ООО "ПРОПИОНИКС"
пн-пт с 09:00 до 18:00 | +7 (966) 348-80-35 |
Резюме
Актуальной областью исследования является изучение положительного воздействия на организм человека молочнокислых штаммов, способных нормализовать функционирование микрофлоры желудочно-кишечного тракта и регулировать здоровье организма человека. Данные штаммы получили название пробиотики, чаще всего к ним относят молочнокислые бактерии рода Lactobacillus и Bifidobactrium. Но в настоящее время ученые все чаще рассматривают молочные пропионовокислые бактерии в качестве пробиотиков. Данная исследовательская статья направлена на изучение свойств молочнокислых бактерий рода Propionibacterium (P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723) с дальнейшим использованием их в качестве пробиотиков для нормализации функционирования микробиоты ЖКТ. Для данных штаммов изучен ряд пробиотических свойств, а именно устойчивость к антибиотикам и антимикробная активность. По результатам исследований следует, что 90 % исследованных штаммов пропионовокислых бактерий характеризовались высокой активностью по отношению ко всем тест-культурам патогенных и условно-патогенных штаммов (Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris). По отношению к большей части антибиотиков исследуемые культуры проявляли высокую устойчивость (35,4 %) и малую чувствительность (16,7 %). Все комбинации исследуемых штаммов проявляли биосовместимость. Полученные данные позволяют использовать исследуемые штаммы и в перспективе консорциумы на их основе в качестве поликомпонентных пробиотических добавок.
Введение
Пробиотики – полезные для организма микроорганизмы, подавляющие развитие дисбактериоза, в результате чего обладающие профилактическими свойствами к хроническим заболеваниям, связанным с метаболическими нарушениями (ожирение, диабет 2-го типа, атеросклероз и т. п.) [1]. Среди пробиотиков наиболее изученными являются молочнокислые бактерии рода Lactobacillus и Bifidobacterium [2]. Кроме данных представителей в качестве пробиотиков могут использоваться и бактерии рода Propionibacterium [3].
Propionibacterium – это неспорообразующие, анаэробные и толерантные к низким концентрациям кислорода бактерии, которые имеют в своей клеточной стенке много муреина, то есть являющиеся грамположительными. Данные бактерии используют при производстве швейцарских сыров [4], они способны преобразовывать углеводы в уксусную и пропионовую кислоты, метаболизировать витамины, бактериоцины (пропионат, ацетат, диацетил), бифидогенные соединения, вещества, проявляющие иммуномодулирующие, антиканцерогенные свойства [5]. Propionibacterium подразделяются на два вида, первый обитает на кожных покровах, второй является «молочным» видом, обитающим в сыром молоке и кисломолочных продуктах [6]. В рамках данной работы интерес представляют «молочные» виды:
Благодаря способности к продуцированию данных биологически активных веществ бактерии рода Propionibacterium актуально использовать как в качестве самостоятельных проботиков, так и в составе поликомпонентных добавок. Сегодня существует большое количество изобретений, в которых используются бактерии рода Propionibacterium, однако в рамках пищевой биотехнологии данные бактерии в основном применяются в качестве продуцента белка [12, 13], закваски для изготовления кисломолочных продуктов питания [14–16], композиции, используемой для увеличения срока хранения продукции [17]. В качестве пробиотиков отечественные исследователи в основном используют Propionibacterium freudenreichii [18], Propionibacterium acidipropionici, а также их смесь с другими молочнокислыми бактериями [19, 20]. В зарубежных исследованиях используют Propionibacterium jensenii [21, 22] и Propionibacterium freudenreichii [23], и их смесь с другими штаммами [24]. Недостатками данных изобретений является отсутствие информации о наличии одних из наиболее важных свойств, присущих пробиотикам: антимикробной активности по отношению к патогенным и условно-патогенным штаммам, устойчивости к действию антибиотиков.
Цель данной работы – изучить пробиотические свойства бактерий рода Propionibacterium (P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723), а именно устойчивость штаммов к действию антибиотиков и наличие антимикробной активности.
Объекты и методы исследований
Исследование проводилось на базе Лаборатории биотестирования природных нутрицевтиков ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет». В качестве объектов исследования использовались штаммы пропионовокислых бактерий, полученные из ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» Propionibacterium jensenii В-6085, Propionibacterium freudenreichii В-11921; Propionibacterium thoenii В-6082; Propionibacterium acidipropionici В-5723 (табл. 1).
Определение устойчивости к антибиотикам. Антибиотикорезистентность пропионовокислых бактерий определяли диско-диффузионным методом [29], который основан на диффузии антимикробных препаратов из пропитанных бумажных дисков в питательную среду. Для этого суспензию исследуемых штаммов высевали сплошным газоном чашки Петри со средой ГРМ (HiMedia, Индия) и одновременно раскладывали на поверхность агара диски с антибиотиками (HiMedia, Индия). Через 24 ч культивирования в термостате при 28 °С фиксировали результаты эксперимента. Интерпретацию результатов устойчивости пропионовокислых бактерий к антибиотикам осуществляли по диаметру зон подавления роста штаммов: диаметр зоны подавления роста менее 10 мм – устойчивый, 10–15 мм – малая чувствительность; 15–25 – чувствительный, более 25 – высокая чувствительность.
Определение антагонистической активности штаммов пропионовокислых бактерий осуществляли согласно методике, описанной в [30]. Для этого исследуемые штаммы инкубировали в стерильном обезжиренном молоке при температуре 28 °С в течение 76 ч, после центрифугировали полученную суспензию. В дальнейшей работе использовали отфильтрованный через мембранные фильтры (диаметр пор 22 µm) супернатант. Антагонистическую активность определяли в отношении патогенных и условно-патогенных тест-штаммов: Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris. В работе использовали ночную культуру перечисленных штаммов. Плотность суспензии пропионовокислых бактерий определяли при помощи денсиметра DEN-1 (BioSan, Латвия). Антагонистическую активность пропионовокислых бактерий определяли диско-диффузионным методом: тест-штамм высевали сплошным газоном на питательную среду; по поверхности засеянной среды раскладывали бумажные диски, пропитанные очищенным супернатантом. Интерпретацию результатов осуществляли по диаметру зон подавления роста тест-штаммов: диаметр зоны подавления роста менее 8 мм – активность отсутствует, 8–13 мм – слабая активность; 13–18 – средняя активность, более 18 – высокая активность.
Таблица 1. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки отдельных штаммов
Наименование штамма
|
Культурально- морфологические признаки
|
Физиолого-биохимические признаки
|
Источник
|
P. jensenii
|
Грамположительные, неспорообразующие, слегка овальные палочки, факультативные анаэробы
|
Каталазоположительные, сбраживают глюкозу, лактозу, трегалозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маннозу, рамнозу, маннитол, инозитол, не разжижают желатин, оптимальная температура 28–30 °C
|
[25–28]
|
P. freudenreichii
|
Грамположительные, неспорообразующие, кокковидной формы, факультативные анаэробы
|
Каталазоположительные, сбраживают лактозу, глюкозу, рибозу, маннозу, мальтозу, галактозу, рамнозу, фруктозу, оптимальная температура 30 °C
|
|
P. thoenii
|
Грамположительные, неспорообразующие, булавовидные палочки, факультативные анаэробы
|
Каталазоотрицательные, сбраживают мальтозу, рибозу, ксилозу, галактозу, фруктозу, сорбитол, лактозу, трегалозу, сахарозу, оптимальная температура 28–30 °С
|
[25–27]
|
P. acidipropionici
|
Грамположительные, неспорообразующие, слегка овальные палочки, факультативные анаэробы
|
Каталазоотрицательные, сбраживают арабинозу, рибозу, галактозу, фруктозу, инозитол, маннитол, сорбитол, мальтозу, лактозу, оптимальная температура 30 °С
|
Для создания пробиотического консорциума важно использовать биосовместимые штаммы, проявляющие устойчивость к антибиотикам и антимикробную активность по отношению к патогенной и условнопатогенной микрофлоре. Для определения биосовместимости исследуемых культур пропионовокислых бактерий использовали капельный метод [31]. Для этого на поверхность агаризованной среды наносили каплю одной суточной культуры, после высыхания наносили каплю второй суточной культуры, и культивировали при температуре 28 °С в течение 24–36 ч. Опыт повторяли со всеми 4-я исследуемыми штаммами. Результаты интерпретировали следующим образом: в случае слияния капель – «+» культуры биосовместимы, в случае перекрытия одного штамма другим – «–» культуры проявляют антагонизм.
В ходе исследовательской работы изучены пробиотические свойства штаммов пропионовокислых бактерий. Результаты определения устойчивости исследуемых штаммов (Propionibacterium jensenii В-6085, Propionibacterium freudenreichii В-11921; Propionibacterium thoenii В-6082; Propionibacterium acidipropionici В-5723) к действию ряда антибиотиков (ампициллин, бензилпенициллин, карбенициллин, полимиксин, стрептомицин, гентамицин, клотримазол, левомицитин, тетрациклин, неомицин, канамицин) представлены в табл. 2.
Результаты по изучению устойчивости к антибиотикам показали, что большинство исследуемых пропионовокислых бактерий обладают малой чувствительностью (16,7 %) и высокой устойчивостью (35,4 %) к антибиотикам. Лишь 2 культуры показали высокую чувствительность: P. freudenreichii В-11921 по отношению к полимиксину (26,5 мм), P. acidipropionici В-5723 по отношению тетрациклину (27,0 мм). Таким образом, в основном культуры пропионовокислых бактерий обладают антибиотикорезистентностью.
Таблица 2. Результаты изучения антибиотикорезистентности штаммов пропионовокислых бактерий
Наименование антибиотика
|
Диаметр зоны подавления роста, мм
|
|||
P. jensenii
В-6085
|
P. freudenreichii
В-11921
|
P. thoenii
В-6082
|
P. acidipropionici
В-5723
|
|
7,0 ± 0,1
|
8,0 ± 0,2
|
6,0 ± 0,2
|
9,5 ± 0,3
|
|
20,0 ± 0,8
|
20,5 ± 0,8
|
6,0 ± 0,2
|
22,0 ± 0,9
|
|
6,0 ± 0,1
|
6,0 ± 0,2
|
17,0 ± 0,6
|
18,0 ± 0,7
|
|
22,0 ± 0,9
|
26,5 ± 1,1
|
12,5 ± 0,4
|
6,0 ± 0,1
|
|
9,5 ± 0,4
|
15,0 ± 0,5
|
22,0 ± 0,9
|
16,0 ± 0,6
|
|
14,0 ± 0,5
|
21,0 ± 0,8
|
9,5 ± 0,2
|
25,0 ± 1,0
|
|
6,0 ± 0,1
|
12,0 ± 0,4
|
21,5 ± 0,8
|
6,0 ± 0,2
|
|
6,0 ± 0,1
|
6,0 ± 0,2
|
23,0 ± 0,9
|
10,0 ± 0,3
|
|
25,0 ± 1,0
|
18,0 ± 0,7
|
10,0 ± 0,5
|
27,0 ± 1,1
|
|
14,5 ± 0,7
|
24,0 ± 1,0
|
14,5 ± 0,5
|
12,5 ± 0,4
|
|
10,0 ± 0,3
|
13,0 ± 0,4
|
7,0 ± 0,2
|
6,0 ± 0,1
|
Антагонистическую способность пропионовокислых культур определяли в отношении тест-культур: Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris. Результаты исследования представлены в табл. 3.
Исходя из результатов исследования антагонистической активности, можно сделать вывод о том, что все исследуемые штаммы обладают ингибирующим действием в отношении патогенных и условно-патогенных штаммов. Высокой активностью обладают 90 % исследуемых пропионовокислых культур. При этом лишь 1 штамм (P. jensenii В-6085) характеризуется средней активностью в отношении тест-культур.
Для создания пробиотического консорциума на дальнейших этапах работы проанализирована биосовместимость культур пропионовокислых штаммов по отношению друг к другу (табл. 4).
Из табл. 4 следует, что все комбинации исследуемых штаммов являются биосовместимыми, вследствие чего можно рекомендовать к использованию в создании консорциумов пробиотического действия.
Растущий интерес потребителя к укреплению здоровья и профилактике хронических заболеваний стимулирует развитие рынка ФПП, в частности развитие добавок, продуктов с пробиотическими штаммами. Данная работа направлена на изучение полезных свойств «молочных» пропионовокислых бактерий для их дальнейшего применения в качестве пробиотика. Исследование позволило оценить способность бактерий P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723 проявлять антимикробную активность по отношению к ряду патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, данное действие обусловлено способностью штаммов к синтезу бактериоцинов, подавляющих жизнедеятельность грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесневелых грибов [32]; оценить высокую устойчивость штаммов к действию антибиотиков.
Проведенное исследование подробно рассмотрело возможность использования бактерий P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723 в качестве пробиотиков. В дальнейших исследованиях авторы планируют изучение пробиотических свойств консорциумов, составленных на основании данных о биосовместимости выше представленных штаммов.
Таблица 3. Результаты изучения антагонистической активности штаммов пропионовокислых бактерий
Тест-культура
|
Диаметр зоны подавления роста, мм
|
|||
P. jensenii
В-6085
|
P. freudenreichii
В-11921
|
P. thoenii
В-6082
|
P. acidipropionici
В-5723
|
|
21,5 ± 1,4
|
21,0 ± 1,1
|
21,0 ± 1,2
|
20,0 ± 1,0
|
|
18,0 ± 0,9
|
19,5 ± 1,0
|
20,5 ± 1,0
|
18,5 ± 0,9
|
|
19,0 ± 1,1
|
22,5 ± 1,4
|
18,0 ± 1,0
|
19,5 ± 1,0
|
|
17,0 ± 0,8
|
18,5 ± 0,9
|
18,5 ± 0,9
|
22,0 ± 1,1
|
|
15,0 ± 0,6
|
21,0 ± 1,2
|
18,0 ± 0,8
|
20,0 ± 1,0
|
Таблица 4. Результаты изучения биосовместимости пропионовокислых штаммов бактерий
Наименование штамма
|
Наименование штамма
|
|||
В-6085
|
В-11921
|
В-6082
|
В-5723
|
|
В-6085
|
|
+
|
+
|
+
|
В-11921
|
+
|
|
+
|
+
|
В-6082
|
+
|
+
|
|
+
|
В-5723
|
+
|
+
|
+
|
|
Работа выполнена в рамках гранта Президента РФ при государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-2694.2020.4).
Доп. информация к разделу о Пропионовокислых бактериях:
Литература