Главная \ 2. Закваски промышленные \ Биотехнология \ Propionibacterium spp. - источник важных для промышленности метаболитов

Propionibacterium spp. - источник важных для промышленности метаболитов

синтез пропионовой кислоты, витамина В12 и трегалозы

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

СОДЕРЖАНИЕ

Резюме

Бактерии рода Propionibacterium состоят из двух основных групп: кожных и классических. Кожные пропионибактерии считаются первичными патогенами для человека, тогда как классические пропионибактерии широко используются в пищевой и фармацевтической промышленности. Бактерии рода Propionibacterium способны синтезировать многочисленные ценные соединения, имеющие широкое промышленное применение. Биомасса бактерий рода Propionibacterium является источником витаминов группы В, в том числе В12, трегалозы и многочисленных бактериоцинов. Эти бактерии также способны синтезировать органические кислоты, такие как пропионовая кислота и уксусная кислота. Благодаря статусу GRAS и своим полезным для здоровья свойствам бактерии рода Propionibacterium и их метаболиты (пропионовая кислота, витамин B12 и трегалоза) широко используются в косметической, фармацевтической, пищевой и других отраслях промышленности. Их также используют в качестве добавок в корма для скота. В этом обзоре мы представляем основные виды пропионибактерий и их свойства, а также даем обзор их функций и применения. В обзоре также представлена современная литература, посвященная возможностям использования Propionibacterium spp. для получения ценных метаболитов. В нем также представлены пути биосинтеза, а также влияние генетических факторов и факторов окружающей среды на эффективность их производства.

Введение

На сегодняшний день были проведены многочисленные исследования по использованию бактерий рода Propionibacterium, которые показали, среди прочего, что эти бактерии способны биосинтезировать ценные метаболиты, такие как пропионовая кислота, витамин B12, бактериоцины и трегалоза. Это говорит о том, что они составляют важную группу микроорганизмов, которые будут иметь промышленное значение в будущем. Основным преимуществом бактерий рода Propionibacterium является то, что они обладают способностью расти и синтезировать метаболиты на субстратах, содержащих различные промышленные отходы, что значительно повышает экономическую рентабельность биотехнологических процессов (Huang et al. 2002; Yazdani and Gonzales 2007; Zhu et al. 2010; Feng et al. 2011; Ruhal and Choudhury 2012a; Zhu et al. 2012; Wang and Yang 2013; Piwowarek et al. 2016). Бактерии рода Propionibacterium и их метаболиты (пропионовая кислота, витамин B12 и трегалоза) широко используются в косметической, фармацевтической и пищевой промышленности. Их также используют в качестве добавок в корма для скота. В этом исследовании мы представляем самый последний обзор литературы, посвященный бактериям рода Propionibacterium и их метаболитам, таким как пропионовая кислота, витамин B12, трегалоза и все известные бактериоцины, а также их текущее и потенциальное использование в различных отраслях промышленности (Thierry et al. 2005; Lee et al. 2013; Cousin et al. 2016; Divek and Kollanoor-Johny 2016; Angelopoulou et al. 2017). Кроме того, рассматриваются пути биосинтеза этих метаболитов и влияние экологических и генетических факторов (Falentin et al. 2010) на эффективность этих процессов, а также влияние различных промышленных отходов в качестве источников углерода на биосинтез этих метаболитов.

Характеристика Propionibacterium

Бактерии из рода Propionibacterium были выделены и описаны в первой половине ХХ века Эдуардом фон Фройденрайхом, Орлом-Йенсеном и ван Нилем, которые отнесли этот род к классу Actinobacteria, порядку Actinomycetales и семейству Propionibacteriaceae (Breed et al. 1957). Бактерии из рода Propionibacterium делятся на две группы по месту обитания: кожные (акне) и классические (молочные). К первой группе относятся виды, обитающие на коже человека, в слизистой оболочке полости рта и желудочно-кишечного тракта, такие как Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Propionibacterium propionicum, Propionibacterium granulosum и Propionibacterium lymphophilum (все они являются патогенными микроорганизмами). Микроорганизмы, относящиеся ко второй филогенетической группе, включают классические штаммы: первая группа состоит из бактерий видов Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium jensenii и Propionibacterium thoenii; вторая группа содержит подвиды внутри Propionibacterium freudenreichii (subsp. shermanii, subsp. freudenreichii) (Meile et al. 1999). Эти подвиды различаются по двум признакам: способности восстанавливать нитраты и способности метаболизировать лактозу. Однако штаммы P. freudenreichii subsp. shermanii могут метаболизировать лактозу (у них есть гены, кодирующие фермент β-D-галактозидазу - EC 3.2.1.23), но они не способны восстанавливать нитраты. Все классические бактерии из рода Propionibacterium обладают способностью к ферментации и являются основными источниками ценных метаболитов, таких как пропионовая кислота, витамин B12, бактериоцин и трегалоза. Пропионовокислые бактерии (PAB) используются в производстве сыра (компоненты стартовых культур для швейцарских сыров и голландских сыров в швейцарском стиле), маринадов, силоса и в качестве пробиотиков в питании животных. Метаболиты, полученные из PAB, используются в качестве консервантов. Propionibacterium spp. присутствуют на травянистых растениях и в рубце крупного рогатого скота, экскрементах травоядных животных, почве, сточных водах, иле, молоке, маринадах, воде после производства масла и в забродившем апельсиновом соке (Kusano et al. 1997; Meile et al. 1999; Koussémon et al. 2003; Leverrier et al. 2004; Suomalainen et al. 2008).

Propionibacterium spp. являются грамположительными бактериями, что означает, что они неподвижны и не продуцируют бактериальные споры, являются каталазоположительными и имеют длину 1-5 мкм. Они распознаются как анаэробные или относительно анаэробные бактерии. PAB очень малы и в анаэробных условиях принимают сферическую форму (кокки). Однако в присутствии кислорода они демонстрируют плеоморфизм, при котором наблюдаются булавовидные клетки; они также могут принимать форму букв V и Y. Оптимальный рН PAB колеблется около 7,0 (диапазон 4,5–8,0), при котором они характеризуются способностью продуцировать пропионовую кислоту и витамин В12, и они демонстрируют повышенную скорость роста даже в присутствии 6,5% NaCl при их оптимальном рН. Большинство Propionibacterium spp. являются мезофилами; однако они устойчивы к гораздо более высоким температурам и могут выживать до 20 с при температуре 70 °C (некоторые штаммы выдерживают температуру до 76 °C в течение 10 с). Оптимальная температура для их роста - 30 °C. Следующие факторы оказывают ингибирующее действие на род Propionibacterium: высокая кислотность, низкая/высокая температура, высокая концентрация соли и активность воды. Адаптация PAB к одному из вышеупомянутых стрессоров повышает их устойчивость к другим параметрам (Kujawski et al., 1994; Boyaval et al., 1999; Koussémon et al., 2003; Leverrier et al., 2004; Benjelloun et al., 2007; Daly et al., 2010). У PAB есть значительные предпочтения в плане роста. В дополнение к веществам, необходимым для их роста (источник углерода и азота), они также нуждаются в надлежащем дополнении микроэлементами (железо, магний, кобальт, марганец, медь, аминокислоты, витамины В7 и В5 и гидрохлорид L-цистеина). Присутствие аспарагиновой кислоты в окружающей среде способствует росту PAB и повышает эффективность их ферментации и выработку углекислого газа (Fröhlich-Wyder et al., 2002). Их основными источниками углерода являются сахариды (например, глюкоза, лактоза, фруктоза, рибоза и галактоза) и органические кислоты (молочная кислота). Они получают азот из пептидов, аминокислот, солей аммония и аминов. Они растут очень медленно на твердой среде и только в строго анаэробных условиях, при температуре 30°C и оптимальном значении рН. Их рост длится до 2 недель при культивировании на лактатной среде с добавлением глюкозы. Из-за этого их трудно идентифицировать и изолировать. Поэтому проводятся дальнейшие исследования для разработки молекулярных методов, которые могли бы помочь в обнаружении пропионибактерий в их среде обитания (Suomalainen et al., 2008). Колонии PAB на твердой среде могут быть кремового, оранжевого, красного или коричневого цвета в зависимости от вида; однако в жидкой среде они ведут себя как тяжелые волокнистые гранулы.

Propionibacterium spp. обладают многими ценными свойствами, и с технологической точки зрения наиболее важными являются следующие: они могут использовать лактозу и лактаты в качестве источника углерода, секретировать внутриклеточные пептидазы и протеазы, связанные с клеточной стенкой, синтезировать соединения, обладающие консервирующими свойствами (бактериоцины, пропионовая кислота и уксусная кислота), они производят соединения, обладающие ароматом и вкусом (пролинаминопептидаза - высвобождает пролин, который придает сыру сладкий вкус; они также обладают способностью превращать свободные аминокислоты в ароматические соединения) и способны вырабатывать витамин В12 (Hugenholtz et al., 2002). Некоторые PAB обладают статусами общепризнанной безопасности (GRAS) и квалифицированной презумпции безопасности (QPS), что означает, что если бактерии не были генетически модифицированы, то живые бактериальные клетки и их метаболиты могут быть добавлены в пищевые продукты.

Промышленное использование пропионовокислых бактерий

Бактерии из рода Propionibacterium нашли широкое применение в сырной промышленности в качестве сырной микрофлоры (вместе с молочнокислыми бактериями, которые благоприятствуют среде обитания штаммов Propionibacterium), используемой при производстве твердых сычужных сыров швейцарского типа (швейцарский сыр Эмменталь, голландский сыр Леердаммер, французский сыр Конте), а также польского голландского сыра швейцарского типа средней твердости (Тыльжицкий, Крулевский) и некоторых др.. Роль этих бактерий в производстве сыра основана на ферментации лактатов с образованием пропионовой и уксусной кислот, которые придают специфический аромат конечному продукту; они также служат натуральными консервантами (Thierry and Maillard 2002; Thierry et al. 2005). Закваски, состоящие из PAB и молочнокислых бактерий (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Penicillium jensenii и Penicillium acidipropionici), используются при производстве овощных маринадов. Их сочетание увеличивает скорость процесса ферментации и защищает конечный продукт от плесени и гниения, помимо того факта, что маринованные огурцы, полученные таким способом, обогащены витамином В12 и обладают лучшими вкусовыми и диетическими свойствами. Кроме того, P. freudenreichii subsp. shermanii индуцирует апоптоз раковых клеток толстой кишки, что объясняется выработкой пропионата и ацетата (Cousin et al., 2016). Кроме того, были опубликованы исследования, касающиеся использования P. freudenreichii subsp. shermanii в качестве полезной для здоровья добавки к сыру типа Фета в 2017 году. Колониеобразующие единицы (КОЕ) Propionibacterium в созревающем продукте увеличивались до 7 дня процесса, а концентрация пропионовой кислоты 52,1 мМ была достигнута через 60 дней. Полученный сыр типа Фета, помимо приданного вкуса, характеризовался оздоровительными свойствами, а также увеличенным сроком годности (Angelopoulou et al. 2017). Штаммы PAB также используются в производстве кормов (Bioprofit™), которые являются источником витамина В12; они способствуют усвоению железа и кальция животными и защищают конечный продукт от грибковых инфекций. Некоторые штаммы PAB используются в качестве пробиотиков для кормления животных. P. freudenreichii регулирует микрофлору кишечника, стимулируя рост бактерий Bifidobacterium, и защищает организм от роста патогенных микроорганизмов, вырабатывая бактериоцины. PAB обладают способностью поглощать микотоксины в пищеварительном тракте. Они стимулируют иммунную систему и устраняют мутагенные эффекты фекальных ферментов, а также вырабатывают трегалозу и витамины В12, Н и фолиевую кислоту. Добавление PAB в корм приводит к увеличению его потребления (усвоения), что способствует росту молодняка животных. Также проводятся исследования по использованию живых PAB в качестве заменителей консервантов с оздоровительным эффектом в молочных продуктах (например, йогуртовых творожных сырах), фруктовых и овощных продуктах, а также продуктах «выпечки» (Langsrud et al. 1995; Mantere-Alhonen 1995; Piveteau 1999; Jan et al. 2002; Hojo et al. 2007; Zárate et al. 2002; Meile et al. 2008; Borawska et al. 2010, Ranadheera et al. 2010; Miks-Krajnik 2012).

Биосинтез пропионовой кислоты

Структура пропионовой кислоты

Пропионовая кислота – органическое соединение из группы карбоновых кислот (C2H5COOH). Это бесцветная водорастворимая (при комнатной температуре) жидкость с неприятным резким запахом. Пропионовая кислота в основном используется в качестве консерванта (Е280); она подавляет рост дрожжей и плесени. Её используют в качестве консерванта в расфасованном нарезанном хлебе, ржаном хлебе, хлебе с пониженной калорийностью, частично испеченных булочках, лаваше и кондитерских изделиях. Она также используется в качестве консерванта в кормах для животных. Максимальная рекомендуемая концентрация пропионовой кислоты составляет 3000 мг/кг конечного продукта. Около 80% вырабатываемой пропионовой кислоты используется в пищевой промышленности и кормопроизводстве. Это важный компонент целлюлозных волокон, гербицидов, парфюмерии и фармацевтических препаратов.

Известны три пути биосинтеза пропионовой кислоты. Один из них использует бактерии Clostridium propionicum, Bacteroides ruminicola и Megasphaera elsdenii. В этих микроорганизмах пируват, полученный в результате гликолиза, сначала превращается в лактат (в присутствии L-лактатдегидрогеназы), затем в результате активности пропионат-КоА-трансферазы образуется лактоил-КоА, который под действием дегидратазы превращается в акрилоил-КоА. На последнем этапе акрилоил-КоА восстанавливается до пропионил-КоА в реакции, катализируемой акрилоил-КоА-редуктазой. Этот путь неэффективен, так как акрилоил-КоА токсичен для бактериальных клеток. Ингибирующее действие акрилоил-КоА прямо коррелирует с рН среды - минимальная токсичная концентрация акрилоил-КоА пропорциональна увеличению рН. Присутствие акрилоил-КоА в среде вызывает увеличение молярного соотношения уксусной и пропионовой кислот даже до 1:1 (теоретически оно должно быть 1:2, такой профиль ферментации возникает из-за необходимости поддерживать сбалансированное окислительно-восстановительное состояние в бактериальных клетках) (Erickson et al. 1979; Reichardt et al. 2014). Согласно исследованию (Kośmider et al. 2010a), соотношение этих соединений в реакции Вуда-Веркмана может составлять 1:8. Таким образом, акрилоил-КоА может способствовать увеличению производства уксусной кислоты за счет пропионовой кислоты, тем самым благоприятствуя биосинтезу уксусной кислоты. Более того, извлечение пропионовой кислоты методом дистилляции сильно ингибируется присутствием уксусной кислоты. Низкая концентрация уксусной кислоты повышает эффективность и облегчает процедуру получения чистой пропионовой кислоты из жидкой среды посткультуры. Поэтому с технологической точки зрения важно, чтобы в процессе производства пропионовой кислоты поддерживалась низкая эффективность биосинтеза уксусной кислоты (Barbirato et al. 1997).

Ферментация пропандиола - еще один известный биосинтетический процесс, используемый для производства пропионовой кислоты. Некоторые бактерии способны синтезировать 1,2-пропандиол из дезокси-сахаров (например, фукозы и рамнозы), дигидроксиацетона и лактата. Этот путь был идентифицирован у бактерий Salmonella enterica и Roseburia inulinivorans, а также у представителей рода Lactobacillus. Синтезируемый в ходе биосинтеза лактальдегид в присутствии дегидрогеназы превращается в 1,2-пропандиол, затем в пропаналь и, наконец, в пропионин. Эффективность производства пропионовой кислоты при ферментации пропандиола зависит от используемого источника углерода. При использовании глюкозы в качестве источника углерода основными продуктами ферментации являются уксусная, муравьиная и молочная кислоты. В таких условиях пропионовая кислота составляет незначительный процент образующихся метаболитов. Производство пропионовой кислоты увеличивается при использовании фукозы или рамнозы в качестве источника углерода, однако уксусная кислота остается доминирующим продуктом (Zang et al. 2010, Reichardt et al. 2014).

Путь Вуда-Веркмана - третий и наиболее важный биосинтетический путь получения пропионовой кислоты, в котором задействованы бактерии рода Propionibacterium. Побочными продуктами этого пути являются метилмалонил-КоА, сукцинил-КоА и CO2. Ключевой особенностью цикла Вуда-Веркмана в PAB является реакция транскарбоксилирования. Ферментом, катализирующим эту реакцию, является метилмалонил-КоА карбоксилтрансфераза, переносящая карбоксильную группу из метилмалонил-КоА в пируват с образованием щавелевоуксусной кислоты и пропионил-КоА (рис. 1). Этот фермент является биотин-зависимой карбокситрансферазой (EC 2.1.3.1) и состоит из трех субъединиц (1.3S, 5S и 12S) (Falentin et al. 2010).

Маршрут биосинтеза пропионовой кислоты у видов Propionibacterium

Рис. 1. Маршрут биосинтеза пропионовой кислоты у видов Propionibacterium (Falentin et al. 2010) *номер фермента (красный), название гена (черный), локус (зеленый). (прим. ред.: о работе Вуда - Веркмана см. здесь).

Путь Вуда-Веркмана (рис. 1) начинается с превращения пирувата, образующегося в ходе гликолиза, в оксалоацетат в присутствии метилмалонил-КоА карбокситрансферазы и комплекса биотин-СО2. Затем оксалоацетат восстанавливается через малат и фумарат в сукцинат. На следующем этапе сукцинат ацетилируется сукцинил-КоА-синтетазой в сукцинил-КоА, который в сотрудничестве с коэнзимом B12 (кобаламином) и метилмалонил-КоА-мутазой превращается в метилмалонил-КоА, что приводит к образованию пропионил-КоА. КоА-трансфераза высвобождает КоА из пропионил-КоА, превращая его в пропионат (рис. 1). Помимо бактерий из рода Propionibacterium, этот путь также присутствует у Veilonella alcalescens и Selenomonas ruminantium (Reichardt et al. 2014).

Путь Вуда-Веркмана (рис. 1) является наилучшим с точки зрения производства пропионовой кислоты. По сравнению с двумя другими путями, в этом пути основным продуктом ферментации является пропионовая кислота, которая синтезируется очень эффективно по сравнению с уксусной кислотой и другими побочными продуктами (Kośmider et al. 2010a; Wang et al. 2013). Этот путь также характеризуется широким спектром возможных источников углерода для применения (богатая ферментативная система Propionibacterium усиливает этот эффект). Преимуществом этого пути является также тот факт, что ни один из промежуточных продуктов ферментации не является непосредственно токсичным для клеток, которые его синтезируют. Однако производство кислот приводит к подкислению среды, что тормозит дальнейший рост микроорганизмов, тем самым снижая производство пропионовой кислоты (Zhang and Yang 2009). Однако это можно легко исправить, нейтрализовав производственную среду.

Метод получения пропионовой кислоты

В настоящее время пропионовая кислота синтезируется с помощью нефтехимических процессов (путем гидрокарбоксилирования этилена), что требует значительных финансовых затрат и наносит существенный вред окружающей среде. Это связано с тем, что химическое производство пропионовой кислоты более экономично, чем микробный процесс с использованием PAB. Рыночная цена синтетической пропионовой кислоты составляет 1000 долларов за тонну, в то время как стоимость 1 тонны кислоты, полученной биотехнологическим способом с участием PAB, может достигать 2000 долларов.

Мировой рынок производства пропионовой кислоты достиг своего пика в 2012 году и составил почти $935 млн. По данным MarketsandMarkets, к 2018 году этот показатель должен вырасти как минимум до 1,7 миллиарда долларов (большая часть приходится на синтетический продукт). Развивающиеся страны Африки и Азии могут стать ответчиками на такой спрос. Кроме того, увеличение спроса на пропионовую кислоту микробного происхождения связано с растущими потребностями населения Северной Америки и европейских стран, где наблюдается повышенный интерес к экологическим продуктам. Рост спроса на пропионовую кислоту связан с появлением на рынке продуктов с "чистой этикеткой" без искусственных добавок (Baumann and Westermann 2016). Учитывая нехватку ресурсов и серьезный экологический ущерб, наносимый химическим производством пропионовой кислоты, а также рост спроса на натуральные и экологичные продукты питания, растет спрос на микробное производство пропионовой кислоты с использованием отходов различных производств. Это позволит ощутимо снизить затраты, а также улучшить экологическую обстановку. Для этого необходимо искать новые метаболические пути, чтобы интенсифицировать биосинтез метаболитов в PAB (Chen et al. 2012; Wang et al. 2013; Guan et al. 2015c).

Бактерии из видов P. freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii и P. acidipropionici представляются наиболее подходящими для биотехнологического производства пропионовой кислоты. Благодаря широкому разнообразию ферментных систем, они могут использовать углерод из различных источников, как в чистом виде, так и из отходов производства (Boyaval and Corre 1987; Carrondo et al. 1988; Hsu and Yang 1991; Lewis and Yang 1992; Quesada-Chanto et al. 1994; Barbirato et al. 1997; Ramsay et al. 1998; Himmi et al. 2000; Huang et al. 2002; Yazdani and Gonzales 2007; Zhu et al. 2010; Feng et al. 2011; Zhu et al. 2012; Piwowarek et al. 2016).

Утилизация отходов, образующихся в результате технологических процессов, - одна из важных проблем производственных компаний и экологов. Правильная утилизация отходов имеет множество преимуществ, включая ограничение загрязнения окружающей среды и затрат на очистку, улучшение гигиены или возможность получения недорогих новых продуктов. Поэтому исследователи постоянно ищут инновационные решения для управления промышленными отходами, особенно в биотехнологии. Отходы производства являются частым резервуаром биологически активных соединений (могут быть хорошим источником углерода, белков, пектина, клетчатки, витаминов и органических кислот). Поэтому целесообразно рассматривать отходы как резервуары ценных материалов, которые можно подвергнуть дальнейшей переработке. Это позволит снизить затраты на обогащение среды, что приведет к удешевлению продукции. Биотехнологическое использование бактерий может привести к снижению загрязнения окружающей среды не только за счет утилизации отходов, но и за счет их превращения в полезные и ценные промышленные соединения, такие как пропионовая кислота, которую в настоящее время получают посредством химического производства (Cybulska et al. 2013, Piwowarek and Lipińska 2015).

При производстве пропионовой кислоты часто используются методы периодического и полунепрерывного культивирования (Barbirato et al. 1997; Zhu et al. 2010). Производство пропионовой кислоты с использованием PAB может ингибироваться по принципу обратной связи из-за обширного накопления побочных продуктов, в первую очередь уксусной кислоты (она снижает pH и, таким образом, подавляет рост бактерий) (Suwannakham and Yang 2005). Экстрактивная ферментация проводилась для уменьшения влияния образующихся кислот на выработку пропионата (Jin and Yang 1998; Zhu et al. 2012). Процесс ферментации, проводимый в этих условиях, также имеет недостатки, такие как снижение эффективности процесса из-за присутствия в культуре экстрагируемого соединения, которое повышает осмотическое давление (Kourkoutas et al. 2005; Meynial-Salles et al. 2008). Suwannakham и Yang (2005) провели иммобилизацию культуры P. acidipropionici ATCC 4875 внутри биореактора, чтобы уменьшить влияние кислот на метаболическую активность бактерий. Иммобилизованные клетки произвели гораздо большее количество пропионовой кислоты (71,8 г/л), что указывает на повышенную устойчивость бактериальных клеток к образующимся кислотам. Этот метод позволил получить на 20-59 % больше пропионата, на 17 % меньше уксусной кислоты и на 50 % меньше сукцината по сравнению со свободными клетками. Стебли сахарного тростника использовались Chen et al. (2012) для иммобилизации P. freudenreichii CCTCC M207015. Самая высокая концентрация пропионовой кислоты (136,23 г/л) была получена при непрерывной ферментации, которая увеличилась на 21,07 % по сравнению со свободными клетками. В каждом случае (Suwannakham and Yang 2005; Chen et al. 2012) наблюдались морфологические изменения в иммобилизованных клетках, такие как трехкратное увеличение длины, уменьшение диаметра и увеличение площади поверхности, что, скорее всего, приводило к более эффективному транспорту соединений и метаболитов через клеточные мембраны. Это, в свою очередь, привело к увеличению производства бактериями пропионовой кислоты.

Исследование по улучшению биосинтеза пропионовой кислоты с помощью генной инженерии

Пропионовая кислота в основном производится с помощью нефтехимических процессов, однако растет интерес к получению этого соединения путем ферментации возобновляемой биомассы. Биосинтез пропионовой кислоты с использованием бактерий из рода Propionibacterium, к сожалению, характеризуется низкой эффективностью процесса с промышленной точки зрения. Поэтому предпринимаются попытки интенсифицировать процесс ферментации с помощью средств генной инженерии. Несколько стратегий были успешно реализованы. Например, Suwannakham et al. (2006) улучшили производство пропионовой кислоты из P. acidipropionici ATCC 4875, удалив из его генома ген ack, кодирующий ацетат киназу. Это привело к ингибированию производства уксусной кислоты и, таким образом, к увеличению производства пропионовой кислоты. Мутант P. acidipropionici (лишенный гена, кодирующего ацетат-киназу) был использован Zhang и Yang (2009) в ходе исследования толерантности PAB к кислой среде путем иммобилизации бактерий в реакторе с волокнистым слоем. Примерно через 3 месяца адаптации мутанта концентрация пропионовой кислоты в ферментационном бульоне достигла 100 г/л, что значительно превышало концентрацию метаболита при использовании штамма дикого типа (71 г/л). Иммобилизованный мутант характеризовался пониженной восприимчивостью к образующимся кислотам в результате повышенной активности и экспрессии гена, кодирующего H+-АТФазу, которая связана с перекачкой протонов и способностью клетки контролировать внутриклеточный градиент pH. Сверхэкспрессия генов, кодирующих глицериндегидрогеназу (GDH), малатдегидрогеназу (MDH) и фумаратгидратазу (FUM), с помощью генной инженерии улучшила производство пропионовой кислоты по данным Liu et al. (2015). Активность этих ферментов в модифицированном штамме была на 2,91-8,12 выше, чем у дикого типа P. jensenii, а уровень транскрипции увеличился с 2,85 до 8,07. Коэкспрессия GDH и MDH увеличила производство пропионовой кислоты с 26 до 39 г/л.

Wang et al. (2015a) проанализировали эффекты сверхэкспрессии трех биотин-зависимых ферментов, а именно пируваткарбоксилазы (PYC), метилмалонил-КоА-декарбоксилазы (MMD) и метилмалонил-КоА-транскарбоксилазы (MMC), которые отвечают за поток углерода в цикле Вуда-Веркмана. Мутанты со сверхэкспрессией MMC и MMD характеризовались повышенным синтезом пропионовой кислоты и пониженной продукцией уксусной и янтарной кислот по сравнению со штаммом дикого типа. Однако рост мутантов, сверхэкспрессирующих PYC, был медленнее, они продуцировали больше сукцината и имели на 12 % более низкую эффективность биосинтеза пропионата. Wang et al. (2015b) проверили влияние сверхэкспрессии нативной пропионил-КоА/сукцинат-КоА-трансферазы (CoAT) в клетках P. shermanii на производство пропионовой кислоты из глюкозы и глицерина. Мутировавший штамм производил больше пропионовой кислоты и характеризовался увеличенной на 10 % эффективностью. Избыточная экспрессия CoAT могла привести к тому, что содержание углерода было направлено на биосинтез пропионовой кислоты, тем самым повышая эффективность. В других исследованиях Ammar et al. (2014) клонировали ген, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу (PPC), из Escherichia coli в P. freudenreichii. PPC катализирует превращение оксалоацетата в фосфоенолпируват в присутствии CO2. Сверхэкспрессия PPC у P. freudenreichii значительно изменила ферментацию пропионовой кислоты. Мутанты, сверхэкспрессирующие PPC, более эффективно утилизировали глицерин и продуцировали пропионат быстрее, чем мутанты дикого типа. Это можно объяснить более эффективным связыванием CO2 и изменениями в пути образования дикарбоновых кислот.

Бактерии из подвида P. freudenreichii не могут утилизировать ксилозу, сахар, который в изобилии содержится в древесной биомассе. Wei et al. (2016) идентифицировали три гена в катаболическом пути ксилозы у P. acidipropionici: ксилозоизомеразу (XylA), переносчик ксилозы (xylT) и ксилулокиназу (xylB). Сверхэкспрессию этих генов в клетках P. freudenreichii subsp. shermanii проводили с использованием экспрессионного вектора pKHEM01, что позволило мутанту эффективно утилизировать ксилозу даже в присутствии глюкозы. Полученный мутант характеризовался сходной кинетикой ферментации глюкозы, ксилозы и смеси глюкозы/ксилозы. Таким образом, сконструированный штамм P. freudenreichii subsp. shermanii может представлять собой потенциальную альтернативу для промышленного производства пропионовой кислоты и других продуктов с высокой добавленной стоимостью из лигноцеллюлозной биомассы (Liu et al. 2012).

Биосинтез пропионовой кислоты контролируется по механизму обратной связи у бактерий из рода Propionibacterium. Повышение устойчивости бактерий к кислотам является наиболее эффективной стратегией для увеличения биомассы PAB и последующего синтеза пропионовой кислоты (Guan et al. 2014). Для достижения этой цели Guan et al. (2012) использовали адаптивную эволюцию и перетасовку генома. Также была установлена значительная роль аргининдеиминазы (EC 3.5.3.6) и глутаматдекарбоксилазы (EC 4.1.1.15) в толерантности бактерий к кислотам в клетках P. acidipropionici (Guan et al. 2013; Zhang and Yang, 2009). Guan et al. (2015b) попытались повысить устойчивость P. jensenii ATCC 4868 к действию кислот путем сверхэкспрессии пяти генов: Arca, ARCC, gadB, GDH и ybaS, кодирующих, в частности, глутаматдегидрогеназу и аргининдеиминазу. Наиболее положительное влияние на устойчивость бактерий к пропионовой кислоте и эффективность ее производства оказала сверхэкспрессия gadB (кодирующего глутаматдекарбоксилазу). Устойчивость P. jensenii к кислоте возросла более чем в 10 раз (по сравнению со штаммом дикого типа), а эффективность достигла общего количества 5,92 г/г глицерина (увеличилась на 23,8 %). Результаты исследования подтвердили, что экспрессия генов с помощью генной инженерии привела к изменению пула аминокислот и дополнительной экспрессии других генов, что, возможно, способствовало увеличению биосинтеза пропионовой кислоты. Это эффективная стратегия увеличения производства пропионата с использованием бактерий из рода Propionibacterium. Эта стратегия может быть полезна при производстве других органических кислот. Современные научные знания о функционировании резистентности к кислоте в клетках Propionibacterium остались на уровне микроокружения. Таким образом, для понимания этих механизмов необходимы дальнейшие исследования. В этом отношении могут быть полезны методы системной биологии. Технологии, сравнивающие геномику и транскриптомику, могут быть использованы для получения штаммов бактерий, устойчивых к кислотам на уровне ДНК, а протеомика и метаболомика - для выявления ключевых белков и метаболитов, а также путей, ответственных за тот или иной признак. Системная биология, предполагающая внедрение признаков одного организма в другой, также может быть использована для повышения устойчивости Propionibacterium к низкому pH. Для этого элементы, отвечающие за устойчивость к кислотам, которые идентифицированы у других бактерий, будут введены в Propionibacterium (Guan et al. 2015a, 2015b). Например, Lu et al. (2013) выявили новую систему кислотоустойчивости у E. coli, в реакции, где L-глутамин превращается в L-глутаминовую кислоту с выделением аммиака. Элементы, ответственные за это изменение в E. coli, могут быть применимы в Propionibacterium для повышения устойчивости к кислотным условиям. Ограничивающим фактором метаболической инженерии бактерий из рода Propionibacterium является система рестрикционной модификации (RM), которая снижает способность клеток к трансформации. Это является серьезным препятствием для генетических манипуляций (Van Luijk et al. 2002). Эти системы координируют активность рестрикционных и модифицирующих ферментов, чтобы отличить чужеродную ДНК от ДНК хозяина, тем самым защищая клетки от внедрения чужеродного генетического материала.

Применение системной биологии и методов синтетической биологии может решить эти проблемы и предоставить новые данные и возможности, расширяющие сферу применения Propionibacterium. Настоящей революцией в плане преодоления ограничений системы RM в клетках PAB может стать метод модификации ДНК, основанный на белке Cas9-CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) associated). Эта система использует элементы приобретенного иммунитета у бактерий и архей в ответ на фаговую инфекцию и генетическую трансформацию с новым генетическим материалом. Микроорганизмы включают фрагменты чужеродной ДНК в свои CRISPR-локусы в геноме, что позволяет в дальнейшем быстро распознать и уничтожить инфекцию. Cas9 может использоваться для внесения стабильных изменений в геном (knock-out и knock-in), в том числе в процессах генетической модификации и активации или глушения выбранных генов (Jinek et al. 2012; Wiedenheft et al. 2012; Cong et al. 2013; Jiang et al. 2013; Ran et al. 2013; Ousterout et al. 2014).

Биосинтез витамина B12

Структура витамина В12

Витамин B12 – это общий термин, используемый для соединений группы кобаламина. Сюда входят четыре основные химические формы: цианокобаламин, в котором кобальт замещен группой CN-, гидроксокобаламин с группой OH-, метилкобаламин с группой CH-; и дезоксиаденозилкобаламин, содержащий 5-дезоксиаденозильный фрагмент. Витамин В12 относится к соединениям коррина (кобаламинам). Молекула кобаламина состоит из четырех пиррольных субъединиц (A–D), связанных друг с другом в альфа-положении, образуя тем самым макроциклическую структуру. Первая субъединица конъюгирована с четвертой (A и D) непосредственно через химическую связь Cα-Cα. Эта структура связывается с центрально расположенным атомом углерода с двумя координированными лигандами (верхним и нижним), например, цианидной группой, аденозином и 5,6-диметилбензимидазолом (DMBI). DMBI отвечает за терапевтические свойства витамина B12 у человека. Присутствие другого заместителя, такого как аденин, в положении DMBI образует так называемый псевдовитамин B12, который активен только в бактериальных клетках (Raux et al. 1999; Beck 2001; Martens et al. 2002). Витамин В12 может синтезироваться только бактериальными клетками и архебактериями, в том числе почвенными микроорганизмами, микрофлорой пищеварительного тракта человека и животных, природными удобрениями и сточными водами. Источниками витамина В12 в рационе человека являются молоко, сыр, яйца, мясо жвачных животных, птица, рыба, ракообразные и мясные субпродукты (Rodionov et al. 2003; Ortigues-Marty et al. 2006; Smith et al. 2007). У человека рекомендуемое потребление кобаламина зависит от возраста и физиологического состояния человека. Оптимальная суточная дозировка для женщин и мужчин (в возрасте ≥14 лет) составляет 2,4 мкг, тогда как суточная доза для беременных и кормящих женщин составляет от 2,6 до 2,8 мкг. Витамин B12 необходим для эритропоэза (образования эритроцитов в костном мозге) и многих других функций человеческого организма (Fenech 2001; Knasmüller and Verhagen 2002; Paoloni-Giacombino et al. 2003; Kolling et al. 2004; Luggen 2006; Smith et al. 2007). Тяжелыми последствиями дефицита витамина B12 являются анемия, атеросклероз, болезни сердца, неврологические заболевания (паралич конечностей, атаксия и летаргия), повышенная восприимчивость дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) к повреждениям, изменения метилирования и другие (Aleman et al. 2001; Fenech 2001; Dharmarajan et al. 2003; Figlin et al. 2003; Luggen 2006).

Кобаламин синтезируется по двум механизмам: аэробному (при участии генов cob, присутствующих у бактерий из рода Pseudomonas) и анаэробному (при участии генов cbi, присутствующих у бактерий из родов Bacillus и Salmonella). Бактериям из рода Propionibacterium для эффективного производства витамина B12 необходимы как анаэробные, так и аэробные условия (в геноме этих бактерий есть гены с префиксом cbi и cob) (Scott 1994; Raux et al. 1996; Raux et al. 1998; Martens et al. 2002; Falentin et al. 2010).

Биосинтез всех тетрапиррольных производных в растениях, археях и большинстве бактерий начинается с основной глутаматной цепи С5. Первым шагом является добавление глутамата к тРНК под действием глутамил-тРНКGlu-синтетазы. Эта реакция требует гидролиза одной молекулы АТФ до АМФ и PPi. Далее тРНКGlu восстанавливается до глутамат-1-полуальдегида, и эта реакция катализируется глутамил-тРНК-редуктазой. Образовавшийся глутамат-1-полуальдегид затем превращается в 5-аминолевулиновую кислоту (ALA) с помощью глутамат-1-полуальдегид-аминотрансферазы, первого общего предшественника любых известных тетрапирролов (внутримолекулярный перенос аминогруппы между С-2 и С-1 семиальдегида). Аденозилкобаламин производится из уропорфириногена III, который образуется из восьми молекул 5-аминолевулиновой кислоты. Первые этапы производства витамина B12 осуществляются в анаэробных условиях и катализируются ферментами, кодируемыми генами с префиксом cbi (рис. 2). Синтез витамина B12 начинается с димеризации молекул 5-аминолевулиновой кислоты, приводящей к образованию порфобилиногена (PBG). Следующим шагом является полимеризация четырех молекул PBG, приводящая к образованию преуропорфириногена. В дальнейшем это соединение подвергается инверсии и циклизации с образованием биологически активного уропорфириногена III — предшественника структуры коррина. В вышеупомянутых реакциях участвуют три фермента: дегидратаза 5-аминолевулиновой кислоты (hemB), порфобилиногендезаминаза (hemC) и синтаза уропорфириногена III (hemD). Действие уропорфириноген-III С-метилтрансферазы приводит к метилированию этого соединения в положениях С-2 и С-7, вызывая образование прототипной версии кольца (прекоррин-2). Сразу после образования прототип корринового кольца связывает кобальт. Эта реакция катализируется АТФ-независимой хелатазой. Углерод С-20 удаляется после связывания кобальта и окисления в виде ацетальдегида, что связано с наличием кобальта, который может иметь разные степени окисления (от + 1 до + 3). В следующих девяти реакциях, катализируемых разными типами ферментов (рис. 2), включающих метилирование углерода в соответствующих положениях, корриновое кольцо превращается в кобинамид. Это происходит за счет конъюгации аминопропанола с мотивом пропионовой кислоты, присоединенным к боковой цепи D-кольца. Следующие реакции требуют присутствия кислорода, поскольку катализируются ферментами, кодируемыми генами с префиксом cob (рис. 2). В результате создается нижний лиганд, и к кобинамиду присоединяются верхний и нижний лиганды. Образование нуклеотида, находящегося под макроциклическим кольцом, происходит в результате переноса фосфорибозильного фрагмента никотинамид-мононуклеотида на DMBI с образованием α-рибазола. Затем α-рибазол присоединяется в присутствии GDP к аденозилкобамамиду, в результате чего высвобождается GMP.. Все вышеупомянутые превращения приводят к образованию полной формы аденозилкобаламина (рис. 2) (Lamm et al. 1982; Blanche et al. 1989; Warren et al. 1990; Louie et al. 1992; Jordan 1994; Sattler et al. 1995; Warren et al. 1998; Roessner et al. 2002; Warren et al. 2002; Piao et al. 2004a, 2004b; Falentin et al. 2010; Kośmider and Czaczyk 2010b; Khan Mazharuddin et al. 2011, Chamlagain 2016).

Биосинтез витамина B12 бактериями из рода Propionibacterium

Рис. 2. Биосинтез витамина B12 бактериями из рода Propionibacterium (Falentin et al. 2010) *номер фермента (красный), название гена (черный)

Активный витамин B12 отличается от псевдовитамина наличием DMBI в нижнем положении лиганда макроциклического кольца. По данным Deptula et al. 2015, в геноме P. freudenreichii имеется фермент слияния BluB/CobT2, участвующий в производстве активной формы витамина B12. Понимание механизмов, влияющих на синтез различных форм кобаламина, важно в контексте селекции штаммов и увеличения производства витамина B12. В биосинтезе витамина B12 у P. freudenreichii задействовано 30 генов (Roth et al. 1993). Наиболее важными с промышленной точки зрения являются заключительные этапы пути (производство, активация и присоединение нижнего лиганда), которые определяют образование терапевтически активного витамина. Ферментативный комплекс BluB/CobT2 является ключевым в биосинтезе активного витамина B12 (рис. 2). DMBI образуется в результате восстановления FMN, катализируемого ферментом BluB в анаэробных бактериях. Образовавшийся DMBI затем активируется ферментом CobT2 (CobT2 отвечает за селективное внедрение DMBI в кобинамид), в результате чего образуется α-рибазолфосфат, который затем присоединяется к макроциклическому кольцу, образуя полную молекулу активной формы кобаламина. Среди семи проанализированных гомологов CobT2, полученных из различных микроорганизмов, все они характеризовались сродством к DMBI и отсутствием способности утилизировать другие субстраты, что препятствует биосинтезу неактивных соединений. Низкий уровень продукции псевдовитамина B12, обусловленный отсутствием способности ферментного комплекса утилизировать, например, аденин, позволяет предположить, что бактерии P. freudenreichii предпочитают активную форму кобаламина в качестве кофактора ферментативных процессов (Falentin et al. 2010; Deptula et al. 2015, Chamlagain 2016).

Все штаммы Propionibacterium, способные к активной продукции витамина B12, могут производить его только в присутствии кислорода. Это связано с кислородной зависимостью лиганда DMBI. Поэтому производство витамина B12 с использованием штаммов Propionibacterium можно разделить на две фазы: на первой фазе бактериальные клетки должны культивироваться в анаэробных условиях в течение первых нескольких дней для образования предшественника витамина B12, то есть кобинамида (промежуточного продукта, в котором отсутствует DMBI-группа). На втором этапе биосинтез активного кобаламина завершается деликатным проветриванием культуры в течение следующих нескольких дней, когда синтезируется низший лиганд, который конъюгируется с ранее образованным кобинамидом (рис. 2). Для эффективного производства также важно поддерживать нейтральный pH и надлежащую температуру (соответственно: pH 7,0 и темп. 30 °C) (Miyano et al. 2000; Leman 2007) производственной среды. Поэтому необходимо удалять пропионовую и уксусную кислоты, образующиеся в процессе ферментации, например, путем подщелачивания среды, "перекрестной" фильтрации (Hatanaka et al. 1998), ферментации с очисткой на колонке с активированным углем (Nakano et al. 1996), экстракционной ферментации (Zhang et al. 1993), электродиализа (Lewis and Yang 1992) или иммобилизации бактериальных клеток (Yang and Huang 1995; Czaczyk et al. 1997a; Czaczyk et al. 1997b). Для поддержания эффективного производства культуральные среды должны быть дополнены важными соединениями или предшественниками в процессе биосинтеза витамина B12, такими как ионы кобальта, DMBI, глицин, треонин, 5-аминолевулиновая кислота, бетаин (присутствует в свекловичной мелассе) и холин, независимо от используемых производственных штаммов (Roman et al. 2001).

Промышленное производство витамина B12

См. также доп. информацию→

Из-за сложности (около 70 стадий) и высокой стоимости химического синтеза кобаламина его промышленное производство основано исключительно на процессах ферментации с использованием микроорганизмов (Blanche et al. 1995; Blanche et al. 1998; Piao et al. 2004a, 2004b). В последние годы участились случаи обогащения пищевых продуктов витамином B12 путем ферментации in situ. В этом контексте примечательно, что P. freudenreichii - единственный микроорганизм, имеющий статус GRAS, который может синтезировать активную форму витамина B12, что делает его уникальным решением для коммерческого производства витамина, а также продуктов питания и кормовых микробиологических добавок с ним. Более того, бактерии P. freudenreichii производят терапевтически активный витамин B12 с сопутствующей незначительной продукцией неактивного аналога. Известны и другие организмы, производящие витамин B12 и классифицируемые как виды GRAS, однако по разным причинам они менее привлекательны для промышленности, чем PAB. Например, бактерии Lactobacillus reuteri не способны включать в нижнюю часть кольца другие лиганды, кроме аденина, и синтезируют витамин B12, который неактивен для человека (Santos et al. 2007; Crofts et al. 2013). 

Существует два способа синтеза витамина В12 пропионибактериями: в первом методе используются бактериальные культуры, ответственные за обогащение некоторых ферментированных пищевых продуктов витамином В12 (Van Wyk et al. 2011). Во-втором, химический путь получения витамина В12, трудоемкий и достаточно дорогой, заменяется микробным синтезом.

Компания «Aventis» (лидер по производству витамина В12) для промышленного производства кобаламина предпочитает использовать P. denitrificans (не имеющий статуса). Биосинтез витамина В12 у P. denitrificans, в отличие от P. freudenreichii, происходит в чистых аэробных условиях. Сочетание генной инженерии с сопутствующими процедурами мутагенизации позволило ученым из Rhône-Poulenc получить штамм P. denitrificans, продуцирующий витамин B12 на уровне 300 мг/л (Blanche et al. 1995). Blanche et al. (1989) описали амплификацию восьми генов оперона cobF-cobM, что привело к увеличению производства кобаламина на 30%. Дальнейшее усиление биосинтеза метаболита (на 20 %) стало возможным благодаря увеличению копий генов cobA и cobE. Генетически модифицированный штамм P. denitrificans позволяет производить витамин B12, покрывающий 80% мировой потребности в нем (Martens et al. 2002).

Для повышения эффективности производства кобаламина штамм P. freudenreichii был подвергнут генетическим манипуляциям. Piao et al. (2004a, 2004b) добились увеличения биосинтеза кобаламина в 2,2 раза, однако эффективность была низкой по сравнению с P. denitrificans. Они экспрессировали гены, участвующие в биосинтезе кобаламина (hem, cob и cbi). Рекомбинированный клон P. freudenreichii, содержащий вектор экспрессии pPK705 со вставкой cobA, cbiLF или cbiEGH, продуцировал соответственно в 1,7-, 1,9- и 1,5 раза больше кобаламина, чем дикий штамм. Ученые (Piao et al. 2004a, 2004b) также ввели в экспрессионный вектор, выделенный из клеток Rhodobacter sphaeroides, ген hemA и эндогенные гены hemB и cobA, получив таким образом в 2,2 раза больше витамина B12, чем при использовании P. freudenreichii, содержащего вектор pPK705.

Использование генетически модифицированных микроорганизмов в производстве метаболитов для профилактики здоровья человека является предметом серьезных споров. Поэтому были проведены многочисленные исследования по оптимизации производства витамина B12 с использованием микроорганизмов, не подвергшихся генетическим модификациям. Эти исследования посвящены поиску штаммов, характеризующихся природно высокой эффективностью биосинтеза витамина B12 или эффективностью метода культивирования (табл. 1). Кроме того, предпринимались попытки повысить эффективность биосинтеза кобаламина путем оптимизации состава ферментационной среды за счет выбора наиболее подходящих источников углерода (Quesada-Chanto et al. 1994), добавления микроэлементов (Trojanowska and Czaczyk 1996) и ионов кобальта (Seidametova et al. 2004), а также одновременного использования различных факторов (Chiliveri et al. 2010). Значительное увеличение производства витамина B12 было получено при обогащении производственной среды предшественниками (Marwaha et al. 1983; Murooka et al. 2005) и аналогами витамина B12 (Thirupathaiah et al. 2012).

Таблица 1 Производство витамина B12 отдельными штаммами из рода Propionibacterium

Штаммы
Источник углерода
Выработка витамина B12
Ref
P. acidipropionici DSM 8250
Свекольная патока
34.8 мг/л
Quesada-Chanto et al. 1994
P. acidipropionici DSM 8250
Тростниковая патока
28.8 мг/л
Quesada-Chanto et al. 1994
P. freudenreichii subsp. shermanii OLP-5
Глюкоза
31.67 мг/л
Thirupathaiah et al. 2012
Propionibacterium freudenreichii NCIB 1081
Глюкоза
4.3 мг/л
Czaczyk et al. 1997a
Propionibacterium shermanii FRDC Pr1
Ферментационные растворы  (молочнокислое брожение)
1,8 мкг/л
Gardner and Champagne 2005
Propionibacterium shermanii PZ-3
Глюкоза
52 мг/л
Hatanaka et al. 1998
P. freudenreichii subsp. shermanii DSM 20270
Отходы производства тофу
10 мг/л
Yu et al. 2015
Propionibacterium freudenreichii CICC 10019
Глюкоза, кукурузный экстракт
42.6 мг/л
Wang et al. 2012

Wang и Yang (2013), коферментируя глюкозу и глицерин путем их постепенного добавления, смогли получить относительно высокие количества витамина B12 и пропионовой кислоты с помощью P. freudenreichii subsp. shermanii (0,72 мг/г и 0,71 г/г, соответственно). Использование обоих источников углерода по отдельности привело к более низким результатам. Wang et al. (2013) показали, что интегрированная система ферментации может обеспечить эффективный метод экономически выгодного и экологичного производства пропионовой кислоты и витамина B12.

Ключевым фактором, ограничивающим производство активного витамина B12 бактериями Propionibacterium, является биосинтез низшего лиганда метаболита, то есть DMBI. Chamlagain et al. (2016) проверили влияние предшественников DMBI (рибофлавина (RF) и никотинамида (NAM)) и DMBI на продукцию витамина B12 P. freudenreichii и P. acidipropionici в среде на основе сыворотки. Одновременное добавление в среду RF (40 мМ) и NAM (27 мМ) увеличивало продукцию витамина B12 в четыре раза по сравнению с контрольными культурами. Для многих штаммов эффективность производства витамина была сопоставима или выше, чем при добавлении DMBI (100 мМ). Chamlagain et al. (2016) продемонстрировали, что наличие RF и NAM увеличивает продукцию активного витамина B12 P. freudenreichii в зависимости от штамма.

Wang P. et al. (2015) проверили влияние пропионовой кислоты и DMBI на производство витамина B12 в сочетании с очисткой в абсорбционной колонке с использованием биореактора. В результате авторы установили, что поддержание начальной и последующей концентрации пропионовой кислоты на уровне 10-20 и 20-30 г/л может эффективно увеличить производство кобаламина. Их метод, включающий контроль количества пропионовой кислоты и DMBI, привел к повышению эффективности производства витамина B12 (58,8 мг/л).

Биосинтез и роль трегалозы в Propionibacterium

трегалоза

Природная трегалоза состоит из двух молекул глюкозы, связанных α,α-1,1’-O-гликозидной связью. Благодаря низкой энергии гликозидной связи это наиболее термодинамически и кинетически стабильный дисахарид, встречающийся в природе. Поскольку D-глюкопиранозильные звенья связываются при участии аномерных атомов углерода, трегалоза не обладает восстановительными свойствами.

Трегалоза широко распространена в живых клетках, например, в дрожжах, грибах, растениях и микроорганизмах (нематодах, ракообразных и насекомых), она также была обнаружена в многочисленных бактериальных клетках, включая Propionibacterium. Присутствие трегалозы в PAB было описано еще 50 лет назад (Stjernholm 1958), однако метаболизм дисахарида трегалозы в этих бактериальных клетках был изучен лишь недавно.

Дисахарид трегалоза играет разные роли в различных организмах. Она выполняют защитную роль в ответ на стресс, вызванный, в частности, высокой или низкой температурой, обезвоживанием или изменением осмотического давления. Бактерии P. freudenreichii способны накапливать высокие уровни трегалозы, особенно в условиях стресса. Известно пять путей метаболизма трегалозы: OtsAB, TreS, TreYZ, TreP и TreT (Avonce et al. 2006). Первые два пути используются бактериями Propionibacterium. По данным Cardoso et al. (2007), синтез трегалозы у P. freudenreichii происходит по пути OtsAB, в то время как TreS отвечает за ее катаболизм.

Путь OtsAB включает две ферментативные реакции, которые катализируются трегалозо-6-фосфат синтазой и трегалозофосфатазой: первый фермент катализирует превращение UDP-глюкозы в глюкозо-6-фосфат и трегалозо-6-фосфат, который затем гидролизуется фосфатазой до трегалозы (рис. 3). У бактерий, способных использовать крахмал, гликоген или мальтодекстрин в качестве источника углерода, происходит другой путь биосинтеза трегалозы, катализируемый двумя ферментами: мальтоолигозилтрегалоза синтазой (TreY) и мальтоолигозилтрегалоза трегалогидролазой (TreZ) (De Smet et al. 2000; Cardoso et al. 2007). TreY воздействует на α-1,4-гликозидную связь на восстановительном конце мальтодекстрина, превращая ее в α,α-1,1-гликозидную связь, что приводит к образованию мальтоолигозильной трегалозы. Впоследствии TreZ катализирует гидролиз второй α-1,4-гликозидной связи мальтоолигозилтрегалозы, что приводит к высвобождению трегалозы (Elbein et al. 2003). У некоторых бактерий (например, Pimelobacter sp.) была обнаружена трегалоза-синтаза (TreS), катализирующая внутриклеточную перегруппировку мальтозы в трегалозу. TreS изомеризует α-1,4-гликозидную связь мальтозы в α,α-1,1-гликозидную связь, образуя трегалозу (Elbein et al. 2003). Впоследствии фермент трегалозофосфорилаза (TreP) участвует в биосинтетическом пути дисахарида трегалозы, происходящем в некоторых грибах. TreP катализирует гидролитическое высвобождение трегалозы из трегалозо-6-фосфата, образовавшегося ранее из глюкозы и глюкозо-1-фосфата. Последний известный путь биосинтеза трегалозы был определен в гипертермофильных клетках археи Thermococcus litoralis. В этих клетках участвует трегалозогликозилтрансфераза-синтаза (TreT), которая катализирует обратимый биосинтез трегалозы из ADP-глюкозы (аденозин-дифосфат глюкозы) и глюкозы (Qu et al. 2004; Ryu et al. 2005).

Схема метаболизма трегалозы у P. freudenreichii

Рис. 3. Схема метаболизма трегалозы у P. freudenreichii (Cardoso et al. 2007; Ruhal et al. 2013) (Pi - неорганический фосфат - ред.)

Трегалозо-6-фосфатсинтаза была обнаружена у многих видов бактерий, дрожжей, плесени, растений и насекомых. В зависимости от вида существует различная специфичность OtsA к источнику глюкозы. В случае P. freudenreichii, пока белки OtsA находятся в стрессовых условиях, они проявляют сродство к ADP-глюкозе. В случае необработанных экстрактов P. freudenreichii OtsA использует исключительно ADP-глюкозу, тогда как чистый рекомбинированный OtsA, помимо ADP-глюкозы, также использует UDP-, GDP-, и TDP-глюкозу. Это позволяет предположить, что регуляторный белок, определяющий специфичность OtsA по отношению к ADP-глюкозе, является вторым белком пути OtsB (рис. 3) (Cardoso et al. 2007).

В ответ на осмотический стресс или снижение pH среды P. freudnereichii демонстрирует повышение уровня трегалозо-6-фосфат синтазы пути OtsAB, тогда как уровень ферментов пути TreS остается неизменным или снижается незначительно. Это подтверждает, что в стрессовых условиях у Propionibacterium species трегалоза синтезируется только по OtsAB-пути. Отсутствие общих путей деградации трегалозы в экстракте из P. freudnereichii позволяет предположить, что за активность в этих клетках отвечает путь TreS, приводящий к разложению трегалозы до мальтозы (рис. 3). Высокая активность амиломальтазы в экстракте P. freudnereichii указывает на то, что из мальтозовосстанавливающего конца мальтоолигосахаридов, полученных с помощью TreS, высвобождается глюкоза, которая впоследствии катаболизируется по пути гликолиза (Cardoso et al. 2007; Othake and Wang 2010).

Физиологическая роль многочисленных путей расщепления трегалозы была четко определена только у нескольких видов бактерий (De Smet et al. 2000; Wolf et al. 2003; Makihara et al. 2005). У мутантов Sphaeroides rhodobacter были обнаружены убедительные доказательства деградации трегалозы по пути TreS (Makihara et al. 2005). Аналогичный TreS-путь был предложен и для клеток Corynebacterium glutamicum. Ход реакции, катализируемой TreS в этих бактериях, направлен как на синтез, так и на деградацию трегалозы. Синтез трегалозы происходит только тогда, когда мальтоза является единственным источником углерода, доступным в окружающей среде (Wolf et al. 2003), в остальных случаях TreS отвечает за разложение трегалозы до мальтозы.

Трегалоза накапливается в клетках P. freudenreichii в ответ на осмотический, окислительный, кислотный и тепловой стресс. Это явно указывает на защитную функцию этого сахара против вышеупомянутых факторов. В стрессовых условиях, таких как повышенная осмолярность, трегалоза отвечает за поддержание эластичности клетки. Роль трегалозы как поглотителя кислородных радикалов была продемонстрирована на Sacchraomyces cerevisiae (Benaroudj et al. 2001; Chi et al. 2001). Накопление трегалозы в ответ на воздействие повышенной температуры было объяснено у ряда мезофильных организмов, таких как дрожжи и бактерии (E. coli и S. enterica) (Strom 1993; de Virgilio et al. 1994; Cánovas et al. 2001). Гены синтазы трегалозы также были определены в геноме бактерии Picrophilus torridus, оптимальный рН роста которой составляет 0,7. Скорее всего, у этого микроорганизма трегалоза участвует в стабилизации клеточной мембраны, которая должна выдерживать сильный градиент рН в окружающей среде.

Мальтоза, сахароза и глюкоза - источники углерода, обычно используемые в исследованиях для производства трегалозы. Однако они постепенно заменяются отходами различных отраслей промышленности, в первую очередь сельскохозяйственной и пищевой, например, кукурузным крахмалом и сырым глицерином (Ruhal and Choudhury 2012a). Некоторые исследования указывают на повышение эффективности получения трегалозы за счет использования осмотически чувствительных мутантов Propionibacterium (Ruhal and Choudhury 2012a, b) и оптимизации условий окружающей среды (Cardoso et al. 2004).

Cardoso et al. (2004) исследовали 18 штаммов Propionibacterium, выделенных из различных молочных источников, на предмет производства трегалозы. Среди исследованных микроорганизмов только три не проявляли способности к биосинтезу и накоплению трегалозы. Это свидетельствует о том, что исследуемые микроорганизмы обладают способностью продуцировать трегалозу. Самый высокий уровень накопления дисахарида трегалозы был определен в клетках P. freudenreichii subsp. shermanii Nizo B365 (131 мг/г). Ученые (Cardoso et al. 2004) также определили взаимодействие вышеупомянутого штамма с условиями окружающей среды при производстве трегалозы. Было обнаружено, что лактоза является лучшим источником углерода для производства трегалозы. Однако лактат, который очень хорошо влияет на рост бактерий, оказался слабым предшественником внутриклеточного накопления полисахарида.

Когда источники углерода, содержащиеся в среде, истощились, Cardoso et al. (2004) начали наблюдать постепенную потерю трегалозы в биомассе, что указывает на ее роль в качестве резервного материала в клетках бактерий. Они также определили увеличение внутриклеточного накопления трегалозы в следующих условиях: снижение рН окружающей среды с 7,0 до 4,5, концентрация NaCl 2% и культивирование в аэробных условиях, где насыщение воздухом составляло 50%. Максимальное накопление трегалозы в клетках увеличилось с 200 до 400 мг трегалозы/г биомассы. Эти результаты указывают на двойную роль трегалозы в PAB. Являясь резервным соединением, этот метаболит также функционирует для защиты бактериальной клетки от стрессовых условий окружающей среды. P. freudenreichii subsp. shermanii Nizo B365 может производить относительно большие количества трегалозы из молока с пониженным содержанием жира, что является многообещающим в отношении производства кисломолочных продуктов, обогащенных трегалозой (Cardoso et al., 2004).

Ruhal и Choudhury (2012a, b) продемонстрировали биосинтез трегалозы как мутантом, так и диким типом P. freudenreichii subsp. shermanii в среде, где единственным источником углерода был сырой глицерин. В случае мутанта с повышенной осмотической чувствительностью накопление метаболита было в три раза выше по сравнению со штаммом дикого типа (391 мг/г биомассы). Скорее всего, это связано с повышенной активностью ADP-глюкозопирофосфорилазы.

Промышленное производство трегалозы в основном осуществляется путем ферментативной конверсии (Chi et al. 2003). Несмотря на эффективность ферментативных методов, в производстве трегалозы все чаще используются бактерии и промышленные отходы, что может повлиять на себестоимость дисахарида трегалозы и, следовательно, на её рыночную цену (Li et al. 2011). Способность некоторых бактерий накапливать трегалозу для промышленного применения была проверена, в частности, на Corynebacterium, E. coli (Li et al. 2011) и P. freudenreichii (Ruhal et al. 2011; Ruhal and Choudhury 2012a, b; Dalmasso et al. 2012). Понимание метаболизма трегалозы может способствовать разработке устойчивых к стрессу штаммов, используемых в промышленных процессах ферментации. Lactococcus lactis - лучший пример в этом смысле. Можно вывести штамм этого вида, характеризующийся повышенным накоплением трегалозы и улучшенной устойчивостью к кислоте (pH 3,0), низкой температуре (4 °C), тепловому шоку (45 °C) и обезвоживанию (Carvalho et al. 2011).

Промышленное применение трегалозы

FDA США присвоило трегалозе статус GRAS, поэтому ее можно добавлять в продукты, предназначенные для широкого потребления (Mancini et al. 2011). Дисахарид трегалоза широко используется в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности, а также применяется в медицине.

Трегалоза устойчива к неферментативному подрумяниванию, которое вызывается реакцией Майяра (как нередуцирующий сахар, трегалоза не вступает в реакцию с соединениями, содержащими аминогруппы) и карамелизации (это связано с низкой энергией гликозидной связи трегалозы, что приводит к высокой прочности). Трегалоза в два раза менее слаще сахарозы, обеспечивает продление энергетического уровня и вызывает очень низкую секрецию инсулина. Благодаря этому дисахарид трегалоза широко используется в пищевой промышленности. В первую очередь она используется как подсластитель и загуститель (наполнитель), маскирует неприятные запахи и защищает крахмал, липиды и белки от окислительного разрушения, а также от воздействия тепла и холода. Трегалозу добавляют, например, в сушеные овощи и фрукты для сохранения их аромата и органолептических свойств (Higashiyama 2002; Elbein et al. 2003; Kroger et al. 2006; Othake and Wang 2010). (Higashiyama 2002; Elbein et al. 2003; Kroger et al. 2006; Othake and Wang 2010). Учитывая растущий интерес потребителей к здоровью и красоте, трегалоза имеет большой потенциал для коммерческого применения, например, в качестве сахара для похудения. Дополнительное преимущество трегалозы заключается в том, что она демонстрирует отличную стабильность при переработке (Cardoso et al. 2004), а также устойчивость к стрессам, таким как низкая температура и высокая осмолярность (Ruhal Choudhury 2012b). Благодаря защитному действию трегалозы на липосомы в косметике и белки и липиды кожи, ее используют при приготовлении увлажняющих мазей. Исследования показали, что 2 %-ный раствор трегалозы способен уменьшить неприятные запахи, выделяемые кожей человека, до 70 % (он ингибирует разложение ненасыщенных жирных кислот и некоторых альдегидов). Поэтому трегалоза находит применение в дезодорантах, парфюмерии и антиперспирантах (Higashiyama 2002; Teramoto et al. 2008; Yu et al. 2012). Она компонент капель THEALOZ®, используемых для лечения сухости глаз. Это связано с тем, что трегалоза может защищать эпителиальные клетки роговицы от обезвоживания и денатурализации тканей (Lee et al., 2013). Кроме того, трегалозу применяют при производстве растворов, используемых при криоконсервации стволовых клеток и хранении органов и тканей, предназначенных для трансплантации. Более того, трегалоза продлевает срок хранения вакцин и антител, а также позволяет хранить рестриктивные ферменты и ДНК-полимеразу при комнатной температуре. Согласно различным исследованиям, употребление продуктов, содержащих трегалозу, влияет на усиление костного метаболизма и предотвращает развитие остеопороза (Higashiyama 2002; Teramoto et al. 2008; Yu et al. 2012). Так называемые терапевтические белки и полипептиды используются при лечении многочисленных заболеваний (например, артрита, анемии, диабета и рака). Их тонкая структура делает их очень восприимчивыми к воздействию протеолитических ферментов, химической и физической деградации или агрегации в жидкостях организма; все это влияет на потерю биологической активности молекулы. Были проведены исследования (Jain and Roy 2008) гидрогелевых белковых носителей, сшитых трегалозой. Учитывая ее биопротекторные свойства, при высвобождении она будет способна создавать микросреду, предотвращающую инактивацию белков и терапевтических полипептидов, секретируемых вместе с трегалозой. Кроме того, предпринимались попытки использовать трегалозу для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона или Хантингтона. Атипичная агрегация и фиксация отдельных белков происходит у пациентов с любым из вышеперечисленных заболеваний. Исследование показало, что трегалоза уменьшает подобные эффекты и препятствует образованию нейротоксичных амилоидов (Liu et al. 2005; Miura et al. 2008; Yu et al. 2012; Chaudhary et al. 2014).

Биосинтез и роль бактериоцинов, синтезируемых PAB

Propionicin T1 - Описание химической структуры

На рис. выше: Описание химической структуры пропионицина T1. Молекулярная формула соединения: C43H69N13O14S (См. отдельно: Пропионицины)

Бактериоцины - это синтезируемые рибосомой пептидные или белковые молекулы с антимикробным действием, которые продуцируются грамотрицательными и грамположительными бактериями. Согласно литературным данным, до 99 % бактерий способны к биосинтезу хотя бы одного бактериоцина (Klaenhammer, 1993). Изначально считалось, что эти вещества проявляют активность исключительно в отношении микроорганизмов, связанных с производителем данного бактериоцина. Однако последующие исследования показали, что они действуют на микроорганизмы других родов, кроме производителя, включая патогенные микроорганизмы, такие как Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus и Clostridium spp. Активность, стабильность и способ действия бактериоцинов определяются их аминокислотным составом и молекулярной структурой (Jack et al. 1995; Schillinger et al. 1996).

В последние годы потребители проявляют большой интерес к продуктам питания без химических консервантов, поэтому был проведен ряд исследований биологических методов сохранения продуктов питания. Одним из решений могут стать бактериальные метаболиты, обладающие антимикробным действием и являющиеся альтернативой химическим консервантам, например, бактериоцины или живые бактериоцингенные культуры. Эти соединения считаются нетоксичными для человека, они чувствительны к действию, в частности, пепсина и трипсина (подвергаются деградации в пищеварительном тракте), и не было установлено негативного влияния бактериоцинов на органолептические и сенсорные характеристики продуктов питания (Cabo et al. 2001; Cleveland et al. 2001). Применение бактериоцинов в качестве биоконсервантов в пищевой и кормовой промышленности требует понимания характеристик этих соединений с особым акцентом на их структуру, механизм действия и стабильность. Кроме того, необходима легализация бактериоцинов в качестве пищевых добавок. Не менее важен и экономический вопрос, связанный с оптимизацией условий их производства. PAB широко используются в производстве продуктов питания, что делает их интересными в качестве потенциального источника соединений с антимикробными свойствами (Faye et al. 2000; Miescher et al. 2000; Brede et al. 2004; Faye et al. 2004; van der Merwe et al. 2004; Gwiazdowska and Trojanowska 2005; Gwiazdowska 2010).

Классические и дермальные бактерии рода Propionibacterium способны продуцировать бактериоцины. Большинство этих соединений вырабатывается классическими видами, такими как P. thoenii, P. jensenii и P. freudenreichii (Al-Zoreky et al. 1991; Faye et al. 2000; Miescher et al. 2000; Ben-Shushan et al. 2003; Brede et al. 2004; van der Merwe et al. 2004; Gwiazdowska and Trojanowska 2005).

Биосинтез бактериоцинов зависит от целого ряда факторов: pH, температуры, состава и консистенции культуральной среды. Подходящий рН для производства бактериоцинов с помощью PAB зависит от используемого штамма. Наиболее интенсивная продукция пропионицина PLG-1 происходит при рН 7, в то время как максимальная продукция дженсенина G наблюдается при рН 6,4 (Lyon et al. 1993; Hsieh et al. 1996; Ekinci and Barefoot 1999; Brede et al. 2004). Faye et al. (2000) наблюдали различную оптимальную температуру при биосинтезе пропионицина T1 с использованием двух штаммов P. thoenii. Штамм LMG 2792 достигал наибольшей продукции пропионицина T1 при температуре 22 °C, в то время как штамм 419 достигал наибольшей продукции при температуре 30 °C. Лучшими средами для биосинтеза бактериоцинов PAB в лабораторных условиях являются бульон с лактатом натрия, MRS и среда, состоящая из свекловичной мелассы и кукурузной крупы. Ben-Shushan et al. (2003) продемонстрировали, что производство пропиоцина PLG-1 в жидкой среде штаммом P. thoenii P127 было выше, чем штаммом GBZ-1, в то время как в полужидкой среде оба бактериоцина имели сопоставимые уровни производства.  Бактериоцины из Propionibacterium характеризуются низкой антимикробной активностью в культуральной среде. Поэтому важно оптимизировать условия, связанные с биосинтезом бактериоцинов, и оптимизировать метод, подходящий для их выделения и эффективности. Из-за низкой концентрации бактериоцинов необходимо концентрировать посткультурную жидкость для определения ее антимикробной активности (Lyon et al. 1993; Ekinci and Barefoot 1999; Morgan et al. 1999; Faye et al. 2000; Brede et al. 2004).

Механизм действия бактериоцинов может быть бактерицидным и/или бактериостатическим по своей природе. Большинство бактериоцинов, продуцируемых PAB, проявляют антагонистический эффект в отношении видов Propionibacterium и Lactobacillus. Эффект бактериоцинов из PAB в отношении близкородственных штаммов изменчив и зависит от степени родства штамма-продуцента и чувствительного штамма. На активность бактериоцинов также влияют доза, степень очистки, фаза роста чувствительных клеток, рН и температура среды (Cintas et al. 2001). Большинство бактериоцинов оказывают бактерицидное действие на чувствительные микроорганизмы через несколько минут после контакта. Некоторые бактериоцины (лактоцин, лейкоцин) (Upreti 1994) обладают бактериостатическим действием, тем самым подавляя размножение чувствительных микроорганизмов. Бактериоцины могут проявлять различную активность, в зависимости от чувствительного микроорганизма; jensenina G обладает бактерицидным действием против L. delbrüecki и бактериостатическим действием против P. acidipropionici (Grinstead and Barefoot 1992). Контакт бактериоцина с чувствительными клетками происходит за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженной молекулой ингибитора и отрицательно заряженными фосфолипидами (тейхоевой и липотейхоевой кислотой), содержащимися в клеточной мембране чувствительного микроорганизма. В результате этих взаимодействий в клеточной мембране образуются поры и ионные каналы (некоторые бактериоцины требуют специфических мембранных рецепторов). Образовавшиеся поры вызывают пассивный отток фосфатов, ионов калия, аминокислот, АТФ и других соединений, что приводит к нарушению протонной двигательной силы, градиента рН или мембранного потенциала. Дефицит ионов, низкий уровень АТФ и кофакторов приводит к ингибированию синтеза белков и нуклеиновых кислот, а также к невозможности получения клетками питательных веществ из окружающей среды, что приводит к их гибели (Bhunia et al. 1991; Jack et al. 1995; Chen et al. 1997; Marciset et al. 1997; Moll et al. 1999; Ryan et al. 1999). Некоторые бактериоцины нарушают синтез клеточной стенки через ингибирование биосинтеза петидогликанов на уровне трансгликозилирования или вызывают лизис клеток чувствительных видов бактерий (deVuyst and Vandamme 1994; González et al. 1994).

Наиболее широкий спектр активности продемонстрировал пропионицин PLG-1, синтезированный P. thoenii P127 (табл. 2), который обладает антимикробным действием в отношении PAB, молочнокислых бактерий, а также грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесеней. Пропионин GBZ-1 и тоеницин 447 обладают антибактериальным действием в отношении патогенного штамма P. acnes. Это позволяет предположить возможность использования данного соединения в лечении акне, вызванного P. acnes. Дженсенин G ингибирует рост спор Clostridium botulinum типов A, B и E. Бактериоцины отдельных PAB, такие как пропионицин F, пропионицин T1 и пропионицин SM1, обладают антагонистическим действием только в отношении штаммов того же вида, что и производитель. Неочищенные препараты бактериоцинов, содержащие пропионицин SM1, проявляют антимикробную активность в отношении дрожжей, плесеней, PAB и молочнокислых бактерий. После очистки пропиоцин SM1 проявляет активность только в отношении штамма P. jensenii DSM20274. Вероятно, это связано с тем, что неочищенный препарат содержит соединения, поддерживающие активность бактериоцина и обладающие антибактериальным и фунгистатическим действием. Во многих случаях бактериоцины PAB оказывают более сильное действие на молочнокислые бактерии, чем на другие PAB. Пропионицин GBZ-1 обладает сильнейшей антагонистической активностью в отношении Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis ATCC 4797. Теницин 447 оказывает бактерицидное действие в отношении Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LMG 13551, тогда как он проявляет бактериостатический эффект в отношении P.acnes. Дженсенин G характеризуется повышенной активностью в отношении родов Lactobacillus и Lactococcus. Ферментативно активированные бактерии характеризуются антагонизмом по отношению к штаммам P. acidipropionici, P. freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii и шести штаммам рода Lactobacillus (Lyon and Glatz 1991; Ratnam et al. 1999; Faye et al. 2000; Miescher et al. 2000; Faye et al. 2002; Ben-Shushan et al. 2003; Brede et al. 2004; van der Merwe et al. 2004).

Таблица 2. Характеристика выделенных бактериоцинов пропионовокислых бактерий

Бактериоцин
Молек. масса (Da)
Устойчивость
Инактивирующие ферменты
Диапазон активности
Ref
pH
Темп.
Пропионицин PLG-1
9238
3–9
80 °C менее 15 минут
Протеаза, проназа Е, пепсин, трипсин, α-химотрипсин
Бактерии G(+): Lactobacillus bulgaricus, L. casei, Pediococcus cervisiae i inne, Бактерии G(-): Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus и другие, грибы: Aspergillus wentii (ATCC 1778), Apiotrichum curvatum, Candida utilis, C. lipolytica и другие
Lyon and Glatz 1991; van der Merwe et al. 
2004
Пропионицин Т1
7130.20
> 2.5
60-100 °C менее 15 минут
Протеиназа К
P. acidipropionici ATCC 4965, ATCC 4875, P. jensenii ATCC 4868, P17, P52, P. thoenii ATCC 4871, ATCC 4872 Lactobacillus sakei NCDO 2714 и другие
Faye et al. 
2000
Пропионицин F
4397
Нет данных
Нет данных
Протеиназа К
штаммы вида Propionibacterium freudenreichii
Brede et al. 
2004
Тоеницин 447
7130
1–10
100 °C менее 15 минут
Протеиназа К, проназа, пепсин, трипсин, α-химотрипсин
Lactobacillus bulgaricus LMG 13551, Propionibacterium acnes ATCC 6919, ATCC 6922, ATCC 11827, ATCC 11828
van der Merwe et al. 2004
Пропионицин SM1
19.942
Нет данных
Нет данных
Нет данных
P. jensenii DSM 20274, DSM 20535
Miescher et al. 
2000
Дженсенин G
> 12.000
Нет данных
100 °C в течение 2 минут
Протеиназа К, проназа Е, протеаза
P. acidipropionici P5, P. jensenii P54, Lactobacillus bulgaricus NCDO 1489, L. delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797, Clostridium botulinum типа A, B, E и другие
Sip et al. 
2009
Дженсенин P
6000–9000
3–12
100 °C в течение 60 мин
Нет данных
P. jensenii B1264, P. thoenii P127 P. acidipropionici P5, P. thoenii P126, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, L. delbruecki subsp. delbruecki ATCC9649 и другие
Ratnam et al. 
1999
PAMP
6383
Нет данных
Нет данных
В концентрации > 100 мкг/мл: протеиназы K, A, P, трипсин,
отобранные штаммы видов: P. acidipropionici, P. freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii, бактерии рода Lactobacillus
Faye et al. 
2000

Характеристики отобранных бактериоцинов

Самый маленький из известных на сегодняшний день бактериоцинов, синтезируемых Propionibacterium, - пропионицин F. Его молекулярная масса составляет 4397 Da, а зрелая форма состоит из 47 аминокислот. Это первый бактериоцин, который был выделен из культуры двух разных штаммов вида P. freudenreichii: LMGT 2956 и LMGT 2946 (Brede et al. 2004). Он кодируется геном pcfA, ниже которого расположены гены, котранскрибирующиеся с pcfA: pcfB, pcfC и pcfD. Предполагается, что пропионицин F активируется двумя процессами: первый включает отсечение 101 аминокислоты от N-концевой части, а второй - удаление 111 аминокислот из С-концевой части пропептида. Пропионицин F содержит цистеины, расположенные в месте отсечения аминоконца пробактериоцина, поэтому, по мнению Brede et al. (2004), ген pcfB, кодирующий S-аденозилметионинтрансферазу, участвует в освобождении N-концевой части с одновременным образованием цистеинового остатка. Отсечение С-концевой части приписывается гену pcfC, кодирующему пролин-аминопептидазу (Brede et al. 2005; Faye et al. 2011). Наличие пролина в карбоксильной области пролин-пептидазы может участвовать в посттрансляционном процессинге бактериоцина. Это сложный процесс, поскольку он состоит из отсечения фрагментов на обоих концах пробактериоцина, и в литературе приводятся случаи посттрансляционной обработки преимущественно одного конца. Гены pcfD (кодирующий ABC-транспортер) и pcfC ответственны за секреторную систему бактериоцина вне клетки. Мембранные белки, кодируемые pcfI, контролируют устойчивость клеток к пропионицину F (Brede et al., 2007).

Пропионицин SM1 является крупнейшим из известных в настоящее время бактериоцинов PAB, продуцируемых двумя различными штаммами P. jensenii. Он образуется в виде пропептида из 207 аминокислот. Как и для большинства бактериоцинов, пропионицин SM1 секретируется вне клетки, когда 27-аминокислотный сигнальный фрагмент N-концевого конца отсекается. Сигнальный пептид имеет типичную структуру и обладает положительно заряженным аминоконцом, центральной гидрофобной областью и полярным карбоксильным концом (von Heijne 1988).

Пропионицин Т1 представляет собой положительно заряженный бактериоцин с молекулярной массой 7,1 kDa. Он проявляет активность против следующих бактерий: P. acidipropionici, P. jensenii, P. thoenii, P. acnes (патент США № 2003/0096365A1) и некоторых молочнокислых штаммов. На основании идентификации гена, кодирующего пропионицин Т1 (pctA), было установлено, что пропионицин Т1 синтезируется как 96-аминокислотный препептид, содержащий на своем аминоконце лидерный пептид длиной в 31 аминокислоту, характеризующийся типичными признаками сигнального пептида, такими как положительно заряженный аминоконец, гидрофобность и специфическая область отсечения. В результате транслокации и процессинга sec-системой препептид превращается в активный бактериоцин длиной в 65 аминокислот. Анализ ДНК выявил область кодирования белка (orf2), расположенную на расстоянии 68 нуклеотидов ниже стоп-кодона структурного гена pctA; аминоконцевая часть этой области указывает на ее связь с ABC-транспортерами. Этот белок расположен в плазматической мембране и обладает четырьмя АТФ-связывающими сайтами в цитоплазме. Поскольку пропионицин Т1 обладает характеристиками белков, секретируемых методом базовой секреции (von Heijne 1988), АТФ-связывающий кассетный транспортер (АВС), вероятно, не связан с его переносом за пределы клетки. Расположение гена позволяет предположить, что АВС-транспортер отвечает за устойчивость клетки к пропионицину Т1, то есть за удаление активного бактериоцина за пределы клетки или его импорт и деградацию внутри клетки (Faye et al. 2000). ABC-транспортеры защищают продуцентов от низина, субтилизина и лактицина 481 (Klein and Entian, 1994; Siegers and Entian, 1995; Rince et al. 1997). Бактериоцин, полностью гомологичный по последовательности пропионицину Т1, - это тоеницин 447, продуцируемый P. thoenii 447. Его зрелая форма состоит из 65 аминокислот. Аминокислотный состав тоеницина 447 содержит типичный паттерн сигнального пептида (Nielsen et al. 1997).

Особый тип белков, вырабатываемых Propionibacterium, - это так называемые патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs). Это название относится к продуцируемым клетками белкам, похожим на бактериоцины, которые активируются только в результате протеазной активности. Впервые они были описаны Ratnam et al. (1999). Авторы представили нетипичный способ действия соединений, продуцируемых следующими штаммами: P. jensenii B1264, P. jensenii 4868 и P. freudenreichii 6207. Штамм P. jensenii B1264, при отсутствии протеолитических ферментов в культуральной среде, проявлял активность исключительно в отношении пропионовых бактерий и Lactobacillus delbrueckii. Благодаря протеазной активности, область действия PAMP-активности штамма была расширена на Lactococcus lactis subsp. lactis C2, Lactobacillus helveticus ATCC 15009 и Lb. plantarum PI 549. Штаммы P. jensenii ATCC 4868 и P. freudenreichii 6207 при отсутствии протеолитических ферментов оказывали влияние только на PAB, тогда как в присутствии протеаз они ингибировали рост Lactobacillus. В 2002 г. Faye et al. охарактеризовали PAMPs, продуцируемые P. jensenii LMG 3032 и P. jensenii ATCC 4868.

PAMP продуцируется в виде пропептида, состоящего из 198 аминокислот, с сигнальным пептидом длиной 27 аминокислот, расположенным на N-конце. Зрелая форма PAMP содержит фрагмент С-конца этого предшественника. Активация PAMP происходит только вне клетки, что довольно нетипично по отношению к другим бактериоцинам. Большинство бактериоцинов продуцируются в виде пептидных предшественников и затем подвергаются внутриклеточным посттрансляционным модификациям или во время транслокации белка за пределы клетки, а затем они трансформируются в биологически активные формы. Аминокислотная последовательность pro-PAMP указывает на наличие сайтов отсечения, например, протеиназы K (специфическая область, расположенная между двумя аргининами). PAMP, подвергнутый воздействию протеиназы K в концентрации 40 мкг/мл, приводит к образованию активного бактериоцина с молекулярной массой 6383 Da (Neumann et al. 1993; Faye et al. 2002).

Было идентифицировано еще одно ингибирующее вещество (BLIS), продуцируемое PAB, именно штаммом P. jensenii B1264 (Wang et al. 2014). BLIS ингибирует рост P. acnes ATCC 6919; таким образом, этот белок может найти новое потенциальное применение в фармацевтической промышленности для борьбы с акне.

Перспективы применения бактериоцинов PAB

Большинство бактериоцинов, синтезируемых классической PAB, относятся к низкомолекулярным белкам, молекулярная масса которых не превышает 10.000 Da, за исключением пропионицина SM1, масса которого составляет 20.000 Da. Бактериоцины характеризуются высокой стабильностью в широком диапазоне рН и температур. Они активны в кислой, нейтральной и щелочной среде и термостабильны, не теряя активности после нескольких или 15-минутного нагревания при 100 °C. Например, активность тоеницина 447 после 15-минутного нагревания при 100 °C остается стабильной; активность падает (на 80 %) только при 121 °C. Дженсенин G сохраняет активность в течение 2 мин нагревания при 100 °C, но более длительное воздействие такой температуры (5, 10 и 15 мин) ограничивает его активность, но без деградации. Некоторые бактериоцины PAB, такие как дженсенин P, стабильны в среде, содержащей 0,1-1 моль/л NaCl, 0,1-2,0% SDS, 4 моль/л мочевины, а также в присутствии различных органических растворителей. Пропионин PLG-1 и другие бактериоцины устойчивы к разрушению при длительном хранении, сохраняя активность до 25 недель (при температурах 4 и -25 °C). Все эти характеристики доказывают целесообразность использования бактериоцинов PAB в производстве и консервировании продуктов питания (Hsieh et al. 1996; Ratnam et al. 1999; Ben-Shushan et al. 2003). Активность вышеупомянутых бактериоцинов, направленная на молочнокислые бактерии, может быть использована при производстве кисломолочных продуктов для предотвращения чрезмерного развития молочнокислых бактерий, вызывающего чрезмерное подкисление продукта. Подобные исследования проводились, в частности, для дженсенина G (Weinbrenner et al. 1997). Бактериоцины также были протестированы для сохранения мяса. Ekİncİ и Candoğan (2014) оценили влияние смеси дженсенина G и этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) на Listeria monocytogenes и E. coli в кусках свежего мяса. Комбинация дженсенина G и EDTA привела к снижению количества бацилл Listeria, обнаруженных в говядине, с 4,78 до 3,49 log cfu/g, но не оказала значительного влияния на снижение количества кишечной палочки. Divek and Kollanoor-Johny (2016) протестировали влияние двух подвидов P. freudenreichii (P. freudenreichii subsp. freudenreichii и P. freudenreichii subsp. shermanii) в отношении трех видов бактерий рода Salmonella (S. enteritidis, S. typhimurium и S. Heidelberg). Оба штамма P. freudenreichii оказались эффективными в подавлении размножения всех трех видов. Кроме того, P. freudenreichii оказал значительное влияние на снижение подвижности сальмонелл. Бактериоцины PAB также могут применяться в сыроделии для ограничения образования красных пятен на сырах, вызванных пигментом, продуцируемым P. thoenii и P. jensenii, без какого-либо негативного влияния на стартовые культуры P. freudenreichii (Sip et al. 2009). Антибактериальная активность некоторых бактериоцинов в отношении P. acnes создает потенциал для применения таких белков в качестве добавок к препаратам против акне (Wang et al. 2014). Судя по всему, в будущем бактериоцины, продуцируемые Propionibacterium, могут широко использоваться в качестве ингибирующих агентов против развития нежелательных микроорганизмов в различных пищевых, косметических и фармацевтических продуктах.

Заключение

PAB, благодаря своему значительному потенциалу, привлекают все большее внимание исследователей и представителей различных отраслей кормовой, пищевой, фармацевтической и медицинской промышленности. Эти бактерии обладают сложной ферментативной системой, позволяющей им утилизировать широкий спектр источников углерода. Однако наиболее важным в контексте промышленного использования пропионовокислых бактерий является то, что они способны производить из побочных продуктов технологических процессов многочисленные биологически активные соединения, включая пропионовую кислоту, витамин В12, трегалозу и бактериоцины. Таким образом, биотехнологическое использование ПАБ может способствовать снижению загрязнения окружающей среды за счет превращения отходов в полезные и ценные компоненты для других отраслей промышленности. Однако необходимы дальнейшие исследования для повышения эффективности биосинтеза этих метаболитов, чтобы увеличить масштабы производства, например, с использованием отходов, что может быть более экономически эффективным, чем существующие методы производства. Кроме того, необходимы дальнейшие исследования биосинтеза метаболитов бактериями из рода Propionibacterium, связанные с оптимизацией условий культивирования, например, путем добавления в культуральную среду подходящих источников углерода, биостимуляторов или генетических модификаций. Однако, поскольку во многих частях мира генетически модифицированные организмы (ГМО) все еще вызывают множество проблем, поиск подходящих микробов, способных производить этот метаболит с высокой эффективностью без вмешательства в их геном, активизировался.

Дополнительная информация:

А) Рекомендовано к прочтению:

Классический биопроцесс для получения цианокобаламина высокой чистоты

1) На рисунке: Классический биопроцесс для получения цианокобаламина высокой чистоты. Основной поток цианокобаламина выделен красным. Емкости промежуточного хранения опущены для упрощения рисунка. P1 - P11 обозначают процессы с 1 по 11 соответственно. Биопроцесс представлен с использованием SuperPro Designer® V9 Academic Site Edition, Intelligen, Inc. (Скотч-Плейнс, Нью-Джерси, США) / Изображение взято из статьи: "Стратегии биопроцессов для получения витамина В12 путем микробиологической ферментации и их применение на рынке". ИсточникÁlvaro Calvillo, et al. Bioprocess Strategies for Vitamin B12 Production by Microbial Fermentation and Its Market Applications / Bioengineering 2022, 9(8), 365

Примечание редактора: Технологии получения цианокобаламина совершенствуются до сих пор. Например, в 2023 г. была описана новая жизнеспособная стратегия для разработки будущих и устойчивых стратегий производства цианокобаламина (CNCbl) с использованием штаммов P. freudenreichii дикого типа без необходимости использования более сложных установок, таких как многофазные непрерывные биопроцессы или адсорбционные биореакторы с расширенным слоем для устранения пропионовой кислоты. Подробнее информация изложена в статье "Разработка стратегии одностадийного непрерывного технологического процесса для производства витамина B12 с помощью Propionibacterium freudenreichii" | Подробнее см.:

Álvaro Calvillo, et al. Developing a single-stage continuous process strategy for vitamin B12 production with Propionibacterium freudenreichii / Microb Cell Fact22, 26 (2023).

2) Микробиологическое производство пропионовой кислоты из пропионибактерий: современное состояние, проблемы и перспективы Подробнее см.:

Long Liu, et al. Microbial production of propionic acid from propionibacteria: Current state, challenges and perspectivesCritical Reviews in Biotechnology, 2012; 32(4): 374–381

3) Использование штамма Propionibacterium freudenreichii T82 для эффективного биосинтеза пропионовой кислоты и трегалозы в среде с экстрактом яблочных выжимок и сточными водами картофеля. | Подробнее см.:

Piwowarek K, et al.. Use of Propionibacterium freudenreichii T82 Strain for Effective Biosynthesis of Propionic Acid and Trehalose in a Medium with Apple Pomace Extract and Potato Wastewater. / Molecules. 2021 Jun 29;26(13):3965.

Б) Материал на сайте:

Литература

Этот сайт использует файлы cookie и метаданные. Продолжая просматривать его, вы соглашаетесь на использование нами файлов cookie и метаданных в соответствии с Политикой конфиденциальности.
Продолжить