнению со здоровой группой (фигура 7C). Кроме того, все эти три молочных продукта ослабили увеличение экспрессии Ifnγ, вызванное DSS (фигура 7D).

Рисунок 7. Влияние сырной матрицы, сыра с одним штаммом и сыра Эмменталь на экспрессию в толстой кишке генов цитокинов при DSS-индуцированном колите. Были определены уровни экспрессии мРНК толстой кишки (A) IL-10, (B) IL-1β, (C) TNFα и (D) IFNγ. Данные представляют собой среднее значение ± SD для 6 мышей на группу. Группы были как и в предыдущих сравнениях (см. пояснение к рис.2). Было проведено несколько сравнений, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 **** p < 0.0001.

3.7. Концентрация провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в толстой кишке мышей

Концентрацию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в тканях толстой кишки оценивали во всех группах мышей с помощью количественного определения ELISA (фиг.8). Колит, вызванный DSS, увеличивает секрецию IL-10 по сравнению со здоровой группой (фигура 8А). Потребление сырной матрицы дополнительно улучшало секрецию IL-10 во время колита, вызванного DSS, по сравнению со здоровой группой (фигура 8А). Однако потребление ферментированных сыров снижало индукцию IL-10 (фигура 8А). DSS-индуцированный колит усиливает секрецию TGFβ в группах PBS-DSS и сырного матрикса-DSS (фигура 8B). Сыр Эмменталь и прием сыра с одним штаммом не влияли значительно на секрецию TGF, по сравнению с DSS-PBS и здоровыми группами (Фигура 8В). Что касается IL-6, его концентрация была увеличена во время колита, в то время как это увеличение было предотвращено потреблением сыра Эмменталь (Рисунок 8C). Аналогично, только сыр Эмменталь ослаблял секрецию IFNγ, индуцированную DSS-индуцированным колитом (фиг.8D). DSS-индуцированный колит увеличивал секрецию IL-17 по сравнению со здоровой группой, что усугублялось приемом сырной матрицы (рис.8E). Только эмментальский сыр был способен (Р < 0,05) снижать секрецию IL-17 по сравнению с группой PBS-DSS (рис.8E). DSS-индуцированный колит вызывал значительное увеличение TNFα только в группе с сырной матрицей (фигура 8F). DSS-индуцированный колит не вызывал значительных изменений в секреции IL-12 по сравнению со здоровой группой (фигура 8G). Потребление сыра также существенно не изменяет секрецию IL-12 по сравнению со здоровой группой (рис. 8G). Наконец, вызванный DSS колит увеличивал секрецию IL-1β по сравнению со здоровой группой, и это не уменьшалось при приеме сыра Эмменталь (рис. 8H).

Рисунок 8. Влияние сырной матрицы, сыра с одним штаммом и сыра Эмменталь на секрецию цитокинов в толстой кишке при DSS-индуцированном колите. Концентрация цитокинов (A) IL-10, (B) TGFβ, (C) IL-6, (D) IFNγ, (E) IL-17, (F) TNFα, (G) IL-12 и (H) IL -1β определяли количественно с помощью ELISA. Данные представляют собой среднее значение ± SD для 6 мышей на группу. Группы были как и в предыдущих сравнениях (см. пояснение к рис.2). Было проведено несколько сравнений, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 **** p < 0.0001.

4. Обсуждение

Предыдущие исследования показали защитную роль потребления отдельных штаммов Propionibacterium freudenreichii в контексте TNBS-индуцированного колита у мышей [14,19,20]. В этом исследовании мы исследовали защитный эффект употребления «пробиотического» сыра Эмменталь в контексте вызванного DSS колита. Этот сыр Эмменталь был произведен в промышленном масштабе на заводе местного производителя сыра, и бактерии-закваски были отобраны по их иммуномодулирующим свойствам: P. freudenreichii CIRM-BIA 129 [20], L. delbrueckii subsp. lactis CNRZ327 [23] и S. thermophilus LMD9 [25]. В конце созревания пропионибактерии составляли основную флору, более 10⁹ КОЕ/г, что типично для сыра Эмменталь [41,42], и штамм P. freudenreichii CIRM-BIA 129 был единственным обнаруженным, как показано анализом PFGE. Термофильные стрептококки и лактобациллы были намного ниже, близки к 106 КОЕ/г, что также типично, так как эти бактерии растут до 10⁸-10⁹ КОЕ/г во время творожной ферментации, а затем испытывают массовую гибель клеток во время созревания Эмментала. [41,42]. Хотя L. delbrueckii subsp. lactis CNRZ327 был преобладающим lactobacillus, они содержали штаммы, добавленные в качестве закваски, а также другие штаммы термофильных стрептококков и лактобацилл. В самом деле, молочнокислые бактерии, не являющиеся стартовыми, обычно обнаруживаются в Эмментале [41,42,43].

В этом исследовании пробиотический сыр Эмменталь сравнивали с ранее описанной моделью экспериментального сыра с одним штаммом [19], ферментированного только P. freudenreichii CIRM-BIA 129, и с плацебо-матрицей без бактерий сыра в DSS-индуцированной модели колита. Смертности не наблюдалось. Потребление DSS вызвало резкую потерю веса в контрольной группе (DSS). Однако предварительная обработка сыром Эмменталь помешала этому. Как сыр Эмменталь, так и сыр одного штамма ослабили тяжесть колита и уменьшили воспаление, о чем свидетельствует индекс активности заболевания. Однако только сыр Эмменталь смог снизить гистопатологический показатель по сравнению с контрольной группой (DSS). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, посвященными пропионибактериям [19,20,23,24]. P. freudenreichii CIRM-BIA 129 отдельно или в комбинации с молочнокислыми бактериями ослаблял TNBS-индуцированный колит [12, 14, 19, 20]. Однако ни один из двух ферментированных сыров не предотвращал укорочение толстой кишки, вызванное DSS. Аналогично, в предыдущем исследовании потребление P. freudenreichii CIRM-BIA 129 в сочетании с молочнокислыми бактериями не предотвращало укорочение толстой кишки при TNBS-индуцированном колите [44].

Колит, вызванный DSS, увеличивает секрецию IgA в тонкой кишке, в то время как сыры с одним штаммом и эмменталь ослабляют это увеличение. Повышенная секреция IgA является выражением нарушения илеального барьера при воспалительной реакции. Снижение воспаления в результате потребления сыра, таким образом, приводило к ослаблению IgA-ответа, предполагая, что DSS-индуцированный колит будет поражать не только толстую кишку, но и тонкую кишку [45,46]. Соответственно, было показано, что P. freudenreichii CIRM-BIA 129 снижает IgA-ответ в контексте 5-фторурацил-индуцированного мукозита [47]. Действительно, нарушение целостности кишечного барьера является ключевым этапом развития воспалительных заболеваний кишечника [48]. DSS-индуцированный колит индуцировал значительное увеличение экспрессии синтазы оксида азота (iNOS) в тканях толстой кишки, и это увеличение было ослаблено тремя тестируемыми молочными продуктами. Однако только эмментальский сыр восстановил в толстой кишке экспрессию гена Ocln, кодирующего трансмембранный белок окклюдин, который способствует барьерной функции кишечника [49].

Цитокины являются основными медиаторами патогенеза колита [5]. Таким образом, мы оценили экспрессию и концентрацию цитокинов в тканях толстой кишки. Результаты экспрессии цитокинов частично соответствовали результатам секреции цитокинов. DSS-индуцированный колит увеличивает секрецию IL-10 и TGFβ, что согласуется с наблюдаемой индукцией этих цитокинов у пациентов с ЯК [50]. Сыры как с одним штаммом, так и Эмменталь ослабили это увеличение. Однако только сыр Эмменталь, потребляемый в качестве защитной предварительной обработки, увеличивал экспрессию гена IL-10 в ткани толстой кишки по сравнению со всеми другими группами. IL-10 представляет собой противовоспалительный цитокин, который ингибирует выработку IL-1β, IL-6 и TNF-α. Его увеличение оказывает защитное действие по отношению к колиту, только если оно инициируется до индукции DSS-колита [51]. Ранее было показано, что L. delbrueckii subsp. lactis CNRZ327, а также P. freudenreichii CIRM-BIA 129 на животных моделях увеличивают подгруппу клеток Treg FOXP3, которые продуцируют большое количество IL-10 [18,23,47]. Точно так же TGFβ является противовоспалительным медиатором, который высоко продуцируется мононуклеарными клетками пациентов с ЯК [50]. В этом исследовании и сыры одного штамма, и сыры Эмменталь ослабили воспаление и, следовательно, секрецию TGFβ в контексте DSS-колита.

Колит увеличивал секрецию IFNγ и IL-6 и имел тенденцию увеличивать секрецию TNFα. На уровне экспрессии DSS индуцировал только экспрессию IFNγ по сравнению со здоровой группой. Потребление сырной матрицы, не содержащей микробов, не модулировало экспрессию TNFα, но снижало экспрессию IFNγ по сравнению с группой PBS-DSS. Однако матрица сыра не ослабляла секрецию IFNγ, TNFα и IL-6, запускаемую DSS. Как сыры одного штамма, так и сыры Эмменталь ослабили экспрессию гена IFNγ, но только сыр Эмменталь уменьшил секрецию IFNγ по сравнению с группой PBS-DSS. Точно так же потребление сыра Эмменталь уменьшило секрецию IL-6. IFNγ, IL-6 и TNFα, которые являются провоспалительными цитокинами и высоко секретируются в слизистой оболочке кишечника пациентов с ЯК [50]. TNF-α продуцируется антигенпрезентирующими клетками и макрофагами. Он индуцирует секрецию IL-6 и IFNγ, типичного цитокина подгруппы Th1-клеток. Секреция IL-6 и TGFβ может индуцировать клетки Th17, которые участвуют в патогенезе ВЗК [52,53]. Действительно, IL-17, цитокин клеток Th17, был повышен во время DSS-индуцированного колита и имел тенденцию ослабляться (p = 0,06) только введением сыра Эмменталь.

Взятые вместе, эти результаты показывают, что потребление сложного сыра Эмменталь и сыра с одним штаммом запускает различные механизмы. Пропионовокислые бактерии в сыре Эмменталь преобладают, в то время как молочнокислые бактерии подвергаются массовому лизису во время созревания сыра [54,55,56]. Однако было показано, что убитые молочнокислые бактерии модулируют химически индуцированный колит [57, 58, 59, 60]. Противовоспалительные свойства молочнокислых бактерий, вероятно, опосредованы компонентами клеточной стенки лизированных или мертвых клеток. Взаимодействия между пропионовой кислотой и молочнокислыми бактериями плохо охарактеризованы и могут модулировать их пробиотические свойства. В качестве примера, с одной стороны, протеолитическая активность молочнокислых бактерий может влиять на иммуномодулирующую поверхностную протеому пропионовокислых бактерий, а также на их способность продуцировать полезные метаболиты [13,61]. С другой стороны, протеолиз молочнокислых бактерий может вызывать высвобождение биологически активных пептидов из казеинов, которые могут участвовать в противовоспалительных свойствах сыра Эмменталь [62,63]. Необходимы дальнейшие исследования для расшифровки взаимодействий между пропионовыми и молочнокислыми бактериями и того, как они влияют на их пробиотические свойства. Эти исследования обеспечат критерии отбора для выбора наиболее эффективных молочнокислых и пропионовокислых бактерий для разработки противовоспалительных функциональных продуктов.

В заключение, сыр Эмменталь, полученный в промышленных условиях с использованием хорошо охарактеризованных иммуномодулирующих стартовых штаммов, был способен смягчить тяжесть вызванного DSS колита на мышиной модели. Этот защитный эффект, по-видимому, является результатом синергии молочнокислых и пропионовокислых бактерий. Это открывает новые перспективы для клинических исследований пациентов, страдающих язвенным колитом. Дальнейшие клинические исследования, проводимые с P. freudenreichii, должны также учитывать взаимодействие пропионибактерий с микробиотой кишечника человека. В предыдущих исследованиях сообщалось о бифидогенном эффекте потребления пропионибактерий [64,65]. Модуляция других сильнодействующих симбионтов, включая виды Akkermansia, Lactobacillus и Faecalibacterium, также должна быть оценена. И наоборот, заслуживает внимания модуляция сильнодействующих патобионтов с провоспалительным потенциалом. Например, сообщалось, что сульфатредуцирующие бактерии участвуют в воспалении при экспериментальном колите [66]. Они способствуют нарушению гомеостаза при воспалении кишечника, способствуя повреждению кишечника за счет образования сероводорода на высоких уровнях [67]. Действительно, колит коррелирует с измененным сообществом сульфатредуцирующих бактерий у мышей, демонстрируя повышенную выработку сероводорода [68]. Последнее может, в свою очередь, влиять на микробиоту кишечника и эффективность пробиотиков [69]. Действительно, некоторые лактобациллы, такие как L. reuteri, L. pentosus и L. paracasei, могут быть чрезвычайно чувствительными к сероводороду [70]. И наоборот, молочнокислые бактерии в тонком кишечнике могут выделять лактат, который служит донором электронов, в то время как сульфат служит акцептором электронов, при производстве сероводорода, как токсичного продукта в оси тонкого-толстого кишечника [71]. Таким образом, следует учитывать его ингибирующее действие на пробиотические бактерии, включая лактобациллы и пропионибактерии. Сложные взаимодействия между пробиотическими кисломолочными продуктами и микробиотой кишечника человека, а также его метаболитами будут определять их благотворную роль в контексте воспаления кишечника.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы можно найти по адресу https://www.mdpi.com/2076-2607/8/3/380/s1. Рисунок S1: анализ PFGE клонов Propionibacterium freudenreichii; Рисунок S2: анализ PFGE термофильных клонов стрептококков; Рисунок S3: анализ PFGE клонов мезофильных лактобацилл; Таблица S1: микробиологический анализ сыра Эмменталь, сыра с одним штаммом и матрицы сыра; Таблица S2: PFGE-анализ различных колоний, выделенных из чашек Петри, проведенный для подсчета P. freudenreichii, Lactobacillus и S. thermophilus в сыре Эмменталь; Таблица S3: Конкретные последовательности праймеров для нацеливания на мышиные гены, проанализированные в исследовании; Таблица S4: Секреторная IgA в разных группах экспериментальных мышей.

К разделу: Пропионовокислые бактерии: Лечение ВЗК

См. также:

• Эффективность пропионовокислых бактерий в лечении колита
• Многообещающие иммуномодулирующие эффекты отдельных штаммов молочных пропионибактерий, подтвержденные in vitro и in vivo
• Пропионовокислые бактерии в профилактике и лечении рака желудка и кишечника
• ВЗК, микробиота и иммунитет слизистой оболочки
• Роль комменсальной кишечной микробиоты в этиопатогенезе ВЗК
• Микробиом, метаболом и воспалительное заболевание кишечника

Литература

1. Diplock, A.T.; Aggett, P.; Ashwell, M.; Bornet, F.R.J.B.; Fern, E.B.; Roberfroid, M. Scientific concepts of functional foods in europe: Consensus document. Br. J. Nutr. 1999, 81, S1–S27. [Google Scholar]
2. Saris, W.H.; Asp, N.G.; Björck, I.; Blaak, E.; Bornet, F.; Brouns, F.; Frayn, K.N.; Fürst, P.; Riccardi, G.; Roberfroid, M.; et al. Functional food science and substrate metabolism. Br. J. Nutr. 1998, 80, S47–S75. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
3. Rabah, H.; Do Carmo, F.L.R.; Jan, G. Dairy propionibacteria: Versatile probiotics. Microorganisms 2017, 5, 24. [Google Scholar] [CrossRef]
4. Santaolalla, R.; Abreu, M.T. Innate immunity in the small intestine. Curr. Opin. Gastroenterol. 2012, 28, 124–129. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
5. Ko, J.K.; Auyeung, K.K. Inflammatory bowel disease: Etiology, pathogenesis and current therapy. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 1082–1096. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
6. Vindigni, S.M.; Zisman, T.L.; Suskind, D.L.; Damman, C.J. The intestinal microbiome, barrier function, and immune system in inflammatory bowel disease: A tripartite pathophysiological circuit with implications for new therapeutic directions. Therap. Adv. Gastroenterol. 2016, 9, 606–625. [Google Scholar] [CrossRef]
7. Zhang, Y.-Z.; Li, Y.-Y. Inflammatory bowel disease: Pathogenesis. World J. Gastroenterol. 2014, 20, 91–99. [Google Scholar] [CrossRef]
8. Derwa, Y.; Gracie, D.J.; Hamlin, P.J.; Ford, A.C. Systematic review with meta-analysis: The efficacy of probiotics in inflammatory bowel disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 2017, 46, 389–400. [Google Scholar] [CrossRef]
9. Ghouri, Y.A.; Richards, D.M.; Rahimi, E.F.; Krill, J.T.; Jelinek, K.A.; DuPont, A.W. Systematic review of randomized controlled trials of probiotics, prebiotics, and synbiotics in inflammatory bowel disease. Clin. Exp. Gastroenterol. 2014, 7, 473. [Google Scholar] [PubMed]
10. Sniffen, J.C.; McFarland, L.V.; Evans, C.T.; Goldstein, E.J.C. Choosing an appropriate probiotic product for your patient: An evidence-based practical guide. PLoS ONE 2018, 13, e0209205. [Google Scholar] [CrossRef]
11. Colliou, N.; Ge, Y.; Sahay, B.; Gong, M.; Zadeh, M.; Owen, J.L.; Neu, J.; Farmerie, W.G.; Alonzo, F.; Liu, K.; et al. Commensal Propionibacterium strain UF1 mitigates intestinal inflammation via Th17 cell regulation. J. Clin. Investig. 2017, 127, 3970–3986. [Google Scholar] [CrossRef]
12. Foligné, B.; Breton, J.; Mater, D.; Jan, G. Tracking the microbiome functionality: Focus on Propionibacterium species. Gut 2013, 62, 1227–1228. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
13. Thierry, A.; Falentin, H.; Deutsch, S.M.; Jan, G. Propionibacterium spp. In Encyclopedia of Dairy Sciences; Fuquay, J.W., Fox, P.F., Mc Sweeney, P.L.H., Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2011; pp. 403–411. [Google Scholar]
14. Foligné, B.; Deutsch, S.-M.; Breton, J.; Cousin, F.J.; Dewulf, J.; Samson, M.; Pot, B.; Jan, G. Promising immunomodulatory effects of selected strains of dairy propionibacteria as evidenced in vitro and in vivo. Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76, 8259–8264. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
15. Le Marechal, C.; Peton, V.; Ple, C.; Vroland, C.; Jardin, J.; Briard-Bion, V.; Durant, G.; Chuat, V.; Loux, V.; Foligne, B.; et al. Surface proteins of Propionibacterium freudenreichii are involved in its anti-inflammatory properties. J. Proteom. 2015, 113C, 447–461. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
16. Deutsch, S.-M.; Mariadassou, M.; Nicolas, P.; Parayre, S.; Le Guellec, R.; Chuat, V.; Peton, V.; Le Maréchal, C.; Burati, J.; Loux, V.; et al. Identification of proteins involved in the anti-inflammatory properties of Propionibacterium freudenreichii by means of a multi-strain study. Sci. Rep. 2017, 7, 46409. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
17. Rabah, H.; Ménard, O.; Gaucher, F.; do Carmo, F.L.R.; Dupont, D.; Jan, G. Cheese matrix protects the immunomodulatory surface protein SlpB of Propionibacterium freudenreichii during in vitro digestion. Food Res. Int. 2018, 106, 712–721. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
18. Rabah, H.; Ferret-Bernard, S.; Huang, S.; Le Normand, L.; Cousin, F.J.; Gaucher, F.; Jeantet, R.; Boudry, G.; Jan, G. The Cheese Matrix Modulates the Immunomodulatory Properties of Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA 129 in Healthy Piglets. Front. Microbiol. 2018, 9, 2584. [Google Scholar] [CrossRef]
19. Plé, C.; Breton, J.; Richoux, R.; Nurdin, M.; Deutsch, S.-M.; Falentin, H.; Hervé, C.; Chuat, V.; Lemée, R.; Maguin, E.; et al. Combining selected immunomodulatory Propionibacterium freudenreichii and Lactobacillus delbrueckii strains: Reverse engineering development of an anti-inflammatory cheese. Mol. Nutr. Food Res. 2016, 60, 935–948. [Google Scholar] [CrossRef]
20. Plé, C.; Richoux, R.; Jardin, J.; Nurdin, M.; Briard-Bion, V.; Parayre, S.; Ferreira, S.; Pot, B.; Bouguen, G.; Deutsch, S.-M.; et al. Single-strain starter experimental cheese reveals anti-inflammatory effect of Propionibacterium freudenreichii CIRM BIA 129 in TNBS-colitis model. J. Funct. Foods 2015, 18, 575–585. [Google Scholar] [CrossRef]
21. Ge, Y.; Gong, M.; Colliou, N.; Zadeh, M.; Li, J.; Jones, D.P.; Li, S.; Mohamadzadeh, M. Neonatal intestinal immune regulation by the commensal bacterium, P. UF1. Mucosal Immunol. 2019, 12, 434. [Google Scholar] [CrossRef]
22. George, F.; Daniel, C.; Thomas, M.; Singer, E.; Guilbaud, A.; Tessier, F.J.; Revol-Junelles, A.-M.; Borges, F.; Foligné, B. Occurrence and Dynamism of Lactic Acid Bacteria in Distinct Ecological Niches: A Multifaceted Functional Health Perspective. Front. Microbiol. 2018, 9, 2899. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
23. Santos Rocha, C.; Gomes-Santos, A.C.; Garcias Moreira, T.; de Azevedo, M.; Diniz Luerce, T.; Mariadassou, M.; Longaray Delamare, A.P.; Langella, P.; Maguin, E.; Azevedo, V.; et al. Local and systemic immune mechanisms underlying the anti-colitis effects of the dairy bacterium Lactobacillus delbrueckii. PLoS ONE 2014, 9, e85923. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
24. Santos Rocha, C.; Lakhdari, O.; Blottière, H.M.; Blugeon, S.; Sokol, H.; Bermúdez-Humarán, L.G.; Azevedo, V.; Miyoshi, A.; Doré, J.; Langella, P.; et al. Anti-inflammatory properties of dairy lactobacilli. Inflamm. Bowel. Dis. 2012, 18, 657–666. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
25. Junjua, M.; Kechaou, N.; Chain, F.; Awussi, A.A.; Roussel, Y.; Perrin, C.; Roux, E.; Langella, P.; Bermúdez-Humarán, L.G.; Le Roux, Y.; et al. A large scale in vitro screening of Streptococcus thermophilus strains revealed strains with a high anti-inflammatory potential. LWT—Food Sci. Technol. 2016, 70, 78–87. [Google Scholar] [CrossRef]
26. De Man, J.D.; Rogosa, M.; Sharpe, M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 1960, 23, 130–135. [Google Scholar] [CrossRef]
27. Terzaghi, B.E.; Sandine, W.E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl. Microbiol. 1975, 29, 807–813. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
28. Malik, A.C.; Reinbold, G.W.; Vedamuthu, E.R. An evaluation of the taxonomy of Propionibacterium. Can. J. Microbiol. 1968, 14, 1185–1191. [Google Scholar] [CrossRef]
29. Richoux, R.; Aubert, L.; Roset, G.; Kerjean, J.R. Impact of the proteolysis due to lactobacilli on the stretchability of Swiss-type cheese. Dairy Sci. Technol. 2009, 89, 31–41. [Google Scholar] [CrossRef]
30. Li, N.; Richoux, R.; Leconte, N.; Bevilacqua, C.; Maillard, M.-B.; Parayre, S.; Aubert-Frogerais, L.; Warlouzel, J.; Moya-Leclair, E.; Denis, C.; et al. Somatic cell recovery by microfiltration technologies: A novel strategy to study the actual impact of somatic cells on cheese matrix. Int. Dairy J. 2017, 65, 5–13. [Google Scholar] [CrossRef]
31. De Freitas, R.; Chuat, V.; Madec, M.-N.; Nero, L.A.; Thierry, A.; Valence, F.; de Carvalho, A.F. Biodiversity of dairy Propionibacterium isolated from dairy farms in Minas Gerais, Brazil. Int. J. Food Microbiol. 2015, 203, 70–77. [Google Scholar] [CrossRef]
32. Gautier, M.; de Carvalho, A.F.; Rouault, A. DNA fingerprinting of dairy propionibacteria strains by pulsed-field gel electrophoresis. Curr. Microbiol. 1996, 32, 17–24. [Google Scholar] [CrossRef]
33. Jan, G.; Rouault, A.; Maubois, J.L. Acid stress susceptibility and acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Lait 2000, 80, 325–336. [Google Scholar] [CrossRef]
34. Rossi, F.; Amadoro, C.; Colavita, G. Members of the Lactobacillus Genus Complex (LGC) as Opportunistic Pathogens: A Review. Microorganisms 2019, 7, 126. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
35. Jenkins, J.K.; Harper, W.J.; Courtney, P.D. Genetic diversity in Swiss cheese starter cultures assessed by pulsed field gel electrophoresis and arbitrarily primed PCR. Lett. Appl. Microbiol. 2002, 35, 423–427. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
36. Diehl, K.H.; Hull, R.; Morton, D.; Pfister, R.; Rabemampianina, Y.; Smith, D.; Vidal, J.M.; van de Vorstenbosch, C. European Federation of Pharmaceutical Industries Association and European Centre for the Validation of Alternative Methods A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J. Appl. Toxicol. 2001, 21, 15–23. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
37. Cooper, H.S.; Murthy, S.N.; Shah, R.S.; Sedergran, D.J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Investig. 1993, 69, 238–249. [Google Scholar]
38. McCafferty, D.M.; Sihota, E.; Muscara, M.; Wallace, J.L.; Sharkey, K.A.; Kubes, P. Spontaneously developing chronic colitis in IL-10/iNOS double-deficient mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2000, 279, G90–G99. [Google Scholar] [CrossRef]
39. Carvalho, R.D.; Breyner, N.; Menezes-Garcia, Z.; Rodrigues, N.M.; Lemos, L.; Maioli, T.U.; da Gloria Souza, D.; Carmona, D.; de Faria, A.M.C.; Langella, P.; et al. Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy Lactococcus lactis NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis. Microb. Cell Fact. 2017, 16, 27. [Google Scholar] [CrossRef]
40. Oliveira, J.S.; Costa, K.; Acurcio, L.B.; Sandes, S.H.C.; Cassali, G.D.; Uetanabaro, A.P.T.; Costa, A.M.; Nicoli, J.R.; Neumann, E.; Porto, A.L.F. In vitro and in vivo evaluation of two potential probiotic lactobacilli isolated from cocoa fermentation (Theobroma cacao L.). J. Funct. Foods 2018, 47, 184–191. [Google Scholar] [CrossRef]
41. Thierry, A.; Salvat-Brunaud, D.; Madec, M.N.; Michel, F.; Maubois, J.L. Swiss cheese ripening: Dynamics of bacterial populations and evolution of the aqueous phase composition for three industrial cheeses. Lait 1998, 78, 521–542. [Google Scholar] [CrossRef]
42. Langsrud, T.; Reinbold, G.W. Flavor development and microbiology of Swiss cheese. A. Review. II Starters, manufacturing process and procedures. J. Milk Food Technol. 1973, 36, 531–542. [Google Scholar] [CrossRef]
43. Gagnaire, V.; Molle, D.; Herrouin, M.; Leonil, J. Peptides identified during Emmental cheese ripening: Origin and proteolytic systems involved. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4402–4413. [Google Scholar] [CrossRef]
44. Foligné, B.; Parayre, S.; Cheddani, R.; Famelart, M.-H.; Madec, M.-N.; Plé, C.; Breton, J.; Dewulf, J.; Jan, G.; Deutsch, S.-M. Immunomodulation properties of multi-species fermented milks. Food Microbiol. 2016, 53, 60–69. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
45. Ohtsuka, Y.; Sanderson, I.R. Dextran sulfate sodium-induced inflammation is enhanced by intestinal epithelial cell chemokine expression in mice. Pediatr. Res. 2003, 53, 143–147. [Google Scholar] [PubMed]
46. Perše, M.; Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: Traps and tricks. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 2012, 718617. [Google Scholar] [CrossRef]
47. Do Carmo, F.L.R.; Rabah, H.; Cordeiro, B.F.; da Silva, S.H.; Pessoa, R.M.; Fernandes, S.O.A.; Cardoso, V.N.; Gagnaire, V.; Deplanche, M.; Savassi, B.; et al. Probiotic Propionibacterium freudenreichii requires SlpB protein to mitigate mucositis induced by chemotherapy. Oncotarget 2019, 10, 7198–7219. [Google Scholar] [CrossRef]
48. Vancamelbeke, M.; Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2017, 11, 821–834. [Google Scholar] [CrossRef]
49. Landy, J.; Ronde, E.; English, N.; Clark, S.K.; Hart, A.L.; Knight, S.C.; Ciclitira, P.J.; Al-Hassi, H.O. Tight junctions in inflammatory bowel diseases and inflammatory bowel disease associated colorectal cancer. World J. Gastroenterol. 2016, 22, 3117–3126. [Google Scholar] [CrossRef]
50. Roda, G.; Marocchi, M.; Sartini, A.; Roda, E. Cytokine Networks in Ulcerative Colitis. Available online: https://www.hindawi.com/journals/ulcers/2011/391787/ (accessed on 1 January 2019).
51. Cardoso, A.; Gil Castro, A.; Martins, A.C.; Carriche, G.M.; Murigneux, V.; Castro, I.; Cumano, A.; Vieira, P.; Saraiva, M. The Dynamics of Interleukin-10-Afforded Protection during Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis. Front. Immunol. 2018, 9, 400. [Google Scholar] [CrossRef]
52. Letterio, J.J.; Roberts, A.B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annu. Rev. Immunol. 1998, 16, 137–161. [Google Scholar] [CrossRef]
53. Wen, J.; Yang, P.; Chen, X.; Fang, Y.; Chang, Q.; Li, C.; Zhang, C. The role of Th17/Treg balance and Th22 cell in the pathogenesis of DSS-induced colitis in mice. Eur. J. Inflamm. 2015, 13, 101–108. [Google Scholar] [CrossRef]
54. Lazzi, C.; Povolo, M.; Locci, F.; Bernini, V.; Neviani, E.; Gatti, M. Can the development and autolysis of lactic acid bacteria influence the cheese volatile fraction? The case of Grana Padano. Int. J. Food Microbiol. 2016, 233, 20–28. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
55. Pang, X.; Zhang, S.; Lu, J.; Liu, L.; Ma, C.; Yang, Y.; Ti, P.; Gao, W.; Lv, J. Identification and Functional Validation of Autolysis-Associated Genes in Lactobacillus bulgaricus ATCC BAA-365. Front. Microbiol. 2017, 8, 1367. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
56. Valence, F.; Deutsch, S.M.; Richoux, R.; Gagnaire, V.; Lortal, S. Autolysis and related proteolysis in Swiss cheese for two Lactobacillus helveticus strains. J. Dairy Res. 2000, 67, 261–271. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
57. Foligné, B.; Nutten, S.; Steidler, L.; Dennin, V.; Goudercourt, D.; Mercenier, A.; Pot, B. Recommendations for improved use of the murine TNBS-induced colitis model in evaluating anti-inflammatory properties of lactic acid bacteria: Technical and microbiological aspects. Dig. Dis. Sci. 2006, 51, 390–400. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
58. Sang, L.-X.; Chang, B.; Wang, B.-Y.; Liu, W.-X.; Jiang, M. Live and heat-killed probiotic: Effects on chronic experimental colitis induced by dextran sulfate sodium (DSS) in rats. Int. J. Clin. Exp. Med. 2015, 8, 20072–20078. [Google Scholar] [PubMed]
59. Thakur, B.K.; Saha, P.; Banik, G.; Saha, D.R.; Grover, S.; Batish, V.K.; Das, S. Live and heat-killed probiotic Lactobacillus casei Lbs2 protects from experimental colitis through Toll-like receptor 2-dependent induction of T-regulatory response. Int. Immunopharmacol. 2016, 36, 39–50. [Google Scholar] [CrossRef]
60. Ueno, N.; Fujiya, M.; Segawa, S.; Nata, T.; Moriichi, K.; Tanabe, H.; Mizukami, Y.; Kobayashi, N.; Ito, K.; Kohgo, Y. Heat-killed body of lactobacillus brevis SBC8803 ameliorates intestinal injury in a murine model of colitis by enhancing the intestinal barrier function. Inflamm. Bowel Dis. 2011, 17, 2235–2250. [Google Scholar] [CrossRef]
61. Baer, A. Influence of casein proteolysis by starter bacteria, rennet and plasmin on the growth of propionibacteria in Swiss-type cheese. Lait 1995, 75, 391–400. [Google Scholar] [CrossRef]
62. Brown, L.; Pingitore, E.V.; Mozzi, F.; Saavedra, L.; Villegas, J.M.; Hebert, E.M. Lactic Acid Bacteria as Cell Factories for the Generation of Bioactive Peptides. Protein Pept. Lett. 2017, 24, 146–155. [Google Scholar] [CrossRef]
63. Politis, I.; Chronopoulou, R. Milk Peptides and Immune Response in the Neonate. In Bioactive Components of Milk; Bösze, Z., Ed.; Advances in Experimental Medicine and Biology; Springer New York: New York, NY, USA, 2008; pp. 253–269. ISBN 978-0-387-74087-4. [Google Scholar]
64. Kaneko, T. A novel bifidogenic growth stimulator produced by Propionibacterium freudenreichii. Biosci. Microfl. 1999, 18, 73–80. [Google Scholar] [CrossRef]
65. Seki, K.; Nakao, H.; Umino, H.; Isshiki, H.; Yoda, N.; Tachihara, R.; Ohuchi, T.; Saruta, H.; Suzuki, K.; Mitsuoka, T. Effects of fermented milk whey containing novel bifidogenic growth stimulator produced by Propionibacterium on fecal bacteria, putrefactive metabolite, defecation frequency and fecal properties in senile volunteers needed serious nursing-care taking enteral nutrition by tube feeding. J. Intest. Microbiol. 2004, 18, 107–115. [Google Scholar]
66. Figliuolo, V.R.; Dos Santos, L.M.; Abalo, A.; Nanini, H.; Santos, A.; Brittes, N.M.; Bernardazzi, C.; de Souza, H.S.P.; Vieira, L.Q.; Coutinho-Silva, R.; et al. Sulfate-reducing bacteria stimulate gut immune responses and contribute to inflammation in experimental colitis. Life Sci. 2017, 189, 29–38. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
67. Figliuolo, V.R.; Coutinho-Silva, R.; Coutinho, C.M.L.M. Contribution of sulfate-reducing bacteria to homeostasis disruption during intestinal inflammation. Life Sci. 2018, 215, 145–151. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
68. Kushkevych, I.; Leščanová, O.; Dordević, D.; Jančíková, S.; Hošek, J.; Vítězová, M.; Buňková, L.; Drago, L. The Sulfate-Reducing Microbial Communities and Meta-Analysis of Their Occurrence during Diseases of Small-Large Intestine Axis. J. Clin. Med. 2019, 8, 1656. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
69. Wallace, J.L.; Motta, J.-P.; Buret, A.G. Hydrogen sulfide: An agent of stability at the microbiome-mucosa interface. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2018, 314, G143–G149. [Google Scholar] [CrossRef]
70. Kushkevych, I.; Kotrsová, V.; Dordević, D.; Buňková, L.; Vítězová, M.; Amedei, A. Hydrogen Sulfide Effects on the Survival of Lactobacilli with Emphasis on the Development of Inflammatory Bowel Diseases. Biomolecules 2019, 9, 752. [Google Scholar] [CrossRef]
71. Kushkevych, I.; Dordević, D.; Kollar, P.; Vítězová, M.; Drago, L. Hydrogen Sulfide as a Toxic Product in the Small-Large Intestine Axis and its Role in IBD Development. J. Clin. Med. 2019, 8, 1054. [Google Scholar] [CrossRef]

Будьте здоровы!