Пропионовокислые бактерии защищают от микотоксинов

 Влияние Пропионибактерий на рост и выработку микотоксинов некоторыми видами Fusarium и Alternaria

Зафиксированы случаи наличия микотоксина не только в растительных, но и в продуктах животного происхождения 

Предисловие редактора

Микотоксины – токсины, которые образуются в процессе жизнедеятельности плесневых грибов; широко распространенные загрязнители продовольственного сырья, продуктов питания человека, и кормов для животных, которые способны нанести вред здоровью. Загрязнение продуктов может произойти на любом из этапов производства.

Микотоксины способны поражать разные группы пищевых продуктов. Степень токсичности одних веществ может быть незначительной, другие грибы способны вызвать сильное отравление человека, развитие рака внутренних органов. Поэтому категорически нельзя употреблять продукты с плесенью.

Эти биологические агенты могут представлять серьезную опасность для здоровья. Некоторые виды плесени способны вызывать у человека отравления – микотоксикозы, которые могут стать причиной развития тяжёлых и опасных для жизни патологий или генных мутаций. В зависимости от видовой принадлежности микотоксины способны поражать органы кроветворения, мышечные волокна, печеночную ткань, сердечно–сосудистую систему, ткани нервной системы, почечную ткань.

Микотоксины попадают в организм только с пищей (алиментарным путем), в результате потребления загрязненных продуктов. Повышенная влажность, теплый воздух, доступ кислорода, наличие органических веществ способствуют их развитию. В таких условиях плесневые грибы быстро образуют большие колонии, где концентрация токсинов постоянно увеличивается.

Наиболее подвержены загрязнению плесневыми грибами злаковые культуры. При нарушении условий хранения они могут образовываться в любых продуктах.

Не всегда можно определить наличие плесневых грибов по внешнему виду, однако они существенно влияют на органолептические свойства: появляется горечь, неприятный вкус, специфический запах (плесневый). Это обусловлено распадом органических веществ под действием микотоксинов.

Афлатоксины – самая опасная группа микотоксинов для человека и животных, обладают сильнейшим канцерогенным действием. Этот микотоксин является мощным гепатотропным ядом, который поражает клетки печени (об этом см. подробнее в разделе: Снижение риска гепатокарциномы с помощью пробиотиков).

Итак, очередное исследовании защитных свойств пропионибактерий от микотоксинов грибов Fusarium и Alternaria

Резюме

Целью данного исследования было изучение противогрибковых свойств пропионибактерий. Три фракции из культур Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii 41 и ssp. freudenreichii 111 (то есть культура, содержащая жизнеспособные бактерии, бесклеточный супернатант и препарат бактериоцина) были проверены на их способность ингибировать рост и продукцию микотоксинов грибов Alternaria alternata (Альтернария альтерната), Fusarium culmorum (Фузариум соломинковый), Fusarium graminearum (Фузариум злаковый) и Fusarium verticillioides (Фузариум початков кукурузы). Рост грибов контролировали во время культивирования с использованием метода посева. Концентрацию продуцируемых токсинов измеряли с помощью ВЭЖХ на 14-й день культивирования. В культурах грибов A. alternata определяли альтенуен (альтенуол) и тенуазоновую кислоту, а в культурах Fusarium измеряли концентрацию ниваленола, дезоксиниваленола, фумонизина B₁ и зеараленона. Наиболее сильное ингибирование роста и продукции токсина наблюдалось в присутствии культур, содержащих жизнеспособные клетки и супернатанты, полученные из культур пропионибактерий. Экстракты бактериоцина обычно оказывали слабое фунгистатическое (противогрибковое) действие на рост A. alternata, F. culmorum и F. graminearum. Способность P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111 для удаления зеараленона из жидкой среды также оценивали. Было показано, что как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки вызывали снижение концентрации зеараленона в среде.

Введение

Грибы представляют собой разнообразную группу эукариотических организмов, ответственных за большинство болезней растений, а также за некоторые инфекционные заболевания человека. Грибки также являются значительными микроорганизмами, приводящими к порче пищи; кроме того, они могут быть вредны для человека из-за производства микотоксинов. Эти метаболиты могут оказывать мутагенное, тератогенное или канцерогенное действие как на человека, так и на животных. Микотоксины могут встречаться в различных сельскохозяйственных продуктах, попадая в пищевую цепочку при выращивании, сборе урожая, транспортировке и хранении. Kuiper-Goodman et al. (1996) заявили, что микотоксины являются наиболее важным хроническим диетическим фактором риска. Подсчитано, что во всем мире около 5,10% всего производства пищевых продуктов могут быть испорчены вышеупомянутыми организмами (Pitt and Hocking, 1999).

Роды Fusarium и Alternaria обычно встречаются в природе, а также часто встречаются в различных товарах, особенно сельскохозяйственного происхождения. Многие виды Fusarium производят микотоксины, такие как трихотецены, фумонизины и зеараленон. Первая группа, то есть трихотецены, включает ниваленол, дезоксиниваленол, фузаренон-х, токсин Т-2, неосоланиол и диацетоксисцирпенол, которые обычно встречаются в злаках, особенно в странах с умеренным климатом (Côté et al., 1986). Фумонизины представляют собой вторую группу родственных микотоксинов, вырабатываемых в основном Fusarium verticillioides. Они часто встречаются в кукурузе, которая используется в основном в качестве корма для животных, а также в некоторых продуктах на основе кукурузы, предназначенных для потребления человеком (Marasas, 2001; Kuiper-Goodman et al., 1996). Наиболее часто выявляемыми, но не самыми токсичными микотоксинами, продуцируемыми Fusarium, являются фумонизины и дезоксиниваленол. Последним из вышеупомянутых токсинов Fusarium является зеараленон, который представляет собой нестероидный эстрогенный микотоксин, продуцируемый различными видами Fusarium, такими как F. culmorum или F. graminearum, которые являются регулярными загрязнителями зерновых культур по всему миру (Haggler et al., 2001). Род Alternaria может быть ответственен за порчу таких важных с коммерческой точки зрения товаров, как фрукты и овощи (Stinson et al., 1980). Виды Alternaria продуцируют многочисленные токсичные вторичные метаболиты, такие как тенуазоновая кислота, альтерианол, альтенуен, метиловый эфир альтернариола и альтертоксин I, II и III (King and Schade, 1984). Токсины альтернарии (Alternaria) проявляют токсическое действие на культуры бактериальных, растительных, животных, а также человеческих клеток (Stack and Prival, 1986; Yekeler et al., 2001).

Бактерии могут защитить пищу от грибковой порчи путем конкурентного роста или производства антимикробных метаболитов. Некоторые сообщения указывают, что различные бактерии, такие как некоторые пробиотические виды Lactobacillus (El-Nezami et al., 2002a, b) или дрожжи (Böswald et al., 1995), могут вызывать деградацию или удаление микотоксинов из питательной среды. Некоторые авторы сообщают о возможности деградации или биотрансформации микотоксинов микроорганизмами. El-Sharkawy et al. (1991) описали превращение зеараленона несколькими видами грибов, отобранными из группы из 23 микроорганизмов, принадлежащих к 7 родам. Böswald et al. (1995) наблюдали превращение зеараленона в α- и β-зеараленол дрожжами Candida tropicalis, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces rouxii и некоторыми штаммами сахаромицетов. El-Nezami et al. (2002а) описали значительное снижение концентрации зеараленона в жидкой среде Lactobacillus rhamnosus. Авторы предположили, что зеараленон был связан с поверхностью клеток, поскольку удаление токсина наблюдалось как жизнеспособными, так и нежизнеспособными клетками. Те же авторы описали способность L. rhamnosus GG и LC705 и Propionibacterium shermanii JS, которые были охарактеризованы как пробиотики, связывать трихотецены и афлатоксины (El-Nezami et al., 1998, 2000, 2002b; Peltonen et al., 2000).

Целью представленной здесь работы является оценка противогрибковой активности P. freudenreichii ssp. shermanii 41 и ssp. freudenreichii 111 против A. alternata и трех видов Fusarium (F. culmorum, F. graminearum и F. verticillioides). В большинстве статей противогрибковая активность пропионибактерий была исследована методом посева, то есть сначала с помощью предварительного выращивания бактерий на агаре, а затем с грибами на мягком агаре (Lind et al., 2005; Miescher et al., 2000). В настоящей статье мы изучили влияние различных фракций, полученных из культур пропионибактерий, как на рост грибов в жидкой среде, так и на продукцию микотоксинов.

Поскольку некоторые авторы показали, что пропионовокислые бактерии способны удалять микотоксин из среды (El-Nezami et al., 2000, 2002b), мы также исследовали способность одного штамма P. freudenreichii удалять зеараленон из PBS (фосфатный буферный физиологический раствор). 

Эксперименты

Материалы и методы

Микроорганизмы и среды. Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii 41 был получен из аграрного университета Познани (Польша) и P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111 был получен из Варминско-Мазурского университета (Ольштын, Польша). Образцы грибов: Alternaria alternata 684, Fusarium culmorum F724, Fusarium graminearum F722 и Fusarium verticillioides F728 были получены из Института защиты растений коллекции патогенных микроорганизмов (BPR) в Познани, Польша. Казеиновую среду использовали для бактериального культивирования. Состав этой среды был описан ранее (Gwiazdowska and Trojanowska, 2006). Картофельный декстрозный бульон (PDB; BTL, ód., Poland) использовали для грибковых культур.

Приготовление различных фракций культур пропионибактерий. Тестируемые штаммы пропионибактерий (10% об./об. Инокулята) выращивали в казеиновой среде в колбах Эрленмейера при 30 °С в течение 10 дней. рН этих культур доводили до 7,0 ± 0,1 каждый день с использованием 25% аммиака. Затем из каждой культуры готовили три фракции. Одна фракция состояла из образца культуры. Бесклеточную супернатантную фракцию получали центрифугированием при 3800 × g в течение 15 минут и фильтрованием через мембрану с низким связыванием белков с размером пор 0,45 мкм (Durapore Low Protein Binding, Millipore Bedford MA, США). Экстракт бактериоцина готовили, как описано ранее (Gwiazdowska and Trojanowska, 2006).

Выращивание грибов с различными фракциями из культур пропионибактерий. Выращивание грибов с культурами пропионибактерий, супернатантами и экстрактами бактериоцина проводили по методике, описанной Czaczyk et al. (2002) с некоторыми изменениями. Культуры грибов культивировали на скошенных агарах при 24 °С в течение 7,10 дней. Хорошо развитые культуры промывали 10 мл стерильной воды и готовили суспензии, содержащие 10⁴ КОЕ / мл. Из жидкой среды (PDB; картофельный декстрозный бульон) 60 мл смешивали с 30 мл соответствующей фракции из культуры пропионибактерий и затем добавляли 10 мл грибковой суспензии. В качестве контролей использовали грибковые культуры с добавлением стерильной казеиновой среды. Все колбы инкубировали при 24 °С при встряхивании (100 об/мин) в течение 14 дней. В начале и после 7 и 14 дней роста рост грибков определяли как КОЕ/мл методом разведения с использованием PDA (картофельно-декстрозный агар; BTL, ód., Poland).

Пробоподготовка для ВЭЖХ-анализа микотоксинов. Образцы готовили на 14-й день культивирования по методу, описанному ранее Perkowski (1993). Всего 50 мл культуры гомогенизировали и смешивали с 100 мл ацетонитрила. Через 24 часа смесь фильтровали и к 25 мл фильтрата добавляли 25 мл гексана, смесь встряхивали и гексан удаляли после 5 минут экстракции. Остаток выпаривают, растворяют в 5 мл метанола и очищают на колонке ВЭЖХ. Колонку заполняли 7,5 г безводного сульфата натрия, 12 г Флорисила (Sigma-Aldrich, St.Louis, USA), суспендированного в гексане, и затем 10 г безводного сульфата натрия. Метанольный экстракт наносили на колонку и дважды промывали 25 мл гексана. Микотоксины элюировали 150 мл смеси хлороформа и метанола (9: 1 по объему). Элюат упаривали досуха и растворяли в 3 мл элюента, используемого для анализа ВЭЖХ.

Адсорбционные анализы. Эксперимент был основан на методе, описанном El-Nezami et al. (2002b) с некоторыми изменениями. Пропионибактерии культивировали в среде казеина в течение 72 часов при 30 °С. Затем культуру центрифугировали (7000 × g в течение 15 минут) и биомассу суспендировали в PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером) pH 7,0 до достижения плотности бактерий 10¹¹ КОЕ / мл. Суспензию разделяли на фракции по 2 мл и добавляли метанольный раствор зеараленона до конечной концентрации 10 и 20 мкг / мл. Образцы инкубировали при 4, 24 и 30 °С в течение 1, 5 и 24 часов. Идентичный эксперимент проводили с инактивированной нагреванием биомассой, которая была приготовлена ​​путем кипячения образца культуры в течение 20 минут при 100 °C для уничтожения клеток. В обоих случаях положительный контроль представлял собой биомассу, суспендированную в PBS, а отрицательный контроль состоял из PBS, содержащего соответствующую концентрацию токсина. После инкубации образцы центрифугировали (7000 × g в течение 5 минут), супернатанты фильтровали через мембраны Millex GS 0,22 мкм (Millipore Bedford MA, США) и, наконец, концентрацию микотоксинов определяли с помощью ВЭЖХ.

ВЭЖХ анализ органических кислот. Концентрацию пропионовой и уксусной кислот определяли жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием хроматографической системы Merck-Hitachi (Merck, Darmstadt, Germany). Анализ ВЭЖХ проводили на колонке Animex HPX-87H 300 × 7,8 мм (Bio-Rad, Филадельфия, США). Колонку элюировали 0,005 М H₂SO₄ при скорости потока 0,8 мл/мин и температуре 30 °С. Образцы фильтровали через мембраны Millex-GP 0,22 мкм (Millipore Bedford MA USA). Концентрации стандартных растворов составляли 4 г/л (пропионовая кислота) и 2 г/л (уксусная кислота). Уровни кислоты определяли путем компьютерной интеграции областей пиков.

ВЭЖХ анализ микотоксинов. Определение микотоксинов проводили с использованием системы Merck-Hitachi (Merck, Darmstadt, Germany), состоящей из автосэмплера (L-7250), насоса (L-7100), флуоресцентного детектора (L-7480) или детектора с диодной матрицей. (DAD; L-7455) и одной из трех разных колонок: Lichrospher RP-18, 250 × 4,6 мм (Merck, Darmstadt), ODS Hypersil, 5 мкм, 200 × 4,6 мм (Hewlett Packard) или адсорбосфера C18, 150 × 4,6 мм, 5 мкм (Alltech, Lexington KY USA). Ниваленол, дезоксиниваленол и зеараленон были определены с использованием колонки Lichrospher RP-18 и детектора DAD при 222 нм (NIV и DON) и 230 нм (ZON). Эту же колонку также использовали для разделения фумонизина B₁, но с флуоресцентным детектором, работающим при 460 нм (длина волны возбуждения) и 500 нм (длина волны излучения). ВЭЖХ-анализ алтенуена проводили с использованием колонки ODS Hypersil и DAD-детектора для регистрации поглощения при 240 нм, тогда как тенуазоновую кислоту определяли с использованием колонки Adorbosphere C18 и длины волны поглощения 280 нм. Подвижной фазой для разделения фумонизина В₁ была метанол: 0,1 М дигидрофосфат натрия (80:20 об./об.), доведенный до рН 3,4 с помощью о-фосфорной кислоты. Для анализа всех других микотоксинов подвижные фазы состояли из смесей метанол-вода переменного соотношения. Анализ проводили изократически при скорости потока 1 мл / мин и при температуре 25 °C (NIV, DON, ZON) или 30 °C (ALT, TA) (Jiménez and Mateo, 1997; Muller и Lepom, 1992; Motta and Soares, 2000). Стандартные калибровочные растворы для всех микотоксинов (Sigma-Aldrich, St.Louis USA) готовили в диапазоне 0,1,0,01 мг / мл. Пределы обнаружения для чистых стандартов, взятые как 3-кратное базовое стандартное отклонение, составляли 30 нг / мл для альтенуена, 50 нг / мл для тенуазоновой кислоты, 20 нг / мл для дезоксиниваленола и ниваленола и 15 нг / мл для зеараленона и 10 нг / мл для фумонизина B₁. Аналитические исследования восстановления проводились путем добавления известного количества токсина (0,1 мг / мл) к незагрязненным образцам. Средние показатели восстановления были определены на основе 10-го реплицирующего анализа. Средние показатели извлечения исследуемых микотоксинов: альтенуола, тенуазоновой кислоты, дезоксиниваленола, ниваленола, зеараленона и фумонизина В1 составили 90, 88, 89, 85, 78 и 86% соответственно.

Определение белка. Для определения концентрации белка использовался метод Брэдфорда (1976).

Статистический анализ. Представленные данные представляют собой среднее (± стандартное отклонение) трех повторных испытаний. Результаты ингибирования роста и продукции микотоксинов были подвергнуты t-критерию Стьюдента для определения значимости различий (р <0,05) между контрольными образцами и экспериментальными образцами, в которые были добавлены различные фракции культур пропионибактерий. Влияние различных факторов на адсорбцию токсинов определяли с использованием дисперсионного анализа ANOVA с уровнем достоверности 95%. Анализы проводились с использованием программы STATISTICA для Windows версии 5.1.

Результаты и обсуждение

Представленные здесь исследования в основном касаются ингибирования роста грибков и выработки микотоксинов в жидкой среде двумя штаммами Propionibacterium. Три фракции: культура, супернатант и препарат бактериоцина были добавлены в грибковые культуры. Во время культивирования (0, 7 и 14 дней) оценивали рост грибов (КОЕ / мл), и результаты представлены на фиг.1. Наиболее сильное ингибирование роста грибов достигалось добавлением культур пропионибактерий. Через 14 дней рост F. culmorum и F. verticillioides был полностью ингибирован, а рост A. alternaria почти полностью ингибирован, а показатель КОЕ/мл F. graminearum был значительно снижен. Было также показано, что супернатанты из культур пропионибактерий оказывают сильное ингибирующее влияние на рост всех изучаемых грибов. Супернатант из культуры P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111 часто был несколько более эффективным в подавлении роста грибов, чем из культуры P. freudenreichii ssp. shermanii 41 (рис. 1). Препараты бактериоцина были только слабо фунгистатическими против A. alternata (рис. 1A). В присутствии бактериоциновых препаратов рост F. culmorum и F. graminearum происходил медленнее, чем в контрольных условиях. В свою очередь, F. verticillioides был нечувствителен к этой конкретной фракции. Не наблюдалось различий в эффектах тех же фракций от культур P. freudenreichii ssp. shermanii 41 и P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111 (рис. 1А-D).

Рис. 1. Рост грибов в присутствии различных фракций культур пропионибактерий: A) Alternaria alternata, B) Fusarium culmorum, C) Fusarium graminearum D) Fusarium verticillioides

Таблица I. Влияние фракций культур Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii 41 и freudenreichii 111 на продукцию микотоксинов Alternaria alternate определяли на 14-й день культивирования

a, b - достоверно различаются при р<0,05

Концентрацию некоторых микотоксинов измеряли после 14 дней роста грибков. Альтенуен (ALT) и тенуазоновая кислота (TA) были определены в культурах A. alternata (таблица I), а ниваленол (NIV), дезоксиниваленол (DON) и зеараленон (ZEN) были определены в культурах F. culmorum и F. graminearum, и концентрация фумонизина B₁ была измерена в случае F. verticillioides (таблица II). Культуры пропионибактерий и супернатанты вызывали снижение концентрации всех исследованных микотоксинов. В культурах A. alternata ALT и TA не были обнаружены или были значительно снижены в присутствии культур пропионибактерий и супернатантов соответственно. Что касается F. culmorum, то наблюдалась аналогичная ситуация. Все исследованные токсины либо не обнаруживались, либо присутствовали на очень низких уровнях в образцах, обработанных культурами пропионибактерий или супернатантами. В случае F. graminearum ZEN не может быть обнаружен ни в контрольном испытании, ни в образцах, обработанных культурами пропионибактерий или супернатантами. Концентрация оставшихся токсинов, NIV и DON, была только значительно снижена в присутствии культур Propionibacterium. Фумонизин B₁ значительно снижался при добавлении культур и супернатантов пропионибактерий в культуры F. verticillioides. В присутствии препаратов бактериоцина уровень всех исследованных микотоксинов был немного ниже, чем в контрольном исследовании, но различия не были значительными.

Таблица II. Влияние культуральных фракций Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii 41 и ssp. freudenreichii 111 на продукции микотоксинов видами Fusarium, определенные на 14-й день культивирования

a, b, c - достоверно различаются при р<0,05; nd – не определено

Результаты показали, что внеклеточные метаболиты пропионибактерий могут эффективно ингибировать рост грибков и выработку микотоксинов в жидкой среде. В многочисленных исследованиях сообщалось о противогрибковой и антимикотоксигенной активности молочнокислых бактерий (Gourama and Bullerman, 1995; Karunaratne et al., 1990). Kimura и Hirano (1988) сообщили, что Bacillus subtilis, выделенный из почвы, ингибировал как рост, так и выработку афлатоксина от Aspergillus parasiticus NRRL 2999 в средах, а также в арахисе и кукурузе. Osman (2004) наблюдал ингибирование роста грибов Aspergillus flavus, споруляции и выработки афлатоксина льном Brevibacterium.

Наиболее сильное действие культур пропионибактерий, содержащих жизнеспособные клетки, вероятно, было вызвано образованием антимикробных метаболитов после добавления этих фракций в культуры грибов. Также возможно, что некоторые соединения были потеряны во время приготовления бесклеточных супернатантов. В подтверждение этого утверждения Osman (2004) отметил снижение противогрибковой активности в бесклеточном супернатанте Brevibacterium linens по сравнению со всей клеточной культурой и подтвердил, что центрифугирование и фильтрация могут быть причиной такого снижения активности. Но, как предположил автор, возможной альтернативной причиной снижения активности может быть также летучесть противогрибковых соединений.

Вероятно, что главные продукты брожения, пропионовая и уксусная кислоты, играют наиболее важную роль в подавлении роста грибов. Как показано в таблице III, P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111 производил больше пропионовой и уксусной кислот, чем P. freudenreichii ssp. shermanii 41, который параллелен большему ингибирующему эффекту P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111 на рост всех исследованных грибов. Однако различия между противогрибковыми свойствами двух штаммов пропионибактерий не были статистически значимыми. В литературе имеется несколько сообщений, подтверждающих ингибирующее действие пропионовой кислоты на рост различных грибов, таких как Aspergillus, Fusarium и Penicillium (Higgins and Brinkhaus, 1999; Paster et al., 1999). Lind et al. (2005) сравнили противогрибковое действие пяти видов пропионибактерий и доказали, что пропионовая кислота, за которой следует уксусная кислота, является наиболее мощным противогрибковым средством. Однако они также заметили, что ингибирование роста грибов может быть лишь частично объяснено присутствием органических кислот, более того, синергический эффект между этими двумя кислотами имеет решающее значение.

Таблица III. Концентрация короткоцепочечных жирных кислот и белка в различных фракциях

nd – не определено

Мы наблюдали, что белковые фракции, полученные из культур двух исследованных штаммов пропионибактерий, также обладают определенной противогрибковой активностью (рис. 1). Также наше предыдущее исследование показало ингибирование некоторых грибов на твердой среде частично очищенными бактериоцинами, продуцируемыми P. freudenreichii ssp. freudenreichii 11 и 111 и P. freudenreichii ssp. shermanii 41 (Gwiazdowska and Trojanowska, 2006). Аналогично, пропионицин PLG-1, продуцируемый Propionibacterium thoenii P126, проявлял противогрибковую активность в отношении Aspergillus ventii, Apiotrichum curvatum, Fusarium tricinctum, Phialophora gregata и дрожжей, принадлежащих к родам Candida, Saccharomyces и Scopularopsis (Lyon) и Gopularopsis (1991). Было обнаружено, что белковые соединения с противогрибковой активностью продуцируются молочнокислыми бактериями (Magnüsson and Schnürer, 2001; Ström et al., 2002) и видами Bacillus (Munimbazi and Bullerman, 1998). В последние годы было выделено несколько новых противогрибковых соединений, продуцируемых молочнокислыми бактериями, например, фениллактовая кислота (Ström et al., 2002) и гидроксилированные жирные кислоты (Sjögren et al., 2003). Таким образом, весьма вероятно, что соединения, отличные от органических кислот, такие как бактериоцины, продуцируемые вторичными метаболическими путями, могут влиять на противогрибковые свойства пропионовокислых бактерий.

Согласно литературным данным, бактерии могут удалять микотоксины, связывая их с клеточной поверхностью (El-Nezami et al., 2002a; 2002b). В нашем исследовании мы исследовали, способен ли какой-либо из исследуемых штаммов адсорбировать зеараленон. Для этой цели был выбран P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111, так как он обладает сильнейшей противогрибковой активностью. Полученные данные свидетельствуют о том, что концентрация зеараленона была значительно снижена как жизнеспособными, так и нежизнеспособными бактериями, поэтому вполне вероятно, что этот эффект может быть результатом поверхностного связывания. Это согласуется с сообщениями о том, что токсины адсорбируются бактериями, а не метаболизируются. В литературе также сообщалось о связывании афлатоксина В₁, афлатоксина М₁ и некоторых токсинов Fusarium молочнокислыми бактериями и пропионибактериями (El-Nezami et al., 1998, 2002a, 2002b; Gratz et al., 2004).

Таблица IV. Удаление зеараленона методом P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111

V - жизнеспособные клетки; NV - нежизнеспособные клетки

В нашем исследовании мы обнаружили, что снижение концентрации токсинов не зависит от температуры или времени инкубации. Наибольшее снижение концентрации ZEN наблюдалось в течение первого часа инкубации. Через 5 часов выделяется определенная концентрация токсинов, однако, когда инкубация продолжается, токсины снова адсорбируются. Эти результаты аналогичны результатам других исследований, в которых описывается способность молочнокислых бактерий адсорбировать микотоксины. El-Nezami et al. (2002a) показали, что удаление зеараленона и его производного α-зеараленола L. rhamnosus GG и L. rhamnosus LC 705 было быстрой реакцией. Но когда инкубация продолжалась, токсины высвобождались в среду в течение первых 4 часов, а затем повторно адсорбировались бактериями. Аналогичные результаты были получены в отношении удаления афлатоксина В₁ теми же штаммами молочнокислых бактерий (El-Nezami, 1998).

В наших исследованиях эффективность снижения токсинов зависела от начальной концентрации токсина. Жизнеспособные бактерии более эффективно снижали уровень токсинов при более низкой концентрации ZEN (10 мкг / мл). В случае нежизнеспособных клеток процесс снижения концентрации ZEN был более эффективным, когда исходная концентрация была высокой. Данные, представленные в литературе, также указывают на то, что нежизнеспособные клетки могут адсорбировать большую концентрацию токсинов, чем жизнеспособные бактерии. El-Nezami et al. (2002b) наблюдали значительное увеличение способности двух штаммов молочнокислых бактерий удалять зеараленон и α-зеараленол из жидких сред после тепловой или кислотной обработки бактерий. Авторы объяснили это наблюдение, предположив, что возмущение клеточной стенки будет способствовать связыванию токсина с различными компонентами клеточной стенки и плазматической мембраны.

Подводя итог: мы обнаружили, что пропионибактерии могут эффективно ингибировать рост определенных видов грибов, принадлежащих к родам Alternaria и Fusarium, и что они также могут снижать концентрацию микотоксинов, продуцируемых этими грибами. Однако ингибирование роста и продукции токсина зависело от вида грибов и от того, какая фракция бактериальной культуры была использована. Как показывают наши результаты, фунгистатическая активность зависит от наличия и взаимодействия различных метаболитов, в том числе белковых веществ. Не выявлено существенных различий в фунгистатической активности двух протестированных штаммов бактерий: P. freudenreichii ssp. shermanii 41 и P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111. Результаты нашего исследования показывают, что P. freudenreichii ssp. freudenreichii 111 может снизить концентрацию зеараленона в растворе и что адсорбция, вероятно, ответственна за этот процесс.

Дополнительная информация на заметку:

Существует мнение, что некоторые микотоксины не представляют значительной угрозы для людей, а только для животных. Здесь мы дадим краткую информацию о микотоксине под названием зеараленон. И есть подозрение, что он не очень желателен для человека.

Зеараленон (zearalenone, ZEN) - это микотоксин нестероидной природы. Его вырабатывают распространенные в умеренном и тропическом климате виды плесневых грибов рода Fusarium - в основном F. graminearum, а также F. culmorum, F. equiseti и F. verticillioides. Чаще всего фузариевые поражают кукурузу, ячмень, овес, рис, пшеницу, рожь, сорго и продукты из этих злаков, а также орехи, бананы, амарант и черный перец. Эти плесени теплолюбивы, для роста им необходима высокая влажность, потому они, в основном, распространены в южных странах, включая и юг Российской Федерации. Но им подходят и условия на складах зерна, если воздух там достаточно влажен. Таким образом, зеараленон может образовываться в зерне как во время роста культур, так и при хранении урожая.

Зеараленон действует на животных подобно гормону эстрогену. Этот гормон стимулирует развитие первичных и вторичных женских половых признаков, участвует в регуляции менструального цикла и протекании беременности, а у мужчин в случае превышения нормы вызывает гинекомастию (увеличение молочных желез) и нарушение половой функции.

Токсический эффект зеараленона, вероятно, основан на его связывании с рецепторами эстрогена. При поражении этим веществом у животных обоих полов увеличиваются молочные железы, отекают и распухают половые органы, а у самок происходят выкидыши и развивается бесплодие. Свиньи особенно чувствительны к зеараленону. Но для коров и овец этот микотоксин не менее опасен, поскольку в рубце жвачных животных из него образуются более активные метаболиты, в том числе зеранол.

Ряд исследований показал, что зеараленон способен накапливаться в печени, мышечной ткани и птичьих яйцах. Хотя прямых доказательств опасности зеараленона для человека нет, существуют данные, что этот микотоксин повышает вероятность возникновения опухолей молочной железы.

Зеараленон не разрушается при измельчении, термической обработке и ферментации зерна. Иногда он встречается в пищевых продуктах вместе с трихотеценовыми токсинами.

Известно не менее 15 производных зеараленона. Один из его метаболитов, зеранол (α-зеараланол), в 3-4 раза более активен, чем зеараленон. Он, как и эстрадиол (один из типов эстрогена), усиливает выделение гормона роста, что, в свою очередь, приводит к нарастанию мышечной массы. Поэтому зеранол используется как стимулятор роста мясного скота в Канаде и всех видов скота в США, но запрещен во многих других странах, в том числе в Европейском союзе. Чтобы установить, был ли зеранол нелегально применен или образовался в организме скота из зеараленона, содержавшегося в корме, проводится сравнительный анализ содержания этих метаболитов в моче. Согласно данным некоторых исследований, зеранол может быть опасен и для людей.

Технические регламенты Таможенного союза №№ 015/2011 «О безопасности зерна» и 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» не допускают присутствия зеараленона в ферментных молокосвертывающих препаратах грибного происхождения, продуктах для детей, беременных и кормящих женщин (не более 5 мкг/кг).

Для анализа содержания зеараленона в пробах продуктов применяются длительные, сложные и достаточно дорогие методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и тонкослойной хроматографии, а также более простой и доступный метод иммуноферментного анализа (ИФА). Для подготовки проб к анализу методом ВЭЖХ используются иммуноаффинные колонки.

Стоит отметить, что исходя из изложенного, применение пробиотических препаратов в сельском хозяйстве (в животноводстве и птицеводстве) может существенно снизить риски опасного влияния микотоксинов. То же, разумеется, относится и к применению пробиотиков для профилактики рисков отравления миктотоксинами у людей, в т.ч. для противогрибковой профилактики пищевых продуктов.

См. дополнительно:

Снижение риска гепатокарциномы с помощью пробиотиков

Пробиотики в защите от эндокринных разрушителей

Литература

1. Böswald C., G. Engelhardt, H. Vogel and P.R. Wallnöffer. 1995. Metabolism of the Fusarium mycotoxins zearalenone and deoxynivalenol by yeast strains of technological relevance. Nat. Toxins 3: 138.144.
2. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248.254.
3. Côté L.M., A.M. Dahlem, T. Yoshizawa, S.P. Swanson and W.B. Buck. 1986. Excretion of deoxynivalenol and its metabolite in milk, urine and feces of lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 69: 2416.2423.
4. Czaczyk K., K. Trojanowska and A. Mueller. 2002. Antifungal activity of Bacillus coagulans against Fusarium sp. Acta Microbiol. Polon. 51: 275.283.
5. El-Nezami H.S., P.E. Kankaanpää, S. Salminen and J.T. Ahokas. 1998. Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind common food carcinogens, alfatoxin B1. Food Chemical Toxicol. 36: 321.326.
6. El-Nezami H.S., H. Mykkänen, P.E. Kankaanpää, S. Salminen and J.T. Ahokas. 2000. Ability of Lactobacillus and Propionibacterium strains to remove aflatoxin B1 from the chicken duodenum. J. Food Protect. 63: 549.552.
7. El-Nezami H.S., N. Polychronaki, S. Salminen and H. Mykkänen. 2002a. Binding rather than metabolism may explain the interaction of two food-grade Lactobacillus strains with zearalenone and its derivative a-zearalenol. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3545.3549.
8. El-Nezami H.S., A. Chrevatidis, S. Auriola, S. Salminen and H. Mykkänen. 2002b. Removal of common Fusarium toxins in vitro by strains of Lactobacillus and Propionibacterium. Food Addit. Contamin. 19: 680.686.
9. El-Sharkawy S., M. Selim, M. Afifi and F. Halaweish. 1991. Microbial transformation of zearalenone to a zearalenone sulfate. Appl. Environ. Microbiol. 57: 549.552.
10. Gourama H. and L.B. Bullerman. 1995. Inhibition of growth and alfatoxin production of Aspergillus flavus by Lactobacillus species. J. Food Protect. 58: 1249.1256.
11. Gratz S., H. Mykkänen, A.C. Ouwehand, R. Juvonen, S. Salminen and H. El- Nezami. 2004. Intestinal mucus alters the ability of probiotic bacteria to bind aflatoxin B1 in vitro. Appl. Environ. Microbiol. 70: 6306.6308.
12. Gwiazdowska D. and K. Trojanowska. 2006. Antimicrobial activity and stability of partially purified bacteriocins produced by Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii and ssp. shermanii. Le Lait 86: 141.154.
13. Haggler W.M., N.R. Towers, C.J. Mirocha, R.M. Eppley and W.L. Bryden. 2001. Zearalenone: mycotoxin or mycoestrogen? In: B.A. Summerell, J.F. Leslie, D. Backhouse, W.L., Bryden and L.W. Burgess (eds), Fusarium. Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, Minn., pp. 321.331.
14. Higgins C. and F. Brinkhaus. 1999. Efficacy of several organic acids against molds. J. Appl. Poultry Sci. 8: 480.487.
15. Jiménez M. and R. Mateo. 1997. Determination of mycotoxins produced by Fusarium isolates from banana fruits by capillary gas chromatography and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 778: 363.372.
16. Karunaratne A, E. Wezenberg and L.B. Bullerman. 1990. Inhibition of mold growth and aflatoxin production by Lactobacillus spp. J. Food Protect. 53: 230.236.
17. Kimura N. and S. Hirano. 1988. Inhibitory strains of Bacillus subtilis for growth and aflatoxin production of aflatoxigenic fungi. Agric. Biol. Chem. 52: 1173.1179.
18. King A.D. and J.E. Schade. 1984. Alternaria toxins and their importance in food. J. Food Protect. 47: 886.901.
19. Kuiper-Goodman T., P.M. Scott, N.P. McEwen, G.A. Lombaert and W. Ng. 1996. Approaches to the risk assessment of fumonisins in corn-based foods in Canada. Adv. Exp. Med. Biol. 392: 369.393.
20. Lind H., H. Jonsson and J. Schnürer. 2005. Antifungal effect of dairy propionibacteria . contribution of organic acids. Int. J. Food Microbiol. 98: 157.165.
21. Lyon W. and B. Glatz. 1991. Partial purification and characterization of a bacteriocin produced by Propionibacterium thoenii. Appl. Environ. Microbiol. 57: 701.706.
22. Magnüsson J. and J. Schnürer. 2001. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1.5.
23. Marasas W.F.O. 2001. Discovery and occurrence of the fumonisins: a historical perspective. Environ. Health Perspect. 109 (Suppl. 2): 239.243.
24. Miescher S., M.P. Stierli, M. Teuber and L. Meile. 2000. Propionicin SM1, a bacteriocin from Propionibacterium jensenii DF1: isolation and characterization of the protein and its gene. Syst. Appl. Microbiol. 23: 174.184.
25. Motta S. and L.M.V. Soares. 2000. Simultaneous determination of tenuazonic and cyclopiazonic acids in tomato products. Food Chem. 71: 111.116.
26. Muller M. and P. Lepom. 1992. The detection of Alternaria mycotoxins in laboratory culture. Zentralblatt fur Mikrobiologie 147: 197.206.
27. Munimbazi C. and L.B. Bullerman. 1998. Isolation and partial characterization of antifungal metabolites of Bacillus pumilus. J. Appl. Microbiol. 84: 959.968.
28. Osman M.M. 2004. Factors affecting the antifungal properties of Brevibacterium linens. Int. Dairy J. 14: 713.722.
29. Paster N., Z. Lecong, M. Menashrov and R. Shapira. 1999. Possible synergistic effect of nisin and propionic acid on the growth of the mycotoxigenic fungi Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus, and Fusarium moniliforme. J. Food Protect. 62: 1223.1227.
30. Peltonen K., H.S. El-Nezami, S. Salminen and J.T. Ahokas. 2000. Binding of aflatoxin B1 by probiotic bacteria. J. Sci. Food Agric. 80: 1941.1945.
31. Perkowski J. 1993. Determination of recovering of Fusarium toxins by different methods (in Polish). Roczniki Akademii Rolniczej w Poznaniu 46: 3.15.
32. Pitt J.I. and A.D. Hocking. 1999. Fungi and Food Spoilage Second ed. Aspen Publications.
33. Sjögren J., J. Magnusson, A. Broberg, J. Schnürer and L. Kenne. 2003. Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14. Appl. Environ. Microbiol. 69: 7554.7557.
34. Stack M.E. and M.J. Prival. 1986. Mutagenicity of the Alternaria metabolites altertoxins I, II and III. Appl. Environ. Microbiol. 52: 718.722.
35. Stinson E.E., D.D. Bills, S.F. Osman, J. Siciliano, M.J. Ceponis and E.G. Heisler. 1980. Mycotoxin production by Alternaria species grown on apples, tomatoes and blueberries. J. Agric. Food Chem. 26: 960.963.
36. Ström K., J. Sjörgen, A. Broberg and J. Schnürer. 2002. Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro) and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllactic acid. Appl. Environ. Microbiol. 68: 4322.4327.
37. Yekeler H., K. Bitmis, N. Özçelik, M.Z. Doymaz and M. Çalta. 2001. Analysis of toxic effects of Alternaria toxins on esophagus of mice by light and electron microscopy Toxicol. Pathol. 29: 492.497.