Исследование пробиотических свойств бактерий рода Propionibacterium

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА PROPIONIBACTERIUM

Резюме

Актуальной областью исследования является изучение положительного воздействия на организм человека молочнокислых штаммов, способных нормализовать функционирование микрофлоры желудочно-кишечного тракта и регулировать здоровье организма человека. Данные штаммы получили название пробиотики, чаще всего к ним относят молочнокислые бактерии рода Lactobacillus и Bifidobactrium. Но в настоящее время ученые все чаще рассматривают молочные пропионовокислые бактерии в качестве пробиотиков. Данная исследовательская статья направлена на изучение свойств молочнокислых бактерий рода Propionibacterium (P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723) с дальнейшим использованием их в качестве пробиотиков для нормализации функционирования микробиоты ЖКТ. Для данных штаммов изучен ряд пробиотических свойств, а именно устойчивость к антибиотикам и антимикробная активность. По результатам исследований следует, что 90 % исследованных штаммов пропионовокислых бактерий характеризовались высокой активностью по отношению ко всем тест-культурам патогенных и условно-патогенных штаммов (Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris). По отношению к большей части антибиотиков исследуемые культуры проявляли высокую устойчивость (35,4 %) и малую чувствительность (16,7 %). Все комбинации исследуемых штаммов проявляли биосовместимость. Полученные данные позволяют использовать исследуемые штаммы и в перспективе консорциумы на их основе в качестве поликомпонентных пробиотических добавок.

Введение

Пробиотики – полезные для организма микроорганизмы, подавляющие развитие дисбактериоза, в результате чего обладающие профилактическими свойствами к хроническим заболеваниям, связанным с метаболическими нарушениями (ожирение, диабет 2-го типа, атеросклероз и т. п.) [1]. Среди пробиотиков наиболее изученными являются молочнокислые бактерии рода Lactobacillus и Bifidobacterium [2]. Кроме данных представителей в качестве пробиотиков могут использоваться и бактерии рода Propionibacterium [3].

Propionibacterium – это неспорообразующие, анаэробные и толерантные к низким концентрациям кислорода бактерии, которые имеют в своей клеточной стенке много муреина, то есть являющиеся грамположительными. Данные бактерии используют при производстве швейцарских сыров [4], они способны преобразовывать углеводы в уксусную и пропионовую кислоты, метаболизировать витамины, бактериоцины (пропионат, ацетат, диацетил), бифидогенные соединения, вещества, проявляющие иммуномодулирующие, антиканцерогенные свойства [5]. Propionibacterium подразделяются на два вида, первый обитает на кожных покровах, второй является «молочным» видом, обитающим в сыром молоке и кисломолочных продуктах [6]. В рамках данной работы интерес представляют «молочные» виды:

• Propionibacterium freudenreichii – молочнокислая бактерия, которая используется в качестве закваски для приготовления сыров, является продуцентом короткоцепочных жирных кислот, витаминов В9, В12 и бифидогенных соединений (1,4-дигидрокси-2-нафтоиновую кислоту) – соединений, стимулирующих рост бактерий группы Bifidobacterium [7].
• Propionibacterium acidipropionici – молочная бактерия, продуцирующая фермент β-галактозидазу, расщепляющую лактозу, и бактериоцины. В результате чего активно используется в приготовлении функциональных продуктов питания для населения, имеющего проблемы с непереносимостью лактозы [7], и для профилактики нарушений, вызванных патогенными и/или условно патогенными штаммами (например, Bacteroides fragilis и Clostridium hystoliticum) [8].
• Propionibacterium jensenii – молочная пропионовокислая бактерия, являющаяся продуцентом витамина В12, участвующего в регулировании уровня холестерина, гомоцистеина, триглицеридов [9] и фермента β-галактозидазы [10].
• Propionibacterium thoenii – пропионовокислая бактерия «молочного» вида, обладающая способностью к продуцированию фермента β-галактозидазы и бактериоцинов (пропионицина [10] и тениицина [11]).

Благодаря способности к продуцированию данных биологически активных веществ бактерии рода Propionibacterium актуально использовать как в качестве самостоятельных проботиков, так и в составе поликомпонентных добавок. Сегодня существует большое количество изобретений, в которых используются бактерии рода Propionibacterium, однако в рамках пищевой биотехнологии данные бактерии в основном применяются в качестве продуцента белка [12, 13], закваски для изготовления кисломолочных продуктов питания [14–16], композиции, используемой для увеличения срока хранения продукции [17]. В качестве пробиотиков отечественные исследователи в основном используют Propionibacterium freudenreichii [18], Propionibacterium acidipropionici, а также их смесь с другими молочнокислыми бактериями [19, 20]. В зарубежных исследованиях используют Propionibacterium jensenii [21, 22] и Propionibacterium freudenreichii [23], и их смесь с другими штаммами [24]. Недостатками данных изобретений является отсутствие информации о наличии одних из наиболее важных свойств, присущих пробиотикам: антимикробной активности по отношению к патогенным и условно-патогенным штаммам, устойчивости к действию антибиотиков.

Цель данной работы – изучить пробиотические свойства бактерий рода Propionibacterium (P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723), а именно устойчивость штаммов к действию антибиотиков и наличие антимикробной активности.

Объекты и методы исследований

Исследование проводилось на базе Лаборатории биотестирования природных нутрицевтиков ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет». В качестве объектов исследования использовались штаммы пропионовокислых бактерий, полученные из ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» Propionibacterium jensenii В-6085, Propionibacterium freudenreichii В-11921; Propionibacterium thoenii В-6082; Propionibacterium acidipropionici В-5723 (табл. 1).

Определение устойчивости к антибиотикам. Антибиотикорезистентность пропионовокислых бактерий определяли диско-диффузионным методом [29], который основан на диффузии антимикробных препаратов из пропитанных бумажных дисков в питательную среду. Для этого суспензию исследуемых штаммов высевали сплошным газоном чашки Петри со средой ГРМ (HiMedia, Индия) и одновременно раскладывали на поверхность агара диски с антибиотиками (HiMedia, Индия). Через 24 ч культивирования в термостате при 28 °С фиксировали результаты эксперимента. Интерпретацию результатов устойчивости пропионовокислых бактерий к антибиотикам осуществляли по диаметру зон подавления роста штаммов: диаметр зоны подавления роста менее 10 мм – устойчивый, 10–15 мм – малая чувствительность; 15–25 – чувствительный, более 25 – высокая чувствительность.

Определение антагонистической активности штаммов пропионовокислых бактерий осуществляли согласно методике, описанной в [30]. Для этого исследуемые штаммы инкубировали в стерильном обезжиренном молоке при температуре 28 °С в течение 76 ч, после центрифугировали полученную суспензию. В дальнейшей работе использовали отфильтрованный через мембранные фильтры (диаметр пор 22 µm) супернатант. Антагонистическую активность определяли в отношении патогенных и условно-патогенных тест-штаммов: Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris. В работе использовали ночную культуру перечисленных штаммов. Плотность суспензии пропионовокислых бактерий определяли при помощи денсиметра DEN-1 (BioSan, Латвия). Антагонистическую активность пропионовокислых бактерий определяли диско-диффузионным методом: тест-штамм высевали сплошным газоном на питательную среду; по поверхности засеянной среды раскладывали бумажные диски, пропитанные очищенным супернатантом. Интерпретацию результатов осуществляли по диаметру зон подавления роста тест-штаммов: диаметр зоны подавления роста менее 8 мм – активность отсутствует, 8–13 мм – слабая активность; 13–18 – средняя активность, более 18 – высокая активность.

Таблица 1. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки отдельных штаммов

Для создания пробиотического консорциума важно использовать биосовместимые штаммы, проявляющие устойчивость к антибиотикам и антимикробную активность по отношению к патогенной и условнопатогенной микрофлоре. Для определения биосовместимости исследуемых культур пропионовокислых бактерий использовали капельный метод [31]. Для этого на поверхность агаризованной среды наносили каплю одной суточной культуры, после высыхания наносили каплю второй суточной культуры, и культивировали при температуре 28 °С в течение 24–36 ч. Опыт повторяли со всеми 4-я исследуемыми штаммами. Результаты интерпретировали следующим образом: в случае слияния капель – «+» культуры биосовместимы, в случае перекрытия одного штамма другим – «–» культуры проявляют антагонизм.

Результаты и их обсуждение

В ходе исследовательской работы изучены пробиотические свойства штаммов пропионовокислых бактерий. Результаты определения устойчивости исследуемых штаммов (Propionibacterium jensenii В-6085, Propionibacterium freudenreichii В-11921; Propionibacterium thoenii В-6082; Propionibacterium acidipropionici В-5723) к действию ряда антибиотиков (ампициллин, бензилпенициллин, карбенициллин, полимиксин, стрептомицин, гентамицин, клотримазол, левомицитин, тетрациклин, неомицин, канамицин) представлены в табл. 2.

Результаты по изучению устойчивости к антибиотикам показали, что большинство исследуемых пропионовокислых бактерий обладают малой чувствительностью (16,7 %) и высокой устойчивостью (35,4 %) к антибиотикам. Лишь 2 культуры показали высокую чувствительность: P. freudenreichii  В-11921 по отношению к полимиксину (26,5 мм), P.   acidipropionici В-5723 по отношению тетрациклину (27,0 мм). Таким образом, в основном культуры пропионовокислых бактерий обладают антибиотикорезистентностью.

Таблица 2. Результаты изучения антибиотикорезистентности штаммов пропионовокислых бактерий

Антагонистическую способность пропионовокислых культур определяли в отношении тест-культур: Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris. Результаты исследования представлены в табл. 3.

Исходя из результатов исследования антагонистической активности, можно сделать вывод о том, что все исследуемые штаммы обладают ингибирующим действием в отношении патогенных и условно-патогенных штаммов. Высокой  активностью  обладают 90 % исследуемых пропионовокислых культур. При этом лишь 1 штамм (P. jensenii В-6085) характеризуется средней активностью в отношении тест-культур.

Для создания пробиотического консорциума на дальнейших этапах работы проанализирована биосовместимость культур пропионовокислых штаммов по отношению друг к другу (табл. 4).

Из табл. 4 следует, что все комбинации исследуемых штаммов являются биосовместимыми, вследствие чего можно рекомендовать к использованию в создании консорциумов пробиотического действия.

Растущий интерес потребителя к укреплению здоровья и профилактике хронических заболеваний стимулирует развитие рынка ФПП, в частности развитие добавок, продуктов с пробиотическими штаммами. Данная работа направлена на изучение полезных свойств «молочных» пропионовокислых бактерий для их дальнейшего применения в качестве пробиотика. Исследование позволило оценить способность бактерий P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723 проявлять антимикробную активность по отношению к ряду патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, данное действие обусловлено способностью штаммов к синтезу бактериоцинов, подавляющих жизнедеятельность грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесневелых грибов [32]; оценить высокую устойчивость штаммов к действию антибиотиков.

Проведенное исследование подробно рассмотрело возможность использования бактерий P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723 в качестве пробиотиков. В дальнейших исследованиях авторы планируют изучение пробиотических свойств консорциумов, составленных на основании данных о биосовместимости выше представленных штаммов.

Таблица 3. Результаты изучения антагонистической активности штаммов пропионовокислых бактерий

Таблица 4. Результаты изучения биосовместимости пропионовокислых штаммов бактерий

Работа выполнена в рамках гранта Президента РФ при государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-2694.2020.4).

Доп. информация к разделу о Пропионовокислых бактериях:

• Антифунгальные свойства молочных пропионибактерий
• Противогрибковая активность пропионибактерий и лактобацилл
• Силосование кормов и пропионибактерии

Литература

1. Markowiak, P. Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health. / P. Markowiak, K. Śliżewska // Nutrients. – 2017. – V. 9(9). – P. 1021. DOI: 10.3390/nu9091021
2. Sources, isolation, characterisation and evaluation of probiotics / L. Fontana, M. Bermudez-Brito, J. Plaza-Diaz, S. Muñoz-Quezada, A. Gil // The British journal of nutrition. – 2013. – 109(2). – P. 35–50. DOI: 10.1017/ s0007114512004011
3. New insights into physiology and metabolism of Propionibacterium freudenreichii / A. Thierry, S.M. Deutsch, H. Falentin, M. Dalmasso, F.J. Cousin, G. Jan // International journal of food microbiology. – 2011. – V. 149(1). – P. 19–27. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2011.04.026
4. Meile, L. Safety assessment of dairy microorganisms: Propionibacterium and Bifidobacterium / L. Meile, G. Le Blay, A. Thierry // International journal of food microbiology. – 2008. – V. 126(3). – P. 316–320. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.08.019
5. Zárate, G. Influence of lactose and lactate on growth and β-galactosidase activity of potential probiotic Propionibacterium acidipropionici / Zárate, A.P. Chaia // Anaerobe.  –  2012.  – V. 18(1). – P. 25–30. DOI: 10.1016/j.anaerobe. 2011.12.005
6. Physiological and functional characteristics of Propionibacterium strains of the poultry microbiota and relevance for the development of probiotic products / E. Argañaraz-Martínez, J.D. Babot, M.C. Apella, A.P. Chaia // Anaerobe. – 2013. – V. 23. – P. 27–37. DOI: 10.1016/j.ana- erobe.2013.08.001
7. Intracellular osmoprotectant concentrations determine Propionibacterium freudenreichii survival during drying / F. Gaucher, H. Rabah, K. Kponouglo, S. Bonnassie, S. Pottier et al. // Applied microbiology and biotechnology. – 2020. – V. 104(7). – P. 3145–3156. DOI: 10.1007/ s00253-020-10425-1
8. Propionibacterium acidipropionici CRL1198 influences the production of acids and the growth of bacterial genera stimulated by inulin in a murine model of cecal slurries / M.J. Lorenzo-Pisarello, M.L. Gultemirian, C. Nieto-Peñalver, A. Perez Chaia // Anaerobe. – 2010. – V. 16, № 4. – P. 345–354. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2010.04.006
9. Huang, Y. The in vivo assessment of safety and gastrointestinal survival of an orally administered novel probiotic, Propionibacterium jensenii 702, in a male Wistar rat model / Y. Huang, L. Kotula, M.C. Adams // Food and chemical toxicology. – 2003. – V.41(12). – P. 1781–1787. DOI: 10.1016/S0278- 6915(03)00215-1
10. Altieri, C. Dairy propionibacteria as probiotics: recent evidences / C. Altieri //World journal of microbiology & biotechnology. – 2016. – V. 32(10). – P. 172. DOI: 10.1007/s11274-016-2118-0
11. Regulating vitamin B12 biosynthesis via the cbiMCbl riboswitch in Propionibacterium strain UF1 / J. Li, Y. Ge, M. Zadeh, R. Curtiss, M. Mohamadzadeh // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2020. – V. 117(1). – P. 602–609. DOI: 10.1073/pnas.1916576116
12. Пат. 2247149 РФ, МПК C12N 1/20, C12P 21/00, C12N 1/20, C12R 1/01. Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii – продуцент кормового белка / Г.В. Галкина, В.И. Илларионова, Е.В. Куксова [и др.]; заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «Биотех-Инжиниринг». – № 2003115718/13; заявл. 28.05.2003; опубл. 27.02.2005.
13. Пат. 2392312 РФ, МПК C12N 1/20, C12P 21/00, C12R 1/01. Штамм Propioni- bacterium freudenreichii subsp. shermanii – продуцент кормового белка / С.Н. Честнов; заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «БИОПРОТЕИН». – № 2007147181/13;  заявл. 21.12.2007; опубл. 20.06.2010.
14. Пат. 96110987 РФ, МПК C12N 1/20, A23C 9/12. Консорциум бактерий Propionibacterium shermani, Streptococcus thermophilus, Acetobacter aceti, используемый для приготовления кисломолочных продуктов, и способ производства кисломолочного продукта / В.Ф. Семенихина, И.В. Рожков, В.Д. Харитонов [и др.]; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности – № 96110987/13; заявл. 29.05.1996; опубл. 27.12.1998.
15. Пат.   2309982  РФ,  МПК  C12N  1/20, A23C 9/12, C12R 1/15. Способ получения бактериального концентрата пропионовокислых бактерий / И.С. Хамагаева, С.М. Тумурова; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Восточно-Сибирский государственный технологический университет. – № 2005117901/13; заявл. 09.06.2005; опубл. 10.11.2007.
16. Пат. 2637387  РФ, МПК A23C 9/12, A23C 9/13. Способ производства кисломолочного продукта / С.И. Артюхова, Н.В. Доржие- ва; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образова- тельное учреждение высшего образования «Омский государственный технический университет». – № 2016132355; заявл. 04.08.2016; опубл. 04.12.2017.
17. Пат. 2640255  РФ, МПК A23C 19/032. Штамм Propionibacterium, обладающий ингибирующей активностью против дрожжей и плесневых грибов (варианты) и его применение / К. Бенфельт, Х.У. Моргенстерн; заявитель и патентообладатель ДЮПОН НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АПС. – № 2014151721; заявл. 21.05.2013;  опубл. 27.12.2017.
18. Пат. 2567813 РФ, МПК A23C 9/12, C12N 1/20, A61K 38/46, C12R 1/01. Способ получения бактериального концентрата / И.С. Хамагаева, Н.А. Замбалова, С.Б, Найданова; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления». – № 2014125648/10; заявл. 24.06.2014; опубл. 10.11.2015.
19. Пат.  97108832  РФ,  МПК  C12N 1/20, A23C   9/12.   Способ   получения  пробиотика «Симбитер-2» и способ производства с его использованием кисломолочного продукта / Д.С. Янковский, Г.С. Дымент, Е.П. Потребчук [и др.]; заявитель и патентообладатель Обще- ство с ограниченной ответственностью Фирма «О.Д. Пролисок». – № 97108832/13; заявл. 23.05.1997; опубл. 27.04.1999.
20. Пат. 2291899 РФ, МПК C12N 1/20, A61К 35/74. Композиция микроорганизмов (варианты) / А. Мяйря-Мякинен, Т. Суомалайнен, О. Ваарала; заявитель и патентообладатель ВАЛИО ЛТД. – № 2003125858/13; заявл. 17.01.2002; опубл. 20.01.2007.
21. Pat.  EP1527159,  IPC A23K 1/00, A23L 1/30, A23L 29/00, A61K 35/74, A61K 35/741, A61K 39/00. Probiotic Propionibacterium jensenii 702 / A.M. Catherine, H.Yang; applicant UNIV NEWCASTLE RES ASS. – № 03729707; stated 20.06.2003; published 04.05.2005.
22. Pat. 20050180963, IPC A01N 63/00, A23K 1/00, A23L 1/03, A23L 1/30, A61K 35/74, A61K 39/00. Probiotic propionibacterium / A.M. Catherine, H.Yang; applicant University of Newcastle Research Associates. – № 11018911; stated 21.12.2004; published 18.08.2005.
23. Pat. WO/2016/183319, IPC A61K 35/744, A61K 9/20, A61K 9/48. Propionibacterium fruedenreichii as a probiotic for infants / М. Mohamadzadeh, В. Sahay; applicant UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH FOUNDATION, INCORPORATED. – № PCT/US2016/032096; stated 17.11.2016; published 12.05.2016.
24. Pat. CZ301673, IPC A23L 1/03, A23L 29/00, A61K 35/74, A61P 1/00, A61P 35/00, C12N 1/20. Combination of probiotics and use thereof / Annika Mäyrä-Mäkinen, Tarja Suomalainen, Outi Vaarala; applicant UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH FOUNDATION, VALIO LTD. – № 2003-1915; stated 17.01.2002; published 19.05.2010.
25. Britz, T.J. Propionibacterium species diversity in leerdammer cheese / T.J. Britz, K.-H.J. Riedel // International Journal of Food Microbiology. – 1994. – V. 22, I. 4. – P. 257–267. DOI: 10.1016/0168-1605(94)90177-5
26. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Second edition. Volume three. The Firmicutes – Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, NY 10013, USA. – 2009. – 1422 р
27. Воробьева, Л.И. Пропионовокислые бактерии / Л.И. Воробьева. – М.: Издательство МГУ, 1995. – 288 с.
28. Хаева,  О.Э. Морфологокультуральные и физиологические особенности новых штаммов Propionibacterium / О.Э. Хаева, Б.Г. Цугкиев, Л.П. Икоева // Известия Горского государственного аграрного университета. – 2019. – Т. 56, № 3. – С. 80–86.
29. Оценка пробиотического потенциала и функциональных свойств lactobacillus reuteri lr1 in vitro / А.В. Бегунова, О.С. Савинова, И.В. Рожкова, Ю.И. Крысанова, Т.В. Фёдоро- ва // Прикладная биохимия и микробиология. – 2020. – Т. 56, № 5. – С. 472–482.
30. Шишин, М.В. Исследование морфологических и антимикробных свойств микроорганизмов кишечного тракта / М.В. Шишов, А.Ю. Просеков // Техника и технология пищевых производств. – 2015. – Т. 39, № 4. – С. 131–137.
31. Волкова, Г.С. Изучение биологических межштаммовых взаимодействий и ростовых свойств производственных штаммов молочнокислых бактерий / Г.С. Волкова, Е.В. Куксова, Е.М. Серба // Актуальные вопросы молочной промышленности, межотраслевые технологии и системы управления качеством. 2020. – Т. 1, № 1 (1). – С. 104–109.
32. Bacteriocins of propionic acid bacteria / Holoa, T. Fayec, D.A. Bredea, T. Nilsena, I. Ødegårdb, et al. // Le Lait. – 2002. – V. 82, № 1. – Р. 59–68

Будьте здоровы!