Свойства и биотехнологический потенциал пропионовокислых бактерий

ПРОПИОНОВОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ. СВОЙСТВА И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ

Рис. 1. Пропионовокислые бактерии P. freudenreichii, используемые в производстве твердых швейцарских сыров типа Эмменталь, а также в заквасках и биологически активных добавках к пище

Раздел составлен по материалам: Хамагаева И.С. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий.−Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006.− 172 с.; Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 288 с.

1. Физиолого-биохимические свойства пропионовокислых бактерий

Содержание:

• 1.1. Общие сведения о пропионовокислых бактериях
• 1.2. Места обитания и виды пропионовокислых бактерий
• 1.3. Форма пропионовокислых бактерий
• 1.4. Условия для роста пропионовокислых бактерий
• 1.5. Антимутагенная активность пропионовокислых бактерий
• 2. Пропионовокислое брожение
• 3. Дыхание ПКБ, защита от кислорода и его активных форма
• 4. Конструктивный обмен. Метаболиты-нутрицевтики
• 5. Использование ПКБ в пищевой промышленности
• Инновации в использовании пропионовокислых бактерий
• Ссылки о пропионовокислых бактериях

1.1. Общие сведения о пропионовокислых бактериях

О полезных свойствах пропионовокислых бактерий см. в разделе:

Классические (молочные) пропионовокислые бактерии обладают уникальными иммуномодулирующими и антимутагенными свойствами, они приживаются в кишечнике людей и способны к снижению геннотоксического действия ряда химических соединений и УФ-лучей. Известно, что положительная роль пропионовокислых бактерий как пробиотиков обусловлена образованием ими пропионовой кислоты, минорных органических кислот, бактериоцинов и ферментов, а также синтезом большого количества витамина В12.

История открытия пропионовокислых бактерий 

Пропионовокислые бактерии были исходно обнаружены биохимически. В 1878 году немецкий химик Альберт Фитц (Albert Fitz) из Страсбурга, ученик F. Hopper-Seler, предсказал жизнедеятельность микроорганизмов в сырах, образующих в бескислородных условиях пропионовую кислоту (пропионат). Им впервые была выведена схема биохимической реакции, ведущей к образованию пропионата в сырах:

3 моля лактата →2 моля пропионата + 1 моль ацетата + CO₂ + H₂O

В начале 20 века из сыров были выделены бактерии, названные в дальнейшем пропионовокислыми. В 1903 году в США Тролли-Петерсон (Troili-Petersson), голландка по происхождению, впервые получила изоляты бактерий из сыров, которые в дальнейшем оказались ПКБ.

Затем в 1905-1909 годах получение культур ПКБ было продолжено микробиологами из Дании - Орла-Енсеном  (Sigurd Orla-Jensen), Швейцарии - Фройденрайхом (Edward von Freudenreich) и США (I. Thoenii). В это время эти бактерии назывались Bacterium (Bacillus) acidi-propionici. Название Propionibacterium ввел Орла-Енсен в 1909 году. Сыры, молоко и мо­лочные продукты стали основными источниками выделения пропионовых бактерий. Из «эмментальского» сыра Фройденрайх и Орла-Енсен выделили чистые культуры бактерий, которые составили три морфологические группы: Bacterium acidi propionici а, В. acidi propionici b и Bacillus acidi propionici.

Тролли-Петерсон, пользуясь методом Бури, выделила ряд штаммов, большая часть которых идентична с культурами Фройденрайха и Орла-Енсена, а одна отлича­лась значительным слизеобразованием и была отнесена к 4 группе - Bacterium acidi propionici с.

В 1921 году американский исследователь Ж.М. Шерман (Sherman, 1921) установил роль спонтанных ПКБ молока в созревании сыров и выделил новый штамм с высоким уровнем кислотообразования. Шерман выделил ряд культур пропионовых бактерий, в том числе новую - В. acidi propi­onici d, отличавшуюся от известных высокой продукцией кислот при развитии в молоке и на среде с глицерином.

В России первым выделял из сыров типа Эмментальского и изучал ПКБ А.Ф. Войткевич (публикация 1925 года). Он описал изолированные пропионовокислые бактерии, которые по своим свойствам напомина­ли В. acidi propionici а.

Корнелиус Бернардус ван Ниль (Ван Ниль), Голландия, 1897-1985, выделил из сыров и идентифицировал много штаммов ПКБ. Он классифицировал их в своей докторской диссертации в 1928 году, будучи ассистентом А.Я. Клюйвера в Дельфте с 1923 г. Это положило начало систематике ПКБ; в результате собственных исследо­ваний, а также на основании литературных данных 8 видов и одну разновидность пропионовокислых бактерий Ван Ниль определил по фенотипу: Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii (+ P. jensenii var. raffinosaceum), P. shermanii, P. pentosaceum, P. rubrum, P. thoenii, P. technicum, P. peterssonii.

В дальнейшем (но еще с 1926 года в Дельфте при напутствии Мартинуса Виллема Бейринка (1851-1931) и под влиянием книги Сергея Николаевича Виноградского «…о серных бактериях») Ван Ниль заинтересовался пурпурными серными бактериями, продолжил эти исследования в Калифорнии, где умер в 1985 году. Однако он все-таки участвовал в 7-м (1957 г.) и 8-м (1974 г.) изданиях Bergy со статьями о ПКБ.

Выделение, идентификация и классификация ПКБ продолжаются. К настоящему времени известно примерно 28 видов классических (или «молочных») и кожных ПКБ, которые идентифицированы фенотипически.

Пропионовокислые бактерии объединены в род Propionibacterium, который входит в состав семейства Propionibacteriaceae.

В целом пропионовокислые бактерии (лат. Propionibacterium) характеризу­ются как грамположительные, каталазоположительные, неспорообразующие, неподвижные, факультативно анаэробные или аэротолерантные палочковидные бактерии. При брожении они образуют пропионовую кислоту, откуда и получили свое название.

1.2. Места обитания и виды пропионовокислых бактериий (ПКБ)

Прим.: Чтобы выделить бактерии булавовидной формы (греч. согуnе - булава), в 1896 г. был создан род Corynebacterium, в который входят виды, сходные с дифтерийной палочкой С. diphtheriae. Этот род дал название группе коринеформных бактерий (в которую вошло несколько родов), которые как в морфологическом, так и в физиологическом отношении занимают промежуточное положение между молочнокислыми бактериями и микобактериями. Коринеформные бактерии представляют собой большую, таксономически разнородную, плохо изученную группу грамположительных полиморфных палочек, внешне сходных с C. diphtheriae. Палочки бывают изогнутыми, овальными, укороченными; имеют метахроматические включения. К коринеформным бактериям с недавних пор относят также и виды Propionibacterium (Шлегель Г. Общая микробиология / под ред. Е.Н. Кондратьевой. - 6-е изд. - Москва; "Мир", 1987. - С. 95-97. - 567 с.).

Пропионовокислые бактерии принадлежат филогенетической группе Actinobacteria (домен Bacteria), в которой образуют компактный кластер. Все бактерии этой группы характеризуются высоким содержанием Г+Ц-пар в хромосомной ДНК. ПКБ объединены в род Propionibacterium, который входит в состав семейства Propionibacteriaceae.

Поскольку главное место обитания анаэробных ПКБ — это поверхность кожи лю­дей, их стали называть кожными пропионовокислыми бак­териями, а бактерии, выделенные из сыра и молока, — мо­лочными, или классическими, пропионовокислыми бакте­риями. Все виды (классических) пропионовокислых бакте­рий рода Propionibacterium представлены в табл. 1.

Таблица 1. — Виды рода Propionibacterium

Название видов и групп, принятых к 1988 г.	Первоначальное название
P. freudenreichii	P. freudenreichii, P. shermanii
P. thoenii	P. thoenii, P. rubrum
P. jensenii	P. jensenii, P.zeae,  P.  thechnicum, P.raffinosaceum, P. petersonii
P. acidi-propionici	P. arabinosum
P. cocoides*	P. pentosaceum

Воробьева и др. предложили в род Propionibacterium включить пропионовокислые кокки, имеющие с палочковидными бактериями много общих свойств. Кокки выделяют из молока и сыров на ранних стадиях их созрева­ния. В отличие от типичных пропионовых бактерий кокки хорошо растут на поверхности плотных сред в виде оран­жевых колоний и обладают широкими ферментативными способностями. Новый вид предложено назвать Propionibacterium coccoides.

Важным свойством рода является образование пропионовой кислоты в результате пропионовокислого броже­ния, зависимого от кофермента B_12.

Основной пробиотически значимой классической («молочной») ПКБ является Propionibacterium freudenreichii, поэтому именно ей уделено особое внимание. Местообитание P. freudenreichii – молоко и молочные продукты: свежее коровье молоко; кисломолочные продукты длительного хранения, например, сброженная жирная сметана (каймак), «твердые» и «полутвердые» сычужные сыры (индигенная микробиота, ПКБ), с высокой температурой второго нагревания  (52-55⁰С), которые долго созревают (до 3-х месяцев и более) при пониженной температуре. P. freudenreichii также обитает в сброженных травах-силосах.

В каймаке (сброженная сметана высокой жирности), сырах и силосах P. freudenreichii образует трофическую цепь с молочнокислыми бактериями, предварительно сбраживающими углеводы (лактозу, глюкозу, мальтозу) с образованием молочной кислоты, которую в форме лактатов ПКБ используют в качестве источников углерода и энергии.

Подходящие («богатые») натуральные среды для культивирования P. freudenreichii в лабораторных и производственных условиях – это глюкозо- или лактатно-кукурузная среда, лактатная молочная сыворотка и другие натуральные среды. Отдельные штаммы бактерии способны использовать лактозу, т.е. расти на обезжиренном молоке. Вышесказаннное свидетельствует о том, что P. freudenreichii тяготеет к пищевым субстратам, причем не вызывая порчи модифицирует их качество. Поэтому эту бактерию можно называть «пищевым микроорганизмом».

Главное место обитания классических пропионово­кислых бактерий - твёрдые сычужные сыры и более 60% штаммов, выделенных в Финляндии из «Эмментальского» сыра, относится к Propionibacterium freudenreichii и Propion­ibacterium shermanii.

Коринеформные бактерии рода Propionibacterium впервые были выделены из швейцарского сыра. Лактат, ко­торый первоначально образуется в свернувшемся молоке молочнокислыми бактериями, сбраживается, затем до пропионата, ацетата и СО₂, развивающимися как вторичная микрофлора пропионовокислыми бактериями. Пропионат и ацетат придают швейцарскому сыру специфический аромат, а выделяющаяся СО₂ создает характерную для него ноздре­ватость.

Дальнейшие исследования показали, что первичным природным местообитанием пропионовых бактерий являет­ся рубец травоядных животных, где они сбраживают лактат, образованный другими представителями микрофлоры руб­ца. Кроме лактата эти бактерии могут сбраживать и другие сахара. Хотя пропионовокислые бактерии не растут в при­сутствии воздуха и требуют для своего развития анаэроб­ных условий или низкого парциального давления О₃, сооб­щение Воробьевой о том, что эти бактерии можно культи­вировать в аэробных условиях, было встречено микробио­логами с удивлением. Американские исследователи обна­ружили у бактерий ферменты цикла Кребса. В результате изучения аэробного метаболизма у пропионовокислых бак­терий установлены функционирующая цепь переноса элек­тронов (ЦПЭ), кислородное, фумаратное, нитратное дыха­ние, система антиокислительной защиты.

Эти исследования продемонстрировали удивительную лабильность метаболизма пропионовокислых бактерий, которые, как оказалось, экипированы как для анаэробной, так и для аэробной жизни. Например, оказалось, что анаэробные представители семей­ства образуют значительные количества супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, ферментов, характерных для аэроб­ного метаболизма. Кроме того, исследованные штаммы развивались в аэробной среде, если субстрат содержал дрожжевой экстракт.

1.3. Форма пропионовокислых бактерий

Рис. 2. Пропионовокислые бактерии - это палочки самой раз­нообразной величины, от очень коротких, почти кокков, до длинных.

Палочковидные клетки пропионовокислых бактерий расположены единично, парами или ко­роткими цепочками. Некоторые виды характеризуются утолщениями и веточками на концах. Величина клеток мо­жет значительно меняться в зависимости от их возраста и условий культивирования. Молодые клетки в аэробных ус­ловиях имеют вид коротких палочек, в анаэробных, а также при повышенных температурах они становятся более длин­ными. Имеются сведения о наличии пропионовокислых бактерий в пределах одного вида взаимопревращающихся от шарообразной до палочковой формы и обратно. Палочковидные клетки бактерий склонны к полимор­физму. Рудиментарное ветвление наблюдается в аэробных или в анаэробных условиях при низких значениях рН.

Бактерии хорошо окрашиваются по Грамму (граммположительные), слабо окрашиваются метиленовой синью, чем значительно отличаются от молочнокислых. Колонии обычно влажные, округлые или в виде гречишного зерна, блестящие, маслянистые. Цвет колоний у пропионовокис­лых бактерий кремовый, желтый, оранжевый, красный, ко­ричневый. Под микроскопом они отличаются от других бактерий по своеобразному «полисадному» расположению клеток, иногда образующих изогнутые цепочки и «иерог­лифы» вследствие деления с защелкиванием. В сканирующем микроскопе видно, что клетки бактерий неровные, с округлыми концами, в отдельных случаях покрыты слизью и образуют слизистые тяжи.

Клетки Propionibacterium freudenreichii часто имеют вид кокков, у Propionibacterium rubrum, Propionibacterium pentosaceum - короткие палочки, а у Propionibacterium petersonii - длинные палочки 8-10 мкм, что в 4-5 раз превосходит раз­меры клетки других видов. Толщина клеток (0,5-1) мкм. Клетки имеют тенденцию к рудиментарному ветвлению, местами образуя небольшие утолщения, отростки и вздутия. Этот вид отличается от других необычайным плеоморфизмом. Неправильной формы клетки с ложным ветвлением и беспорядочными перегородками сохраняются на всех ста­диях роста культуры.

P. shermanii выделяют из «Швейцарского» и «Совет­ского» сыров, сырого молока. В больших количествах обра­зует пролин, с чем связывают аромат сыра. Клетки в виде коротких палочек, часто почти кокков. От других видов от­личается более высокой термоустойчивостью. Главная жир­ная кислота - 12-метилтетрадекановая (»43%). Главный са­хар в пептидогликане - галактоза, меньше маннозы и рамнозы, глюкозы нет вообще. Сбраживает лактозу.

1.4. Условия для роста пропионовокислых бактерий

 

Рис. 3. Propionibacterium freudenreichii переменного размера и морфологии. Морфология анализируется с помощью сканирующей электронной микроскопии бактерий в экспоненциальной фазе роста (а), в стационарной фазе роста (б), а также при адаптации в кислой среде при рН 5,0 (c) и в желчных солях (d)

Пропионовокислые бактерии растут в пределах темпе­ратуры (15-40)°С, хотя есть данные, что рост происходит при более низкой температуре (до минус 10°С). Оптималь­ная температура развития классических пропионовокислых бактерий (30±1)°С. Оптимальная величина рН роста про­пионовокислых бактерий 6,5-7,0, максимальная - 8,0, мини­мальная - 4,6.

Пропионовокислые бактерии относятся к солеустойчивым. При содержании в лактатной среде 4% NaCl проис­ходит нормальный рост и брожение.

Состав клеточных стенок: обнаружено два раз­личных типа пептидогликана. Клетки P. shermanii и P. freudenreichii содержат непосредственно поперечно связанный пептидогликановый тип с т-ДАП в положении 3. В состав сахаров клеточных стенок P. shermanii и P. freudenreichii входят галактоза, манноза и рамноза (последняя в клеточ­ных стенках других видов не обнаружена), глюкоза отсут­ствует.

При   обследовании   40   штаммов   было   обнаружено, что основным типом жирной кислоты, экстраги­руемой из целых клеток, является С₁₅ насыщенная кислота с разветвленной цепочкой. Причем у видов P. shermanii и Р. freudenreichii С₁₅-кислота присутствует в форме антеизо-С₁₅-изомера (12-метилтетрадекановая), у второй группы (Р. arabinosum, P. jensenii, P. pentosaceum, P. thoenii, P. zeae) об­наруживают в основном изо-С₁₅-кислоту (13-метилтетра-декановую). У других бактериальных видов С₁₅-кислоты присутствуют в «следовых» количествах, так что наличие ее в больших количествах (больше в 2-3 раза, чем любой другой жирной кислоты) у пропионовых бактерий может служить диагностическим признаком.

Таксономическим признаком рода является также со­став клеточных фосфолипидов. Для рода Propionibacterium основной фосфолипид представлен мономанозидом глицерил фосфорилмиоинозита. Фосфолипиды у пропионовокислых бактерий составляют около 10% от общего коли­чества липидов.

Главный гликолипид пропионовокислых   бактерий представлен  1-0-пентаденаил-2-0 (6-0-гентадеканоил-a-D-маннопиранозил) миоинозитом и  включает жирные кисло­ты (пентадеканоидную, гептадеканоидную), маннозу и ино­зит в молярных отношениях 2:1:1. Все изученные виды пропионовых бактерий содержат однотипный главный гли­колипид, что является важным таксономическим признаком рода.

Пропионовокислые бактерии синтезируют значитель­ные количества жирных кислот, липидов и фосфолипидов, состав которых является таксономическим признаком. Некоторые штаммы P. shermanii синтезируют также C₁₂, С₂₁, С₂₂, С₂₃ - жирные кислоты. Липиды пропионовокислых бактерий, по-видимому, не только входят в структурные элементы клеток, но и играют еще роль защитных компо­нентов против действия некоторых антибиотиков.

Пропионовокислые бактерии в значительных количе­ствах синтезируют полифосфаты.

При выделении пропионовокислых бактерий учитыва­ют такие свойства, как способность использовать лактаты, хороший рост в анаэробных условиях при нейтральном зна­чении рН. Анаэробные условия создают путем добавления к агаровой среде сульфита Na или цистеина, тиогликолята Na.

Купенов с целью получения колоний пропионо­вокислых бактерий в чашках Петри без создания анаэроб­ных условий предлагает использовать среду Кребса, содер­жащую дрожжевой экстракт Дифко, лактат Na, «V.F.»-бульон, соли и 0,5-1,0% агара «Oxoid».

Для выделения и поддержания пропионовокислых бактерий рекомендуют среду следующего состава (%): триптиназа (BBL)-l, дрожжевой экстракт (Difco)-l, лактат Na-1, KH₂PO₄-0,25, MnSO₄-0,0005, агар (Difco)-1,5. Вода дистиллированная, конечный рН доводят до 7,0. Для созда­ния оптимальных условий роста в среду вносят х-цистеин (0,05%) и твин 80 (0,05%), стимулирующие рост бактерий.

Среда, поддерживающая хороший рост всех пропио­новых бактерий, имеет следующий состав (%): триптиназа (BBL)-l, дрожжевой экстракт (Дифко)-0,5, глюкоза-1, СаС1₂, MnSO₄, NaCl-0,002, К-фосфатный буфер-0,05М, твин 80 Na-формальдегид сульфоксалат-0,05, NaHCO₃-0,l, ко­нечный рН-7,0.

В исследованиях Воробьевой хороший рост пропионовокислых бактерий достигался в кукурузно-глюкозной среде состава: кукурузный экстракт - 2%, глюко­за - 1%, К₂НРО₄-0,2%, (NH₄)₂SO₄-0,5%, СоС1₂-6Н₂О-10 мг/м, рН 7,0 с помощью насыщенного раствора NaHCO₃. В отли­чие от многих, пропионовокислые бактерии хорошо утили­зируют лактаты, поэтому зрелые сыры («Швейцарский», «Советский», «Алтайский») успешно используют для выде­ления пропионовых бактерий.

Пропионовокислые бактерии лучше всего используют лактат в присутствии дрожжевого экстракта, но еще более сильное стимулирующее действие, чем дрожжевой экстракт, проявляет бесклеточный экстракт штаммов мо­лочнокислых бактерий - Streptococcus thermophilus. Лактат в качестве источника углерода обеспечивает более высокую скорость роста пропионовокислых бактерий, чем лактоза.

Суммируя результаты изыскания повышения биоло­гической полноценности молочных сред, можно отметить следующее. При добавлении в молоко или сыворотку 0,5%-ного дрожжевого экстракта увеличивается продуцирование кислот пропионовокислыми бактериями в 2,5-4,5 раза, а при внесении 1% лактата натрия активизируется этот процесс в 1,6-4,6 раза. Эффект от добавления пептонизированного молока, гидролизата казеина значительно меньше. Наи­более  благоприятной средой для развития пропионовых бактерий является дрожжевой автолизат с глюкозой.

Потребность пропионовокислых бактерий в наборе витаминов значительно меньшая, чем у молочнокислых бактерий. Delwiche показал, что они нуждаются толь­ко в пантотеновой кислоте и биотине, некоторые из них требуют тиамина. Рибофлавин стимулирует рост, но облигатной потребности в нем нет, витамины B₁₂ и В₂ бактерии синтезируют самостоятельно. Рост всех пропионовокислых бактерий стимулируется твином 80. Низин оказывает сильное ингибиторное действие.

В качестве источника углерода для синтеза наиболее благоприятна глюкоза, хотя бактерии неплохо растут на лактозе, лактате, пирувате, глицерине. Отдельные виды свертывают молоко, не разжижают желатин, образуют диацетил и ацетоин. На средах с глюкозой и арабинозой про­пионовокислые бактерии образуют a-молочную кислоту, при использовании в качестве источника углерода молоч­ной кислоты - пропионовую и уксусную кислоты.

Для культивирования на лактозосодержащих средах наибольший интерес представляет вид Propionibacterium shermani.

Из дрожжевого экстракта было выделено растворимое в эфире вещество, которое являлось фактором роста для пропионовокислых бактерий, если последние культивиро­вались на среде с единственным источником азота - суль­фатом аммония. Сравнительное изучение влияния различ­ных солей аммония на рост P. shermanii показало, что наи­более благоприятен уксуснокислый и щавелевокислый ам­моний, наименее - NH₄NO₃; NH₄H₂PO₄, цитрат H(NH₄)₃PO₄ являются равноценными источниками азота для пропионо­вокислых бактерий.

Пропионовые бактерии могут синтезировать все ами­нокислоты за счет ассимиляции азота (NH₄)₂SO₄. Биосинтез белков пропионовыми бактериями сопрово­ждается созданием пула из 15 аминокислот: цистина, гистидина, аргинина, аспартата, глутаминовой кислоты, глицина, серина, треонина, b-аланина, тирозина, валина, метионина, пролина, фенилаланина и лейцина. Известно, что бактерии содержат пептидазы, при участии которых обес­печивают себя незаменимыми аминокислотами и осуществ­ляют реакции трансаминирования, могут расти на любой из 20 аминокислот, внесенной в среду в качестве единственно­го источника азота.

 1.5. Антимутагенная активность пропионовокислых бактерий

Прим.: Процесс возникновения мутаций получил название мутагенеза. Мутагенез — внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций). Различают естественный (спонтанный) и искусственный (индуцированный) мутагенез. См. : Мутагены, антимутагены и пробиотики. 

Известно, что серосодержащие аминокислоты стиму­лируют рост, а бактерии устойчивы к высоким концентра­циям H₂S в среде. Из серосодержащих амино­кислот пептидов молока бактерии образуют диметилсульфид, обладающий антимутагенным действием.

Пропионовые бактерии, как и все живые существа, в первую очередь бактерии, постоянно и длительно подвер­гаются воздействию внешних и внутренних мутагенов. К обычным внешним естественным источникам мутагенов относятся радиация, газ радон, космические лучи, К⁴⁰ и дру­гие радионуклиды (ядра нестабильных изотопов, самопро­извольно распадающихся в земной коре).

Поскольку в естественных условиях микроорганизмы (а также растения и животные) постоянно подвергаются действию мутагенов, у них сформировались эндогенный и экзогенный защитные механизмы: у всех живых существ образуются молекулы, способные к осуществлению анти­мутагенеза. Под антимутагенезом понимают снижение час­тоты спонтанной и индуцированной мутации. Антимутаге­ны регулируют скорость спонтанных мутаций, стабилизи­руют мутационный процесс. Антимутагены повышают ак­тивность ферментативных систем, участвующих в детокси­фикации поступающих в клетку веществ, влияют на окис­лительно-восстановительный потенциал организма. Все эти процессы приводят к снижению мутаций.

В 1989 г. Воробьёвой, с использованием теста Эймса, впервые была обнаружена антимутагенность пропионовых бактерий против азида Na (NaN₃). 

Изучение антимутагенеза  (см. мутагенез) важно именно в отношении тех бактерий, которые используют при изготовлении кор­мов, кормовых добавок и пищи. Бактерии как источники антибиомутагенов или десмутагенов могут быть использованы для предобработки пищевых продуктов и кормов с це­лью нейтрализации мутагенных (канцерогенных) веществ, а также как пробиотики. Пропионовокислые бактерии широ­ко используют на практике: в сыроделии, производстве ви­тамина В₁₂, приготовлении ветеринарного препарата пропиовита, силосовании кормов. 

Экстракты клеток классических пропионовокислых бактерий проявляют высокую эффективность антимутаген­ного действия. Кроме супероксиддисмутазы в клеточном экстракте пропионовых бактерий присутствуют и другие белки (видимо, ферменты) с антимутагенной активностью. Пока можно твердо сказать, что обследованные штаммы обладают антимутагенностью против Азида натрия (NaN₃) и Нитрозогуанидина (НГ) и что антимутагены имеют пептидную (белковую) природу и, видимо, являются ферментами.

См. также: Антимутагенная активность ПКБ против 4НХО и МННГ

Было показано, что кожные и классические про­пионовокислые бактерии выделяют в среду вещества с ан­тимутагенной активностью. Десмутагенное действие культуральной жидкости проявлялось при выращивании бакте­рий на среде с глюкозой, лактозой и лактатом. Установле­ние факта атимутагенности культуральной жидкости и кле­точного экстракта пропионовокислых бактерий открыло но­вые, ранее не известные у них свойства, обуславливающие защиту клетки от внешних и эндогенных мутагенов. Поэтому пропионовокислые бактерии могут стать источни­ками новых и ценных антимутагенов.

Таким образом, пропионовокислые бактерии относят­ся к наиполезнейшим микроорганизмам. Они способны к синтезу практически важных веществ: большинства амино­кислот, значительного количества жирных кислот, липидов и фосфолипидов, полифосфатов, ферментов и витаминов.

2. Пропионовокислое брожение

Главное энергетическое значение для пропионовокислых бактерий имеют так называемые ключевые реакции пропионовокислого брожения. Под пропионовокислым брожением подразумевают биохимический процесс превращения бактериями сахара или молочной кислоты и ее солей в пропионовую кислоту. В этом брожении, кроме пропионовой кислоты, образуются и такие продукты, как уксусная кислота, углекислый газ, ян­тарная кислота, ацетоин, диацетил, другие летучие ароматические соединения - диметилсульфид, ацетальдегид, пропионовый альдегид, этанол и пропанол.

---

Пропионовокислое брожение выражается следующим уравнением:

3C₃H₁₂О₆  =   6С₃Н₆О₃   =   4С₃Н₆О₂  +   2С₂Н₄О₂   +  2СО₂   +   2Н₂О  +   х кДж

  сахар         молочная   пропионовая   уксусная
                      кислота         кислота          кислота

Химизм данного брожения подобен типичному мо­лочнокислому брожению с той разницей, что образовавшая­ся молочная кислота в этом брожении не конечный продукт, а промежуточный. От других типов брожения пропионово­кислое отличается высоким выходом АТФ, участием неко­торых уникальных ферментов и реакций.

Пропионовокислым бактериям свойственен бродиль­ный тип метаболизма: они расщепляют сахара по пути Эмбдена-Мейергоффа до пропионата, ацетата, СО₂ и сукцината. Химизм пропионовокислого брожения хорошо изучен и описан. Ключевую реакцию брожения - превращение a-метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА катализирует кофермент B₁₂ (Ado Cbl).

Когда сбраживаемым субстратом является лактат, он сначала окисляется в пируват. Часть пирувата далее окисля­ется до ацетил-КоА и СО₂, причем превращение ацетил-КоА в ацетат сопровождается образованием АТФ. По­лучение в процессе брожения окисленных продуктов, аце­тата и СО₂ уравновешивается сопутствующим восстановле­нием пирувата до пропионата.

Пировиноградная кислота - обязательное промежу­точное соединение в брожении.

Пировиноградная кислота - химическое соединениес формулой СН₃(СО)СООН, органическая кетокислота. 

Пируваты (соли пировиноградной кислоты) - важные химические соединения в биохимии. Они представляют собой конечный продукт метаболизма глюкозы в процессе гликолиза. Одна молекула глюкозы превращается при этом в две молекулы пировиноградной кислоты. Дальнейший метаболизм пировиноградной кислоты возможен двумя путями - аэробным и анаэробным.

В условиях достаточного поступления кислорода, пировиноградная кислота превращается в ацетил-кофермент А. Он выступает в качестве основного субстрата для серии реакций, известных как цикл Кребса, или дыхательный цикл, цикл трикарбоновых кислот. Пируват также может быть превращён в анаплеротической реакции в оксалоацетат. Оксалоацетат затем окисляется до углекислого газа и воды. При анаэробном дыхании в клетках пируват, полученный при гликолизе, преобразуется в лактат при помощи фермента лактатдегидрогеназы и NADP в процессе лактатной ферментации, либо в ацетальдегид и затем в этанол в процессе алкогольной ферментации.

---

Пируват может быть превращен в пропионат несколь­кими путями:

1) Пируват —> Акрилат —> Пропионат;

2) Пируват —> Лактат —> Пропионат;

3) Пируват + С₁ —> Сукцинат —> Метилмалонат —> Про­пионат

Первые две возможности у пропионовых бактерий не реализуются, и образование пропионата происходит из дикарбоновой кислоты по третьему пути.

Сначала лактат окисляется до пирувата при участии флавопротеида в качестве акцептора водорода, затем в ре­акции транскарбоксилирования образуется оксалоацетат. Донором СО₂ служит (8)-метилмалонил-КоА, а переносчи­ком СО₂ - биотин. Под действием малатдегидрогеназы и фумаразы образуется фумарат, который восстанавливается до сукцината в реакции, катализирующей фумаратредуктазой. Эта реакция сопряжена с синтезом АТР путем фосфо-рилирования, сопряженного с переносом электронов. Далее в КоА - трансферазной реакции образуется сукцинал-КоА. Затем под действием метилмалонил-КоА-мутазы, содержа­щей кофермент B₁₂, осуществляется перегруппировка, ве­дущая к образованию (R)-метилмалонил-КоА, который, однако, не является субстратом для транскарбоксилазы. Ско­рее всего, (S)-стереоизомер образуется при действии спе­цифической рацемазы. В зтом случае в реакции транскарбоксилирования синтезируется пропионил-КоА, и в резуль­тате последующего переноса КоА на сукцинат образуется пропионат.

В процессе сбраживания лактата в пропионат потреб­ляется одна молекула NADH₂. Она образуется при окисле­нии лактата до ацетата в соответствии с суммарным урав­нением реакций брожения:

Лактат + NADH₂ + ADP + P_i  —>  Пропионат  +  NAD  + ATP.

Открытие американских исследователей нашло свое подтверждение и в исследованиях Воробьевой. Реак­ции, ведущие к образованию пропионовой кислоты у пропионовокислых бактерий, могут быть представлены сле­дующей последовательностью:

суммарно: Пируват + 4Н⁺ —> Пропионат

Превращение оксалоацетата в сукцинат происходит в результате работы ферментов ЦТК: малатдегидрогеназы, фумаразы и сукцинат-дегидрогеназы. Указанные ферменты выделены из клеток P. shermanii и осуществляют пре­вращение оксалоацетата в сукцинат с достаточно высокой скоростью.

Схема пропионовокислого брожения. Обозначения: 1. Пируватдегидрогеназа, 2. Фосфотрансацетилаза (Фн), 3. Ацетилкиназа (АДФ), 4. ФЕП-карбокситрансфосфорилаза (Фн, НСО₃), 5. Метилмалонил-КоА-транскарбоксилаза (биотин), 6. Малатдегидрогена, 7. Фумараза, 8. Сукцинатдегидрогеназа (фумаратредуктаза; Фп, цит.b), 9. КоА-трансфераза, 10. Метилмалонил-КоА-изомераза (мутаза), 11. Метилмалонил-КоА-рацемаза

---

Уксусная кислота образуется в результате окислительного декарбоксилирования пирувата:

В результате своей жизнедеятельности ПКБ образуют много пропионовй кислоты/пропионата натрия (до 1-2%). Соотношение продуктов брожения может быть разное и в значительной степени зависит от степени окисленности источника углерода. При росте на среде с глицерином, на­пример, отношение пропионовая : уксусная = 2:1 (это также обычное соотношение), с лактатом 1:1,5 и пируватом 1:2. Так, по Данным Орла-Енсена, в нор­мальном, вполне созревшем эмментальском cыpe количест­во пропионовой кислоты обыкновенно превышает количе­ство уксусной приблизительно в два раза. В сырах других типов это соотношение всегда сильно отклоняется в пользу уксусной кислоты, которая нередко становиться уже преоб­ладающей. Так, по данным Орла-Енсена, в нормальном эдамском сыре количество пропионовой кислоты / количе­ство уксусной кислоты = 1/8. С другой стороны, по наблю­дениям А. Виртанена, при культивировании пропионовокислых бактерий в строго аннааэробных условиях соотноше­ние между количествами кислот отклоняется в обратную сторону; именно в этом случае на одну молекулу уксусной всегда образуется 3 молекулу пропионовой. Также большое влияние имеет значение концентрации ионов во­дорода. При увеличении концентрации ионов водорода в среде изменяется соотношение основных продуктов броже­ния: образование уксусной кислоты увеличивается, а про­пионовой заметно уменьшается.

Соотношение пропионовой и уксусной кислот зависит от состава и свойств среды и внешних условий существова­ния микроорганизмов. В сырах в период максимального развития культуры пропионовых бактерий (первая фаза) в основном образуются относительно окисленные соединения (уксусная кислота), в период спада развития - преимущест­венно более восстановленные (вторая фаза). Но при замед­лении развития культуры P. shermanii (замена пептона ам­монийными солями) уксусная кислота превалирует перед пропионовой, однако и в этом случае отношение пропионовой кислоты к уксусной возрастает. Этот пример служит доказательством связи продуцирования кислот с составом среды. Отношение пропионовой кислоты к уксусной зави­сит также от вида бактерий. В среде с глюкозой и дрожже­вым автолизатом пропионовокислые бактерии рода P. thonii продуцируют указанные кислоты в отношении 5:1, для Р. rubrum это отношение равно 3:1 и для P. shermanii - 2:1. Для культур P. shermanii (9 штаммов) отношения пропионовой кислоты к уксусной колеблется от 1,4 до 2,8. Между коли­чеством организмов и количеством образующихся кислот нет прямой связи.

Изменение состава карбоновых кислот в питательной среде (соли молочной, пировиноградной и янтарной кислот) значительно влияет на продуцирование пропионовой и ук­сусной кислот культурами P. shermanii. Отношение пропионовой кислоты к уксусной изменяется, с лактатом оно равно 1,83 (17,55:9,55), с пируватом - 0,64 (8,20:12,75) и янтарной кислотой - 2,0 (3,30:1,50). В присутствии лактозы продуцирование пропионовой кислоты происходит более энергично, чем в присутствии глюкозы. При сбраживании культурами P.jensenii пировиноградной кислоты более окисленной, чем молочная, также наблюдается, что соот­ношение пропионовой и уксусной кислот смещается в сто­рону более окисленной уксусной.

Соотношение кислот зависит от состава закваски. Так, при использовании закваски с двумя культурами - L. helveticum и Str. thermophilus это соотношение ниже, чем при ис­пользовании одной L.helveticum.

Таким образом, уникальность пропионовокислого брожения обусловлена участием ФЕП - карбоксилтрансфосфорилазы фермента, не обнаруженного у других орга­низмов, синтезирующих пропионат. Благодаря наличию этого фермента, брожение, осуществляемое пропионово-кислыми бактериями, работает как циклический процесс. Другая особенность брожения связана со способом образо­вания пропионата, которое сопряжено с восстановлением фумарата до сукцината и окислением пирувата до ацетата и СО₂. Транспорт электронов, сопровождающий эти реакции, сопряжен с окислительным фосфорилированием и синтезом АТФ. И третьей уникальной характеристикой брожения яв­ляется высокий выход АТФ, превышающий выход АТФ в других известных брожениях. 1,5 М глюкозы могут дать пропионовокислым бактериям около 6 М АТФ.

См. дополнительно: Механизмы образования пропионата

• Помимо пропионовой и уксусной кислот, формируются также минорные продукты: молочная кислота, формиат, янтарная кислота, ацетоин, диацетил и другие летучие ароматические соединения: диметилсульфид, ацетальдегид, пропионовый альдегид, этанол и пропанол. Все эти соединения создают аромат пищевых продуктов, получаемых  при использовании ПКБ.
• P. freudenreichii способна катаболизировать моносахара: глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, а также лактат, пируват, глицерин. Подвид P. freudenreichii ssp. shermanii растет на дисахариде лактозе. Способность катаболизировать (расщеплять) лактозу в организме взрослого человека - важное свойство микроорганизма-пробиотика.

3. Дыхание ПКБ, защита от кислорода и его активных форм

Пропионовокислые бактерии помимо пропионовокислого брожения (ПБ) способны к аэробному дыханию, которое, однако, несовершенно и представляет собой, скорее, защитный от молекулярного кислорода механизм, нежели способ получения энергии. В 70-х годах прошлого века было установлено, что в цитоплазматической мембране бактерии функционирует электронтранспортная дыхательная цепь (ЭТЦ), включающая хиноны и цитохромы, которая служит прежде всего пропионовокислому брожению на стадии восстановления фумарата в сукцинат (здесь, в анаэробном дыхании, вовлеченном в ПБ, фумарат является конечным акцептором электронов). При культивировании бактерий в условиях аэрации дыхательная цепь переключается на молекулярный кислород как конечный акцептор электронов: происходит индукция синтеза терминальной оксидазы (цитохромов a1, a2, первоначальное обозначение), увеличивается эффективность окислительного фосфорилирования. При ограниченной аэрации (давление воздуха, поступающего в хемостат, от 42 до 330 мм Hg-столба) возрастает общее количество цитохромов (b₅₆₀, a₆₀₀ и d₆₇₂) и выход биомассы. Поэтому считают, что аэробное дыхание вносит вклад в энергетику бактерии в условиях дополнительной, но ограниченной аэрации.

При интенсивном аэрировании ПБ угнетено: выделение клетками пропионовой и уксусной кислот снижается или прекращается, но накапливается пируват. В таких условиях пропионовая кислота может быть использована в катаболизме как субстрат.

Эти данные свидетельствуют о том, что и «наиболее анаэробная» из классических ПКБ – P. freudenreichii, не способная к образованию колоний на поверхности твердых («богатых») сред в присутствии кислорода, уже имеет дыхательную цепь и способна использовать молекулярный кислород (при определенных пониженных концентрациях его в жидкой среде) в качестве конечного акцептора электронов с получением энергии. Однако эта дыхательная цепь редуцирована, несовершенна, что проявляется в резистентности дыхания к цианиду. Она имеет большее значение как «предохранительное» дыхание, нейтрализующее молекулярный кислород.

Бактерия обладает флавиновыми оксидазами, не связанными с ЭТЦ, а также ферментами, участвующими в антиоксидантной защите (ФАОЗ) собственных клеток: каталазой, пероксидазой и супероксиддисмутазой. Радикалы О₂^- образуются в любой дыхательной цепи на этапе переноса электронов от хинонов на цитохромы, а в редуцированной ЭЦТ они к тому же являются конечными продуктами дыхания (вместо воды). Поэту понятно значение супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и пероксидазы в обмене веществ ПКБ. Такая достаточно развитая система дыхания и ФАОЗ молочнокислым бактериям (МКБ) не свойственна.

4. Конструктивный обмен. Метаболиты-нутрицевтики.

молекула аланина	молекула метионина	молекула витамина В12	молекула витамина В2

Выше изображены некоторые метаболиты ПКБ (молекулярные модели)

Отличительным свойством метаболизма P. freudenreichii является тесное сопряжение энергетических процессов и конструктивного обмена. Пропионовокислое брожение (ПБ) как основной энергетический процесс эфффективно обеспечивает конструктивный метаболизм классических пропионовокислых бактерий. Об этом свидетельствует высокий молярный экономический коэффициент: Yc=ACB (абсолютно сухая биомасса) г / моль глюкозы = 37,5 (у S. cerevisiae = 19). При этом, P. freudenreichii, в отличие от молочнокислых бактерий, способна синтезировать все метаболиты, необходимые для поддержания своего гомеостаза на минимальных средах (содержащих ионы кобальта) как анаэробно, так и в присутствии воздуха. При этом она накапливает в клетках или выделяет в среду соединения (см. таблицу), среди которых много полезных для человека и животных, включая нутрицевтики (нутрицевтики – это низкомолекулярные соединения, например, витамины группы B или аминокислоты, которые поступая в организм человека и не разлагаясь, участвуют в метаболических реакциях – ред.).

Метаболиты и ферменты	Экзо- / Эндо-	Процесс, реакция, функция
Корриноиды (B12), много: 800-1500 мкг/г ACB	Эндометаболиты	Анаболизм и катаболизм
Витамины группы B: Рибофлавин (B2), Пиридоксин (B6),  Никотиновая к-та (B5), Фолиевая к-та (B9)	Эндо- и экзометаболиты (зависит от штамма)     Экзометаболит	То же       Анаболизм
Пролин, метионин и др. (аромат сыра, хлеба)	Эндо- и экзометаболиты	Анаболизм
Свободные нуклеотиды (вкус пищевых продуктов, нутрицевтики)	То же	Катаболизм нуклеиновых кислот
Пропионаты и ацетаты 2:1 (вкус + консерванты пищевых продуктов) Диацетил (аромат, антимикробный фактор)	Экзометаболиты	Катаболизм углеводов или лактата. Антимикробные факторы
Ферменты: Каталаза, пероксидаза, супероксиддисмутаза	Внутриклеточные	Антиоксидантная функция (ФАОЗ)
- B12-зависимая рибонуклеотидредуктаза	Поверхностные и внеклеточные	Источник дезоксирибонуклеотидов, биосинтез ДНК
- Липазы и пептидазы	Внеклеточные	Гидролиз липидов и белков в среде
Белки-антимутагены и реактиваторы клеток	Экзометаболиты	Антимутагенная защита и реактивирование
Бифидогенные факторы	Экстрактивные или выделяемые в КЖ	Стимуляция роста бифидобактерий
Бактериоцины	Экзометаболиты	Антимикробное действие
Трегалоза	Внутриклеточный сахар	Антистрессовая защита белков ПКБ. Заменитель сахара.

5. Использование пропионовокислых бактерий в пищевой промышленности

См. отдельно:

Propionibacterium spp. - источник важных для промышленности метаболитов

Ниже описываются более ранние сведения об опыте использования пропионовокислых бактерий в пищевом производстве. Сегодня, благодаря новым исследованиям, а также разработанному во ВСГУТУ методу активизации пробиотических культур в молоке и иных пищевых средах (повышению ферментативной активности без стимуляторов роста), значительно расширилась сфера применения пропионовокислых бактерий (и др. пробиотических культур) в пищевой отрасли. В частности, инновационные технологии успешно апробированы в производстве кисломолочной продукции, мясопродуктов и хлебопечении (см.: Закваски для пищевой промышленности).

Сыроделие - наиболее древняя биотехнология, ис­пользующая биохимическую активность пропионовых бак­терий. Первые исследования пропионовокислых бактерий были связаны с изучением их роли в созревании сыров. Наиболее высокими органолептическими свойствами и дли­тельными сроками хранения обладают твердые сычужные сыры с высокой температурой второго нагревания, при из­готовлении которых принимают участие пропионовокислые бактерии. Об этом см. отдельно по ссылке→

---

Пропионовокислые бактерии также  применяют в хлебопечении. Их наряду с молочнокислыми бактериями и дрожжами вводят в некоторые закваски для теста с целью образования в процессе ферментации, помимо молочной и уксусной кислот, еще и пропионовой.

При внесении в тесто такой закваски хлеб содержит 0,1% уксусной; 0,2% молочной, 0,1% пропионовой кислоты (по отношению к весу муки). Такого количества пропионовой кислоты достаточно для проявления фунгицидного дей­ствия, без заметного влияния на вкус и аромат выпекаемого хлеба.

---

Использование пропионовокислых бактерий нашло себя, хотя пока и незначительно, в кисломолочном производстве (прим.: сегодня есть все перспективы расширения сферы применения пропионовокислых бактерий в производстве кисломолочных биопродуктов).

С целью обогащения витамином В12 в кефир и другие молочнокислые продукты вносили пропионовокислые бак­терии, повышая, таким образом, питательные свойства и лечебную ценность этих продуктов.

В нашей стране изготовлен кисломолочный напиток, закваска которого включает уксуснокислые бактерии Acetobacter lovaniense, вязкие рассы молочнокислых стрептококков и P. shermanii с соотношении штаммов (2,5-3,5):(9-11):(3-4). Сырьем, служит смесь молока с творожной сывороткой в соотношении 9:1-7:3. Разбавление молока творожной сывороткой приводит к экономии молока, но вместе с тем и к разбавлению его, вследствие чего содержа­ние в продукте сухих веществ, витаминов, белка снижается. Эти неизбежные потери компенсируются использованием в составе закваски бактерий, синтезирующих белки, витами­ны, внеклеточные полисахариды, увеличивающие вязкость продукта. Активными продуцентами внеклеточных полиса­харидов служат некоторые штаммы уксуснокислых бакте­рий. В симбиозе со стрептококками образование внеклеточ­ных полимеров увеличивалось. P. shermanii и A.lovaniense в виде монокультур не росли в молоке, а в смеси росли и вы­зывали его свертывание за  (32-36)ч, обогащая молоко вита­мином В₁₂ и другими витаминами группы В.

Однако при совместном культивировании с молочно­кислыми стрептококками наблюдали снижение содержания витаминов, которые, по-видимому, утилизировались по­следними. Поэтому при изготовлении напитка уксуснокис­лые и пропионовокислые бактерии выращивают в сыворотке (где они хорошо растут), а молочнокислые и уксуснокис­лые бактерии в молоке с последующим смешиванием ком­понентов. При добавлении в молоко 5% творожной сыворотки содержание в продукте витамина В₁₂ составляло 12500 мкг/кг, В₂ 74,8 мкг/кг, никотиновой кислоты 2900 мкг/кг, а при добавлении в молоко 20% сыворотки 27850; 176,8 и 18250 мкг/кг соответственно.

Известен также способ производства кисломолочного продукта, предусматривающий нормализацию молока, до­бавление 4,5 % сахарозы, пастеризацию при 87°С с выдерж­кой 15 мин,^: гомогенизацию при давлении 15 МПа при 45°С. Молоко охлаждают до 33°С и вносят 5% симбиотической закваски пропионовокислых бактерий, молочнокислых мезофильных ароматобразующих стрепококков и. уксусно­кислых бактерий. После сквашивания до кислотности 56-64°Т в течение (3,5-5,0)ч в межстенное пространство резер­вуара со сгустком пускают ледяную воду и оставляют в по­кое. Через 2 ч проводят перемешивание молочного сгустка  5 мин, затем продолжают охлаждение до 14°С. Титруемая кислотность сгустка составляет 80°Т. Далее вносят 12% фруктово-ягодного наполнителя или 0,08% ароматизатора, перемешивают его в течение 5 мин, после чего разливают в тару. Охлаждение продукта до (2-4)°С ведут в холодильной камере. Срок хранения продукта один месяц при данной температуре. Готовый продукт имеет однородную сметанообразную гомогенную консистенцию молочно-белого цвета, кисломолочный освежающий, слегка острый вкус. Количество клеток пропионовокислых бактерий в 1 см³ 10 единиц, молочнокислых стрептококков 10⁷, уксуснокислых бакте­рий 10².

С использованием пропионовокислых бактерий изготовляют кисломолочный продукт «Тонус».  Мо­локо нормализуют, гомогенизируют, пастеризуют при 90-94^оС  с выдержкой    2-8 мин или при 85-89°С 10-15 мин, охлаждают до температуры заквашивания 32-34°С, вносят 3-5% симбиотической закваски, состоящей из пропионовокислых, молочнокислых мезофильных ароматобразующих стрептококков и уксуснокислых бактерий, сквашивают до 68-7б°Т, охлаждают в покое 2-3 ч, перемешивают (5-10)мин, охлаждают до (14-20)°С, перемешивают и доохлаждают до (4-8)^оС. Готовый продукт содержит пропионово­кислых бактерий 10⁸-10⁹, молочнокислых бактерий 10⁷-10⁸, уксуснокислых бактерий 10¹-10³. Создание оптимальных условий для жизнедеятельности вышеперечисленных мик­роорганизмов приводит к продуцированию и накоплению витаминов в процессе сквашивания. В результате в готовом продукте содержится витамина А больше, чем в сборном сыром молоке или простокваше в 3 раза, витамина Е в 7-8 раз, В₁ - в 1,5-2 раза, В₂ - в 1,5 раза, витамина В₁₂ - в 10-15 раз. В готовом продукте содержание нитратов-канцерогенов снижается на 50% по сравнению с сырым молоком.

---

Э.Е. Грудзинской, A.K. Максимовой и А.В. Рожковой были разработаны способы получения кисломолочно­го продукта «Эвита» и сметаны, в состав закваски которых входили пропионовокислые бактерии - продуценты вита­минов группы В, за счет которых повышаются питательные свойства и биологическая ценность продуктов.

При изготовлении сметаны применение закваски, со­держащей продуценты витаминов группы В, позволяет вес­ти процесс ее производства в одних условиях независимо от жирности сырья, при этом сквашивание ведут при (30-32)^оС, что ускоряет процесс и позволяет получить продукт с высокими питательными свойствами.

Полученный продукт богат витаминами группы В (В₁, В₂, В₁₂), фолиевой кисло­той, микроэлементами, в ток числе и железом, а также дру­гими продуктами метаболизма в легкоусвояемой форме, ко­торые обладают лечебными свойствами. Срок хранения сметаны составляет 10 суток.

Д.С. Янковким и Г.С. Дымент (Украинский научно-исследовательский институт мясной и молочной промышленности) получили бактериальную закваску, состоя­щую из пропионовокислых бактерий и аэробных микроор­ганизмов родов Acetobacter, Bacillus и Pseudomonas. Активизация размножения пропионовокислых бактерий в молоке происходит в результате активного поглощения кислорода аэробными микроорганизмами вышеуказанных таксономи­ческих групп и таким образом исключается влияние данного ингибитора на пропионовокислые бактерии. Кроме того, штаммы родов Bacillus и Pseudomonas, обладающие высо­кой протеолитической активностью, накапливают низкомо­лекулярные азотистые вещества, стимулирующие развитие Propionibacterium.

В процессе исследований было выявлено, что для по­лучения симбиотических сочетаний, обладающих высокой молокосвертывающей протеолитической   активностью и другими производственно-ценными свойствами при высо­ком содержании клеток пропионовокислых бактерий, анаэробные бактерии рода Propionibacterium необходимо со­единить с аэробными бактериями родов Acetobacter, Bacillus или Pseudomonas в соотношение комбинаций молочнокис­лых бактерий 2:3.

Во Всесоюзном научно-исследовательском институте молочной промышленности Э.Е.Грудзинской был раз­работан способ получения кисломолочного напитка из сы­воротки, предусматривающий термическую обработку ис­ходного сырья, охлаждение до температуры заквашивания, внесение закваски, сквашивания полученной смеси и охла­ждение. Способ отличается тем, что, с целью повышения биологической ценности продукта и улучшения его вкусо­вых свойств, после термической обработки в сыворотку вносят добавку азотистых соединений в количестве (5-10)% от массы сыворотки, перед внесением закваски смесь нейтрализуют, а в качестве закваски используют культуру про­пионовокислых бактерий - штамм P.shermanii Э₂ и дрожжи «Скородумовой», при этом сквашивание ведут при темпе­ратуре (29-31)°С в течение (70-74) ч. В качестве добавки азотистых соединений используют гидролизованное моло­ко, кукурузной экстракт, дрожжевой автолизат или культуральную жидкость из микроорганизмов, синтезирующих аминокислоты - ацидофильных или уксуснокислых бакте­рий. Готовый продукт имеет кисло-сладкий вкус с дрожже­вым привкусом и содержит: витамин В₁₂ 250-300; B₁156-228; В₂ 250-150; фолиевой кислоты 110-178 мкг/л.

Э.Е. Грудзинской, В.Ф. Семенихиной, Н.В. Скобелевой был создан консорциум бактерий P. shermanii, Strepto­coccus lactis subsp, Diacetilactis и Acetobacter aceti, исполь­зуемый для приготовления кисломолочных напитков. Ве­дущая роль пропионовокислых бактерий проявляется в преобладании их по количеству клеток (10⁸-10⁹) КОЕ в 1см³ и осуществлению синтеза витаминов группы В. Пропионовокислые бактерии в чистой культуре плохо развиваются в молоке и нуждаются в сопутствующих микроорганизмах, способных обогатить среду доступным для них азотным пи­танием. С этой целью в симбиоз введены ароматобразующие молочнокислые и уксуснокислые бактерии. Ароматобразующие молочнокислые, стрептококки находятся в симбиозе в количестве 10⁷-10⁸ клеток. Они подрабатывают сложные белки молока до более усвояемых форм (пептиды, полипептиды, аминокислоты), кроме того, они малоактив­ные и при развитии снижают рН среды медленно до рН 4,7 (к моменту сквашивания), имеют низкий предел кислотообразования. Тем самым создают благоприятные условия и благоприятствуют условиям синтеза витаминов группы В.

Уксуснокислые бактерии в симбиозе находятся в ко­личестве 10¹-10³ клеток. В чистой культуре они в молоке не развиваются. Являясь автотрофами, они синтезируют аминокислоты и поставляют азотное питание для пропионовокислых бактерий, особенно в период формирования сим­биоза, активизируя их развитие. Уксуснокислые бактерии увеличивают жизнеспособность бактерий за счет потребле­ния молочной кислоты основного продукта метаболизма молочнокислых бактерий, снижая кислотность закваски и повышая рН среды, в сторону, благоприятную для жизне­деятельности пропионовокислых и молочнокислых бактерий. Симбиоз стабильно синтезирует при развитии на моло­ке витамина: В₁₂ - от 28 до 32 мкг/л, B₁ - от 0,06 до 0,08 мг%, В₂ - от 0,16 до 0,69 мг%, Е - до 0,064 мг%, содержит фолиевую кислоту. Титруемая кислотность соответствует 65-75°T.

Данные раздела показывают, что пропионовокислые бактерии использовали в основном в сыроделии при произ­водстве сыров с высокой температурой второго нагревания и незначительно - при производстве кисломолочных про­дуктов.

Таким образом, при выработке кисломолочных про­дуктов в качестве закваски используют пропионовокислые бактерии в комбинации с молочнокислыми бактериями. При совместном культивировании пропионовокислых бактерий молочнокислыми бактериями отмечается отсутст­вие антагонистического воздействия друг на друга. Однако молочнокислые бактерии утилизируют витамины, образо­ванные пропионовокислыми бактериями, вследствие чего снижается лечебная и биологическая ценность продуктов. Анализируя данные раздела, следует подчеркнуть, что от­сутствуют кисломолочные продукты с использованием од­них пропионовокислых бактерий.

Инновации в использовании пропионовокислых бактрий

Интенсивный путь развития молочной промышленно­сти требует новых, нетрадиционных подходов к разработке технологии молочных продуктов. Одним из важнейших на­правлений развития технического прогресса в области переработки молока является развитие биотехнологии, в част­ности применение ферментных препаратов для производст­ва молочных продуктов. Среди ферментных препаратов, рекомендованных для пищевой промышленности, важная роль принадлежит b-галактозидазе, использование которой при переработке молочного сырья позволяет ускорить про­цесс молочнокислого брожения, повысить лечебные свой­ства и качество молочных продуктов.

И.С. Хамагаевой были созданы научные осно­вы биотехнологии получения новых лечебных кисломолоч­ных продуктов для детского и диетического питания с при­менением ферментного препарата дрожжевой b-галактозидазы. Авторами установлено, что вследствие дей­ствия b-галактозидазы на молочный сахар накапливаются важные бифидогенные продукты трансгликозилирования. Известно, что, помимо гидролитического действия, b-галактозидаза катализирует реакции трансгликозилирова­ния, в ходе которых образуются высокомолекулярные олигосахариды при использовании лактозы в качестве субстра­та.

И.С. Хамагаевой теоретически обоснован механизм стимулирующего действия b-галактозидазы на рост бифидобактерий в молоке. Обнаружено, что активизация роста бифидобактерий связана с повышением собственной b-галактозидазной активности бактерий, в результате чего бифидобактерий приобретают способность накапливать из лактозы необходимые для своего роста соединения: глюко­зу и олигосахариды.

Так как пропионовокислые бактерии и бифидобакте­рии относятся к одной группе - коринеформенным бакте­риям, то была выдвинута гипотеза о возможности активи­зации пропионовокислых бактерий в молоке с помощью ферментного препарата b-галактозидазы... Сегодня, запатентованный метод активизации ПКБ позволил создать уникальные закваски из монокультур пробиотических микроорганизмов и их комбинаиций, которые успешно могут применяться в технологиях производства разнообразных пищевых продуктов.

Результаты:

На инновационных заквасках уже сегодня можно производить высококачественные кисломолочные биопродукты с высокими пробиотическими и потребительскими свойствами, а сама технология позволяет интенсифицировать технологический процесс за счет  исключения трудоемких этапов изготовления лабораторных, пересадочных и производственных заквасок, гарантирует получение продукта со стабильными свойствами и снижает до минимума возможность его обсеменения посторонней микрофлорой. На основе использования культур пробиотических микроорганизмов разработаны и апробированы технологии производства функциональных хлебобулочных изделий и мясопродуктов. Высокая перспективность использования биотехнологических приемов в производстве продуктов питания подтверждается практическими результатами. Помимо улучшения вкусовых, структурно-механических и микробиологических свойств пищевого продукта, повышается и его биологическая ценность. Ферментированные биопродукты отличает высокая степень витаминизации (витаминами групп В, в т.ч. В12) и сбалансированность по аминокислотному составу. Также заметно продлеваются сроки хранения хлебобулочных и мясных изделий, изготовленных по соответствующим технологиям, в т.ч. за счет повышения микробиологической чистоты продуктов, а сам технологический процесс производства продуктов значительно интенсифицируется.

По теме см. также:

• О пропионовокислых бактериях (Автор: Л.И.Воробьева)
• Пропионовокислые бактерии как пробиотики
• Иммунотропное действие пропионовокислых бактерий
• Кислотоустойчивость пропионовокислых бактерий
• Устойчивость пропионовокислых бактерий к поваренной соли
• Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий (Монография) - Хамагаева И.С. (формат PDF)

Более подробную информацию об уникальных пробиотических свойствах и биотехнологическом потенциале пропионовокислых бактерий см. в разделе "СТАТЬИ".

Будьте здоровы!