Молочные пропионовокислые бактерии предотвращают остеопороз

МОЛОЧНЫЕ ПРОПИОНОВОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ ПРЕДОТВРАЩАЮТ ОСТЕОПОРОЗ

Пробиотик Propionibacterium freudenreichii MJ2 усиливает дифференциацию и минерализацию остеобластов за счет увеличения соотношения OPG / RANKL

Примечание редактора: Данная статья об исследовании является сугубо научной, изобилующей специальными терминами, поэтому для рядового читателя данную работу можно описать кратко. Суть исследования заключается в том, что пероральное введение живых или термически убитых молочных пропионовокислых бактерий (ПКБ) предотвращает индуцированную остеопорозом потерю костной массы. В частности, поверхностные белки, выделенные из штамма Propionibacterium freudenreichii MJ2, способствовали дифференцировке и минерализации остеобластов. Остеобласты - это молодые клетки костной ткани(диаметром 15-20 мкм), которые синтезируют межклеточное вещество - матрикс. Таким образом, ПКБ усиливают дифференцировку и минерализацию остеобластов, и эффективным компонентом ПКБ являются их поверхностные белки, которые влияют на определенные гены. При этом отмечено, что неживые ПКБ влияют на этот процесс эффективнее, чем живые. Причина этого не поясняется, однако можно предположить, что неживые ПКБ сразу представляют собой пищевой компонент и поверхностные белки лучше усваиваются организмом, в то время как живые ПКБ осуществляют транзит по ЖКТ и «неохотно» отдают свои определенные поверхностные белки. Однако при приеме биодобавок с ПКБ и пробиотических кисломолочных продуктов (ферментированных ПКБ) потребляются как живые так и не живые ПКБ. Поэтому эти продукты можно рассматривать как перспективные средства для предотвращения разрушения костной ткани. Также ранее мы сообщали, что в работе MarioM. Zaiss., etal. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nature Communications, 9, Article number: 55 (2018). было  показано, что пропионат защищает костную систему от патологического разрушения (предотвращает остеопороз). Так как ПКБ являются активными продуцентами пропионата, то их прием в качестве биодобавок, с точки зрения профилактики остеопороза, весьма оправдан.

Резюме

Дифференцировка остеобластов важна для развития кости и поддержания плотности костной ткани. Propionibacterium freudenreichii - пробиотик с противовоспалительным свойством. Целью данного исследования было изучение усиливающего влияния P. freudenreichii MJ2 (MJ2), выделенного из сырого молока, на дифференцировку остеобластов, их минерализацию и сигнальный путь. Для экспериментов in vitro и in vivo использовали линию остеобластных клеток плода человека hFOB 1.19 и модель овариэктомированной крысы соответственно. Уровни экспрессии генов и белков, связанных с дифференцировкой и минерализацией остеобластов, измеряли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (qPCR) и вестерн-блоттинга соответственно. Для измерения минерализации остеобластов проводили окрашивание ализарином красным S. Обработанные термически убитым MJ2 (hkMJ2) клетки показали значительно увеличенную дифференцировку остеобластов за счет увеличения соотношения остеопротегерин (OPG) / рецепторный активатор лиганда ядерного фактора-κB (RANKL) и значительно увеличили минерализацию остеобластов за счет стимуляции экспрессии костного морфогенетического белка 2 и runt-связанного транскрипционного фактора 2. Кроме того, пероральное введение живого или термически убитого MJ2 овариэктомированным крысам ингибировало индуцированную остеопорозом потерю костной массы. В частности, поверхностные белки, выделенные из MJ2, способствовали дифференцировке и минерализации остеобластов. Таким образом, MJ2 усиливает дифференцировку и минерализацию остеобластов через сигнальный путь OPG/RANKL, и эффективным компонентом MJ2 могут быть его поверхностные белки.

1. Введение

Кость - это жесткая ткань, встречающаяся только у позвоночных. Кости в основном играют роль в структурной поддержке механических функций, защите внутренних органов, обеспечении среды для кроветворения и накоплении минералов, таких как кальций и фосфор [1]. Кость состоит из остеобластов, остеокластов и остеоцитов. Остеобласты, тип клеток, образующих кость, происходят из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и продуцируют внеклеточный матрикс кости. И наоборот, остеокласты, тип клеток, резорбирующих кость, происходят из гемопоэтических стволовых клеток костного мозга и обладают эрозивным действием, секретируя протеолитические ферменты. Остеоциты - это долгоживущие клетки, обнаруженные в зрелой костной ткани, которые происходят из зрелых остеобластов и больше не участвуют в формировании кости [1].

В общем, остеобласты постепенно изменяют свою форму по мере дифференциации и, наконец, приобретают кубовидную форму и составляют выстилку поверхности кости [2]. Они отвечают за производство различных компонентов костного матрикса. Следовательно, остеобласты являются очевидной мишенью для укрепления костной структуры. Дифференцировка остеобластов регулируется различными секретируемыми факторами, включая костные морфогенетические белки (BMPs), трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) и факторы роста фибробластов (FGFs), через различные сигнальные пути, включающие путь BMP-2/runt-связанный транскрипционный фактор 2 (RUNX2), hedgehog-сигнализацию, Notch-сигнализацию, WNT-сигнализацию и FGF-сигнализацию. Из этих путей путь BMP-2/RUNX2 модулируется BMPs и стимулирует специфические для остеобластов транскрипционные факторы, включая RUNX2. BMPs, которые являются членами суперсемейства TGF-β, играют важную роль в эмбриональном развитии и формировании скелета [3]. RUNX2 считается преобладающим фактором, опосредующим дифференцировку остеобластов. Этот фактор транскрипции обладает способностью регулировать конвергенцию остеогенных путей [4] и способствует усилению экспрессии генов, связанных с дифференцировкой остеобластов, таких как щелочная фосфатаза (ALP), остерикс (OSX) и фибронектин (FN). RUNX2 увеличивает соотношение остеопротегерин (OPG) / рецепторный активатор лиганда ядерного фактора-κB (RANKL), что является важным индикатором дифференцировки остеобластов. ALP является обычным клеточным белком и важным ферментом для клеточной активности и ранней дифференцировки остеобластов [4]. OPG подавляет развитие и дифференцировку остеокластов, вмешиваясь в комбинацию RANKL и рецепторного активатора ядерного фактора-κB (RANK) [5].

На протяжении всей жизни кость повторяет цикл формирования и разрушения под действием остеобластов и остеокластов соответственно. Повторяющийся цикл тщательно регулируется, что важно для здоровья костей. Таким образом, когда эта сбалансированная система разрушается, могут возникать различные заболевания костей [6,7]. Остеопороз - распространенное заболевание костей, при котором кость становится слабее и может сломаться из-за уменьшения костной массы и структурного ухудшения. Уменьшение костной массы происходит из-за нарушения баланса между остеобластами и остеокластами, что приводит к большей деградации кости остеокластами, чем образованию кости остеобластами [1,8]. Риск развития остеопороза естественным образом увеличивается с возрастом. Помимо возраста, другими факторами риска являются пол, курение и образ жизни. В частности, у женщин в постменопаузе костная масса быстро снижается из-за снижения уровня эстрогена в период менопаузы [9]. Распространенность остеопороза увеличивается по мере увеличения числа пожилых людей во всем мире, что стало серьезной глобальной проблемой здравоохранения. Для лечения остеопороза было разработано множество лекарств, но они имеют побочные эффекты, такие как расстройство желудка, изжога и тошнота [10,11]. Наиболее распространенная терапия остеопороза - это женские гормоны эстроген и прогестерон. Однако их хорошо известный побочный эффект - повышение риска рака груди [12]. Поэтому следует разрабатывать препараты без побочных эффектов или с меньшим количеством побочных эффектов. Помимо кальция и витамина D, были разработаны функциональные пищевые ингредиенты, такие как фитоэстрогены, для снижения риска остеопороза [13,14]. В последнее время все большее внимание уделяется пробиотикам, предотвращающим и улучшающим остеопороз [15,16]. Propionibacterium freudenreichii - это пробиотическая бактерия, которая считается безопасной. P. freudenreichii используется в качестве закваски для сыра и производит нутрицевтики, такие как витамины B12, B2 и K, и обладает бифидогенной активностью, которая характеризуется усилением роста бифидобактерий [17]. Вид P. freudenreichii улучшает модель острого колита, индуцированного декстрансульфатом натрия, у крыс, стимулируя экспрессию MUC2 [18]. Он также увеличивает уровни экспрессии мРНК dbl-1, tig-2, sma-3 и rnt-1 у Caenorhabditis elegans [19]. Среди них гены dbl-1 и tig-2 являются гомологами генов BMP-5 и BMP-8 позвоночных, соответственно, которые участвуют в развитии хряща и кости [20]. Кроме того, ген sma-3 является гомологом гена BMP-5 позвоночных, а ген rnt-1 является гомологом генов семейства RUNX человека, участвующих в регуляции пролиферации и дифференцировки остеобластов. На основании этих предыдущих сообщений мы предположили, что штамм P. freudenreichii MJ2 может вносить вклад в дифференцировку остеобластов и формирование кости. В этом исследовании влияние P. freudenreichii MJ2 на здоровье костей было исследовано путем сосредоточения внимания на его влиянии на дифференцировку и минерализацию остеобластов, а также на его сигнальный путь с использованием клеточной линии эмбриональных остеобластов человека hFOB 1.19, которая является типичной моделью клеток остеобластов человека для исследований in vitro, таких как дифференцировка и физиология остеобластов человека [21], и овариэктомированных (OVX) крыс.

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

Клеточная линия фетальных остеобластов человека hFOB 1.19 (ATCC CRL-11372) была приобретена из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США). Модифицированная среда Eagle/питательная смесь Ham's F-12 (DMEM/F12) Dulbecco, фетальная бычья сыворотка (FBS) и пенициллин/стрептомицин были получены из HyClone (Логан, Юта, США). 3-[4,5-Диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) был приобретен у Amresco (Солон, Огайо, США). п-Нитрофенилфосфат (pNPP) и ализарин красный S (натриевая соль 3,4-дигидрокси-9,10-диоксо-2-антраценсульфоновой кислоты) были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Моногидрат хлорида цетилпиридиния был получен от Samchun Chemical (Сеул, Корея). Рекомбинантный белок Noggin человека был приобретен в R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота, США). Диметилсульфоксид (DMSO) был приобретен в DAEJUNG (Siheung, Корея).

2.2. Культура клеток

Клетки hFOB 1.19 выращивали в среде DMEM / F12 с 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37°C с 5% CO₂. Среду меняли каждые 3 дня. В этом исследовании использовали клетки hFOB 1.19 менее чем на 10 пассажей. В опытах использовались клетки с конфлюэнтностью 80–90%. Принимая во внимание рекомендацию ATCC и предыдущие исследования [22,23], в этом исследовании среда не дополнялась аскорбиновой кислотой, бета-глицерофосфатом и дексаметазоном. Клетки высевали с плотностью 2,5 × 10⁴ клеток / мл и голодали в бессывороточной среде DMEM / F12 в течение 24 часов для синхронизации клеточного цикла.

2.3. Выделение Propionibacterium freudenreichii MJ2 и получение термоубитого P. freudenreichii MJ2

Штамм P. freudenreichii MJ2, использованный в этом исследовании, был выделен из непастеризованного сырого молока, полученного с местной фермы. Сырое молоко серийно разбавляли и высевали на лактат-агар с дрожжевым экстрактом (YELA), который состоял из 1% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 0,025% K2 HPO₄, 0,005% MnSO₄, 1% лактата натрия и 1,5% агара (pH доведен до 7,0 ± 0,05) [24]. После инкубации при 30°C в анаэробных условиях в течение 7 дней штамм выделяли после субкультивирования отдельных колоний. Затем с помощью секвенирования гена 16S рРНК был идентифицирован штамм P. freudenreichii и обозначен как P. freudenreichii MJ2. Штамм (KCCM12272P) депонирован в Корейском центре культуры микроорганизмов. P. freudenreichii MJ2 выращивали в усиленной клостридиальной среде (RCM) и культивировали при 30°C в камере с анаэробным кондиционированием (контейнерная система GasPak™ EZ; BD, Franklin lakes, NJ, USA). После 48 ч инкубации бактериальные клетки собирали центрифугированием при 3000 × g в течение 10 минут, а затем дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Гранулированные бактерии разбавляли до 1 × 10⁹ КОЕ / мл и уничтожали нагреванием при 100°C в течение 30 минут. Было подтверждено, что P. freudenreichii MJ2 не растет после термической обработки. Lactobacillus plantarum (недавно классифицированный как Lactiplantibacillus plantarum) [25] KACC15357 был приобретен из Корейской коллекции сельскохозяйственных культур (Wanju, Jeollabuk-do, Корея) и культивировался в бульоне De Man, Rogosa и Sharpe (MRS, Oxoid Ltd., Hampshire, Великобритания) в анаэробных условиях при 37 °C в течение 24 ч.

2.4. Измерение жизнеспособности клеток

Клетки hFOB 1.19 высевали в 96-луночные планшеты при плотности 2,5 × 10⁴ клеток / мл. После инкубации в течение ночи при 37°C клетки голодали в бессывороточной среде DMEM / F12 в течение 24 часов и обрабатывались убитыми нагреванием P. freudenreichii MJ2 (hkMJ2) (1 × 10⁶, 1 × 10⁷ или 1 × 10⁸. клеток / мл) в течение 14 дней. Среду меняли каждые 3 дня. Среду аспирировали и добавляли 0,5 мг / мл МТТ. После инкубации при 37°C в течение 1 часа супернатант аспирировали и формазаны растворяли в DMSO в течение 1 часа. Чтобы удалить выпавшую в осадок высокую дозу hkMJ2, планшеты центрифугировали при 3000 × g в течение 5 мин, а затем собирали только супернатант. Поглощение измеряли при 540 нм с использованием планшет-ридера SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США). Жизнеспособность клеток (%) рассчитывали как процент по отношению к группе отрицательного контроля.

2.5. Анализ активности щелочной фосфатазы (ALP)

Клетки hFOB 1.19 высевали в 12-луночные планшеты при плотности 2,5 × 10⁴ клеток / мл. После инкубации при 37°C в течение ночи клетки голодали в бессывороточной среде в течение 24 часов, а затем обрабатывались hkMJ2 (1 × 10⁶, 1 × 10⁷ или 1 × 10⁸ клеток / мл) в течение 14 дней. Для анализа ингибирования клетки обрабатывали 100 нг / мл Noggin, который участвует в развитии костей. Среду меняли каждые 3 дня. Затем клетки промывали PBS и лизировали в буфере, который состоял из 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ MgCl₂ и 0,2% Triton X-100. Суспензии клеток помещали на лед при перемешивании и затем центрифугировали при 2500 × g в течение 10 мин при 4°C. Супернатанты собирали, и каждый образец (50 мкл / лунка) загружали в 96-луночный планшет. Раствор субстрата pNPP (50 мкл) добавляли в каждую лунку. После осторожного перемешивания планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 50 мкл NaOH и измеряли оптическую плотность при 405 нм с использованием планшет-ридера SpectraMax 340PC384. Относительную активность ALP нормализовали к концентрации общего белка, количественно определенной с помощью анализа Брэдфорда (Biorad, Hercules, CA, USA).

2.6. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qPCR)

Клетки hFOB 1.19 высевали в 6-луночные планшеты при плотности 2,5 × 10⁴ клеток / мл. После инкубации в течение ночи при 37°C клетки голодали в бессывороточной среде в течение 24 часов, а затем обрабатывались hkMJ2 (1 × 10⁶, 1 × 10⁷ или 1 × 10⁸ клеток / мл) в течение 14 дней. Для анализа ингибирования клетки обрабатывали 100 нг / мл Noggin. Среду меняли каждые 3 дня. Тотальную РНК экстрагировали с использованием реагента Ribo-Ex (GeneAll Biotechnology, Сеул, Корея) в соответствии с инструкциями производителя. Экстрагированную общую РНК количественно определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), а затем преобразовывали в кДНК с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК RevertAid (Thermo Scientific). qPCR выполняли с использованием набора Kapa SYBR Fast qPCR (Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA) с системой 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Реакционную смесь предварительно нагревали до 95°C в течение 10 минут с последующими 40 циклами при 95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 30 секунд. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) использовалась в качестве контрольного гена, и последовательности праймеров, использованные в этом исследовании, показаны в таблице 1. Праймеры были приобретены у Bioneer (Сеул, Корея). Относительную экспрессию генов определяли количественно на основе равных количеств РНК и рассчитывали значение ΔCt (ΔCt = Ct_{target gene} − Ct_{reference gene}). Значение ΔΔCt рассчитывали по следующему уравнению: ΔΔCt = (ΔCt_treated − ΔCt_untreated). Нормализованное изменение экспрессии выражалось как 2^-ΔΔCt (контроль GAPDH был установлен на 1) [26]. Для образцов животных заднюю бедренную кость крысы иссекали, расщепляли на мелкие кусочки с помощью жидкого азота и гомогенизировали в реагенте Ribo-Ex для извлечения мРНК. Супернатант собирали после центрифугирования при 12000× g в течение 10 мин, а последующую экстракцию мРНК и qPCR проводили, как описано выше. Для бедренной кости крысы в качестве эталонного гена использовали β-актин, а праймерные последовательности OPG, RANKL и β-актина приведены в таблице 1.

Таблица 1. Последовательности праймеров, используемые для qPCR.

2.7. Вестерн-блоттинг

Клетки hFOB 1.19 высевали в чашки диаметром 60 мм при плотности 2,5 × 10⁴ клеток / мл. После инкубации в течение ночи при 37°C клетки голодали в бессывороточной среде в течение 24 часов, а затем обрабатывались hkMJ2 (1 × 10⁶, 1 × 10⁷ или 1 × 10⁸ клеток / мл) в течение 14 дней. Среду меняли каждые 3 дня. Затем клетки собирали и лизировали для экстракции белка с использованием буфера для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) (Rockland Immunochemicals, Лимерик, Пенсильвания, США), содержащего смесь ингибиторов протеазы Halt ™ (Thermo Scientific). Концентрацию общего белка определяли методом Брэдфорда, и белки денатурировали при 100°C в течение 10 мин. Равное количество белка (20 мкг) из каждого образца отделяли электрофорезом в 10% -ном додецилсульфат-натрий-полиакриламидном геле. Разделенные белки переносили на PVDF-мембрану (Millipore, Bedford, MA, USA) и блокировали 5%-ным обезжиренным молоком в трис-буферном солевом растворе (TBS) с 0,05% Твином 20 (TBST) при комнатной температуре в течение 2 час. Мембрану трижды промывали TBST, а затем инкубировали с первичным антителом при 4°C в течение ночи. Антитела против эндогенного контрольного β-актина (разведение 1: 5000, MA5-15739; Thermo Scientific), OPG (разведение 1: 1000, GTX55734; Genetex, Ирвин, Калифорния, США), RANKL(разведение 1: 1000, GTX32834; Genetex), BMP2 (разведение 1: 500, ab14933; Abcam), Smad1/5/9 (разведение 1: 1000, ab66737; Abcam) и RUNX2 (разведение 1: 1000, ab23981; Abcam) использовали в качестве первичных антител. Мембраны трижды промывали TBST, а затем инкубировали с вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа. Для обнаружения анти-β-актина использовали козье анти-мышиное IgG (H+L)-конъюгированное с пероксидазой хрена антитело (разведение 1:10000, NCI1430KR; Thermo Scientific), а для обнаружения других белков - козье анти-кроличье IgG (H + L) - конъюгированное с пероксидазой хрена антитело (разведение 1:5000, NCI1460KR; Thermo Scientific). После инкубации мембрану трижды промывали TBST и проявляли с помощью набора SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific). Изображения получали и количественно оценивали с помощью программы ImageJ Gel Analysis (Softomic, Барселона, Испания). Для образцов на животных иссекали заднюю бедренную кость крысы, удаляли соединительную ткань и мышцы. Затем бедренную кость разделяли на мелкие кусочки с помощью жидкого азота и гомогенизировали в буфере RIPA для экстракции белка. После центрифугирования при 13 000 об / мин в течение 5 мин получали супернатант с последующей денатурацией белка. Вестерн-блоттинг проводили с первичными антителами против эндогенного контрольного β-актина, OPG и RANKL (разведение 1:1000, GTX108515; Genetex), как описано выше.

2.8. Двумерный электрофорез (2-DE) и ЖХ-МС / МС

2-DE проводили, как описано ранее [27]. Аликвоты в буфере для образцов (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4,5% 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат, 100 мм дитиоэритрита и 40 мм Трис, рН 8,8) наносили на иммобилизованные полосы нелинейного градиента рН 3-10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Швеция). Изоэлектрическая фокусировка производилась на 80 000 Vh. Второе измерение анализировали на полиакриламидных гелях с линейным градиентом 9–16% (18 см × 20 см × 1,5 мм) при постоянном токе 40 мА на гель в течение приблизительно 5 часов. После фиксации белка в 40% метаноле и 5% фосфорной кислоте в течение 1 ч гели окрашивали кумасси бриллиантовым синим G-250 (Thermo Fisher) в течение 12 ч. Гели обесцвечивали H₂O, сканировали на денситометре GS710 (Bio-Rad, Ричмонд, Калифорния, США) и преобразовывали в электронные файлы, которые затем анализировали с помощью программы анализа изображений Image Master Platinum 5.0 (Amersham Biosciences).

Нано-ЖХ-МС/МС анализ выполняли с помощью Easy n-LC (Thermo Fisher) и масс-спектрометра LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher), оборудованного источником наноэлектрораспыления. Образцы разделяли на колонке с наноразмерными отверстиями C18 (150 × 0,1 мм, размер пор 3 мкм; Agilent). Подвижная фаза A для разделения ЖХ представляла собой 0,1% муравьиной кислоты и 3% ацетонитрила в деионизированной воде, а подвижная фаза B представляла собой 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Хроматографический градиент представляет собой линейное увеличение от 0% B до 60% B за 9 минут, от 60% B до 90% B за 1 минуту и ​​3% B за 5 минут. Скорость потока поддерживалась на уровне 1,8 мкл / мин. Масс-спектры получали с использованием сбора данных, зависящего от данных, с полным сканированием массы (380-1700 m/z) с последующими 10 сканированиями MС / MС. Для полного сканирования MС1 разрешение орбитальной ловушки составляло 15000, а автоматическая регулировка усиления (AGC) составляла 2 × 10⁵. Для MС / MС в LTQ AGC составлял 1 × 10⁴. Алгоритм mascot (Matrix Science, Бостон, Массачусетс, США) использовался для идентификации пептидных последовательностей в базе данных белковых последовательностей. Критерии поиска в базе данных были следующими: таксономия; Homo sapiens, фиксированная модификация; карбамидометилированный по остаткам цистеина, вариабельная модификация; окислен по остаткам метионина, максимально допустимое пропущенное расщепление; 2, допуск MС; 10 ppm, погрешность MС/MС; 0,8 Да. Пептиды фильтровали с порогом значимости p <0,05.

2.9. Иммуноцитохимия (ICC)

Клетки высевали на покровные стекла, покрытые 0,1% желатином, в 24-луночный планшет при плотности 1,25 × 10⁴ клеток / мл. После инкубации в течение ночи при 37°C клетки голодали в бессывороточной среде в течение 24 часов, а затем обрабатывались hkMJ2 (1 × 10⁶, 1 × 10⁷ или 1 × 10⁸ клеток / мл) в течение 14 дней. Среду меняли каждые 3 дня. Клетки промывали PBS, а затем фиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 30 мин. Клетки промывали PBS и затем повышали проницаемость с помощью 0,1% Triton X-100 в PBS. Затем клетки блокировали 10% нормальной ослиной сывороткой (NDS) при комнатной температуре в течение 30 мин. Первичное антитело против RUNX2 (разведение 1: 1000, ab23981; Abcam) в 2% NDS разводили до 1: 500 и применяли при 4°C в течение ночи. Клетки промывали PBS и затем инкубировали с вторичным антителом, козьим анти-кроличьим IgG DyLight 488 (разведение 1:1000, 35553; Thermo Scientific), в 2% NDS. Ядра окрашивали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (Sigma) в течение 5 мин, а покровные стекла монтировали с помощью VECTASHIELD ® (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Изображения были получены под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом C1 plus (Nikon, Токио, Япония).

2.10. Окрашивание ализарином красным S

Клетки высевали в 12-луночный планшет при плотности 2,5 × 10⁴ клеток / мл. После инкубации в течение ночи при 37°C клетки голодали в бессывороточной среде в течение 24 часов, а затем обрабатывались hkMJ2 (1 × 10⁶, 1 × 10⁷ или 1 × 10⁸ клеток / мл) в течение 21 дня. Среду меняли каждые 3 дня. Затем клетки промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре. Фиксирующий раствор отсасывали и клетки тщательно промывали дистиллированной водой. Готовили раствор ализарина красного S (2%), растворенный в дистиллированной воде (доведенный до pH 4,2), фильтрованный через шприц-фильтр 0,22 мкм, и клетки окрашивали раствором при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. Затем раствор отсасывали и клетки осторожно промывали дистиллированной водой. Изображения получали под оптическим микроскопом, а затем окрашенные отложения растворяли в 10% цетилпиридиния хлориде. Для количественного определения уровней минерализации супернатанты переносили в 96-луночный планшет и измеряли оптическую плотность при 562 нм.

2.11. Модель животных

Семьдесят две самки крыс Sprague Dawley (возраст 9 недель) массой 170–190 г были приобретены в компании Koatech (Пхёнтхэк, Корея). Их поддерживали при 24 ± 1°C с 12-часовым циклом свет/темнота при влажности 55%. Животные содержались с неограниченным доступом к лабораторной диете (Harlan diet 2018S, Koatech) и воде. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Корейского университета (номер утверждения KUIACUC-2020-0005). Все экспериментальные процедуры выполнялись в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Публикация NIH № 85–23, 1996). После акклиматизации в течение 1 недели крысы были случайным образом разделены на девять групп (n = 8 в каждой группе) (таблица 2). Крыс в фиктивной группе подвергали только разрезу без удаления яичников, а из других групп удаляли двусторонние яичники. Крысам вводили ежедневную пероральную инъекцию каждой тестовой линии в течение 4 месяцев, и их вес измеряли каждую неделю. Для экспериментов на животных в качестве положительного эталонного штамма использовали Lactobacillus plantarum KACC15357. Известно, что L. plantarum предотвращает потерю костной массы [28]. L. plantarum культивировали в бульоне MRS в анаэробных условиях при 37°C в течение 24 часов, и штамм получали по той же методике, которая описана выше. Мертвые P. freudenreichii MJ2 получали с помощью той же процедуры термообработки (100°C в течение 30 мин), описанной выше.

Таблица 2. Группы животных, использованные в данном исследовании.

2.12. Измерение минеральной плотности костной ткани (BMD)

Высококачественные 3D-изображения бедренных костей крыс были получены с помощью системы микрокомпьютерной томографии (CT) (SkyScan 1173, Konitch, Бельгия) с разрешением 20 мкм, фильтром 1,0 мм, экспозицией 500 мс, напряжением 90 кВ и током 88 мкА. Изображения были реконструированы с использованием программного обеспечения Nrecon (версия 1.7.4.2). Задние лапы крыс сканировали с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии с использованием InAlyzer (Medikors, Соннам, Корея) с разрешением 108 × 108 мкм, размером поля 140 × 210 мм и временем сканирования 5 мин. Минеральную плотность костной ткани (BMD) анализировали с помощью программы InAlyzer.

2.13. Гистологический анализ

Для гистологического анализа бедро крысы фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, декальцинировали в 10% этилендиаминтетраацетате и заливали парафином. Залитые парафином ткани разрезали на срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Срезы наблюдали под обращенно-фазовым микроскопом DM750 (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).

2.14. Экстракция поверхностных белков из P. freudenreichii MJ2

Поверхностные белки P. freudenreichii MJ2 экстрагировали с использованием хаотропного реагента, как описано ранее [29,30]. P. freudenreichii MJ2 культивировали в течение 48 часов при 30°C, собирали центрифугированием при 3000 об / мин в течение 10 минут, а затем дважды промывали PBS. Затем к осадку бактериальных клеток добавляли 5 M гидрохлорид гуанидина со значением OD600, равным 20, и осторожно суспендировали. Суспензию инкубировали при 50°C в течение 15 мин. Затем проводили центрифугирование при 21 000×g в течение 20 мин, а супернатанты собирали и диализировали против PBS в течение 24 ч при 4°C с использованием кассеты для диализа Slide-A-Lyzer^® с отсечкой 10 кДа (Thermo Scientific). Оставшиеся гранулы также собирали, разбавляли до 1 × 10⁹ клеток/мл и диализировали. Через 24 ч раствор в кассете собирали и измеряли концентрацию белка методом Брэдфорда, а затем хранили при температуре -80 °C.

2.15. Статистический анализ

Экспериментальные значения in vitro выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD), а экспериментальные значения in vivo выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистический анализ выполняли с использованием SPSS 24.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Разницу между двумя группами проверяли с помощью t-критерия Стьюдента, а различия между группами определяли с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным критерием достоверно значимой разницы (HSD) Тьюки. Статистически значимым считалось значение p <0,05.

3. Результаты

3.1. Цитотоксичность hkMJ2 в клетках hFOB 1.19

Чтобы исследовать цитотоксичность hkMJ2 в клетках hFOB 1.19, их жизнеспособность измеряли с помощью анализа МТТ. Жизнеспособность клеток, обработанных hkMJ2 (1 × 10⁶, 1 × 10⁷ или 1 × 10⁸ клеток / мл), не показала значительного снижения (рис. 1). Поэтому в этом исследовании мы использовали hkMJ2 в концентрациях 1 × 10⁶, 1 × 10⁷ и 1 × 10⁸ клеток / мл.

Рисунок 1. Цитотоксическое действие термически убитого P. freudenreichii MJ2 (hkMJ2) на клетки hFOB 1.19. Эти значения указывают на среднее значение ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех повторностях.

3.2. Повышение активности щелочной фосфатазы (ALP) и минерализации остеобластов, вызванное hkMJ2

Чтобы исследовать влияние hkMJ2 на дифференцировку остеобластов, мы проанализировали активность ALP, маркера относительно ранней стадии дифференцировки остеобластов. Хотя активность ALP в клетках, обработанных 1 × 10⁶ клеток/мл hkMJ2, существенно не увеличивалась, активность ALP в клетках, обработанных 1 × 10⁷ и 1 × 10⁸ клеток / мл hkMJ2, была значительно увеличена по сравнению с отрицательным контролем (рис. 2А, В). Эти результаты свидетельствуют о том, что hkMJ2 стимулировал индукцию дифференцировки остеобластов. Чтобы исследовать, индуцирует ли hkMJ2 терминальную дифференцировку остеобластов, степень минерализации измеряли с использованием ализарина красного S, который образует красный комплекс с кальцием. Образование красных отложений значительно увеличивалось дозозависимым образом с hkMJ2 по сравнению с отрицательным контролем (рис. 2C, D). Эти результаты свидетельствуют о том, что hkMJ2 увеличивает минерализацию остеобластов.

Рисунок 2. Влияние убитых нагреванием P. freudenreichii MJ2 (hkMJ2) на активность щелочной фосфатазы (ALP) и минерализацию остеобластов. Активность ALP анализировали окрашиванием п-нитрофенилфосфатом (× 100, шкала = 100 мкм) (А) и определяли количественно (В). Отложения кальция окрашивали ализариновым красным S (× 100, шкала = 100 мкм) (C) и определяли количественно (D). Значения указывают на среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях.

3.3. Экспрессия генов и белков, связанных с дифференцировкой остеобластов, индуцированная лечением hkMJ2

Чтобы исследовать влияние hkMJ2 на уровни экспрессии генов и белков, связанных с дифференцировкой остеобластов, мы выполнили qPCR и вестерн-блоттинг соответственно. Хотя уровень экспрессии остерикса (OSX) не изменялся дозозависимым образом, он был значительно повышен в клетках, обработанных hkMJ2, по сравнению с отрицательным контролем. Уровни экспрессии остеогенных генов, включая OPG / RANKL, фибронектин (FN) и остеокальцин (OC), были значительно увеличены в клетках, обработанных hkMJ2 дозозависимым образом по сравнению с отрицательным контролем (рис. 3A). Однако, хотя соотношение белков OPG / RANKL в клетках, обработанных hkMJ2, постепенно увеличивалось по мере увеличения дозы, соотношение OPG / RANKL значительно увеличивалось только в клетках, обработанных 1 × 10⁸ клеток / мл hkMJ2 (рис. 3B, C).

Рисунок 3. Уровни экспрессии генов и белков, связанных с дифференцировкой остеобластов, в клетках, обработанных убитыми нагреванием P. freudenreichii MJ2 (hkMJ2). Уровни экспрессии генов измеряли с помощью qPCR (A), а белки измеряли с помощью вестерн-блоттинга (B) и определяли количественно (C). Значения указывают на среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях.

3.4. 2-DE и идентификация белков

Чтобы изучить возможный механизм P. freudenreichii MJ2 в дифференцировке остеобластов, мы выполнили 2-DE (двумерный электрофорез). Среди 690 пятен 51 пятно показало увеличение уровня экспрессии более чем в 2 раза, а 90 пятен показали снижение уровня экспрессии до менее 0,5 раза по сравнению с отрицательным контролем. Среди них два пятна (<0,2 раза) и четыре пятна (> 4 раза) были идентифицированы с помощью ЖХ-МС / МС (таблица 3). Чтобы исследовать взаимосвязь между этими белками и генами, связанными с дифференцировкой остеобластов, которые были проанализированы на рисунке 3, мы провели анализ STRING. Когда минимальный требуемый показатель взаимодействия был установлен на средний уровень достоверности 0,400, белок теплового шока (HSPD1), протеин-дисульфид-изомераза (P4HB) и виментин (VIM) продемонстрировали взаимодействие с генами, связанными с дифференцировкой остеобластов (рис. 4). Эти результаты показали, что VIM, HSPD1 и P4HB могут быть связаны с белками, связанными с дифференцировкой остеобластов. В частности, протеиндисульфидизомераза связана со стрессом эндоплазматического ретикулума (ER), а передача сигналов, индуцированная стрессом ER, связана с образованием кости [31,32]. Путь передачи сигналов костного морфогенетического белка 2 (BMP2), опосредованный стрессом ER, индуцирует дифференцировку остеобластов. Следовательно, hkMJ2 может играть роль в передаче сигналов BMP2, связанных со стрессом ER и дифференцировкой остеобластов.

Рисунок 4. STRING-анализ сетей взаимодействия белков. Взаимодействия идентифицированных белков были картированы путем поиска в базе данных STRING версии 10.5 с порогом достоверности 0,4. В результирующей сети ассоциации белков белки представлены в виде узлов, соединенных линиями, толщина которых представляет уровень достоверности. Связанные с дифференцировкой остеобластов гены BGLAP (OC), TNFRSF11B (OPG), SP7 (OSX), TNFSF11 (RANKL) и FN1 (фибронектин) были получены из данных qPCR (рис. 3).

Таблица 3. Белки, идентифицированные методом двумерного электрофореза (2-DE) и ЖХ-МС/МС

¹ Кратное изменение по-разному экспрессируемых белков в группе, обработанной 1 × 10⁸ клеток / мл hkMJ2, по сравнению с контрольной группой.

3.5. Лечение hkMJ2 активирует сигнальный путь BMP2 / RUNX2

Путь передачи сигналов BMP2 является критическим механизмом дифференцировки остеобластов, за которым следует активация RUNX2, критического транскрипционного фактора дифференцировки остеобластов. Чтобы исследовать механизм индуцированной hkMJ2 дифференцировки остеобластов, уровни экспрессии мРНК BMP2, RUNX2, Smad1, Smad5, Smad8, Smad4 и RUNX2 были проанализированы с помощью qPCR. Уровни экспрессии генов, связанных с сигнальным путем BMP2 / RUNX2, были значительно увеличены в клетках, обработанных 1 × 10⁷ и 1 × 10⁸ клеток / мл hkMJ2 по сравнению с отрицательным контролем, за исключением экспрессии Smad1 и Smad8, которая была значительно увеличена только в клетках, обработанных 1 × 10⁸ и 1 × 10⁷ клеток / мл hkMJ2, соответственно (рис. 5А). Уровни экспрессии белков BMP2, Smad 1/5/9 и RUNX2 были значительно увеличены в клетках, обработанных 1 × 10⁸ клеток / мл hkMJ2, по сравнению с отрицательным контролем (рис. 5B, C). Уровень экспрессии RUNX2, измеренный с помощью ICC, показал значительное увеличение в клетках, обработанных 1 × 10⁷ и 10⁸ клеток / мл hkMJ2 (рис. 5D, E). Эти результаты показали, что hkMJ2 может способствовать активации сигнального пути BMP2 / RUNX2.

Рисунок 5. Влияние убитых нагреванием P. freudenreichii MJ2 (hkMJ2) на уровни экспрессии генов и белков, связанных с передачей сигналов BMP2 / RUNX2. Уровни экспрессии генов измеряли с помощью qPCR (A), а белки измеряли с помощью вестерн-блоттинга (B) и определяли количественно (C). Уровень экспрессии белка RUNX2 измеряли иммуноцитохимическим методом (ICC) (× 60, масштабная линейка = 40 мкм) (D), а относительную интенсивность оценивали количественно (E). Значения указывают на среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях.

Чтобы проверить, усиливает ли hkMJ2 дифференцировку остеобластов посредством пути передачи сигналов BMP2 / RUNX2, мы использовали BMP-ингибитор Noggin [33]. Хотя клетки, обработанные только ингибитором, не проявляли значительного ингибирующего эффекта по сравнению с отрицательным контролем, клетки, обработанные 100 нг/мл Noggin (и 1 × 108 клеток/мл hkMJ2), показали значительное снижение экспрессии мРНК по сравнению с клетками, обработанными только hkMJ2 (рис.6А). Кроме того, активность ALP в клетках, обработанных Noggin и hkMJ2, показала значительное снижение по сравнению с клетками, обработанными только hkMJ2 (рис. 6B). Эти результаты свидетельствуют о том, что hkMJ2 способствует дифференцировке остеобластов через сигнальный путь BMP2/RUNX2.

Рисунок 6. Уровни экспрессии генов, связанных с передачей сигналов BMP2 / RUNX2, в клетках, обработанных убитыми нагреванием штаммом P. freudenreichii MJ2 (hkMJ2) (1 × 10⁸ клеток / мл) и BMP-ингибитором Noggin (100 нг / мл) (A) и активность ALP (B). Значения указывают на среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях.

3.6. Влияние введения P. freudenreichii MJ2 (MJ2) и / или L. plantarum (LP) крысам после овариэктомии (OVX) на массу тела и гепатотоксичность

Чтобы исследовать ингибирующий эффект MJ2 на потерю костной массы на модели крыс OVX, крысам OVX вводили hkMJ или живой MJ2, а в качестве контроля использовали живую L. plantarum (LP). После 16 недель лечения вес тела не показал значительной разницы между всеми группами OVX. Группы OVX показали увеличение массы тела по сравнению с фиктивной группой, что могло быть связано с овариэктомией. Кроме того, не было значительных различий в уровнях глутаминовой щавелевоуксусной трансаминазы (GOT) или глутаминовой пируваттрансаминазы (GPT) в сыворотке между группами (Таблица 4). Эти результаты показали, что введение живых / мертвых MJ2 и LP не проявляло гепатотоксичности у мнимых крыс и крыс OVX.

Таблица 4. масса тела и сывороточные уровни глутаминовой оксалоуксусной трансаминазы (GOT) и глутаминовой пируваттрансаминазы (GPT) овариэктомированных крыс (OVX).

Значения указывают на среднее значение ± SEM.

3.7. Улучшение BMD бедренной кости и ингибирующий эффект на потерю костной массы у крыс OVX, получавших MJ2

Изображения групп при micro-CT показаны на рисунке 7A. Минеральную плотность костной ткани (BMD) бедренной кости оценивали с помощью рентгенографии. BMD в группе OVX была значительно снижена по сравнению с таковой в фиктивной группе (рис. 7B). BMD групп, обработанных бактериями, за исключением групп, получавших живые MJ, была значительно увеличена по сравнению с таковой в группе OVX. Эти результаты показали, что мертвый MJ2 сам по себе или с L. plantarum был более эффективен в предотвращении потери костной массы, чем введение живого MJ2 мышам с остеопорозом, индуцированным OVX.

Рисунок 7. Влияние MJ2 и L. plantarum на остеопорозную костную массу и костную микроархитектуру. Трехмерные изображения бедренной кости задней конечности были получены с помощью micro-CT (А). Была определена количественная оценка минеральной плотности костной ткани (BMD), измеренной двухэнергетическим сканированием с помощью рентгеновской абсорбциометрии (B). Микроархитектуру кости (кортикальная кость (С) и трабекулярная кость (D)) анализировали методом окрашивания H&E и количественно оценивали (×100, шкала бар = 100 мкм). Эти значения указывают на среднее значение ± SEM. ### p < 0,001 по сравнению с группой sham; * p < 0,05, ** p < 0,01 и *** p < 0,001 по сравнению с группой OVX.

3.8. Ингибирующий эффект на потерю костной массы у крыс OVX, получавших MJ2

Для исследования гистологических изменений ткани бедра мы провели окрашивание H&E. По сравнению с фиктивной группой, кортикальная кость в группе OVX истончилась (Рисунок 7C), а площадь костных трабекул в группе OVX уменьшилась и разорвалась (Рисунок 7D). Введение мертвого MJ2 приводило к заметному увеличению толщины кортикальной кости и площади костных трабекул. Эти результаты показали, что мертвый MJ2 оказывает ингибирующее действие на потерю костной массы у крыс OVX.

3.9. Крысы OVX, обработанные MJ2, демонстрируют увеличение отношения OPG / RANKL

Уровни экспрессии генов и белков OPG / RANKL достоверно не снижались в группе OVX по сравнению с группой sham, в то время как группы, обработанные мертвым MJ2, показали значительное увеличение дозозависимым образом по сравнению с группой OVX (рис. 8).

Рис. 8. Влияние MJ2 и L. plantarum на соотношение OPG / RANKL и экспрессию генов и белков, связанных с дифференцировкой остеобластов. Уровни экспрессии генов OPG / RANKL (A) и уровни экспрессии белков измеряли вестерн-блоттингом (B) и определяли количественно (C). Каждое значение указывает среднее значение ± SEM трех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах. * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001 по сравнению с группой OVX.

3.10. Жизнеспособность клеток, обработанных поверхностными белками (SP), экстрагированными из MJ2

Для исследования цитотоксичности поверхностных белков (SPs) и SP-обедненной фракции в клетках hFOB 1.19 жизнеспособность клеток измеряли методом МТТ. Жизнеспособность клеток, обработанных SPS 5, 10 и 20 мкг/мл или SP-обедненной фракцией (40 мкг/мл), не показала значительного снижения (рис.9). Поэтому мы использовали эти концентрации SP и обедненную SP фракцию в следующих экспериментах.

Рисунок 9. Цитотоксичность поверхностных белков (SPs), выделенных из MJ2 на клетках hFOB 1.19. Эти значения указывают на среднее значение ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах.

3.11. Активность ALP и уровни экспрессии генов, связанных с дифференцировкой остеобластов, в клетках, обработанных SPs, извлеченными из MJ2

Для изучения влияния поверхностных белков (SPs) на раннюю дифференцировку остеобластов мы проанализировали активность ALP. Относительная активность ALP в обработанных SP клетках была значительно повышена по сравнению с отрицательным контролем (рис. 10А, B). Неожиданно, хотя активность ALP в клетках, обработанных SP-обедненной фракцией (40 мкг/мл), была ниже, чем в клетках, обработанных SP, активность ALP в SP-обедненной фракции также была значительно повышена по сравнению с отрицательным контролем. Кроме того, истощенная SP фракция не увеличивала уровни экспрессии мРНК генов, связанных с дифференцировкой остеобластов, за исключением RUNX2. Уровни экспрессии OPG/RANKL, BMP2 и RUNX2 в клетках, обработанных SPs, были значительно увеличены дозозависимым образом по сравнению с отрицательным контролем, за исключением гена OC, который был значительно увеличен только в клетках, обработанных SP 20 мкг/мл (рис.10С). Истощенная SP-фракция не увеличивала уровни экспрессии мРНК генов, связанных с дифференцировкой остеобластов, за исключением RUNX2. Результаты показали, что SPs, происходящие из P. freudenreichii MJ2, участвуют в дифференцировке остеобластов.

Рисунок 10. Активность щелочной фосфатазы (ALP) и уровни экспрессии генов, связанных с дифференцировкой остеобластов, в клетках, обработанных поверхностными белками, экстрагированными из P. freudenreichii MJ2. Активность ALP анализировали окрашиванием (×100, шкала = 100 мкм) (А) и анализом активности (B). Уровни экспрессии генов, связанных с дифференцировкой остеобластов, измеряли методом qPCR (C). Значения указывают на среднее значение ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах.

3.12. Минерализация остеобластов в клетках, обработанных SPs, извлеченными из MJ2

Чтобы исследовать влияние SPs на минерализацию остеобластов, образование комплекса ализарин красный S-кальций измеряли путем окрашивания ализариновым красным S. Минерализация остеобластов, обработанных SPs, была значительно увеличена в зависимости от дозы по сравнению с отрицательным контролем (рис. 11). Однако фракция, обедненная SPs, не усиливала минерализацию остеобластов. Эти результаты показали, что SPs, происходящие из P. freudenreichii MJ2, стимулируют позднюю стадию дифференцировки остеобластов и повышают минерализацию остеобластов.

Рис. 11. Влияние поверхностных белков, экстрагированных из P. freudenreichii MJ2, на минерализацию остеобластов. Отложения кальция окрашивали ализариновым красным S (× 100, масштабная линейка = 100 мкм) (A) и определяли количественно (B). Значения указывают на среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах.

4. Обсуждение

Остеопороз - типичное заболевание, которое обычно возникает у пожилых людей. Переломы, вызванные остеопорозом, вызывают физическую боль и являются дорогостоящими из-за длительного лечения. Нарушение баланса между образованием кости остеобластами и разрушением кости остеокластами приводит к различным заболеваниям костей, включая не только остеопороз, но также ревматоидный артрит и остеопению [6,34]. Таким образом, важно разработать новые препараты, которые эффективно улучшают здоровье костей и являются надежными в долгосрочной перспективе. В последнее время многие исследования продемонстрировали, что некоторые пробиотики и их метаболиты могут лечить остеопороз, улучшая формирование костей или влияя на метаболизм костей [16,35,36,37]. Bifidobacterium longum увеличивает минеральную плотность костной ткани(BMD) и параметры костеобразования, а штаммы Lactobacillus уменьшают потерю костной массы на моделях животных после овариэктомии. Бутират, продуцируемый Lactobacillus rhamnosus, стимулирует образование костей, регулируя анаболизм костей. На основе взаимосвязи между микробиотой кишечника и остеоиммунологией было изучено влияние пробиотиков на здоровье костей [38]. ВОЗ определяет пробиотики как живые микроорганизмы, полезные для здоровья. Таким образом, большинство исследований пробиотиков проводилось с живыми пробиотиками. Инактивированные пробиотики показали положительный эффект, аналогичный живым пробиотикам in vitro [39]. Однако имеется мало информации о влиянии мертвых пробиотиков на формирование костей и его механизме. В этом исследовании hkMJ2 показал усиливающий эффект на формирование костной ткани.

Активность щелочной фосфатазы (ALP) является фенотипическим маркером ранней стадии дифференцировки остеобластов и увеличивает уровни экспрессии генов и белков, связанных с дифференцировкой остеобластов. hkMJ2 значительно увеличивает активность ALP, что указывает на то, что hkMJ2 стимулирует раннюю стадию дифференцировки остеобластов. Отношение OPG / RANKL является важным показателем дифференцировки, связанной с остеобластами и остеокластами. OPG усиливает дифференцировку остеобластов и ингибирует дифференцировку остеокластов, блокируя связывание RANK и RANKL [40]. Когда RANK предшественников остеокластов и RANKL связываются в качестве начального сигнала, следует образование и дифференцировка остеокластов. Однако OPG ингибирует их взаимодействие, связываясь с RANKL вместо RANK. hkMJ2 увеличивает соотношение OPG / RANKL, что указывает на то, что hkMJ2 увеличивает дифференцировку остеобластов и ингибирует дифференцировку остеокластов. OSX экспрессируется во всех типах развивающихся костных клеток и ингибирует дифференцировку клеток-предшественников в хондроциты [41]. FN - это крупный гликопротеин, который связывается с клетками и участвует в клеточных процессах, включая заживление ран, миграцию клеток и организацию цитоскелета [42], что также способствует выживанию и дифференцировке остеобластов. OC, как тип костного неколлагенозного белка, синтезируется на поздней стадии дифференцировки остеобластов [43]. hkMJ2 увеличивал уровни экспрессии OSX, FN и OC, что говорит о том, что hkMJ2 стимулирует дифференцировку остеобластов путем усиления регуляции генов, связанных с процессом дифференцировки остеобластов. OC является отличительной чертой терминальной дифференцировки остеобластов. Минерализация рассматривается как показатель успешной дифференцировки остеобластов. Образование комплекса ализарин красный S-кальций увеличивается в клетках, обработанных hkMJ2, это указывает на то, что hkMJ2 усиливает отложения кальция в дифференцированных остеобластах. Следовательно, hkMJ2 стимулировал дифференцировку остеобластов путем стимуляции экспрессии генов на ранней стадии дифференцировки и завершал дифференцировку остеобластов, что увеличивало минерализацию остеобластов.

Среди белков, идентифицированных с помощью 2-DE и ЖХ-МС/МС в клетках, обработанных hkMJ2, HSPD1 и P4HB ассоциированы с белками, связанными с дифференцировкой остеобластов. HSPD1 - это митохондриальный белок-шаперонин, который регулирует гомеостаз митохондриальных функций и поддерживает процессы сворачивания белков. P4HB - это многофункциональный ферментный белок, участвующий в клеточной стрессовой реакции ER, а также действует как молекулярный шаперон. STRING генерирует сеть белковых взаимодействий на основе высокопроизводительных экспериментальных данных и прогнозов на основе анализа контекста генома. STRING-анализ результатов экспрессии генов и идентифицированных белков показал, что hkMJ2 стимулировал дифференцировку остеобластов. β-актин (ACTB) и виментин (VIM) являются критическими компонентами цитоскелета, и эти два белка были увеличены в клетках, обработанных hkMJ2. VIM преимущественно экспрессируется в клетках мезенхимального происхождения, которые включают остеобласты. Сообщалось, что VIM ингибирует транскрипцию гена ОC, опосредованную активирующим фактором транскрипции 4 (ATF4), и задерживает дифференцировку остеобластов [44]. Дифференцировка остеобластов опосредуется несколькими специфическими для остеобластов факторами транскрипции, такими как OSX и ATF4. Интересно, что в этом исследовании как экспрессия VIM, так и экспрессия гена OC были увеличены в клетках, обработанных hkMJ2. В частности, hkMJ2 увеличивает экспрессию RUNX2 на уровне транскрипции и трансляции, это указывает на то, что hkMJ2 увеличивает дифференцировку остеобластов посредством фактора транскрипции RUNX2, а не ATF4. BMP2, который принадлежит к суперсемейству TGF-β, стимулирует образование кости, индуцируя дифференцировку остеобластов [31,32]. Он взаимодействует с рецептором, а затем вызывает передачу сигнала за счет активации белков SMAD, которые активируют SMAD1, SMAD5 или SMAD8. В конечном итоге этот процесс способствует транскрипции генов остеобластов, что усиливает минерализацию зрелых остеобластов [41]. Белок теплового шока, индуцированный стрессом, усиливает образование костей за счет активации передачи сигналов BMP [45], а передача сигналов BMP2 увеличивает индуцированную RUNX2 дифференцировку остеобластов посредством легкого стресса ER. В этом исследовании hkMJ2 увеличивал уровни экспрессии генов и белков BMP2, Smad1/5/8 и RUNX2. Кроме того, BMP-ингибитор Noggin подавлял стимулирующее действие hkMJ2 на дифференцировку остеобластов. Эти результаты предполагают, что hkMJ2 способствует дифференцировке остеобластов посредством пути передачи сигналов BMP2 / RUNX2.

Овариэктомия - типичная процедура для индукции постменопаузального остеопороза у животных. В этом исследовании дефицит эстрогена, вызванный овариэктомией, снизил минеральную плотность костной ткани (BMD), а мертвые MJ2 и L. plantarum (LP), убитые жарой, значительно увеличили BMD бедренной кости, тогда как, неожиданно, живой MJ2 не увеличил BMD. В частности, в отличие от живых MJ2 и LP, введение мертвого MJ2 привело к значительному увеличению толщины кортикальной кости и площади губчатой ​​кости. Эти результаты предполагают, что мертвый MJ2 более эффективен для предотвращения потери костной массы у крыс OVX, чем живой MJ2. В дополнение к увеличению BMD мертвый MJ2 может быть более предпочтительным для производства для лечения заболеваний костей, таких как остеопороз, чем живой MJ2, из-за более длительного срока хранения мертвого MJ2. Кроме того, мертвый MJ2 более эффективен для предотвращения потери костной массы у крыс OVX, чем LP, обладающий антиостеопоротическим действием [28]. LP облегчает остеопороз, подавляя экспрессию TNF-α, связанную с NF-κB, и снимает воспаление кишечника, что улучшает остеопороз. Неожиданно совместное лечение живыми или мертвыми MJ2 и LP не показало синергетического эффекта у крыс OVX. Отношение OPG / RANKL на уровне транскрипции и трансляции показало соответствие с BMD у крыс OVX, получавших мертвый MJ2, за исключением высокой дозы живого MJ2, которая значительно увеличивала экспрессию генов соотношения OPG / RANKL. Следовательно, мертвый MJ2 может ингибировать остеопоротическую потерю костной ткани, способствуя дифференцировке остеобластов. В нашем следующем исследовании индукция гомеостаза микробиоты кишечника при введении MJ должна быть исследована на крысах OVX с нарушенным составом микробиоты кишечника.

Бактериальные поверхностные белки отображаются на открытой поверхности клеточной стенки. У грамположительных бактерий поверхностные белки классифицируются в соответствии с ковалентными и нековалентными взаимодействиями [46]. Ковалентно присоединенные белки включают белки, прикрепленные к цитоплазматической мембране, липопротеины, прикрепленные к липидному слою мембраны, и белки, прикрепленные к пептидогликанам с помощью сортазы. Нековалентно присоединенные белки включают связывание через домены связывания клеточной стенки, такие как домен связывания холина, домен мотива лизина и мотив гомологии S-слоя. Кроме того, существуют другие экстрагируемые поверхностно-связанные белки, называемые «подрабатывающими» белками, которые изначально находятся в цитоплазме, но расположены на поверхности клетки посредством неизвестного механизма [47]. В случае пробиотиков известно, что их поверхностные белки играют различную роль в устойчивости к стрессу, адгезии со слизью и иммуномодуляции. Поверхностные белки, экстрагированные из P. freudenreichii ITG P20, обладают противовоспалительной активностью, регулируя индукцию цитокинов [30]. В этом исследовании экстрагированные поверхностные белки увеличивали активность щелочной фосфатазы (ALP), уровни экспрессии мРНК генов, регулируемых дифференцировкой остеобластов, и минерализацию остеобластов. Эксперименты in vitro и in vivo показали, что hkMJ2 значительно увеличивает дифференцировку и минерализацию остеобластов, а также минеральную плотность костной ткани (BMD). Следовательно, эффективный белок (белки) среди поверхностных белков может быть устойчивым к нагреванию или денатурированный белок (белки) может иметь повышенное влияние на дифференцировку и минерализацию остеобластов.

5. Выводы

P. freudenreichii MJ2, выделенный из сырого молока, увеличивает дифференцировку остеобластов и минерализацию в остеобластных клетках плода человека hFOB 1.19. В частности, hkMJ2 более эффективен, чем живой MJ2. В частности, поверхностные белки MJ2 способствуют дифференцировке и минерализации остеобластов посредством сигнального пути BMP2 / RUNX2. hkMJ2 также увеличивает минеральную плотность костной ткани у крыс OVX. Таким образом, эти результаты предполагают, что hkMJ2 можно использовать для улучшения здоровья костей и лечения остеопороза.

См. дополнительно:

• Микробиота кишечника человека: ключевой медиатор остеопороза и остеогенеза
• Взаимодействие микробиоты, костей и аллергии

Литература

1. Su, N.; Yang, J.; Xie, Y.; Du, X.; Chen, H.; Zhou, H.; Chen, L. Bone function, dysfunction and its role in diseases including critical illness. Int. J. Biol. Sci. 2019, 15, 776–787. [Google Scholar] [CrossRef]
2. Safadi, F.F.; Barbe, M.F.; Abdelmagid, S.M.; Rico, M.C.; Aswad, R.A.; Litvin, J.; Popoff, S.N. Bone structure, development and bone biology. In Bone Pathology; Khurana, J.S., Ed.; Humana Press: New York, NY, USA, 2009; pp. 1–50. [Google Scholar]
3. Atsuta, Y.A.-O.; Takahashi, Y.A.-O. Early formation of the Müllerian duct is regulated by sequential actions of BMP/Pax2 and FGF/Lim1 signaling. Development 2016, 143, 3549–3559. [Google Scholar] [CrossRef]
4. Kirkham, G.; Cartmell, S. Genes and proteins involved in the regulation of osteogenesis. In Topics in Tissue Engineering; Ashammakhi, N., Reis, R., Chiellini, E., Eds.; 2007; Volume 3, pp. 1–22. Available online: (accessed on 12 January 2021).
5. Yu, H.; de Vos, P.; Ren, Y. Overexpression of osteoprotegerin promotes preosteoblast differentiation to mature osteoblasts. Angle Orthod. 2011, 81, 100–106. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
6. Tanaka, Y.; Nakayamada, S.; Okada, Y. Osteoblasts and osteoclasts in bone remodeling and inflammation. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2005, 4, 325–328. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
7. Hirayama, T.; Danks, L.; Sabokbar, A.; Athanasou, N. Osteoclast formation and activity in the pathogenesis of osteoporosis in rheumatoid arthritis. Rheumatology 2002, 41, 1232–1239. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
8. Raisz, L.G. Pathogenesis of osteoporosis: Concepts, conflicts, and prospects. J. Clin. Investig. 2005, 115, 3318–3325. [Google Scholar] [CrossRef]
9. Riggs, B.L. The mechanisms of estrogen regulation of bone resorption. J. Clin. Investig. 2000, 106, 1203–1204. [Google Scholar] [CrossRef]
10. Kennel, K.A.; Drake, M.T. Adverse effects of bisphosphonates: Implications for osteoporosis management. Mayo Clin. Proc. 2009, 84, 632–638. [Google Scholar] [CrossRef]
11. Skjødt, M.K.; Frost, M.; Abrahamsen, B. Side effects of drugs for osteoporosis and metastatic bone disease. Br. J. Clin. Pharmacol. 2019, 85, 1063–1071. [Google Scholar] [CrossRef]
12. Wentzensen, N.; Trabert, B. Hormone therapy: Short-term relief, long-term consequences. Lancet 2015, 385, 1806–1808. [Google Scholar] [CrossRef]
13. Brouns, F.; Vermeer, C. Functional food ingredients for reducing the risks of osteoporosis. Trends Food Sci. Technol. 2000, 11, 22–33. [Google Scholar] [CrossRef]
14. Rajput, R.; Wairkar, S.; Gaud, R. Nutraceuticals for better management of osteoporosis: An overview. J. Funct. Foods 2018, 47, 480–490. [Google Scholar] [CrossRef]
15. Collins, F.L.; Rios-Arce, N.D.; Schepper, J.D.; Parameswaran, N.; Mccabe, L.R. The potential of probiotics as a therapy for osteoporosis. Microbiol. Spectr. 2017, 5, BAD-0015-2016. [Google Scholar]
16. Jansson, P.-A.; Curiac, D.; Ahrén, I.L.; Hansson, F.; Niskanen, T.M.; Sjögren, K.; Ohlsson, C. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: A randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. Lancet Rheumatol. 2019, 1, e154–e162. [Google Scholar] [CrossRef]
17. Zárate, G. Dairy Propionibacteria: Less conventional probiotics to improve the human and animal health. In Probiotic in Animals; InTech: London, UK, 2012; pp. 153–202. [Google Scholar]
18. Ma, S.; Yeom, J.; Lim, Y.-H. Dairy Propionibacterium freudenreichii ameliorates acute colitis by stimulating MUC2 expression in intestinal goblet cell in a DSS-induced colitis rat model. Sci. Rep. 2020, 10, 5523. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
19. Kwon, G.; Lee, J.; Lim, Y.-H. Dairy Propionibacterium extends the mean lifespan of Caenorhabditis elegans via activation of the innate immune system. Sci. Rep. 2016, 6, 31713. [Google Scholar] [CrossRef]
20. Savage-Dunn, C. TGF-beta signaling. WormBook 2005, 1–12. [Google Scholar] [CrossRef]
21. Subramaniam, M.; Jalal, S.M.; Rickard, D.J.; Harris, S.A.; Bolander, M.E.; Spelsberg, T.C. Further characterization of human fetal osteoblastic hFOB 1.19 and hFOB/ERα cells: Bone formation in vivo and karyotype analysis using multicolor fluorescent in situ hybridization. J. Cell. Biochem. 2002, 87, 9–15. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
22. De Souza Malaspina, T.S.; Dos Santos, C.X.; Campanelli, A.P.; Laurindo, F.R.M.; Sogayar, M.C.; Granjeiro, J.M. Tartrate-resistant acid phosphatase activity and glutathione levels are modulated during hFOB 1.19 osteoblastic differentiation. J. Mol. Histol. 2008, 39, 627–634. [Google Scholar] [CrossRef]
23. Al Mamun, M.A.; Hosen, M.J.; Islam, K.; Khatun, A.; Alam, M.M.; Al-Bari, M.A.A. Tridax procumbens flavonoids promote osteoblast differentiation and bone formation. Biol. Res. 2015, 48, 1–8. [Google Scholar] [CrossRef]
24. Thierry, A.; Madec, M. Enumeration of propionibacteria in raw milk using a new selective medium. Le Lait 1995, 75, 315–323. [Google Scholar] [CrossRef]
25. Zheng, J.; Wittouck, S.; Salvetti, E.; Franz, C.M.A.P.; Harris, H.M.B.; Mattarelli, P.; O’Toole, P.W.; Pot, B.; Vandamme, P.; Walter, J.; et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020, 70, 2782–2858. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
26. Livak, K.J.; Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods 2001, 25, 402–408. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
27. Park, K.-S.; Kim, H.; Kim, N.-G.; Cho, S.Y.; Choi, K.-H.; Seong, J.K.; Paik, Y.-K. Proteomic analysis and molecular characterization of tissue ferritin light chain in hepatocellular carcinoma. Hepatology 2002, 35, 1459–1466. [Google Scholar] [CrossRef]
28. Kim, D.-E.; Kim, J.-K.; Han, S.-K.; Jang, S.-E.; Han, M.J.; Kim, D.-H. Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49 Alleviate Bacterial Vaginosis and Osteoporosis in Mice by Suppressing NF-κ B-Linked TNF-α Expression. J. Med. Food 2019, 22, 1022–1031. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
29. Do Carmo, F.L.R.; Rabah, H.; Huang, S.; Gaucher, F.; Deplanche, M.; Dutertre, S.; Jardin, J.; Le Loir, Y.; Azevedo, V.; Jan, G. Propionibacterium freudenreichii Surface Protein SlpB Is Involved in Adhesion to Intestinal HT-29 Cells. Front. Microbiol. 2017, 8, 1033. [Google Scholar] [CrossRef]
30. Le Maréchal, C.; Peton, V.; Plé, C.; Vroland, C.; Jardin, J.; Briard-Bion, V.; Durant, G.; Chuat, V.; Loux, V.; Foligné, B. Surface proteins of Propionibacterium freudenreichii are involved in its anti-inflammatory properties. J. Proteom. 2015, 113, 447–461. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
31. Jang, W.-G.; Kim, E.-J.; Kim, D.-K.; Ryoo, H.-M.; Lee, K.-B.; Kim, S.-H.; Choi, H.-S.; Koh, J.-T. BMP2 protein regulates osteocalcin expression via Runx2-mediated Atf6 gene transcription. J. Biol. Chem. 2012, 287, 905–915. [Google Scholar] [CrossRef]
32. Murakami, T.; Saito, A.; Hino, S.-I.; Kondo, S.; Kanemoto, S.; Chihara, K.; Sekiya, H.; Tsumagari, K.; Ochiai, K.; Yoshinaga, K. Signalling mediated by the endoplasmic reticulum stress transducer OASIS is involved in bone formation. Nat. Cell Biol. 2009, 11, 1205–1211. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
33. Zhu, W.; Kim, J.; Cheng, C.; Rawlins, B.A.; Boachie-Adjei, O.; Crystal, R.G.; Hidaka, C. Noggin regulation of bone morphogenetic protein (BMP) 2/7 heterodimer activity in vitro. Bone 2006, 39, 61–71. [Google Scholar] [CrossRef]
34. Chen, X.; Wang, Z.; Duan, N.; Zhu, G.; Schwarz, E.M.; Xie, C. Osteoblast–osteoclast interactions. Connect. Tissue Res. 2018, 59, 99–107. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
35. Parvaneh, K.; Jamaluddin, R.; Karimi, G.; Erfani, R. Effect of probiotics supplementation on bone mineral content and bone mass density. Sci. World J. 2014, 2014, 565962. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
36. Parvaneh, K.; Ebrahimi, M.; Sabran, M.R.; Karimi, G.; Hwei, A.N.M.; Abdul-Majeed, S.; Ahmad, Z.; Ibrahim, Z.; Jamaluddin, R. Probiotics (Bifidobacterium longum) increase bone mass density and upregulate Sparc and Bmp-2 genes in rats with bone loss resulting from ovariectomy. BioMed. Res. Int. 2015, 2015, 897639. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
37. Tyagi, A.M.; Yu, M.; Darby, T.M.; Vaccaro, C.; Li, J.-Y.; Owens, J.A.; Hsu, E.; Adams, J.; Weitzmann, M.N.; Jones, R.M. The microbial metabolite butyrate stimulates bone formation via T regulatory cell-mediated regulation of WNT10B expression. Immunity 2018, 49, 1116–1131. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
38. Xu, X.; Jia, X.; Mo, L.; Liu, C.; Zheng, L.; Yuan, Q.; Zhou, X. Intestinal microbiota: A potential target for the treatment of postmenopausal osteoporosis. Bone Res. 2017, 5, 17046. [Google Scholar] [CrossRef]
39. Chen, M.; Weng, K.; Huang, S.; Liu, Y.; Tseng, S.; Ojcius, D.M.; Shih, S. Pretreatment with a heat-killed probiotic modulates monocyte chemoattractant protein-1 and reduces the pathogenicity of influenza and enterovirus 71 infections. Mucosal Immunol. 2017, 10, 215–227. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
40. Boyce, B.F.; Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Arch. Biochem. Biophys. 2008, 473, 139–146. [Google Scholar] [CrossRef]
41. Long, F. Building strong bones: Molecular regulation of the osteoblast lineage. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012, 13, 27–38. [Google Scholar] [CrossRef]
42. Yang, C.; Wang, C.; Zhou, J.; Liang, Q.; He, F.; Li, F.; Li, Y.; Chen, J.; Zhang, F.; Han, C. Fibronectin 1 activates WNT/β-catenin signaling to induce osteogenic differentiation via Integrin β1 interaction. Lab. Investig. 2020, 100, 1494–1502. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
43. Sila-Asna, M.; Bunyaratvej, A.; Maeda, S.; Kitaguchi, H.; Bunyaratavej, N. Osteoblast differentiation and bone formation gene expression in strontium-inducing bone marrow mesenchymal stem cell. Kobe J. Med. Sci. 2007, 53, 25–35. [Google Scholar] [PubMed]
44. Lian, N.; Wang, W.; Li, L.; Elefteriou, F.; Yang, X. Vimentin inhibits ATF4-mediated osteocalcin transcription and osteoblast differentiation. J. Biol. Chem. 2009, 284, 30518–30525. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
45. Yao, Y.; Watson, A.D.; Ji, S.; Boström, K.I. Heat shock protein 70 enhances vascular bone morphogenetic protein-4 signaling by binding matrix Gla protein. Circ. Res. 2009, 105, 575–584. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
46. Desvaux, M.; Dumas, E.; Chafsey, I.; Hébraud, M. Protein cell surface display in Gram-positive bacteria: From single protein to macromolecular protein structure. FEMS Microbiol. Lett. 2006, 256, 1–15. [Google Scholar] [CrossRef]
47. Wang, W.; Jeffery, C.J. An analysis of surface proteomics results reveals novel candidates for intracellular/surface moonlighting proteins in bacteria. Mol. Biosyst. 2016, 12, 1420–1431. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]