Пропионовокислые бактерии как пробиотики

Пропионовокислые бактерии как пробиотики

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) обладают комплексом физиолого-биохимических свойств, что позволяет включать их в состав пробиотических композиций. Их потенциальные ресурсы пока недооценены. Список описанных пробиотических характеристик ПКБ необходимо расширить за счет добавления антимутагенной, реактивирующей и защитной (протекторной) активности, впервые обнаруженной нашей группой. Живые и мертвые клетки ПКБ и Luteococcus casei (лютеококк из семейства Propionibacteriaceae), а также их культуральная жидкость (КЖ) проявляли антимутагенное (АМ) действие на спонтанный и индуцированный мутагенез. Защитная и реактивная активность клеток Propionibacterium freudenreichii связана с внутриклеточным белком, идентифицированным как цистеинсинтаза, синтез которого индуцируется некоторыми стрессорными факторами. В неблагоприятных условиях, приводящих к лизису большинства клеток, выделившийся белок может играть жизненно важную роль в клеточной популяции в целом, поддерживая существование вида. Активный белок проявляет перекрестно-реактивные свойства, как защитное, так и реактивирующее действие на клетки кишечной палочки и дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida guilliermondii. Филогенетически близкий к ПКБ Luteococcus casei продуцирует и выделяет в среду белковый метаболит, обладающий защитным и реактивирующим действием на клетки продуцента, Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae и Candida scottii, обработанные нагреванием и УФ-облучением. Экзометаболит синтезируется клетками в логарифмической фазе роста. Эффективность его воздействия обратно пропорциональна выживаемости микробов. КЖ Luteococcus casei рассматривается как источник нового пребиотика с реактивирующими и защитными свойствами

Фон

Совокупность всех микробных биоценозов человека и животных рассматривается как своеобразный экстракорпоральный орган. Общее количество его клеток превышает количество всех эукариотических клеток из тканей и органов (1). Концентрация бактериальных клеток в желудке, двенадцатиперстной и тонкой кишке может достигать 10⁵ клеток/г. Ощелачивание приводит к увеличению бактериальной численности, которая достигает 10¹⁰-10¹¹ клеток/г (2). Разнообразие бактерий включает более 500 видов. Общая масса бактерий в толстой кишке взрослого человека достигает 1,5-2,0 кг.

Роль кишечных микроорганизмов заключается в биосинтезе витаминов групп В и К, аминокислот и белков; метаболизме желчных пигментов и желчных кислот; адсорбции питательных веществ и микроэлементов; обеззараживании патогенов; регуляции перистальтики кишечника; защите от ксенобиотиков и образовании летучих кислот путем разложения продуктов.

Облигатные микроорганизмы кишечника не изолированы, а постоянно взаимодействуют с окружающей средой, центральной нервной, эндокринной и иммунной системами. Многочисленные дисбалансы приводят к тяжелым заболеваниям. В частности, применение антибиотиков угнетает фекальную микрофлору. При этом факультативные микробы могут колонизировать кишечник. Часто желудочно-кишечные инфекции связаны с колонизацией Helicobacter pylori. Считается, что эти бактерии провоцируют гастрит и дуоденит и играют определенную роль в развитии рака.

Устойчивые изменения соотношения нормальной микрофлоры пищеварительного тракта приводят к дисбактериозу. Комплексное ее лечение включает восстановление количества и/или баланса микробов нормальной микрофлоры путем применения пробиотиков. Пробиотики представляют собой монокультуры или смешанные культуры живых микроорганизмов, положительно влияющие на здоровье человека и животных за счет улучшения свойств эндогенной микрофлоры (3).

Некоторые лактобациллы, бифидобактерии и нелактобактерии, такие как Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium freudenreichii и дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, считаются пробиотиками для человека (4). В целом 96-99% резидентной микрофлоры кишечника человека являются строгими анаэробами, растущими при низких окислительно-восстановительных потенциалах среды. Таким образом, предполагается, что использование электролизованной воды, католита со значительными восстановительными свойствами, может способствовать жизнедеятельности нормальной микрофлоры (5).

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) объединены в семейство Propionibacteriaceae, род Propionibacterium. Их отличительными особенностями являются: образование пропионовой кислоты в результате пропионовокислого брожения, зависимого от кофермента В12, и высокое содержание G+C (65-67%).

В зависимости от особенностей среды обитания ПКБ делятся на две группы: молочные, или классические, и кожные. Первые выделяют из молока, кисломолочных продуктов и сыра; они также содержатся в 24 видах овощей и фруктов. Кожные ПКБ представляют собой единственную анаэробную микрофлору здоровой кожи человека и компонент ассоциантов рубца жвачных животных (Ассоциация микробов - это сосуществование двух и более видов микроорганизмов в естественных (природных) и искусственно создаваемых условиях независимо от линии генетических связей и обладающих различными биологическими свойствами. В таком состоянии они могут находиться постоянно (аутофлора) или временно (паразитоценоз) в организме человека и животных - ред.). Молочные ПКБ использовались в сыроварении с древних времен. В России они входят в состав заквасок некоторых молочных продуктов, таких как «ПАМ» (ацидофильное молоко, обогащенное коммерческим препаратом пропионовокислых бактерий P. freudenreichii subsp. Shermanii – ред.) и «Тонус», и являются источником витамина В12, порфиринов, антиоксидантных ферментов (СОД и каталазы) и пропионовой кислоты (6), но их потенциал в качестве пробиотиков, как правило, недооценивается (новые продукты: «Целебный», «Пропионикс кефирный» - ред.).

Некоторые бактерии были выделены из сыра на ранней стадии созревания. Они проводят ферментацию, типичную для рода Propionibacterium, и имеют высокое сходство по содержанию G+C (63,4%). Они были отнесены к роду Luteococcus на основании анализа линейного полиморфизма рестриктированных фрагментов ДНК и MALDI-TOF-масс-спектрального анализа белков цитоплазмы (прим. ред.: масс-спектрометр, наиболее широко используемый с MALDI - масс-спектрометр времени полета (TOF)). Штамм был идентифицирован как Luteococcus japonicus subsp. casei (Luteococcus japonicus - грамположительная и неподвижная бактерия из рода Luteococcus, выделенная из почвы в Японии - ред.) Они синтезируют экзометаболиты, обладающие как защитными, так и реактивными свойствами, и представляют несомненный интерес в связи с проблемами, обсуждаемыми в настоящей статье.

Пробиотические свойства ПКБ

Пробиотические свойства ПКБ связаны с: I) образованием полезных метаболитов и антимикробных соединений; II) синтезом β-галактозидазы, фермента, расщепляющего лактозу, что предотвращает непереносимость лактозы у некоторых людей; III) бифидогенной активностью; IV) массовым синтезом трегалозы, низкокалорийного углевода; V) содержанием некоторых микроэлементов (Mn-267, Fe-535, Cu-102; в мг/кг) в биомассе ПКБ, (7) которое превышает их концентрацию в молочноксилых и бифидобактериях; VI) снижением активности канцерогенных ферментов, β-глюкоронидазы, нитроредуктазы и азоредуктазы, которые превращают фекальные прокарциногены в активные формы канцерогенов (8) (данные были получены на животных, но ПКБ может вызывать аналогичные эффекты у людей); VII) образованием и накоплением во время восстановления нитратов и нитритов (9) (монооксид азота (NO) контролирует многие важные функции, такие как нейротрансмиссия, расширение сосудов, перистальтика кишечника и защита слизистой оболочки; хронические кишечные заболевания иногда вызываются отсутствием образования NO в организме); VIII) синтезом соединений с полезными физиологическими и противораковыми свойствами посредством изомеризации линолевой кислоты в P. freudenreichii ssp. shermanii; IX) апоптозом клеток колоректальной карциномы in vitro тем же штаммом (10).

Антимикробные продукты

Конечными продуктами энергетического обмена в ПКБ являются пропионовая и уксусная кислоты и СО₂. Кислоты не поддерживают рост гнилостных бактерий, клостридий, дрожжей и грибков. СО₂ участвует в снижении окислительно-восстановительного потенциала и токсичен для ряда аэробных гнилостных бактерий. Некоторые штаммы ПКБ продуцируют бактериоцины, которые ингибируют рост и выживание клеток Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica, а также, в отличие от молочнокислых бактерий, рост грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесени (11,12).

Антимутагенная активность

В настоящее время естественные защитные механизмы не всегда справляются с резким повышением мутационного давления, поэтому поиск и наличие антимутагенов следует рассматривать как элемент компенсаторного подхода к защите генофонда. Таким образом, большое значение в улучшении здоровья человека имеет возможность снижения количества мутагенов с использованием в качестве антимутагенного (АМ) фактора бактерий, преимущественно обитающих в кишечном тракте. Впервые продемонстрирована АМ-активность ПКБ в отношении мутаций, индуцированных 4-нитрохинолином и N-нитро-N-нитрозогуанидином (переходные мутации), а также 9-аминоакридином и 2-нитрофлуореном (мутации со сдвигом рамки считывания) (13). Живые и мертвые клетки, а также культуральная жидкость (КЖ) обладают АМ-эффектом. Показано, что АМ-активность КЖ обусловлена белковым соединением. AM-свойства ПКБ невозможно переоценить, принимая во внимание наличие в пище различного количества мутагенов.

Стимуляция роста бифидобактерий

ПКБ генерируют и выделяют бифидогенные метаболиты, способствуя росту некоторых штаммов бифидобактерий (11). 2-Амино-3-карбокси-1,4-нафтохинон, синтезируемый P. freudenreichii, является активным бифидогенным стимулятором.

Источники нутрицевтиков

Нутрицевтики обладают как питательными, так и лечебными свойствами. Уникальный метаболизм ПКБ обеспечивает их клетки набором кофакторов, в основном участвующих в переносе и перегруппировке С-1-соединений. Примечательно, что ключевая реакция пропионового брожения (превращение метилмалонил-КоА в пропионил-КоА) присутствует в клетках человека, но имеет противоположную направленность, приводя к образованию сукцината, необходимого для синтеза цитохромов, каталазы и других соединений порфиринового происхождения. ПКБ производит другие нутрицевтики, такие как витамины B9 и B12 и производные нуклеотидов. ПКБ являются рекордсменами по биосинтезу витамина В12. Его получают в результате промышленного культивирования этих бактерий. Витамин В12 принимает участие в кроветворении и применяется в терапии пернициозной анемии. Некоторые штаммы также продуцируют фолиевую кислоту (витамин B9). Фолиевая кислота является кофактором многочисленных метаболических реакций, включая биосинтез нуклеотидов, структурных блоков РНК и ДНК. Низкое содержание фолиевой кислоты коррелирует с повышенным содержанием гомоцистеина в крови и, следовательно, с сердечными заболеваниями (14). Сообщалось о некоторых доказательствах роли фолиевой кислоты в предотвращении определенных опухолей. ПКБ можно использовать в качестве клеточных фабрик при производстве фолиевой кислоты.

Производные нуклеотидов применяются в терапии для профилактики и лечения тромболитических заболеваний.

Накопление трегалозы

При различных стрессах клетки ПКБ вырабатывают значительное количество трегалозы, низкокалорийного пищевого сахара. Трегалоза служит стабилизатором белка, сохраняет естественный цвет и вкус пищи, ее свежесть.

Адгезивные свойства и способность выживать в кишечном тракте

Эффективные пробиотические бактерии должны обладать высокой адгезией и способностью сохранять жизнеспособность, несмотря на множество неблагоприятных факторов, таких как желудочные кислоты и ферменты, соли желчных кислот и ферменты тонкого кишечника, а также антагонистическое влияние других бактерий. В модельных опытах in vitro было показано, что уровень адгезии ПКБ составляет до 0,2-0,6% всех добавленных бактерий (15). Уровень адгезии лактобактерий и бифидобактерий был достоверно выше: от 1,3 до 24,3%. Установлено, что адгезия ПКБ может быть усилена их предварительной коагрегацией с другими пробиотическими бактериями. Устойчивость ПКБ к кислотности и солям желчных кислот повышалась предварительной адаптацией к вышеперечисленным стрессовым факторам (16).

ПКБ составляют незначительную часть от общей микрофлоры кишечника здорового человека (0,001%); однако ежедневное пероральное введение в течение недели приводило к достоверному увеличению их содержания (до 10⁶ клеток/г). Этого количества вполне достаточно для проявления благоприятного воздействия на экологию кишечника и физиологию хозяина.

Эффект ПКБ как стимулятора роста других полезных бактерий достигается без колонизации и адгезии в кишечном тракте.

Защитная и реактивная активность - новые критерии использования ПКБ в качестве пробиотиков

В естественных условиях в организме человека и животных, при переработке пищевых продуктов и введении лекарственных средств бактерии периодически подвергаются воздействию различных стрессовых факторов. Сублетальные и летальные дозы стрессоров не всегда блокируют клеточное деление. Способность бактерий к выживанию в стрессовых ситуациях зависит от функционирования индуцируемых механизмов адаптации, включающих аутоиндукторы, компоненты белковой и небелковой природы (17).

Защитные экзометаболиты обнаружены у клеток Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и Lb. casei. Они могут напрямую взаимодействовать с клеточными структурами, нейтрализовать активные молекулы (18) или действовать как сигнальные молекулы, вызывая активацию реакции на стресс (17).

Белок с молекулярной массой 35 кДа был выделен из клеток P. freudenreichii (19). Оказывал как защитное, так и реактивирующее действие на клетки-продуценты и клетки кишечной палочки, подвергнутые УФ-облучению, нагреванию и воздействию желчных кислот. Путем секвенирования N-концевой и внутренней областей белка он был идентифицирован как цистеинсинтаза. Белок вырабатывается конститутивно, и его синтез усиливается нагреванием, УФ-светом и обработкой детергентом. Активный белок не выделяется в окружающую среду и проявляет защитные свойства в стрессовых ситуациях. При высокой смертности клеток, подвергаясь лизису, они выделяют свое содержимое. В то же время часть популяции, потенциально способная к репликации, но пораженная шоком, получает сигнал, активирующий в клетках естественные системы репарации. Иными словами, обнаруженный нами внутриклеточный реактивирующий белок может играть жизненно важную роль в клеточной популяции в целом, поддерживая существование вида в неблагоприятных условиях.

Белковый экзометаболит с реактивирующим и защитным (протекторным) действием выделяли фильтрованием культуральной жидкости из Luteococcus casei через смешанные ацетатные мембраны. Его биологическая активность связана с компонентом (м.м. около 8 кДа), полученным с помощью ВЭЖХ-гель-фильтрации (эксклюзионной хроматографии). Масс-спектральный анализ показал, что этот пептид имеет м.м. 7,6 кДа и составляет до 80% общего белка фракции, элюируемой с мембранного фильтра. Экзометаболит образуется во время логарифмической фазы роста Luteococcus casei и накапливается в среде в незначительных количествах. Наоборот, его количество достаточно для увеличения выживаемости бактерий в стрессированных клетках в 4-6 раз по сравнению с контрольными клетками. Для оценки защитного или реактивирующего действия клетки инкубировали в течение 10 мин до или после воздействия стрессового фактора перед их посевом на плотную среду. Контрольные клетки инкубировали в 3% растворе NaCl (элюент). Реактивный эффект экзометаболитов обратно зависел от выживаемости бактерий. Активный метаболит не обладает как митогенным, так и бактерицидным действием на продуцента и различные штаммы ПКБ. Белковый экзометаболит Luteococcus casei обладает уникальной широтой микробного спектра антистрессового действия. Была продемонстрирована перекрестная реакция активного фактора на стрессовые клетки E. coli и примитивных эукариот, дрожжей S. cerevisiae и Candida scottii (20,21). Широкая широта антистрессового действия и простота выделения экзометаболита из культуральной жидкости позволяют рассматривать его как новый перспективный пребиотик.

Вывод

Изучение пропионовокислых бактерий (ПКБ), их взаимосвязи с иммунными функциями и метаболизмом человеческого организма должно быть продолжено ввиду очевидных положительных эффектов этих бактерий. Увеличение содержания ПКБ в желудочно-кишечном тракте человека служит важной задачей. Это требует создания селективных штаммов бактерий, способных оседать и конкурировать с компонентами микрофлоры кишечника и быть совместимыми с другими пробиотиками.

Дополнительная информация:

• Пропионовокислые бактерии
• Молочные пропионибактерии: Универсальные пробиотики
• Propionibacterium freudenreichii: Общие характеристики и пробиотические свойства
• Антибиотикорезистентность, антагонистическая активность и биосовместимость пропионовокислых бактерий
• Противодействие ожирению и противодиабетические эффекты молочной бактерии Propionibacterium freudenreichii
• Безопасность молочных пропионовкислых бактерий
• Антиоксидантные свойства пропионовокислых бактерий P. freudenreichii
• Бифидогенный стимулятор роста, продуцируемый P. freudenreiichii
• Пропионовокислые бактерии в профилактике и лечении рака
• Польза пропионибактерий из сыра в отношении колита
• Эффективность пропионовокислых бактерий в лечении колита
• Молочные пропионовокислые бактерии смягчают воспаление, модулируя путь ядерного фактора «каппа-би» с помощью внеклеточных везикул
• Многообещающие иммуномодулирующие эффекты отдельных штаммов молочных пропионибактерий, подтвержденные in vitro и in vivo
• Кислотоустойчивость пропионовокислых бактерий
• Пропионовая кислота и пропионаты
• Антимутагенная активность пропионовокислых бактерий
• Некоторые пробиотически значимые свойства пропионибактерий
• Пропионовокислые бактерии в лечении мукозита, вызванного химиотерапией
• Снижение риска гепатокарциномы с помощью пропионовокислых и лактобактерий
• Молочные пропионовокислые бактерии предотвращают остеопороз

• Пропионовокислые бактерии защищают от микотоксинов

• Бактериоцины пропионовокислых бактерий
• Кислотоустойчивость пропионовокислых бактерий
• Биотехнологический потенциал пропионовокислых бактерий
• О пропионовокислых бактериях (статья, автор:Воробьева Л.И.)
• Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 288 с. (монография, автор - Воробьева Л.И.)
• Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий (монография, автор Хамагаева И.С.)
• Предпосылки для испытаний штамма Propionibacterium freudenreichii RVS-4-irf в качестве компонента клинического питания (Автор: Рыжкова Е.П.)
• Молочные пропионовокислые бактерии увеличивают продолжительность жизни нематод Caenorhabditis elegans через активацию иммунной системы - (иссл.)

Литература

1. Shenderov BA. Medical microbial ecology and functional nutrition. Moscow: Grant, 2001 (in Russian).
2. Saarela M, Lahteenmaki L, Crittenden R, Salminen S, Mattila-Sandholm T. Gut bacteria and health foods - the European perspective. Int J Food Microbiol. 2002;78:99-117.
3. Fuller R. Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol. 1989;66:365-78.
4. Holzapfel W, Haberer J, Snell U, Schillinger JHJ, Huis in’t Veld JH. Overview of gut flora and probiotics. Int J Food Microbiol. 1998;41:85-101.
5. Vorobjeva NV. Selective stimulation of the growth of anaerobic microflora in the human intestinal tract by electrolyzed reducing water. Med Hypotheses. 2005;64:543-6.
6. Vorobjeva LI. Propionibacteria. Dordrecht: Kluwer Academic; 1999.
7. Mantere-Alhonen S. Propionibacteria used as probiotics. A review. Lait. 1995;75:447-52.
8. Perez-Chaia A, Zarate G, Oliver G. The probiotic properties of propionibacteria. Lait. 1999;79:175-86.
9. Roland N, Avice JC, Ourry A, Maubois JL. Production of nitric oxide by propionibacteria: a new criterion for their utilization as probiotics. Second International Symposium on Propionibacteria, University College, Cork, Ireland, 1998:40.
10. Jan G, Belzacq S, Haouzi D, Rouault A, Metivier D, Kroemer G, et al. Propionibacteria induce apoptosis of colorectal carcinoma cells via short-chain fatty acids acting on mito- chondria. Cell Death Differ. 2002;9:179-88.
11. Warminska-Radiko I, Laniewske-Moroz L, Babuchowski A. Influence of propionibacteria on selected pathogenic microorganisms. 3rd International Symposium on Propionibac-  teria, Zurich, 8-11 July 2001:36.
12. Holo H, Faye T, Brede DA, Nilsen T, Oregard I, Langsrud T, et al. Bacteriocins of propionic acid bacteria. Lait. 2002;82: 59-68.
13. Vorobjeva LI. Antimutagenic properties of bacteria: review. Appl Biochem Microbiol. 2002;38:97-107.
14. Hugenholtz J, Hunik J, Santos H, Smid E. Nutraceutical production by propionibacteria. Lait. 2002;82:103-13.
15. Jan G, Leverrier P, Proudi I, Roland N. Survival and beneficial effects of propionibacteria in the human gut: in vivo and in vitro investigations. Lait. 2002;82:131-44.
16. Leverrier P, Dimova D, Pichereau V, Auffrey Y, Boyaval P, Jan G. Susceptibility and adaptive response to bile salts in Propionibacterium freudenreichii: physiological and proteomic analysis. Appl Environ Microbiol. 2003;69:3809-18.
17. Rowbury RJ. UV radiation-induced enterobacterial responses, other processes that influence UV tolerance and likely environmental significance. Sci Prog. 2003;86:1-23.
18. Vorobjeva LI. Physiological peculiarities of propionibacteria - present facts and prospective applications. Sci Prog. 2000;83: 277-301.
19. Vorobjeva LI, Leverrier P, Zinchenko AA, Boyaval P, Khodjaev E, Jan G. Anti-stress activity of Propionibacterium freudenreichii: identification of a reactivative protein. Antonie van Leeuwehoek. 2004;85:53-65.
20. Vorobjeva LI, Khodjaev EY, Ponomareva GM. The extra-cellular protein of Luteococcus japonicus subsp. casei reactivates cells inactivated by UV irradiation or heat shock. Microbiology 2003;72:482-7 (in Russian).
21. Vorobjeva LI, Khodjaev EY, Ponomareva GM.  Cross-effects of extracellular factors of adaptation to stress in Luteococcus casei and Saccharomyces cerevisiae. Appl Biochem Microbiol 2005;41:171-5 (in Russian).

Будьте здоровы!