Бактерии как источники пищевых биоантиоксидантов

Антиоксидантные свойства пробиотических микроорганизмов

Исследования антиоксидантных свойств бифидо- и пропионовокислых бактерий 

СОДЕРЖАНИЕ:

1. Кратко об АФК (ROS) и антиоксидантах
2. Улучшение антиоксидантного статуса в крови
3. Антиоксидантные свойства бифидобактерий B. longum
4. Антиоксидантное действие B. longum и L. acidophilus
5. Биодоступные антиоксиданты в молоке, ферментированном B. longum
6. Антиоксидантные свойства пропионовокислых бактерий P. freudenreichii

Кратко об АФК и антиоксидантах

Окислительный стресс относится к повышенным внутриклеточным уровням кислородных радикалов, которые вызывают повреждение липидов, белков и ДНК. Активные формы кислорода (АФК или ROS), включая супероксидные анионные радикалы, гидроксильные радикалы и перекись водорода, являются одними из высокоактивных свободных радикалов кислорода. В процессе эволюции большинство живых организмов обзавелись ферментативной защитой (супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (GPx), глутатионредуктаза (GR, также известная как глутатион-дисульфидредуктаза (GSR)), неферментативной антиоксидантной защитой (глутатион, тиоредоксин, витамин С, Витамин Е) и системами репарации для защиты от окислительного стресса [1]. Однако этих нативных антиоксидантных систем, как правило, недостаточно для предотвращения окислительного повреждения живых организмов. Антиоксидантные добавки с использованием веществ, которые задерживают или предотвращают окисление клеточных субстратов, продемонстрировали способность защищать организм человека от окислительного повреждения. Хотя некоторые синтетические антиоксиданты, включая бутилгидроксианизол (E320) и бутилгидрокситолуол (E321), широко используются для замедления окисления липидов, их безопасность в последнее время подвергается сомнению из-за повреждения печени и канцерогенности [2]. Поэтому в последние годы большое внимание уделяется поиску более безопасных и натуральных антиоксидантов из биоресурсов для замены синтетических антиоксидантов. Недавние исследования привели к возобновлению интереса к пробиотикам, которые, как было доказано, обладают значительными антиоксидантными способностями как in vivo, так и in vitro [3-6].

Активные формы кислорода (АФК)

За исключением анаэробных организмов, кислород необходим для всех животных и растений. Гипоксия возникает, когда концентрация кислорода ниже нормального уровня, что может привести к травмам и даже смерти. И наоборот, окислительный стресс возникает, если концентрация кислорода превышает нормальный уровень. Многие факторы могут заставить организмы испытывать окислительный стресс, такие как сигареты, гербициды, оксиды азота, озон, радиация и некоторые металлы. АФК, в том числе ионы кислорода и пероксиды, являются продуктами нормального кислородпотребляющего метаболического процесса и часто связаны с окислительным стрессом. АФК могут быть сгенерированы как эндогенно, так и экзогенно. Источники АФК можно найти на рисунке 1.

Рисунок 1. Источники активных форм кислорода (АФК) (см. [15]).

Из-за их высокой реактивной природы, АФК могут модифицировать другие виды кислорода, ДНК, белки или липиды. Считается, что избыточное количество АФК может вызывать нестабильность генома [7], что приводит к различным хроническим заболеваниям, включая атеросклероз, артрит, диабет, болезнь Альцгеймера, нейродегенеративные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания [8–12]. Тем не менее, стоит отметить, что в дополнение к окислительному стрессу, при поддержании в надлежащих клеточных концентрациях, АФК важны для роли передачи сигналов в клетке [13]. В последние десятилетия исследователи обнаружили, что АФК могут служить вторыми мессенджерами для регулирования биологических процессов [14]. Таким образом, АФК имеют две стороны, что требует обоснованного и безопасного их использования, чтобы не повлиять пагубно на нормальную окислительно-восстановительную биологию.

Рисунок 2. Модуляция антиоксидантной защиты пробиотиками

1. пробиотики хелатируют ионы металлов;
2. пробиотики обладают собственными антиоксидантами (ферменты СОД, каталаза);
3. пробиотики производят антиоксидантные метаболиты (фолаты, глутатион (GSH));
   
4. пробиотики регулируют антиоксидантную активность хозяина;
5. пробиотики повышают уровень антиоксидантных метаболитов хозяина;
6. пробиотики регулируют сигнальные пути;
7. пробиотики снижают активность ферментов, продуцирующих АФК;
8. пробиотики регулирует микрофлору кишечника

См. дополнительно к п.2. к рис. 2:

За последние несколько лет мы стали свидетелями огромного роста наших знаний о благотворном влиянии пробиотиков, особенно тех, которые играют важную роль в опосредовании реакций на окислительный стресс. Однако механизмы антиоксидантного действия не до конца изучены. Таким образом, полная картина взаимодействия пробиотиков с антиоксидантной способностью должна быть дополнительно исследована и в ближайшем будущем получена.

Литература

1. Mishra, V.; Shah, C.; Mokashe, N.; Chavan, R.; Yadav, H.; Prajapati, J. Probiotics as potential antioxidants: A systematic review. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3615–3626.
2. Luo, D.; Fang, B. Structural identification of ginseng polysaccharides and testing of their antioxidant activities. Carbohydr. Polym. 2008, 72, 376–381.
3. Lin, M.Y.; Yen, C.L. Antioxidative ability of lactic acid bacteria. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 1460–1466.
4. Shen, Q.; Shang, N.; Li, P. In vitro and in vivo antioxidant activity of Bifidobacterium animalis 01 isolated from centenarians. Curr. Microbiol. 2011, 62, 1097–1103.
5. Wang, Y.; Wu, Y.; Wang, Y.; Fu, A.; Gong, L.; Li, W.; Li, Y. Bacillus amyloliquefaciens SC06 alleviates the oxidative stress of IPEC-1 via modulating Nrf2/Keap1 signaling pathway and decreasing ROS production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 101, 1–12.
6. Persichetti, E.; De Michele, A.; Codini, M.; Traina, G. Antioxidative capacity of Lactobacillus fermentum LF31 evaluated in vitro by oxygen radical absorbance capacity assay. Nutrition 2014, 30, 936–938.
7. Ames, B.N.; Shigenaga, M.K.; Hagen, T.M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 7915–7922.
8. Eftekharzadeh, B.; Maghsoudi, N.; Khodagholi, F. Stabilization of transcription factor Nrf2 by tBHQ prevents oxidative stress-induced amyloid _ formation in NT2N neurons. Biochimie 2010,  92, 245–253.
9. Harrison,D.; Griendling, K.K.; Landmesser,U.;Hornig, B.; Drexler,H. Role of oxidative stress in atherosclerosis. Am. J. Cardiol. 2003, 91, 7–11.
10. Ostrakhovitch, E.A.; Afanas’ev, I.B. Oxidative stress in rheumatoid arthritis leukocytes: Suppression by rutin and other antioxidants and chelators. Biochem. Pharmacol. 2001, 62, 743–746.
11. Griendling, K.K.; FitzGerald, G.A. Oxidative stress and cardiovascular injury part I: Basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS. Circulation 2003, 108, 1912–1916.
12. Ceriello, A.; Motz, E. Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance, diabetes, and cardiovascular disease? The common soil hypothesis revisited. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 816–823.
13. Morrell, C.N. Reactive Oxygen Species. Circ. Res. 2008, 103, 571–572.
14. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J. Cell Biol. 2011, 194, 7–15.
15. Waris, G.; Ahsan, H. Reactive oxygen species: Role in the development of cancer and various chronic conditions. J. Carcinog. 2006, 5, 14.

УЛУЧШЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА В КРОВИ

Итак, кислород из-за неполного восстановления производит свои активные формы (АФК), которые повреждают клеточные макромолекулы, например, разрывая пептидные связи и вызывая окисление мембранных липидов [3]. Известно, что бактерии имеют различные механизмы защиты от кислорода. Например, что касается молочнокислых бактерий [4–6], B. longum вырабатывает молекулы антиоксиданты для удаления свободных радикалов кислорода [7]. Тем не менее, в литературе не так много информации об антиоксидантной способности пробиотических бактерий.

Окислительный стресс пагубно влияет на здоровье человека. Некоторые заболевания и расстройства, такие как воспалительные заболевания кишечника [11, 12] и сердечно-сосудистые заболевания [13], были связаны с наличием активных форм кислорода (АФК). Улучшение антиоксидантного статуса в крови было предложено как способ уменьшить возникновение этих заболеваний. Исследования показали, что изменение диеты увеличивает антиоксидантную способность крови [14, 15]. Для этого антиоксиданты, присутствующие в пищевой матрице, сначала должны абсорбироваться в ЖКТ, а затем использоваться метаболизмом человека, что в совокупности представляет собой биодоступность антиоксиданта. Биодоступность связана с усвояемой формой (и способностью к усвоению), которая представляет собой поглощенные антиоксиданты, которые доступны для всасывания в кишечнике после пищеварения [16].

Антиоксидантные свойства бифидобактерий Bifidobacterium longum

Бифидобактерии Bifidobacterium longum являются одним из доминирующих видов желудочно-кишечной микробиоты человека и поэтому могут иметь потенциал в качестве пробиотиков. Новые мишени, такие как антиоксидантные свойства пробиотических микроорганизмов, представляют интерес для благотворного воздействия на здоровье хозяина. B. longum вырабатывают молекулы антиоксиданты для удаления свободных радикалов кислорода.

В ряде исследований было установлено, что некоторые гены, присутствующие в бифидобактериях, кодируют белки, связанные с реакцией окислительного стресса:

• Так, например, известно, что Алкилгидропероксидредуктаза C (AhpC) (гомолог NADH-оксидазы) восстанавливает кислород до перекиси водорода [2, 8, 9]. Полное секвенирование генома B. longum NCC2705 выявило присутствие гена (trx), кодирующего тиоредоксинредуктазоподобный белок, который взаимодействует с AhpC для устранения перекиси водорода [1].
• Другие ферменты включают альфа-субъединицу рибонуклеотидредуктазы (NrdA) и NTP-пирофосфогидролазу (MutT1), которые участвуют в защите и восстановлении повреждений ДНК после окислительного стресса [8].
• Кроме того, полифосфатные гранулы (poly P) образуются в ответ на окислительный стресс. Предполагается, что предполагаемый ген полифосфаткиназы (ppk), присутствующий в бифидобактериях, ответственен за этот синтез poly P) [10].

Для более понятного описания антиоксидантных свойств бифидобактерий лонгум кратко опишем результаты двух интересных исследований (за 2000 и 2015 гг), показывающих степень антиокислительной активности пробиотиков и оставивших ряд вопросов для дальнейшего изучения данной темы.

Исследование 1

Антиоксидантное действие кишечных бактерий Bifidobacterium longum ATCC 15708 и Lactobacillus acidophilus ATCC 4356

Исследовано антиоксидантное действие интактных клеток и внеклеточных бесклеточных экстрактов кишечных молочнокислых бактерий B. longum (ATCC 15708) и L. acidophilus (ATCC 4356). Как интактные, так и бесклеточные экстракты из 10 (9) клеток B. longum и L. acidophilus продемонстрировали антиоксидантную активность, ингибируя перекисное окисление линолевой кислоты на 28-48%. Это указывало на то, что эти два штамма продемонстрировали превосходную антиоксидантную активность.

B. longum и L. acidophilus также показали способность поглощать альфа, альфа-дифенил-бета-пикрилгидразил (DPPH) свободные радикалы, поглощая 21-52%. Интактные клетки этих двух кишечных бактерий продемонстрировали высокий ингибирующий эффект на цитотоксичность 4-нитрохинолин-N-оксида (4NQO). Цитотоксичность 4NQO была снижена L. acidophilus приблизительно наполовину и почти на 90% B. longum. Тем не менее, не наблюдается ингибирования цитотоксичности для внутриклеточных бесклеточных экстрактов 10 (9) клеток B. longum и L. acidophilus.

Также оценивали влияние B. longum и L. acidophilus на ингибирование перекисного окисления липидов в плазме. Результаты показали, что оба кишечных штамма были способны защищать липиды плазмы от окисления в разной степени. Степень ингибирования перекисного окисления липидов в плазме варьировала от 11 до 29% для 10 (9) клеток B. longum и L. acidophilus. Вообще говоря, B. longum продемонстрировал лучшую антиоксидантную способность, чем L. acidophilus в этом исследовании.

Исследование 2

Биодоступные антиоксиданты в молоке, ферментированном Bifidobacterium longum

Целью данного исследования было оценить биодоступность антиоксидантов в молоке, сбраживаемом отобранными штаммами B. longum subsp. longum при динамическом пищеварении in vitro. Антиоксидантную способность клеточных экстрактов из 38 штаммов, из которых 32 относятся к B. longum subsp. longum, оценивали по методу ORAC (способность поглощать кислородные радикалы). 32 штамма B. longum subsp. longum перечислены в таблице 1.

---

Таблица 1: Происхождение штаммов Bifidobacterium longum subsp. longum

Штамм	Происхождение	Ссылка или источник
ATCC 15707	Взрослые фекалии	Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния
ATCC 15708	Детские фекалии	Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния
ATCC 51870	Детские фекалии	Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния
DSM 20097	Телячий кал	Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур GmbH
NCC 2705	Кал младенца	Нестле, Лозанна, Швейцария
CUETM 171 CUETM 172 CUETM 177 CUETM 186 CUETM 193 CUETM 239 CUETM 245 CUETM 247 CUETM 259 CUETM 260 CUETM 263 CUETM 268 CUETM 281 CUETM 287 CUETM 290 PRO 16-10 PRO 42-1 PRO 42-10 PRO 42-2 PRO 42-8 RW 001 RW 008 RW 009 RW 019 RW 020 RW 023 RW 024	Детские фекалии NA1 Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Детские фекалии Взрослые фекалии Взрослые фекалии Взрослые фекалии Взрослые фекалии Взрослые фекалии Коммерческий препарат Коммерческий препарат Коммерческий препарат Коммерческий препарат Коммерческий препарат Коммерческий препарат Коммерческий препарат	Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Bahaka et al. [63] Savard et al. [64] Savard et al. [64] Savard et al. [64] Savard et al. [64] Savard et al. [64] Roy et al. [65] Roy et al. [65] Roy et al. [65] Roy et al. [65] Roy et al. [65] Roy et al. [65] Roy et al. [65]
1 Нет данных

Для анализа ORAC, другие штаммы бактерий, кроме B. longum subsp. longum были использованы для целей сравнения, а именно B. adolescentis ATCC 15703, B. breve ATCC 15698, B. catenulatum CUETM174, B. longum subsp. suis ATCC 27533, B. longum subsp. Infantis ATCC 15702 и B. animalis subsp. lactis ВВ-12.

На основе скрининга и типирования последовательности генов с помощью анализа последовательности локусов с множественным локусом (MLSA) было выбрано пять штаммов для ферментации восстановленного обезжиренного молока. Все пять штаммов (CUETM268, 172, 245, 247 или PRO 16-10) подкисляли молоко до среднего значения рН 4,5 и достигали количества клеток 10⁹ КОЕ на мл.

Антиоксидантная способность варьировала среди протестированных штаммов (P = 0,0009). Два штамма B. longum subsp. longum (CUETM 172 и 171) показали значительно более высокие значения ORAC, чем другие штаммы бифидобактерий.

Рисунок 1: Антиоксидантная способность B. longum subsp. longum в паре с дендрограммой мультилокусного секвенирования MLSA. Слева дендрограмма «объединения соседей» Джукса-Кантора, построенная с использованием сцепленных последовательностей пяти локусов (mutT1, ahpC, trx, nrdA и ppk). Штаммы, отмеченные синей точкой, являются штаммами, выбранными для ферментации молока. Длина ответвлений, выраженная в единицах замен на сайт выравнивания последовательностей, указывается шкалой. Справа значения поглощающей способности радикалов кислорода (ORAC) соответствуют средневзвешенному значению, определенному ANCOVA. Столбик ошибок представляет стандартную ошибку (SE).

---

Выживаемость штаммов

Выживаемоть бактериальных штаммов определяли путем подсчета жизнеспособных клеток в выделении и с помощью обработки моноазидом пропидия в сочетании с количественной ПЦР (PMA-qPCR). Образцы были взяты из ферментированного молока в начале и из модели ЖКТ (ТИM-1) в следующих точках: через 30 и 60 мин из желудочного отделения, через 60, 120, 180 и 240 мин из дуоденального отделения (12-перстной кишки), через 300 мин из комбинированного отделения (тощей и подвздошной кишки) и через 60, 120, 180, 240 и 300 мин из выделений подвздошной кишки.

 

Рисунок 2: Выживаемость пяти штаммов, используемых для ферментации молока в процессе переваривания in vitro (TIM-1). Жизнеспособные клетки определяли по PMA-qPCR и по количеству жизнеспособных клеток (VC) в выделении после каждого часа переваривания. Оставшиеся клетки в тощей и подвздошной кишках после 300 мин переваривания были включены в показатель выживаемости. Результаты представлены относительно общего количества клеток в ферментированном молоке в начале (% от потребления). Полосы ошибок представляют стандартное отклонение.

---

Биоаккумулируемость антиоксидантов

Однако, по-видимому, не существует взаимосвязи между типами генных последовательностей и антиоксидантной способностью. Молоко, ферментированное каждым из пяти выбранных штаммов, не имело более высоких начальных значений ORAC по сравнению с неферментированными образцами молока. Однако более высокая биодоступность антиоксидантов в кисломолочном продукте (175–358%) наблюдалась во время пищеварения.

До переваривания (табл. 2) не было выявлено достоверной разницы между антиоксидантной способностью неферментированного молока и молока, ферментированного каждым из пяти штаммов бифидобактерий (F=0,9870; P=0,4649).

Таблица 2: Сравнение антиоксидантной активности (ORAC) для порции 100 г различных видов пищи.
Описание еды	Значение ORAC (мкмоль TE1/100г)
Черника, дикая, сырая 2	9621
Вино столовое, красное, Каберне Совиньон 2	4523
Клюквенный сок, несладкий 2	1452
Ферментированное молоко (CUETM 245)	1318
Ферментированное молоко (PRO 16-10)	1312
Ферментированное молоко (CUETM 247)	1255
Ферментированное молоко (CUETM 268)	1175
Ферментированное молоко (CUETM 172)	1076
Неферментированное молоко	1174
Коммерческое UHT обезжиренное коровье молоко 3	1270
Яблочный сок, консервированный или в бутылках, несладкий, без добавления аскорбиновой кислоты 3	414
1 Эквивалент тролокса. 2Haytowitz and Bhagwat [18]. 3Zulueta et al. [17].

Во время пищеварения антиоксидантная способность в тощей кишке оставалась выше, чем в подвздошной кишке в каждой точке отбора проб (данные не показаны). Количество доставляемых биоаккумулирующих антиоксидантов определяли путем умножения антиоксидантной емкости тощего и подвздошного отделов на каждый час пищеварения на объем диализата. Наибольшая поставка антиоксидантов была получена между 60 и 120 минутами пищеварения как в тощей, так и в подвздошной кишке. После пяти часов переваривания молоко ферментируемое B. longum subsp. longum PRO 16-10 показало наибольшее количество антиоксидантов при 16383 мкмоль TE. Наименьшее количество антиоксидантов (8080 мкмоль TE) было получено с молоком, ферментированным B. longum subsp. longum CUETM 172. Биодоступность антиоксидантов выражалась в процентах от потребления антиоксидантов в пище (300 г кисломолочного продукта) до переваривания. К концу переваривания антиоксиданты в ферментированном молоке обладали биодоступностью от 175% для B. longum subsp. longum CUETM 172 и до 358% для B. longum subsp. longum PRO 16-10.

Рисунок 3: Биодоступность антиоксидантов (в диализатах), оцененная по способности поглощать кислородные радикалы (ORAC) во время переваривания in vitro (TIM-1) кисломолочного молока (300 г), ферментированного B. longum subsp. longum CUEMT 172 (▲), CUETM 268 (■), CUETM 245 (●), CUETM 247 (X) и PRO 16-10 (♦). (а) Совокупное количество биодоступных антиоксидантов выражено в мкмоль эквивалента Trolox (TE). (б) Биодоступность антиоксидантов, выраженная в процентах от потребления (т.е. от содержания антиоксидантов в 300 г ферментированного молока перед пищеварением). Столбики ошибок представляют стандартное отклонение.

---

Улучшенная биодоступность, вероятно, обусловлена ​​гибелью части клеток B. longum. Молоко, ферментированное штаммом с самой низкой выживаемостью в верхних отделах ЖКТ (B. longum subsp. longum PRO 16-10), имело самую высокую биодоступность антиоксидантов.

Пробиотики обычно определяются как «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью хозяина» (ФАО / ВОЗ), но различные количества мертвых клеток во время переваривания ферментированного молока могут способствовать пользе для здоровья, предоставляя биодоступные антиоксиданты. Эти антиоксиданты могут привести к улучшению антиоксидантной способности крови человека.

Литература

1. A. Klijn, A. Mercenier, and F. Arigoni, “Lessons from the genomes of bifidobacteria,” FEMSMicrobiology Reviews, vol. 29, no. 3, pp. 491–509, 2005.
2. M. A. Schell, M. Karmirantzou, B. Snel et al., “The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 99, no. 22, pp. 14422–14427, 2002.
3. A. L. Brioukhanov and A. I. Netrusov, “Aerotolerance of strictly anaerobic microorganisms and factors of defense against oxidative stress: a review,”Applied Biochemistry andMicrobiology, vol. 43, no. 6, pp. 567–582, 2007.
4. J. A. O. Saide and S. E. Gilliland, “Antioxidative activity of lactobacilli measured by oxygen radical absorbance capacity,” Journal of Dairy Science, vol. 88, no. 4, pp. 1352–1357, 2005.
5. M. L. Stecchini, M. Del Torre, and M. Munari, “Determination of peroxy radical-scavenging of lactic acid bacteria,” International Journal of FoodMicrobiology, vol. 64, no. 1-2, pp. 183–188, 2001.
6. T. Virtanen, A. Pihlanto, S. Akkanen, and H. Korhonen, “Development of antioxidant activity in milk whey during fermentation with lactic acid bacteria,” Journal of Applied Microbiology, vol. 102, no. 1, pp. 106–115, 2007.
7. M. Y. Lin and F. J. Chang, “Antioxidative effect of intestinal bacteria Bifidobacterium longum ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilus ATCC 4356,”DigestiveDiseases and Sciences, vol. 45, no. 8, pp. 1617–1622, 2000.
8. M. Xiao, P. Xu, J. Zhao et al., “Oxidative stress-related responses of Bifidobacterium longum subsp. longum BBMN68 at the proteomic level after exposure to oxygen,” Microbiology, vol. 157, no. 6, pp. 1573–1588, 2011.
9. T. Odamaki, J. Z. Xiao, S. Yonezawa, T. Yaeshima, and K. Iwatsuki, “Improved viability of bifidobacteria in fermented milk by cocultivation with Lactococcus lactis subspecies lactis,” Journal of Dairy Science, vol. 94, no. 3, pp. 1112–1121, 2011.
10. Y. Qian, W. J. Borowski, and W. D. Calhoon, “Intracellular granule formation in response to oxidative stress in Bifidobacterium,” International Journal of FoodMicrobiology, vol. 145, no.  1, pp. 320–325, 2011.
11. A. Keshavarzian, A. Banan, A. Farhadi et al., “Increases in free radicals and cytoskeletal protein oxidation and nitration in the colon of patients with inflammatory bowel disease,” Gut, vol. 52, no. 5, pp. 720–728, 2003.
12. A. TЁuzЁun, A. Erdil, V. Inal et al., “Oxidative stress and antioxidant capacity in patients with inflammatory bowel disease,” Clinical Biochemistry, vol. 35, no. 7, pp. 569–572, 2002.
13. Y. Wang, O. K. Chun, and W. O. Song, “Plasma and dietary antioxidant status as cardiovascular disease risk factors: a reviewof human studies,” Nutrients, vol. 5, no. 8,pp. 2969–3004, 2013.
14. G. Mazza, C. D. Kay, T. Cottrell, and B. J. Holub, “Absorption of anthocyanins from blueberries and serum antioxidant status in human subjects,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 50, no. 26, pp. 7731–7737, 2002.
15. C. B. Pedersen, J. Kyle, A. M. Jenkinson, P. T. Gardner, D. B. McPhail, and G. G. Duthie, “Effects of blueberry and cranberry juice consumption on the plasma antioxidant capacity of healthy female volunteers,” European Journal of Clinical Nutrition, vol. 54, no. 5, pp. 405–408, 2000.
16. H. Palafox-Carlos, J. F. Ayala-Zavala, and G. A. Gonzґalez- Aguilar, “The role of dietary fiber in the bioaccessibility and bioavailability of fruit and vegetable antioxidants,” Journal of Food Science, vol. 76, no. 1, pp. R6–R15, 2011.
17. Zulueta, A. Maurizi, A. Frґıgola, M. J. Esteve, R. Coli, and G. Burini, “Antioxidant capacity of cow milk, whey and deproteinized milk,” International Dairy Journal, vol. 19, no. 6-7, pp. 380–385, 2009.
18. D. Haytowitz and S. Bhagwat, USDA Database for the Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) of Selected Foods, Release т2, U.S. Department of Agriculture, 2010.

АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Propionibacterium freudenreichii

Вольтамперометрическое исследование антиоксидантной активности жидких культур пропионовокислых бактерий

Прямым высокочувствительным вольтамперометрическим методом установлено, что жидкие культуры штаммов Propionibacterium freudenreichii способны проявлять высокий антиоксидантный эффект. Это позволило рассчитать величину кинетического критерия, количественно характеризующего антиоксидантную активность данных культур.

Propionibacterium freudenreichii (P. freudenreichii) относятся к группе так называемых классических или “молочных” пропионовокислых бактерий (ПКБ). По ряду свойств они близки к лактобациллам и бифидобактериям, для которых ранее было установлено, что они обладают выраженными антиоксидантными свойствами (Драчёва, 2005, 2007; Драчёва и др., 2008). Основным продуктом жизнедеятельности ПКБ является пропионовая кислота. Наряду с ней они активно продуцируют и такие жизненно важные экзометаболиты, как витамины группы В, в том числе В12 и фолиевую кислоту (Hugenholtz et al., 2002), а также свободные нуклеотиды (Иконников и др., 1982). Отличительной особенностью ПКБ является повышенное содержание в их клетках корриноидов, т.е. соединений группы витамина В12 (Рыжкова (Иордан), 2003).

Неоднозначность метаболизма ПКБ, возможность его перестроек впервые была выявлена при изучении влияния молекулярного кислорода на энергетический обмен этих бактерий. Пропионовокислое брожение (с участием витамина В12) является основным энергодающим процессом, однако определенный вклад в его протекание вносят фумаратное (анаэробное) и кислородное дыхание. Молекулярный кислород и витамин В12 служат факторами перестройки энергетического обмена. Естественный высокий уровень корриноидов, на 2—3 порядка превышающий таковой у многих прототрофов, оказался существенным для аэротолерантности P. freudenreichii на минимальной среде (Рыжкова, 2003). Корриноиды — сложные биомолекулы с уникальной кобальт-углеродной связью, обратимое расщепление которой определяет их множественные химические и биохимические функции. В защите клеток анаэробных прокариот возможно их участие как древних неспецифических факторов-антиоксидантов для тиоловых соединений. Возможно, это обусловлено особенностью генезиса ПКБ в условиях древней Земли. Вместе с тем ПКБ содержат ферменты, которые участвуют в антиокислительной защите собственных клеток. Среди них — флавиновые оксидазы, супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, цитохромы (Краева, Воробьева, 1981). Однако сами эти ферменты могут быть уязвимы при воздействии кислорода (Pritchard et al., 1977; Pritchard, Asmundson, 1980) и нуждаются в защите.

В связи с вышесказанным штаммы P. freudenreichii были выбраны нами в качестве объектов исследования. Это имеет и практическую направленность, поскольку ПКБ сейчас рассматривают в качестве пробиотиков и как факторы антимикробной защиты пищевых продуктов. Продуцируя экзометаболиты, такие как пропионовая и уксусная кислоты, диацетил, пропионицины, данные бактерии проявляют антимикробные свойства, подавляя рост бацилл разных видов, а также микроскопических грибов (Lind et al., 2007).

Активные формы кислорода (АФК) в умеренных концентрациях в живом организме выступают в роли медиаторов процессов передачи клеточного сигнала. Но в условиях повышенного содержания они оказывают повреждающее действие в виде избыточной концентрации свободных радикалов, поражающих биомакромолекулы (белков, ДНК) и клетки организма, в первую очередь разрушая липиды их мембран. В ходе эволюции в организме человека возникла защитная антиоксидантная система, которая базируется на комплексе ферментов: оксидазы, супероксиддисмутазы, каталазы, а также витаминов А, С, Е и некоторых коферментов.

К антиоксидантам относится широкий круг органических соединений, обладающих антирадикальной и антиокислительной способностью. Разнообразие этих соединений обусловлено различиями в механизме их окисления-восстановления. Важно отметить, что для эффективного поддержания оптимальной концентрации АФК в организме человека, особенно при оксидативном стрессе (для защиты его естественной иммунной системы), целесообразно использовать экзогенные антиоксиданты, в том числе и микроорганизмы, обладающие такими свойствами.

Целью настоящей работы явилось исследование антиокислительных (антиоксидантных) свойств жидких культур пропионовокислых бактерий (двух штаммов Propionibacterium freudenreichii) при использовании высокочувствительного вольтамперометрического метода.

Материлы и методы

В работе использовали жидкие культуры штаммов Propionibacterium freudenreichii RVS-2-ims (I) и Propionibacterium freudenreichii RVS-4-irf (II), которые были изолированы из твердых сыров, идентифицированы (фенотипически и филогенетически) и депонированы в ВКПМ под номерами B-9653 and B-9654 соответственно.

Бактерии культивировали на глюкозо-минеральной (минимальной) питательной среде 72 ч при 30°C при свободном доступе воздуха и при периодической нейтрализации образуемых кислот. Образцы для анализа были нейтральными (рН 6,8—7,0). Концентрация живых клеток в конце культивирования составляла (3—4) x 10⁹ КОЕ/см³. Микроскопию клеток проводили с помощью микроскопа Laboval-4 (фирма “Karl Zeiss Jena”, Германия). Выращенные культуры хранили более двух недель при 6°C.

Для изучения антиоксидантной активности ПКБ использовали электрохимический метод катодной вольтамперометрии. Методика эксперимента заключалась в получении вольтамперограмм катодного восстановления кислорода с помощью портативного программируемого анализатора “Антиоксидант” (фирма “Полиант”, г. Томск). Элетрохимическая ячейка прибора представляла собой стеклянный стаканчик, в который последовательно помещали фоновый электролит и анализируемые образцы биопрепаратов. В качестве фонового электролита был выбран фосфатный буфер (рН 6,86). В электрохимической ячейке также находился индикаторный ртутно-пленочный электрод, хлорид-серебряный электрод сравнения и хлорид-серебряный вспомогательный электрод. Объемы отбираемых проб составляли 0,1; 0,5 и 1,0 см³. В работе использовали магнитную мешалку.

Антиоксидантную активность образцов определяли, используя метод катодной вольтамперометрии, в частности процесс электровосстановления кислорода, ЭВ О₂ (стадии 1—4). Он обладает рядом преимуществ, но главное — в его основе лежит модельная реакция ЭВ О₂, протекающая на индикаторном электроде по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в тканях и клетках организма человека:

В данном способе рассматривается одноэлектронное восстановление кислорода с образованием активных кислородных радикалов: O₂^.-, HO₂^.  (стадии 1—3). Предполагается, что антиоксиданты, имеющие восстановительную природу, реагируют с кислородом и его активными радикалами на поверхности индикаторного электрода, что отражается в уменьшении катодного тока ЭВ О₂ на ртутно-пленочном электроде в области потенциалов от 0 до –0,7 В по следующему механизму:

Описанным выше вольтамперометрическим методом исследовали антиоксидантные свойства образцов двух анализируемых культур ПКБ и среды, на которой культивировали бактерии, в качестве контроля.

Результаты и обсуждение

Рис. 1. Вольтамперограммы электровосстановления кислорода в отсутствие (1) и в присутствии (2—6) образца Propionibacterium freudenreichii RVS-2-ims при разбавлении 1 : 100 (А), 1 : 20 (Б) и 1 : 10 (В) и при времени опыта t = 4 мин (2), t = 8 мин (3), t = 12 мин (4), t = 16 мин (5), t = 20 мин (6)

---

На рисунке представлены вольтамперограммы электровосстановления кислорода в отсутствие и в присутствии образцов культуры P. freudenreichii RVS-2-ims при разбавлении 1 : 100 (рисунок, А), 1 : 20 (рисунок, Б) и 1 : 10 (рисунок, В) и различном времени проведения эксперимента (от 4 до 20 мин).

На примере исследованных образцов штамма видно, что они проявляют выраженную антиоксидантную активность, уменьшая величину тока. При этом наиболее значительно эффект проявляется при наименьшем (1 : 10) разбавлении. Таким образом, чем выше концентрация культуры ПКБ в анализируемом образце, тем более высокую антиоксидантную активность проявляет биопрепарат. Также следует отметить, что и питательная среда, хотя и в незначительной степени, но также обладает антиоксидантными свойствами.

В результате проведенных исследований строили зависимость изменения предельного тока электровосстановления кислорода от времени протекания процесса.

На основании полученных данных была рассчитана количественная характеристика антиоксидантной активности ПКБ, в качестве которой использовали кинетический критерий К, мкмоль/дм³ · мин. Он отражает количество прореагировавших с анализируемым образцом кислородных форм во времени, следствием чего является эффективность взаимодействия образца с кислородными радикалами, которая определяется по формуле:

где СO₂ — концентрация кислорода в фоновом растворе, мкмоль/дм³; Ii — текущее значение предельного тока ЭВ О₂ в присутствии анализируемого образца ПКБ, мкА; I₀ — значение предельного тока ЭВ О₂ в отсутствие анализируемого образца ПКБ, мкА; t — время протекания процесса, мин.

Полученные результаты были обработаны статистически следующим образом:

K_sr — среднее значение кинетического критерия:

S_i — стандартное отклонение одного определения:

S_r — относительное стандартное отклонение:

Рассчитанные значения кинетического критерия антиоксидантной активности для исследуемых образцов жидких культур ПКБ приведены в таблице 3.

Таблица 3. Значения кинетического критерия антиоксидантной активности образцов жидких культур ПКБ и питательной среды (n = 3, P = 0,95)

Наименование образца	Разбавление	Ksr мкмоль/дм3 · мин	Sr
P. freudenreichii RVS-2-ims:
Образец Ia	1 : 100	0,41	0,048
	1 : 20	1,62	0,071
	1 : 10	4,12	0,031
Образец Iб	1 : 100	0,53	0,047
	1 : 20	1,84	0,038
	1 : 10	1,84	0,014
P. freudenreichii RVS-4-irf:
Образец IIa	1 : 100	0,51	0,031
	1 : 20	1,53	0,016
	1 : 10	3,68	0,020
Образец IIб	1 : 100	0,41	0,057
	1 : 20	1,56	0,049
	1 : 10	3,82	0,020
Питательная среда	1 : 100	0,12	0,021
	1 : 20	0,24	0,023
	1 : 10	0,38	0,022

Представленные данные свидетельствуют о том, что культуры исследованных штаммов Propionibacterium freudenreichii RVS-2-ims (I) и Propionibacterium freudenreichii RVS-4-irf (II) обладают выраженными антиоксидантными свойствами. При этом образцы культур штамма I проявляют более высокую антиоксидантную активность в соответствии с величиной кинетического критерия по сравнению с образцами штамма II.

Заключение

Полученные результаты позволяют заключить, что исследованные штаммы пропионовокислых бактерий вида P. freudenreichii обладают существенными антиоксидантными свойствами, т.е. могут служить в качестве эффективно действующих биоантиоксидантов. Это имеет научное и практическое значение, так как расширяет возможности использования ПКБ, например, для обогащения биологически активными веществами пищевых продуктов, в частности при создании физиологически функциональных продуктов питания. В настоящее время European Food Safety Authority (EFSA) включил P. freudenreichii в список безопасных пищевых микроорганизмов, т.е. присвоил данной бактерии статус Qualified Presumption of Safety (QPS). Также классические ПКБ включены в список GRAS (Generally recognized as safe – общепризнанные, как безопасные).

Источник: Драчева Л.В. Вольтамперометрическое исследование антиоксидантной активности жидких культур пропионовокислых бактерий / Л.В. Драчева, Е.В. Дорожко, О.А. Аврамчук, Е.И. Короткова, Е.П. Рыжкова, Хао Ли, И.В. Данилова / Вестник Московского университета. Биология. - 2009. - № 4. - С. 24-28.

Список литературы

1. Драчева Л.В. 2005. Антиоксидантные свойства пробиотических биопрепаратов // Сб. мат-лов III съезда Общества биотехнологов России. Москва, 25—27 октября 2005 г. М. С. 41.
2. Драчева Л.В. 2007. Антиоксидантная активность пробиотических биоантиоксидантов // Клиническое питание. № 1—2. 39.
3. Драчева Л.В., Короткова Е.И., Дорожко Е.В. 2008. Применение вольтамерометрического метода при изучении биоантиоксидантов // Пищ. промышленность. № 4. 28—29.
4. Иконников Н.П., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. 1982. Выделение нуклеотидов и их производных иммобилизованными клетками Propionibacterium shermanii // Прикл. биохим. и микробиол. 8. № 1. 34—40.
5. Краева Н.И., Воробьева Л.И. 1981. Супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза пропионовокислых бактерий // Микробиология. 50. № 5. 813—817.
6. Рыжкова (Иордан) Е.П. 2003. Множественные функции корриноидов в биологии прокариотических организмов // Прикл. биохим. и микробиол. 39. № 2. 133—159.
7. Hugenholtz J., Hunik J., Santos H., Smid E. 2002. Nutraceutical production by propionibacteria // Le Lait (Dairy Scince & Technol). 82. N 1. 103—112.
8. Lind H., et. al. 2007. Antifungal compounds from cultures of dairy propionibacteria type strains // FEMS Microbiol. Lett. 271. N 2. 310—315.
9. Pritchard G.G., Asmundson R.V. 1980. Aerobic electron transport in Propionibacterium shermanii effects of cyanide // Adv. Microbiol. 126. 167—173.
10. Pritchard G.G., Wimpenny J.W.T., Morris H.A., Levis M.W.A., Hughes D.E. 1977. Effects of oxygen on Propionibacterium shermanii grown in continuous culture // J. Gen. Microbiol. 102. N 1. 223—233.

Дополнительная информация:

• Антиоксиданты и свободные радикалы
• Антиоксидантные ферменты
• Антиоксидантные свойства лакто- и бифидобактерий
• Роль супероксиддисмутазы при акне и терапевтический потенциал пропионовокислых бактерий
• Селен-зависимая глутатионпероксидаза

Будьте здоровы!