Вопрос ферментации пищевых продуктов в смешанных культурах

Межмикробные взаимодействия при ферментации пищевых продуктов

СОДЕРЖАНИЕ

ЧАСТЬ I. Межмикробные взаимодействия при ферментации пищевых продуктов в смешанных культурах	ЧАСТЬ II. Молочнокислые и пропионовокислые бактерии: формирование сообщества для получения функциональных продуктов с бифидогенными и гипотензивными свойствами
Аннотация	Аннотация
Введение	Введение
Виды и механизмы межмикробных взаимодействий	1. Методика
Йогуртовый консорциум	2. Результаты и их обсуждение 2.1. Формирование сообщества лакто- и пропионовокислых бактерий
Молочнокислые и пропионовокислые бактерии
Производство и размножение смешанных культур	2.2. Функциональные свойства кисломолочных продуктов in vitro.
Выводы	2.3. Функциональные свойства кисломолочных продуктов in vivo
Литература	Литература

Межмикробные взаимодействия при ферментации пищевых продуктов в смешанных культурах

Аннотация

Большинство известных природных и промышленных процессов ферментации пищевых продуктов протекают под действием либо простых, либо сложных сообществ микроорганизмов. Очевидно, что эти ферментирующие микробы будут взаимодействовать не только с ферментируемым субстратом, но и друг с другом. Эти взаимодействия между микробами сложны, но, как считается, имеют решающее значение для получения желаемых свойств продукта. Взаимодействие микроорганизмов опосредовано различными молекулярными и физиологическими механизмами. Будут рассмотрены примеры механизмов взаимодействия, влияющих на результаты процессов ферментации пищевых продуктов. Наконец, кратко рассмотрены технологические и научные проблемы, связанные с производством и размножением сложных смешанных заквасочных культур. Исследования состава и функциональности сложных микробных консорциумов набирают обороты и открывают новые возможности для контроля и совершенствования процессов ферментации пищевых продуктов, а также для разработки новых направлений применения смешанных культур.

Введение

Ферментацию можно считать одной из старейших технологий производства пищевых продуктов с желаемыми свойствами, такими как длительный срок хранения и хорошие органолептические показатели [1]. Готовые ферментированные пищевые продукты обычно обладают повышенной микробной стабильностью и безопасностью, а некоторые из них могут храниться даже при температуре окружающей среды. Кроме того, существует ряд примеров ферментационных процессов, которые приводят к повышению питательной ценности [2,3] или усвояемости [4] пищевого сырья. Наконец, процессы ферментации пищевых продуктов также позволяют получать продукты с повышенными вкусовыми качествами для потребителей [5]. Все эти аргументы повысили интерес к изучению естественных процессов ферментации пищевых продуктов, а точнее, к установлению связи между разнообразием сообщества ферментирующих микробов и их свойствами, энергетикой процесса и качеством продукта.

Большинство процессов ферментации пищевых продуктов зависят от смесей микробов, которые действуют согласованно, обеспечивая желаемые характеристики продукта. В целом можно констатировать, что сложные микробные консорциумы выполняют более сложную деятельность (универсальность) и переносят больше изменений в окружающей среде (устойчивость) по сравнению с чистыми культурами. Универсальность и надежность можно объяснить двумя особенностями [6]. Во-первых, члены консорциума общаются друг с другом посредством обмена метаболитами или молекулярными сигналами. В результате каждая отдельная клетка смеси реагирует на присутствие других в консорциуме [7]. Второй ключевой особенностью является разделение труда между членами консорциума, ведущее к общему результату, который можно объяснить только объединением задач, выполняемых отдельными микробами или субпопуляциями [7,8]. Устойчивость сложных культур в процессах брожения характеризуют с точки зрения надежной заквасочной активности и получения пищевых продуктов постоянного качества. Интересно, что сложные культуры также демонстрируют более высокую степень устойчивости к атаке бактериофагов по сравнению с определенными культурами с одним или двумя штаммами [9]. Объяснение последнему явлению можно найти в присутствии в сложных заквасочных культурах бактериофагов как неотъемлемых членов микробного сообщества. Фаги фактически способствуют созданию генетического и фенотипического разнообразия микробной популяции [10]. Несмотря на то, что бактериофаги важны для эффективности и надежности сложных заквасок, обсуждение роли бактериофагов выходит за рамки данного обзора.

Знание состава микробных сообществ важно для понимания и, в конечном итоге, управления его функциональностью и может быть проанализировано с помощью секвенирования рРНК (метагеномного) [11,12]. Наконец, соответствующие межмикробные взаимодействия в сложных ферментациях могут быть продемонстрированы путем объединения профилирования (мета)транскриптома [12] и целевых анализов роста.

В этом обзорном документе будут обсуждаться последние достижения в исследованиях состава и функциональности сложных микробных сообществ в ферментированных пищевых продуктах. Особое внимание будет уделено роли микробного взаимодействия и его последствиям для функциональности продукта.

Виды и механизмы межмикробных взаимодействий

Все типы взаимодействий, которые, как известно, происходят между микробами, потенциально играют роль в консорциумах микробов, обнаруженных в ферментирующих пищевых продуктах [13]. По экологическому типу взаимодействий различают: во-первых, конкуренцию (-/- взаимодействие); во-вторых, мутуализм (+/+ взаимодействие); в-третьих, комменсализм (+/0 взаимодействие); в-четвертых, аменсализм (-/0 взаимодействие) и в-пятых, паразитизм (+/- взаимодействие) [13,14]. В конкуренции два или более видов, штаммов или субпопуляций микробов конкурируют за один или несколько факторов роста. Этот тип взаимодействия отрицательно влияет на обоих взаимодействующих партнеров, но обычно приводит к временному увеличению относительной численности одного взаимодействующего партнера по сравнению с другим. В случае мутуализма оба взаимодействующих вида/штамма приобретают приспособленность. Протокооперация между Streptococcus salivarius subsp. thermophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus при ферментации йогурта является хорошо известным примером мутуализма с четкой связью с функциональностью продукта [15]. При комменсалистических взаимодействиях один (микро)организм получает выгоду от другого, но другой партнер во взаимодействии не затрагивается. Примером такого взаимодействия является стимуляция роста протеазо-негативных вариантов (prt-) Lactococcus Lactis в сырной закваске протеазо-положительными (prt+) вариантами [16]. Варианты prt+ не несут прямого вреда от поставки пептидов и аминокислот в вариант prt-. Однако поскольку длительное совместное культивирование двух вариантов приводит к резкому увеличению относительной численности варианта prt-, комменсализм постепенно переходит в паразитизм (см. рис. 1). В целом считается, что продукция бактериоцинов конкретными молочнокислыми бактериями поддерживает доминирование продуцента в микробном сообществе (конкурентное исключение) [17,18]. С точки зрения экологической типизации это можно рассматривать как форму аменсализма.

Рис.1. От комменсализма к паразитизму. Казеин является основным источником органического азота в молоке. Во время ферментации молока протеолитические положительные варианты Lactococcus Lactis (обозначенные синим цветом как prt+) поставляют избыток пептидов и аминокислот для поддержки роста протеолитических отрицательных вариантов (обозначенных желтым цветом как prt-) L. Lactis (ситуация (а)). Взаимодействие, описанное в ситуации (а), можно рассматривать как комменсализм. После длительной инкубации молока (ситуация (б)) относительная численность вариантов prt- по сравнению с вариантами prt+ увеличивается, поскольку варианты prt- имеют несколько более высокую скорость роста. Это приводит к переходу от комменсалистского взаимодействия к паразитическому взаимодействию. Зеленая стрелка указывает на стимулирующий эффект, вызванный поступлением пептидов и аминокислот. Красная стрелка указывает на ингибирующий эффект, который оказывают варианты prt- на основе конкуренции за питательные вещества.

С другой стороны, тот же принцип отбора также приводит к стабильному сосуществованию между продуцентами бактериоцина и нечувствительными к бактериоцину микробами. В сложной культуре, содержащей продуцент бактериоцинов узкого спектра в относительно низкой численности, происходит взаимодействие с организмом-мишенью, которое можно назвать аменсализмом. Это, однако, не приводит к полному доминированию штамма-продуцента, поскольку он также сталкивается с конкуренцией за питательные вещества со стороны нечувствительных микробов, присутствующих в культуре. Более того, продуцент бактериоцина оказывает негативное воздействие, если таковое имеется, на незначительную часть микробного сообщества и, следовательно, не получает никакой пользы для роста от уничтожения своей мишени. Последний пример демонстрирует сложную сеть взаимодействий, существующую в смешанных культурах.

Вышеупомянутые типы взаимодействий опосредуются множеством молекулярных и физиологических механизмов. Перекрестное питание и обмен метаболитами являются одними из таких механизмов. Например, стабильная, неконкурентная ассоциация между мальтозонегативными, толерантными к молочной кислоте видами дрожжей и молочнокислыми бактериями в закваске основана на комплементарном использовании мальтозы [19]. Было обнаружено, что Lactobacillus sanfranciscensis поглощает мальтозу через симпортер мальтоза/протон и впоследствии превращает накопленную мальтозу в глюкозу и глюкозо-1-фосфат (G-1P). G-1P будет далее метаболизироваться гликолитическим путем, а внутриклеточная глюкоза будет секретироваться Lb. sanfranciscensis. Впоследствии секретируемая глюкоза может быть использована сосуществующими кислототолерантными и мальтозонегативными видами дрожжей, такими как Kazachstania exigua или Candida humilis. Более того, стабильное совместное существование Lb. sanfranciscensis с мальтозоположительными видами/штаммами дрожжей может происходить и за счет катаболитной репрессии секретируемой глюкозы, подавляющей экспрессию генов и путей утилизации мальтозы в дрожжах. Это приводит к взаимодействию, по сути, аналогичному тому, которое наблюдается между Lb. sanfranciscensis и мальтозоотрицательными дрожжами [20-22].

Как уже говорилось во введении, обмен сигнальными молекулами играет роль в ряде взаимодействий между микробами. Процесс quorum sensing (QS, кворум-сенсинг или «чувство кворума») опосредует коммуникацию между клетками бактерий путем выделения и обнаружения молекул-индукторов и служит культуре для контроля плотности популяции. Обнаружение молекул-индукторов приводит к синхронизации экспрессии генов (суб)-популяций в бактериальных культурах [23]. QS играет роль во многих микробиологических процессах, таких как патогенность, образование биопленок, компетентность, споруляция и продуцирование антимикробных соединений. Два наиболее изученных типа аутоиндукторов, опосредующих QS, - это ацил-гомосерин-лактоны и модифицированные пептиды, используемые грамотрицательными и грамположительными бактериями соответственно [24]. Иногда молекулы индукторов выполняют двойную функцию. Например, лантибиотический пептид низин действует в первую очередь как антимикробное соединение, но также участвует в кворум-сенсинге в качестве сигнальной молекулы [25]. При изучении взаимодействия между патогенной для растений бактерией Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi и непатогенными сопутствующими микроорганизмами [26] было показано, что сигналы кворума могут распространяться между видами, занимающими одну и ту же нишу, и что QS играет ключевую роль в создании стабильных совместных культур различных видов. Потенциально это явление может играть роль в сложных сообществах микробов, обитающих в ферментируемых пищевых продуктах и на их поверхности.

В следующих двух разделах описаны примеры процессов ферментации со смешанными культурами, в которых взаимодействие между микробами имеет важное значение для функциональности конечного продукта ферментации.

Йогуртовый консорциум

Йогурт представляет собой молочный продукт, заквашенный определенными смесями S. salivarius subsp. thermophilus и Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus [15]. Процесс ферментации и специфические взаимодействия между этими двумя видами хорошо документированы [27]. Недавно транскриптомное профилирование смешанной культуры йогурта было объединено с систематическим анализом влияния взаимодействующих соединений на рост взаимодействующих видов [27]. Последнее исследование показывает, что взаимодействие между этими бактериями влияет в первую очередь на метаболизм пуринов, аминокислот и длинноцепочечных жирных кислот. В общих чертах модель роста йогуртового консорциума [15] подтвердилась. Однако некоторые детали оказались иными. Например, обнаружено, что казеинолитическая активность Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus недостаточна для удовлетворения биосинтетических потребностей в сере и аминокислотах с разветвленной цепью у обоих видов молочнокислых бактерий. Поэтому ожидается, что увеличение поступления этих аминокислот повлияет на состав культуры и, соответственно, на характеристики продукта. Этот конкретный результат демонстрирует дополнительную ценность глобального профилирования экспрессии генов в смешанных культурах. Другое недавнее исследование [28] продемонстрировало способность высокопроизводительной метаболомики выявить микробные взаимодействия между йогуртовыми бактериями. Интересно, что концентрация ароматического соединения диметилтрисульфида (DMTS) оказалась относительно низкой в монокультурах Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC BAA365 и S. salivarius subsp. thermophilus LMD9 по сравнению с концентрацией, обнаруженной в смешанных культурах. Это наблюдение позволяет предположить, что взаимодействие двух видов молочнокислых бактерий приводит к усилению синтеза DMTS.

Молочнокислые и пропионовокислые бактерии

Помимо важной роли в производстве сыров швейцарского типа, антимикробная активность молочнокислых бактерий (МКБ) и пропионовокислых бактерий (ПКБ) делает их особенно подходящими для промышленного биоконсервирования, а также для производства in situ и ex situ функциональных и пищевых метаболитов.

Рис.2. Схематическое изображение подтвержденных и гипотетических мутуалистических взаимодействий, происходящих между МКБ и ПКБ во время совместной ферментации и соединений, имеющих отношение к разработке функциональных и питательных биоингредиентов.

Культивирование ПКБ в присутствии МКБ является классическим примером комменсализма с трофической цепью в качестве источника углерода. МКБ производят молочную кислоту (например, из лактозы), которая служит предпочтительным источником углерода для роста ПКБ и производства пропионовой и уксусной кислоты (рис. 2). Потребности этих двух микроорганизмов в питании и физическом росте сложны [11], и дополнительные метаболиты МКБ и ПКБ могут поддерживать синергический эффект роста. Однако мутуалистические взаимодействия трудно предсказать на основе культур одного штамма. Присутствие лактата в смешанных культурах не может объяснить все благоприятные эффекты роста ПКБ [29]. В сырах швейцарского типа рост, поддерживаемый ПКБ, может быть связан с протеазной активностью МКБ и продукцией пептидов и свободных аминокислот [30]. Часто сообщалось о стимуляции роста МКБ в смешанных культурах с ПКБ, что связано с меньшим накоплением лактата в среде, стимулирующим действием жирных кислот, продуцируемых ПКБ [31], и добавлением СО₂ под действием ПКБ [29].

Тонкие взаимодействия МКБ и ПКБ, вероятно, важны для их консервирующего действия, которое, как было показано, зависит от целого ряда антимикробных соединений, таких как молочная, пропионовая и уксусная кислоты, перекись водорода, диацетил и некоторые другие низкомолекулярные метаболиты, а также бактериоцины [32]. Исследования в основном были направлены на выявление отдельных противогрибковых соединений в супернатантах бесклеточных культур, которые часто обнаруживались лишь в виде следов, но до сих пор мало что известно об общих и предполагаемых сложных механизмах противогрибкового действия. Большинство идентифицированных антимикробных веществ представляют собой низкомолекулярные соединения с молекулярной массой менее 1000 Da [33]. Все эти соединения образуются в низких концентрациях и демонстрируют высокие минимальные ингибирующие концентрации [32,34]. Только сложная смесь проявляет активность, а эффекты отдельных параметров, таких как pH, время, температура и добавки, часто взаимосвязаны и имеют высокую штаммоспецифичность [33]. Присутствие живых клеток было необходимо для некоторых противогрибковых систем и подтверждало гипотезу о взаимодействии клеток [35]. Кроме того, было показано, что тесный контакт противогрибковых штаммов, как это происходит при их иммобилизации в гелевых шариках, или наличие твердой матрицы, как в пищевых продуктах, значительно усиливает антагонистическую активность комбинации МКБ-ПКБ [32,36].

Еще одним недавним примером применения совместных культур МКБ-ПКБ является производство витаминов. После широкого скрининга природного биоразнообразия МКБ и ПКБ на выработку фолиевой кислоты и витамина B12 был разработан высокоэффективный процесс ферментации с использованием совместной культуры Lactobacillus plantarum SM39 и Propionibacterium freudenreichii DF13 [37,38]. При использовании двухэтапного процесса, состоящего из начального анаэробного периода инкубации и последующей аэробной фазы, и среды пермеата молочной сыворотки, дополненной предшественниками витаминов, был достигнут очень высокий выход общего фолата - до 8400 нг/мл, что сопоставимо с генно-инженерными штаммами [39]. Кроме того, соотношение двух витаминов можно было регулировать для достижения оптимального питательного эффекта путем манипулирования условиями ферментации. Совместный рост клеток привел к сбалансированному соотношению МКБ и ПКБ 1–1 и может отражать метаболическую зависимость двух штаммов от источника углерода.

Широкий метаболический набор культур МКБ и ПКБ и мутуалистический характер взаимодействия МКБ и ПКБ делают их особенно пригодными для использования в надежных и контролируемых процессах ферментации в промышленных масштабах. Подбор совместных культур, обладающих различными характеристиками, особенно перспективен для расширения производства ряда уникальных функциональных и/или пищевых дизайнерских биоингредиентов (рис. 2).

Производство и размножение смешанных культур

Промышленное производство заквасок почти исключительно основано на традиционной периодической ферментации с использованием чистых культур планктонных клеток*. Затем отдельно полученные культуры смешивают для приготовления коммерческих культуральных препаратов [40]. Есть лишь очень немногие исключения, когда смешанные культуры размножаются в контролируемых условиях в биореакторах. Примерами могут служить производство мезофильных культур (для Гауды и Эдама в Нидерландах), а также термофильных культур (для Эмменталя и других твердых сыров в альпийских регионах) [41].

*Прим. ред.: Планктонные клетки классически определяются как "свободно движущиеся бактерии во взвешенном состоянии", в отличие от биопленок ("структурированного сообщества бактериальных клеток, заключенных в самовоспроизводящийся полимерный матрикс и прикрепленных к инертному или живому материалу").

Получение определенных смешанных или более сложных неопределенных культур является очень сложной задачей из-за различий в требованиях к питанию, оптимальным условиям выращивания и скорости роста микробных популяций. Между этими популяциями могут возникать как кооперативные, так и антагонистические явления. Действительно, периодическое культивирование не очень эффективно для поддержания соотношения бактерий в смешанных культурах или исходного разнообразия в сложных культурах и приводит к изменению активности и качества конечного ферментированного продукта. В качестве альтернативы традиционно используется так называемая обратная закваска, когда в новую партию ферментируемого субстрата инокулируется часть свежезаквашенного продукта. Например, сыры поверхностного созревания (они же сыры "с мытой коркой", "слизневые", "созревающие в мазке" - ред.) после посолки, либо инокулируются коммерческими смешанными культурами, содержащими различные штаммы Brevibacterium linens, Debaromyces hansenii и/или Geotrichum candidum, либо в некоторых странах промываются мазками от старых сыров (метод размазывания «старый-молодой») [42]. Однако оба подхода имеют свои ограничения. Определенные поверхностные стартовые культуры содержат небольшое количество видов бактерий и дрожжей, которые не отражают сложности и разнообразия домашней микробиоты, часто связанной с типичностью сыра [42]. Кроме того, отмечается низкая конкурентоспособность коммерческой созревающей заквасочной культуры, инокулированной в сырное молоко, с гораздо более жизнеспособной домашней (типичной для местного вида сыра – ред.) микробиотой [43].

Разработка контролируемых технологий, позволяющих эффективно и контролируемо размножать сложную микробиоту, полученную из микробиологически безопасного сыра, может стать более подходящей альтернативой, чем использование определенных культур заквасок (для контроля качества и загрязнения). Одним из возможных решений может стать иммобилизация клеток, которая была изучена для проведения ферментаций с высокой плотностью клеток для производства как клеток, так и метаболитов, что имеет ряд преимуществ перед ферментациями с планктонными клетками. Этими преимуществами являются: высокая плотность клеток, приводящая к высокой производительности, повторное использование биокатализаторов, повышенная устойчивость к загрязнению и атакам бактериофагов, повышение стабильности плазмид, предотвращение вымывания при непрерывном культивировании, а также физическая и химическая защита клеток [44]. Технология иммобилизации клеток была успешно опробована для получения смешанных культур, содержащих конкурентные и неконкурентные штаммы молочнокислых бактерий и бифидобактерий [45,46]. Современные данные свидетельствуют о том, что иммобилизация клеток в сочетании с непрерывным культивированием может также использоваться для эффективного одностадийного получения функциональных культур и пробиотических клеток с регулируемой физиологией, повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям окружающей среды и улучшенными технологическими и функциональными характеристиками [44,47]. Недавно были разработаны системы непрерывной ферментации с иммобилизованной фекальной микробиотой человека для точного моделирования кишечной ферментации и стабильного культивирования сложной микробиоты в течение длительных периодов времени в несколько месяцев [48,49]. Подобные подходы можно использовать для иммобилизации, стабилизации и размножения сложной микробиоты, используемой для ферментации пищевых продуктов, а также для изучения микробных взаимодействий, происходящих в сложных пищевых экосистемах.

Выводы

Будущее развитие и диверсификация стартовых культур (заквасок) для процессов ферментации пищевых продуктов должны основываться на растущих научных знаниях о поведении сложных сообществ ферментирующих микробов и на новых методологиях культивирования этих сложных культур. Присущее им свойство стабильности состава и стабильной работы сложных микробных сообществ, справляющихся с возмущениями окружающей среды, также называемое устойчивостью культуры, можно объяснить обменом информацией и метаболитами между взаимодействующими микробами. Как было продемонстрировано в тематических исследованиях относительно простого йогуртового консорциума [27,28], использование высокопроизводительных инструментов функциональной геномики приводит к открытию новых механизмов взаимодействия между микробами в смешанных культурах. Механистические знания о взаимодействиях микробов могут быть использованы для оптимизации контроля процессов ферментации пищевых продуктов и, следовательно, окажут влияние на качество ферментированных пищевых продуктов.

Когда акцент в разработке стартовых культур (заквасок) смещается в сторону сложных культур, неизбежно требуются инновационные технологии и подходы для размножения и производства этих культур безопасным, воспроизводимым и экономически эффективным способом. В частности, технология иммобилизованных клеток представляет собой высокопотенциальное решение для размножения сложных определенных и неопределенных культур для пищевой промышленности. Инновационные инженерные решения по-прежнему необходимы для масштабирования процессов и реализации полунепрерывных или непрерывных процессов, необходимых для обеспечения высокой эффективности, контроля и низких эксплуатационных затрат в промышленном масштабе.

• Литература

---

Молочнокислые и пропионовокислые бактерии: формирование сообщества для получения функциональных продуктов с бифидогенными  и гипотензивными свойствами

Аннотация

В работе представлены результаты исследований по созданию на основе молочнокислых и пропионовокислых бактерий комбинированной закваски и изучению функциональных свойств продуктов, полученных на ее основе. Показано, что кисломолочный продукт, полученный с использованием комбинированной закваски на основе подобранных штаммов: Streptococcus cremoris СR201, Lactobacillus rhamnosus Ф и Propionibacterium shermanii Э2 в соотношении 2 : 1 : 6 (об./об./об.) in vitro обладал выраженным антагонистическим действием в отношении патогенных, условно-патогенных микроорганизмов и возбудителей порчи продуктов, а также ингибировал активность ангиотензин-1-превращающего фермента, в моделях in vivo оказывал бифидогенное и умеренное гипотензивное действие. Кроме того, добавление в обезжиренное молоко гидролизатов сывороточных белков коровьего молока приводило к усилению роста пропионовокислых бактерий и увеличению количества жизнеспособных клеток в готовом кисломолочном продукте, что повышало его антимикробную активность in vitro и бифидогенное (пробиотическое) действие in vivo.

Введение

В современных условиях в связи с изменением экологической обстановки и широким применением антибиотиков наблюдается ухудшение здоровья населения, связанное в первую очередь с нарушениями микробиома человека, приводящее к тяжелым заболеваниям как желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), так и организма в целом. В настоящее время проблема изучения микробной экологии человека, а также в этой связи симбионтных и пробиотических микроорганизмов, становится актуальной и важной задачей [1–5].

В последние годы концепция оздоровления человека и предупреждения развития различных заболеваний ЖКТ заключается во введении в рацион кисломолочных продуктов, содержащих пробиотические штаммы бактерий, включая лактобактерии, бифидобактерии и пропионовокислые бактерии [6–9]. При этом все большее внимание исследователей привлекают пропионовокислые бактерии, обладающие пробиотическими свойствами, благодаря продукции уксусной, пропионовой и минорных органических кислот, ферментов и биологически активных продуктов их вторичного метаболизма [10]. Пропионовокислые бактерии в ЖКТ устойчивы к действию желчных кислот и выдерживают низкую (рН 2.0) кислотность среды в желудке [11]. Они ингибируют активность β-глюкуронидазы, азаредуктазы и нитроредуктазы – ферментов, образуемых кишечной микрофлорой и вовлекаемых в образование мутагенов, канцерогенов и промоторов роста опухолей [12]. Некоторые штаммы пропионовокислых бактерий способны синтезировать бактериоцины, например, Propionibacterium thoenii P126 и Propionibacterium jensenii B1264, подавляющие разввитие ряда грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжей и плесневых грибов [13]. Экспериментальные и клинические исследования пропионовых бактерий показали наличие у них иммуномодулирующей, антивирусной, противо-воспалительной, бифидогенной активностей, а также гипохолестеринемических, антиоксидантных, антиканцерогенных и др. свойств [10]. В ряде исследований также показана высокая антимутагенная активность пропионовокислых бактерий [12].

Таким образом, широкий спектр продуктов вторичного метаболизма и комменсальный характер взаимодействий с молочнокислыми бактериями делают пропионовокислые бактерии перспективными для использования в процессах ферментации и получения широкого спектра различных функциональных продуктов [13, 14].

Цель работы − создание комбинированной закваски на основе молочнокислых и пропионовокислых бактерий и изучение функциональных свойств продуктов, полученных с ее использованием в моделях in vitro и in vivo

1. МЕТОДИКА

Культуры. В работе использовались штаммы молочнокислых Lactobacillus rhamnosus Ф, Lactococcus cremoris СR201 и пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Э2 из фонда Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности (ВНИМИ, Москва, Россия). Для культивирования лактобактерий использовали стерильное обезжиренное молоко, для пропионовокислых бактерий – кукурузно-лактозную среду ГМК2 («Синтэкс», Россия).

В качестве тест-штаммов были использованы грамотрицательные Escherichia coli B-125 и грам-положительные бактерии Staphylococcus aureus 2097 (из коллекции Научного центра экспертизы средств медицинского применения Минздрава России), а также вызывающий порчу продуктов штамм плесневого микроскопического гриба Penicillium brevicompactum, выделенный из сметаны, и изолят дрожжей Torulaspora delbrueckii, выделенный из йогурта. Тест-культуры S. aureus 2097, E.coli B-125, P. brevicompactum и T. delbrueckii выращивали пробирках на скошенном питательном агаре следующего состава (г/л): пептон мясной ферментативный – 21.0, агар микробиологический – 12.15, натрия хлорид – 6.5, глюкоза – 6.25, Na₂HPO₄ – 3.5, KH₂PO₄ – 0.6. S. aureus 2097 и E.coli B-125 культивировали при 37 ± 2°С, P. brevicompactum и T. delbrueckii – при 24 ± 2°С.

Антагонистическая активность. Антагонистичекую активность штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий определяли методом смешанных популяций в сравнении с ростом тест-штаммов в монокультурах [15]. Совместное культивирование исследуемых штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий и тест-штаммов проводили на питательной среде следующего состава (г/л гидролизованного молока): глюкоза – 10, дрожжевой экстракт – 5.0, KH₂PO₄ – 4.0, при температуре 37 ± 1°С и 24 ± 1°С для тест-штаммов бактерий и грибов соответственно. После 24 и 48 ч совместного культивирования с тест-штаммами бактерий проводили высевы на плотные питательные среды, для дрожжей и плесневых грибов после 24 и 72 ч соответственно.

Антагонистическую активность кисломолочных напитков по отношению к патогенным, условно-патогенным микроорганизмам и возбудителям порчи продуктов определяли методом диффузии в агар [16]. Исследуемые образцы вносили в виде кисломолочного продукта без подщелачивания.

Биосовместимость штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактериальных культур. Биосовместимость культур определяли методом прямого совместного культивирования на поверхности плотной питательной среды (капельная методика) [17]. Суточную культуру наносили на поверхность питательной среды бактериологической петлей диаметром 3 мм. Посев оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1–2 мм от края первого пятна, наносили каплю культуры тестируемого микроорганизма. Растекаясь, вторая капля затекала на пятно культуры до половины диаметра. В той части, где произошло наложение капель, создавались условия для возникновения конкурирующих отношений между культурами. Свободные части пятен каждой культуры служили контролем жизнеспособности каждой из них. После подсыхания капель чашки инкубировали в анаэростате в анаэробных условиях при 30°С. Наличие антагонизма выявляли визуально по наличию признаков подавления роста одной культуры другой.

Питательная среда для определения биосовместимости культур имела следующий состав: гидролизованное молоко – 50%, дрожжевой автолизат – 4%, KH₂PO₄ – 4 г/л, объем доводили до 1 л дистиллированной водой.

Определение количества клеток. Количество клеток L. rhamnosus в чистой и смешанных культурах определяли методом посева на питательную среду MRS-агар. Культивирование проводили в анаэробных условиях при 37 ± 1°С, подсчитывали все выросшие на среде колонии в течение 48–72 ч.

Количество клеток P. shermanii в чистой и смешанных культурах определяли методом посева на питательную среду следующего состава (%): триптон − 1.0, дрожжевой экстракт − 1.0, агар-агар −1.5, K₂HP0₄ − 0.025, MnS0₄ − 0.005 и лактат натрия − 2.1 (60%-ный сироп) [18]. Культивирование проводили в анаэробных условиях при 30 ± 1°С, подсчитывали выросшие на среде  колонии.  В смешанной культуре P. shermanii подсчет выросших колоний осуществляли через 2–3 и 6 сут термостатирования при 30 ± 1°С. Количество клеток бактерий рассчитывали как разность между общим количеством колоний, выросших через 6 сут, и количеством колоний, выросших через 2–3 сут [19].

Количество клеток L. cremoris определяли по ГОСТ 33951-2016 «Молоко и молочная продукция. Методы определения молочнокислых микроорганизмов».

Кислотообразующая активность штаммов. Кислотообразующую активность определяли после внесения в стерилизованное обезжиренное молоко 10% закваски с последующим культивированием в биореакторах фирмы DASGIP (“Eppendorf”, Германия) с автоматическим измерением активной кислотности.

Содержание органических кислот. Органические кислоты в среде (молочная, уксусная и пропионовая) анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Agilent Infinity 1290 (“Agilent Technologies”, США) с детекцией на диодно-матричном детекторе при длине волны 210 нм с использованием колонки Zorbax SB-C8 (4.6 × 50 мм, 1.8 мкм) как описано в работе [15].

Определение функциональных свойств кисломолочных продуктов in vitro. Антиоксидантную активность in vitro в образцах кисломолочных напитков определяли флуоресцентным методом ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) с помощью микропланшетного фотометра-флуориметра BioTek Synergy 2 (“BioTek”, США) с генерацией пероксильного радикала в реакционной среде [20].

Гипотензивную активность in vitro в образцах белково-пептидных гидролизатов белков подсырных сывороток определяли по их способности ингибировать ангиотензин-1-превращающий фермент (АПФ) – ключевое звено ренин-ангиотензиновой системы, участвующей в регуляции артериального давления [20]. Измерения проводили с помощью микропланшетного фотометра-флуориметра BioTek Synergy 2 (“BioTek”).

Определение функциональных свойств кисломолочных продуктов в моделях in vivo. Исследование гипотензивных свойств кисломолочных продуктов проводили на самцах крыс линии SHR (Питомник лабораторных животных “ПУЩИНО”, Пущино, Россия) со спонтанной гипертензией (Spontaneously hypertensive rats) [21]. Животные случайным образом были распределены на три группы по 10 особей каждая:

• контрольная группа – вводили по 2 мл дистиллированной воды;
• опытная группа № 1 – вводили по 2 мл кисломолочного продукта на основе обезжиренного молока;
• опытная группа № 2 – вводили по 2 мл кисломолочного продукта с добавлением гидролиза- та сывороточных белков молока.

Введение соответствующих образцов осуществлялось ежедневно внутрижелудочно при помощи зонда. В течение 25 сут эксперимента проводили контроль уровня артериального давления у лабораторных животных с использованием монитора Coda Monitor (“Kent Scientific”, США) с набором манжет и датчиков RAT-CUFFKIT (“Kent Scientific”, США). Для каждого животного проводили не менее 10 циклов измерений, а полученные при этом результаты усредняли.

Исследование бифидогенных свойств кисломолочных продуктов проводили на самцах крыс линии Wistar (бридированы в виварии ФИЦ Биотехнологии РАН) на модели антибиотик-ассоциированного дисбиоза [22]. Дисбиоз индуцировали ежедневным введением внутрижелудочно с помощью зонда антибиотика (АБ) – 10%-ного фторхиналон байтрила (Байтрил®, “Bayer”, Германия) в дозе 10 мг на 1 кг массы тела животного. В эксперименте по тестированию бифидогенных свойств было взято четыре группы по 10 животных каждая:

По окончании экспериментов (25 и 14 сут при исследовании гипотензивных и бифидогенных свойств соответственно) экспериментальных животных усыпляли углекислым газом. Производили забор крови и фекальных масс из толстой кишки.

Сыворотку крови отделяли центрифугированием в течение 10 мин на центрифуге 5702R (“Eppendorf”, Германия) при 4°С и 2000 g. В сыворотке крови концентрацию компонентов ренин-ангиотензиновой системы – ангиотензинов I и II определяли методом ИФА с использованием коммерческих наборов (“Enzo”, США).

Для количественного учета групп микроорганизмов навеску из фекалий крыс массой 1.0 г вносили в регенерированный агаризованный 0.1%-ный тиогликолево-фосфатный буфер в соотношении 1 : 10. Из этой суспензии готовили последовательные 10-кратные разведения, которые вносили в соответствующие питательные среды. Бифидобактерии в фекальных массах животных определяли на среде TOS-MUP-агар (TOS пропионатный агар с мупироцином лития, “Merck”, Германия), лактобациллы – на среде МRS как описано в работе [23].

Рис. 1. Антагонистическая активность (%) Lactobacillus rhamnosus Ф (Lrh) и Propionibacterium shermanii Э2 (Pr) и их ассоциаций (соотношение 1 : 2, 1 : 4, 1 : 6) по отношению к тест-штаммам условно-патогенных Escherichia coli B-125 (а), патогенных Staphylococcus aureus 2097 (б) микроорганизмов и возбудителей порчи пищевых продуктов Penicillium brev- icompactum (в) и Torulaspora delbrueckii (г) на 24 ч (1) и 72 ч (2) совместного культивирования.

Содержание, питание, уход за животными, манипуляции и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями приказа Минздрава России от 1.04.2016 № 199н “Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики” и Международными правилами гуманного обращения с животными" – Директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей.

Органолептическую оценку кисломолочных напитков проводили по 5-бальной шкале.

Статистическая обработка. Обработку данных проводили с применением программ “Statistica 10” и “Microsoft Exel”. Статистически значимыми по двустороннему критерию Стъюдента считали отличия при p < 0.05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Формирование сообщества лакто- и пропионовокислых бактерий

Результаты исследований ряда авторов показывают, что антимикробная активность является не только видовым, но характерным для отдельного штамма признаком [24]. На первом этапе работы для включения в ассоциацию лакто- и пропионовокислых бактерий был изучен спектр антимикробной активности пробиотических штаммов

L. rhamnosus Ф, P. shermanii Э2, а также их сообществ в соотношении 1 : 2, 1 : 4 и 1 : 6 (об./об.). В качестве тест-культур использовали штаммы S.  aureus 2097, E.coli B-125, штамм P. brevicompactum, выделенный из сметаны, штамм дрожжей T. elbrueckii, выделенный из йогурта. Из результатов, представленных на рис. 1 видно, что при раздельном культивировании наиболее выраженной антагонистической активностью обладал штамм L. rhamnosus Ф, несколько меньшей – P. shermanii.

Рис. 2. Кислотообразующая активность штаммов Lactobacillus rhamnosus Ф (а) и Propionibacterium shermanii Э2 (б) при культивировании на различных средах: 1 – гидролизат сывороточных белков коровьего молока; 2 – обезжиренное коровье молоко.

Для ассоциации молочнокислых и пропионовокислых бактерий было отмечено увеличение ингибирования роста тестовой культуры плесневого гриба по сравнению с монокультурами. Так, степень подавления ассоциациями была на уровне 67–73%, а монокультурами – 61 и 43% для L. rhamnosus Ф и P. shermanii Э2 соответственно. Антагонистическая активность монокультур L. rhamnosus Ф и P. shermanii Э2 и их ассоциаций по отношению к патогенной бактерии S. aureus 2097 была практически на одном уровне (19–23%). Наибольшую степень подавления дрожжей показали монокультуры (15–20%) по сравнению с их ассоциациями (6–14%). Таким образом, как монокультуры, так и смешанные культуры обоих штаммов in vitro обладали хорошей антагонистической активностью.

На втором этапе работ оценивали развитие пробиотических культур L. rhamnosus Ф и P. shermanii Э2 в обезжиренном молоке при оптимальной температуре культивирования (37°С) и внесении 10% посевного материала. Результаты показали, что лактобациллы являются слабыми кислотообразователями, а пропионовые бактерии не способны ферментировать обезжиренное молоко в виде монокультуры (рис. 2). При заквашивании штаммом L. rhamnosus Ф коагулирование белков молока наблюдалось спустя 20 ч, при этом сгусток имел недостаточно выраженный кисломолочный вкус и был непрочным. Снижение значения активной кислотности (ΔрН) составляло 0.5 и 1.3 через 12 и 24 ч роста соответственно на стерилизованном обезжиренном молоке (рис. 2а). Полученные результаты подтверждают данные литературы о низкой протеолитической активности пробиотических лактобацилл и пропионовокислых бактерий в отношении казеина молока [25, 26]. Для интенсификации роста было проведено культивирование исследуемых штаммов на гидролизате сывороточных белков молока [20]. При культивировании L. rhamnosus Ф на белково-пептидном гидролизате наблюдали ускоренную динамику снижения активной кислотности: ΔрН через 12 и 24 ч составляло 0.6 и 1.7 ед. соответственно (рис. 2а). Рост штамма P. shermanii Э2 при культивировании на белково-пептидном гидролизате также происходили более интенсивно по сравнению с ростом на обезжиренном молоке: ΔрН через 12 и 24 ч – 0.3 и 0.8 соответственно (рис. 2б). При этом сквашенные образцы во всех случаях характеризовались жидкой консистенцией и выраженным горьким вкусом (оценка 1–2 по бальной шкале).

Для получения кисломолочного продукта с приемлемыми органолептическими свойствами в ассоциацию пробиотических культур был включен третий штамм – L. cremoris СR201, который являлся умеренным кислотообразователем, но обеспечивал, с одной стороны медленное снижение рН для роста культур L. rhamnosus Ф и P. shermanii Э2, с другой – образовывал при сквашивании сгусток, обладающий высокими реологическими свойствами. При этом анализ биосовместимости культур L.   rhamnosus Ф, P. shermanii Э2 и L. cremoris СR201 показал, что они не проявляют антагонизм по отношению друг к другу и потому могут быть использованы для подбора эффективного сообщества (рис. 3).

Добавление L. cremoris СR201 к пробиотическим культурам L. rhamnosus Ф и P. shermanii Э2 способствовало ускорению сквашивания обезжиренного молока. Так, уже через 12 ч культивирования значение активной кислотности достигало значения рН 4.7–4.8 (табл. 1, 2). При этом нарастание кислотности в процессе сквашивания комбинированными заквасками повышалось с увеличением в них доли лактококков (табл. 2). Количество клеток молочнокислых бактерий для всех вариантов исследованных соотношений культур в ассоциации составляло около 10⁸ КОЕ/мл, в то же время наибольшее количество пропионовокислых бактерий в конце ферментации было отмечено для соотношения штаммов L. cremoris СR201: L. rhamnosus Ф: P. shermanii Э2 1 : 1 : 6 и 2 : 1 : 6 (табл. 1, 2).

Рис. 3. Определение биосовместимости культур Lactobacillus rhamnosus Ф (Lrh) с Propionibacterium shermanii Э2 (Pr) (а) и L. rhamnosus Ф (Lrh), P. shermanii Э2 (Pr) с Lactococcus cremoris СR201 (Lcr) (б) капельным методом.

Внесение 20–30% белкового гидролизата в молочную основу увеличивало количество клеток P. shermanii Э2 в готовом продукте в 10 раз (2–4 × 10⁸ КОЕ/мл), по сравнению с образцом, приготовленном на стерилизованном обезжиренном молоке (1 × 10⁷ КОЕ/мл) (табл. 2). Содержание молочнокислых бактерий было приблизительно на одном уровне – 2.5 × 10⁸  КОЕ/мл при всех исследованных соотношениях культур. Продолжительность сквашивания до достижения значения рН 4.8 составила 9–10 ч при концентрации инокулята 5–10%.

Органолептическая оценка образцов кисломолочных напитков показала, что наилучшими вкусовыми качествами и консистенцией (вязкость и гомогенность сгустка) обладал кисломолочный продукт, полученный при использовании соотношения штаммов в ассоциации L. cremoris СR201: L. rhamnosus Ф : P. shermanii Э2 2 : 1 : 6 (табл. 1).

Действительно, культивирование пропионовокислых бактерий (ПКБ) в присутствии молочнокислых (МКБ) является классическим примером комменсализма в смешанных культурах [27]. Так, с одной стороны, в результате сбраживания лактозы молочнокислыми бактериями образуется молочная кислота, которая является предпочтительным источником углерода для роста пропионовокислых бактерий и синтеза ими пропионовой и уксусной кислот.

Таблица 1. Характеристики заквасок и готовых продуктов на их основе

Соотношение штаммов в закваске, об./об.			Активная кислотность в процессе сквашивания, рН*			Количество клеток, КОЕ/мл						Органо-лепти-ческая оценка, балл
						молочнокислые бактерии			пропионовокислые бактерии
L. cremoris СR201	L. rhamno-sus Ф	P. sher-manii Э2	0 ч	8 ч	12 ч	0 ч	8 ч	10 ч	0 ч	8 ч	10 ч
1	1	2	6.17	4.90	4.75	6×106	2.6×108	7×108	1.7×106	3×107	7 × 107	3
1	1	4	6.17	4.92	4.74	5×106	2.4×108	7×108	4×106	2×107	2 ×107	3
1	1	6	6.15	4.93	4.74	2.5×106	1.1×108	4×108	6.4×106	4.2×107	2 ×108	3
2	1	4	6.19	4.79	4.72	6×106	6.8×107	2.5×108	4.2×106	6.4×107	8.4×107	4
2	1	6	6.18	4.78	4.73	2.5×106	6.5×107	1×108	6.0×106	8×107	1.1×108	4

* Содержание гидролизата сывороточных белков молока 30%.

Рис. 4. Схематическое представление доказанных и гипотетических мутуалистических взаимодействий, происходящих между молочнокислыми и пропионовокислыми бактериями во время их совместной ферментации и образования соединений, необходимых для их развития и синтеза функциональных биомолекул.

C другой стороны, в результате работы протеаз МКБ образуются необходимые для роста ПКБ пептиды и свободные аминокислоты (рис. 4). При этом рост МКБ в смешанных культурах с ПКБ стимулировался за счет снижения скорости накопления молочной кислоты и наличия синтезируемых пропионовыми бактериями факторов роста, таких как экзополисахариды, жирные кислоты и др. При этом добавление белково-пептидного гидролизата в молочную основу стимулировало более интенсивный рост ПКБ в смешанной культуре по сравнению с ростом на обезжиренном молоке (табл. 1, 2). По-видимому, наличие пептидов и свободных аминокислот в ростовой среде уже в начале культивирования обеспечивало возможность роста пропионовых бактерий одновременно с МКБ без задержки, связанной с предварительным накоплением в среде ростовых веществ, необходимых ПКБ и образующихся в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий.

2.2. Функциональные свойства кисломолочных продуктов in vitro.

Анализ биологически активных свойств кисломолочных продуктов (КМП) in vitro, полученных с использованием закваски (L. cremoris СR201: L. rhamnosus Ф: P. shermanii Э2 – 2 : 1 : 6) показал, что оба продукта (как на обезжиренном молоке, так и с добавлением 30% гидролизата сывороточных белков обладали высокой антиоксидантной, гипотензивной и антимикробной активностями (табл. 3).

Оба образца КМП показали близкие значения антиоксидантной активности – 260–280 мкМ ТЭ/г белка (табл. 3). Тем не менее, КМП с гидролизатом показал более высокую АПФ-ингибирующую активность IC₅₀ – 1.9 ± 0.2 мг/мл продукта, тогда как на обезжиренном молоке 3.2 ± 0.6. Хорошо известно, что в результате гидролиза белков коровьего молока под действием протеолитических систем заквасочных и пробиотических культур образуется широкий спектр биологически активных пептидов, обладающих антиоксидантной, АПФ-ингибирующей, антимикробной и др. активностями [28–30].

Таблица 2. Изменение рН и количества клеток заквасочных культур в процессе сквашивания кисломолочных продуктов с разным содержанием белково-пептидного гидролизата

Соотношение штаммов в ассоциации, об./об.			Кол-во гидро-лизата, %	Изменение рН		КОЕ/мл
						лактобактерии		P. shermanii
L. cremoris СR201	L. rhamnosus TR	P. shermanii Э2		0 ч	10 ч	0 ч	10 ч	0 ч	10 ч
2 2 2 2	1 1 1 1	6 6 6 6	30 20 10 0	6.19 6.32 6.24 6.25	4.78 4.83 4.86 4.80	5×106 2×106 2.5×106 1×106	1.4×108 2.5×108 2.5×108 2.5×108	6.4×106 6.4×106 6.4×106 6.4×106	4.0×108 2.7×108 6×107 1.4×107

Рис. 5. Антагонистическая активность в отношении E. coli B125 (а, б) и Penicillium brevicompactum (в, г) КМП, полученных сквашиванием обезжиренного молока (а, в) и тоже с добавлением 30% гидролизата сывороточных белков коровьего молока (б, г). (Использована комбинированная закваска на основе штаммов Streptococcus cremoris СR201, Lactobacillus rhamnosus Ф и Propionibacterium shermanii Э2 в соотношении 2 : 1 : 6).

Добавление в молочную основу гидролизата сывороточных белков коровьего молока, в котором ранее нами был идентифицирован ряд антиоксидантных и АПФ-ингибирующих пептидов [20], по-видимому, привело к усилению антигипертензивных свойств кисломолочного продукта, но антиоксидантная активность при этом не увеличивалась, по сравнению с таковой в продукте без гидролизата. Последнее может объясняться тем, что наибольший вклад в антиоксидантную активностью вносят ди- и трипептиды, которые в первую очередь могут быть использованы бактериями в процессе их жизнедеятельности.

КМП с гидролизатом также проявлял более высокую антагонистическую активность по отношению тест-штаммов бактерий S. aureus 2097, E. coli B-125 и возбудителя порчи пищевых продуктов – плесневого гриба P. brevicompactum, по сравнению с образцом, полученным сквашиванием обезжиренного молока (табл. 3, рис. 5), что коррелировало с более высоким содержанием жизнеспособных клеток P. shermanii Э2 в кисломолочном продукте с добавлением белково-пептидного гидролизата. Взаимодействия между МКБ и ПКБ важны для проявления ими антимикробного и фунгицидного действия, определяющего его пробиотические и консервирующие эффекты, которые, как известно, значительно возрастают в смешанных культурах (комбинированных заквасках). Это связано с усилением синтеза антимикробных соединений, таких как молочная, пропионовая и уксусная кислоты, пероксид водорода, диацетил и некоторые другие низкомолекулярные метаболиты, в том числе бактериоцины [27, 31–33]. Так было показано, что фунгицидная активность 33 штаммов МКБ связана в первую очередь с продукцией таких органических кислот, как молочная, уксусная и фенилмолочная кислоты [34].

Таблица 3. Антиоксидантная, гипотензивная и антимикробная активности кисломолочных продуктов, полученных с использованием комбинированной закваски (Streptococcus cremoris СR201, Lactobacillus rhamnosus Ф и Propionibacterium shermanii Э2 в соотношении 2 : 1 : 6)

Показатель	Напиток кисломолочный на пастеризованном обезжиренном молоке*	Напиток кисломолочный на пастеризованном молоке с белково-пептидным гидролизатом, 30%*
Содержание молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов, КОЕ/мл**
P. shermanii	(1.5–3) × 107	(4–6) × 108
L. rhamnosus	(4–6) × 108	(3–3.5) × 108
L. cremoris	(5–7) × 108	(7–8) × 108
АОЕ, мкМ ТЭ/г белка	267 ± 11	276 ± 14
АПФ-ингибирующая активность (IC50), мг/мл	3.2 ± 0.6	1.9 ± 0.2
Антагонистическая активность (зона угнетения роста тест-культур на агаризованной среде, мм)
S. aureus 2097	13.3–14.5	16.3–17.3
E. coli B125	26.0–27.0	28.7–31.5
P. brevicompactum	20–21	24.0–25.5

Таблица 4. Динамика артериального давления (АД) и концентрация компонентов ренин-ангиотензиновой системы в сыворотке крови крыс линии SHR

Группа, №	Систолическое АД, мм рт. ст.			Диастолическое АД, мм рт. ст.			Ангиотензин I, пг/мл	Ангиотензин II, пг/мл
	0 сут.	25 сут.	ΔР	0 сут.	25 сут.	ΔР	25 сут	25 сут
1. Вода (интактный контроль)	166±15	200±19	+34	90±11	127±17	+37	4.47±0.21	2.94±0.28
2. Контрольный КМП*(обезжиренное молоко)	171±14	165±13	–6	106±12	106±10	0	4.96±0.30	2.59±0.23
3. Опытный КМП (с 30% гидролизата)	170±13	154±12	–16	108±7	97±8	–11	5.23±0.17	2.36±0.33

* КМП – кисломолочный продукт на основе штаммов L. rhamnosus Ф, S. cremoris СR201 и P. shermanii Э2 в соотношении 2 : 1 : 6.

Анализ содержания молочной, уксусной и пропионовой кислот (353, 2321, 1188 мкг/мл соответственно) в КМП показал, что концентрация первых двух в образце продукта с добавлением белково-пептидного гидролизата выше в 6 и 2 раза соответственно, по сравнению с приготовленным на обезжиренном молоке (56, 1020, 1746 мкг/мл соответственно). В то же время содержание пропионовой кислоты в КМП с гидролизатом, наоборот, меньше.

2.3. Функциональные свойства кисломолочных продуктов in vivo.

На следующем этапе были исследованы функциональные свойства (гипотензивные и бифидогенные) двух образцов кисломолочных продуктов, полученных на обезжиренном молоке (контроль) и с добавлением 30% гидролизата сывороточных белков (опыт в моделях in vivo).

Оценка гипотензивных свойств КМП на основе комбинированной закваски проводилась на модели с использованием крыс с устойчиво высоким уровнем артериального давления (линия SHR). Среднее систолическое давление у крыс на момент начала эксперимента составляло 176 ± 12 мм рт. ст. (табл. 4). Показано статистически значимое снижение среднего систолического давления при внутрижелудочном введении образцов КМП. Гипотензивный эффект на 25 день эксперимента для опытного образца КМП составил ΔP = 16 мм рт. ст., в то время как для контрольного образца (на обезжиренном молоке) всего лишь Δ P = 6 мм рт. ст. (табл. 4).

Для выяснения механизмов гипотензивного действия продуктов в сыворотке крови животных были измерены концентрации основных компонентов ренин-ангиотензиновой системы: ангиотензинов I и II (рис. 6). Концентрация ангиотензина I в крови животных, получавших опытный образец КМП (группа № 3), составляла 5.0–5.3 пг/мл и была несколько выше, по сравнению с животными группы № 2, получавшими КМП на обезжиренном молоке, у которых концентрация ангиотензина I в крови составляла 4.9–5.0 пг/мл (табл. 4). В то же время концентрация ангиотензина II в крови опытных животных, получавших продукты, была ниже, по сравнению с группой интактного контроля (группа № 1) – 2.9–3.0 пг/мл, причем в группе, получавших КМП с гидролизатами, данный эффект был несколько более выражен (2.36 пг/мл), по сравнению с группой, получавшей КМП на обезжиренном молоке (2.6 пг/мл) (табл. 4). Полученные результаты по изменению уровней ангиотензинов I и II в сыворотке крови животных группы № 2 коррелировали с результатами снижения давления у этой группы. Когда уровень ангиотензина II снижался вследствие ингибирования действия АПФ, повышается уровень антиотензина I (рис. 6).

Рис. 6. Схематическое изображение функционирования и взаимодействия компонентов ренин-ангиотензиновой системы (АПФ – ангиотензин-1-превращающий фермент) [37]. Ренин регулирует начальный, лимитирующий скорость работы этап ренин-ангиотензиновой системы путем отщепления N-концевого сегмента ангиотензиногена, в результате чего образуется биологически инертный декапептид – ангиотензин 1 (Ang 1). Неактивный декапептид Ang 1 гидролизуется АПФ с отщеплением С-концевого дипептида с образованием биологически активного октапептида ангиотензина 2 (Ang 2) – мощного вазоконстриктора. Ферментативная активность АПФ приводит к повышению вазоконстрикции (сужению кровеносных сосудов, особенно артерий и как следствие повышению артериального давления) и снижению вазодилятации.

Таким образом, в основе механизма антигипертензивного эффекта кисломолочных продуктов in vivo, по всей видимости, лежит ингибирование АПФ, при этом оба продукта обладали АПФ-ингибирующей активностью in vitro (табл. 3). Показанный нами гипотензивный эффект для КМП согласовывался с данными литературы. Так, при тестировании КМП, заквашенных различными культурами молочнокислых бактерий, было показано снижение систолического давления у крыс линии SHR в диапазоне значений 6–20 мм рт. ст. [35–37].

На модели индуцированного антибиотиком дисбиоза у самцов крыс линии Wistar исследованы бифидогенные свойства КМП. Показано, что по сравнению с интактным контролем при внутрижелудочном введении антибиотика Байтрил в ЖКТ происходят изменения, свидетельствующие о развитии умеренного дисбактериоза. Прежде всего, это относится к составу микрофлоры кишечника. В толстом кишечнике у животных группы № 2 (отрицательный контроль) статистически достоверно (p < 0.01) снижался уровень лактобацилл в 2.2 раза, бифидобактерий – в 9 раз (табл. 5), по сравнению с интактным контролем. В опытной группе животных № 4, в которой на фоне приема АБ крысам ежедневно вводили внутрижелудочно опытный образец КМП с добавлением гидролизата, выявлены позитивные изменения в составе “полезной” (пробиотической) флоры (табл. 5).

Таблица 5. Содержание лактобактерий и бифидобактерий при внутрижелудочном введении кисломолочных продуктов крысам Wistar на фоне антибиотик-индуцированного дисбиоза

Группа	Количество бифидобактерий, КОЕ/г фекас	Количество лактобактерий, КОЕ/г фекас
№ 1 Интактный контроль	9.0 × 108	8.8 × 108
№ 2 Отрицательный контроль (АБ* + вода)	1.5 × 108	4.0 × 108
№ 3 Контрольный продукт (АБ + КМП** на обезжиренном молоке)	1.5 × 108	4.2 × 108
№ 4 Опытный продукт (АБ + КМП с 30% гидролизата)	4.0 × 108	5.8 × 108

Показано статистически достоверное нарастание количества кишечных лактобацилл Lactobacillus и бифидобактерий (примерно в 1.5 и 3 раза соответственно, p < 0.05) в фекальных массах животных, которым на фоне приема антибиотика вводили опытный КМП (содержащий 30% гидролизата) (табл. 5). В то время как для контрольного образца КМП (на обезжиренном молоке) эффект отсутствовал. При этом бифидогенная активность КМП с гидролизатом коррелировала с повышенным содержанием в нем ПКБ по сравнению с продуктом на молоке (табл. 4). Известно, что пропионовокислые бактерии обладают бифидогенным действием, при этом синтезируемая ими пропионовая кислота оказывает стимулирующее влияние на метаболическую активность бифидобактерий, в частности Bifidobacterium longum [38]. Однако содержание пропионовой кислоты в КМП с гидролизатом меньше, чем в продукте на молоке (1188 и 1746 мкг/мл соответственно).

Необходимо отметить, что не только продукция пропионовой кислоты может отвечать за бифидогенный эффект ПКБ. Так, например было показано, что P. freudenreichii является продуцентом ростовых бифидогенных стимуляторов, таких как 2-амино-3-карбокси-1,4-нафтохинон (ACNQ) и 1,4-дигидрокси-2-нафтойная кислота (DHNA) [39]. Также было показано, что при транзите через ЖКТ наличие жизнеспособных клеток пропионобактерий усиливало рост и развитие местной бифидофлоры кишечника, при этом тестируемое содержание ПКБ в каловых массах составляло порядка 10⁹ КОЕ.

При проведении исследований использовалось оборудование Центра коллективного пользования “Промышленные биотехнологии” Федерального государственного учреждения “Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук". Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 16-16-00094).

• Литература

Дополнительная информация

• Разработка высококачественных многовидовых пробиотических рецептур
• Ферментированные продукты, здоровье и микробиом кишечника
• Производство и поставка пробиотиков. Обзор практики
• Выживаемость пробиотических бактерий при различных видах консервирования
• Микробная ферментация (культивирование микроорганизмов)
• Технологии иммобилизации в производстве пробиотических продуктов питания
• Замороженная концентрированная закваска на основе симбиоза пробиотических бактерий
• Бакконцентраты для продуктов гетероферментативного брожения
• Способ получения бакконцентрата консорциума пробиотических
• Использование комбинированной закваски бифидо- и пропионовокислых бактерий (практика)

Литература

Литература к части 1

Литература к части 2

Smid EJ, Hugenholtz J: Functional genomics for food fermentation processes. Annu Rev Food Sci Technol 2010, 1:497-519. Ja¨ gerstad M, Piironen V, Walker C, Ros G, Carnovale E, Holasova M, Nau H: Increasing natural food folates through bioprocessing and biotechnology. Trends Food Sci Technol 2005, 16:298-306. LeBlanc JG, Rutten G, Bruinenberg P, Sesma F, de Giori GS, Smid EJ: A novel dairy product fermented with Propionibacterium freudenreichii improves the riboflavin status of deficient rats. Nutrition 2006, 22:645-651. Bartkiene E, Juodeikiene G, Vidmantiene D, Viskelis P, Urbonaviciene D: Nutritional and quality aspects of wheat sourdough bread using L. luteus and L. angustifolius flours fermented by Pedioccocus acidilactici. Int J Food Sci Technol 2011, 46:1724-1733. Moroni AV, Dal Bello F, Arendt EK: Sourdough in gluten-free bread-making: an ancient technology to solve a novel issue? Food Microbiol 2009, 26:676-684. Brenner K, You L, Arnold FH: Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology. Trends Biotechnol 2008, 26:483-489. Keller L, Surette MG: Communication in bacteria: an ecological and evolutionary perspective. Nat Rev Microbiol 2006, 4:249-258. Ayad EH, Verheul A, Engels WJ, Wouters JT, Smit G: Enhanced flavour formation by combination of selected lactococci from industrial and artisanal origin with focus on completion of a metabolic pathway. J Appl Microbiol 2001, 90:59-67. Wouters JTM, Ayad EHE, Hugenholtz J, Smit G: Microbes from raw milk for fermented dairy products. Int Dairy J 2002, 12:91-109. Rodriguez-Valera F, Martin-Cuadrado A-B, Rodriguez-Brito B, Pasic L, Thingstad TF, Rohwer F, Mira A: Explaining microbial population genomics through phage predation. Nat Rev Microbiol 2009, 7:828-836. Van Hijum SAFT, Vaughan EE, Vogel RF: Application of state-of- art sequencing  technologies to indigenous food fermentations. Curr Opinion Biotechnol 2013, 24:178-186. Roh SW, Kim K-H, Nam Y-D, Chang H-W, Park E-J, Bae J-W: Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing. ISME J 2010, 4:1-16. Hugenholtz J: Population dynamics of mixed starter cultures. Neth Milk Dairy J 1986, 40:129-140. Boucher DH, James S, Keeler KH: The ecology of mutualism. Ann Rev Ecol Syst 1982, 13:315-347. Sieuwerts S, de Bok FA, Hugenholtz J, van Hylckama Vlieg JE: Unraveling microbial interactions in food fermentations: from classical to genomics approaches. Appl Environ Microbiol 2008, 74:4997-5007. Hugenholtz J, Splint R, Konings WN, Veldkamp H: Selection of protease-positive and protease-negative variants of Streptococcus cremoris. Appl Environ Microbiol 1987, 53:309-314. Leroy F, De Winter T, Moreno MRF, De Vuyst L: The bacteriocin producer Lactobacillus amylovorus DCE 471 is a competitive starter culture for type II sourdough fermentations. J Sci Food Agric 2007, 87:1726-1736. Settanni L, Corsetti A: Application of bacteriocins in vegetable food biopreservation. Int J Food Microbiol 2008, 121:123-138. De Vuyst L, Vrancken G, Ravyts F, Rimaux T, Weckx S: Biodiversity, ecological determinants, and metaboli exploitation of sourdough microbiota. Food Microbiol 2009, 26:666-675. Stolz P, Hammes WP, Vogel RF: Maltose–phosphorylase and hexokinase activity in lactobacilli from traditionally prepared sourdoughs. Adv Food Sci 1996, 18:1-6. Gobbetti M: The sourdough microflora: interactions of lactic acid bacteria and yeasts. Trends Food Sci Technol 1998, 9:267-274. Hammes WP, Stolz P, Ga¨ nzle M: Metabolism of lactobacilli in traditional sourdoughs. Adv Food Sci 1996, 18:176-184. Ng W-L, Bassler BL: Bacterial quorum-sensing network architectures. Annu Rev Genet 2009, 43:197-222. Camilli A, Bassler BL: Bacterial small-molecule signaling pathways. Science 2006, 311:1113-1116. Sturme MHJ, Kleerebezem M, Nakayama J, Akkermans ADL, Vaughan EE, de Vos WM: Cell to cell communication by autoinducing peptides in gram-positive bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 2002, 81:233-243. Hosni T, Moretti C, Devescovi G, Suarez-Moreno ZR, Fatmi MB, Guarnaccia C, Pongor S, Onofri A, Buonaurio R, Venturi V: Sharing of quorum-sensing signals and role of interspecies communities in a bacterial plant disease. ISME J 2011, 5:1857-1870. Sieuwerts S, Molenaar D, van Hijum SAFT, Beerthuyzen M, Stevens MJA, Janssen PWM, Ingham CJ, de Bok FAM, de Vos WM, van Hylckama Vlieg JET: Mixed-culture transcriptome analysis reveals the molecular basis of mixed-culture growth in Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus. Appl Environ Microbiol 2010, 76:7775-7784. de Bok FA, Janssen PW, Bayjanov JR, Sieuwerts S, Lommen A, van Hylckama Vlieg JET, Molenaar D: Volatile compound fingerprinting of mixed-culture fermentations. Appl Environ Microbiol 2011, 77:6233-6239. Liu JAP, Moon NJ: Commensalistic interaction between Lactobacillus acidophilus and Propionibacterium shermanii. Appl Environ Microbiol 1982, 44:715-722. Baer A, Ryba I: Influence of casein proteolysis by starter bacteria, rennet and plasmin on the growth of propionibacteria in Swiss-type cheese. Lait 1995, 75:391-400. Perez Chaia A, Strasser de Saad AM, de Ruiz Holgado AP, Oliver G: Short-chain fatty acids modulate growth of lactobacilli in mixed culture fermentations with propionibacteria. Intern J Food Microbiol 1995, 26:365-374. Miescher Schwenninger S, Meile L, Lacroix C: Antifungal Lactic Acid Bacteria and Propionibacteria for Food Biopreservation, Protective Cultures, Antimicrobial Metabolites and Bacteriophages for Food and Beverage Biopreservation. Woodhead Publishing Ltd.; 2011:. 27–62. Dalie DKD, Deschamps AM, Richard-Forget F: Lactic acid bacteria — potential for control of mould growth and mycotoxins: a review. Food Control 2010, 21:370-380. Schnurer J, Magnusson J: Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Trends Food Sci Technol 2005, 16:70-78. Tu°ma S, Vogensen FK, Plockova´ M, Chumchalova´ J: Isolation of antifungally active lactobacilli from Edam cheese. Acta Alimentaria 2007, 36:405-414. Miescher Schwenninger S, Lacroix C, Truttmann S, Jans C, Bommer D, Sporndli C, Bigler L, Meile L: Characterization of lowmolecular weight antiyeast metabolites produced by a foodprotective Lactobacillus/Propionibacterium co-culture. J Food Prot 2008, 71:2481-2487. Hugenschmidt S, Miescher Schwenninger S, Gnehm N, Lacroix C: Screening of a natural biodiversity of lactic and propionic acid bacteria for folate and vitamin B12 production in supplemented whey permeate. Int Dairy J 2010, 20:852-857. Hugenschmidt S, Miescher Schwenninger S, Lacroix C: Concurrent high production of natural folate and vitamin B12 using a co-culture process with Lactobacillus plantarum SM39 and Propionibacterium freudenreichii DF13. Process Biochem 2011, 46:1063-1070. Santos F, Wegkamp A, de Vos WM, Smid EJ, Hugenholtz J: Highlevel folate production in fermented foods by the B-12 producer Lactobacillus reuteri JCM1112. Appl Environ Microbiol 2008, 74:3291-3294. Grattepanche F, Miescher-Schwenninger S, Meile L, Lacroix C: Recent developments in cheese cultures with protective and probiotic functionalities. Dairy Sci Technol 2008, 88:421-444. Powell IB, Broome MC, Limsowtin GKY: Cheese Starter Cultures: General Aspects. Encyclopedia of Dairy Sciences. Academic Press; 2011:. 552–558. Bockelmann W: Smear-ripened cheeses. Encyclopedia of Dairy Sciences. Academic Press; 2011:. 753–766. Goerges S, Mounier J, Rea MC, Gelsomino R, Heise V, Beduhn R, Cogan TM, Vancanneyt M, Scherer S: Commercial ripening starter microorganisms inoculated into cheese milk do not successfully establish themselves in the resident microbial ripening consortia of a South German red smear cheese. Appl Environ Microbiol 2008, 74:2210-2217. Lacroix C, Yildirim S: Fermentation technologies for the production of probiotics with high viability and functionality. Curr Opin Biotechnol 2007, 18:176-183. Doleyres Y, Fliss I, Lacroix C: Continuous production of mixed lactic starters containing probiotics using immobilized cell technology. Biotechnol Prog 2004, 20:145-150. Grattepanche F, Lacroix C: Production of high-quality probiotics using novel fermentation and stabilization technologies. Biotechnology in Functional Foods and Nutraceuticals. CRC Press; 2010:. 361–388. Doleyres Y, Fliss I, Lacroix C: Increased stress tolerance of Bifidobacterium longum and Lactococcus lactis produced during continuous mixed-strain immobilized-cell fermentation. J Appl Microbiol 2004, 97:527-539. Payne AN, Zihler A, Chassard C, Lacroix C: Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends Biotechnol 2012, 30:17-25. Payne A, Chassard C, Banz Y, Lacroix C: The composition and metabolic activity of child gut microbiota demonstrate differential adaptation to varied nutrient loads in an in vitro model of colonic fermentation. FEMS Microbiol Ecol 2012, 80:608-623.

Kerry R.G., Patra J.K., Gouda S., Park Y., Shin H.-S., Das G. // J. Food Drug Anal. 2018. V. 26. № 3. P. 927–939. Foster J.A., Rinaman L., Cryan J.F. // Neurobiol. Stress. 2017. V. 7. P. 124–136. Tang W.H.W., Kitai T., Hazen S.L. // Circ. Res. 2017. V. 120. № 7. P. 1183–1196. Sánchez B., Delgado S., Blanco-Míguez A., Lourenço A., Gueimonde M., Margolles A. // Mol. Nutr. Food Res. 2017. V. 61. № 1. P. 1600240. Zoumpopoulou G., Pot B., Tsakalidou E., Papadimitriou K. // Int. Dairy J. 2017. V. 67. P. 46–60. Leroy F., Vuyst L. De // Trends Food Sci. Technol. 2004. V. 15. № 2. P. 67–78. Tamang J.P., Shin D.-H., Jung S.-J., Chae S.-W. // Front. Microbiol. 2016. V. 7. P. 578. Marco M.L., Heeney D., Binda S., Cifelli C.J., Cotter P.D., Foligné B., Gänzle M., Kort R., Pasin G., Pihlanto A., Smid E.J., Hutkins R. // Curr. Opin. Biotechnol. 2017. V. 44. P. 94–102. Macori G., Cotter P.D. // Curr. Opin. Biotechnol. 2018. V. 49. P. 172–178. Cousin F.J., Mater D.D.G., Foligné B., Jan G. // Dairy Sci. Technol. 2011. V. 91. № 1. P. 1–26. Saarela M., Mogensen G., Fondén R., Mättö J., Mattila-Sandholm T. // J. Biotechnol. 2000. V. 84. № 3. P. 197–215. Vorobjeva L.I., Khodjaev E.Y.U., Vorobjeva N.V. // Microb. Ecol. Health Dis. Taylor & Francis, 2008. V. 20. № 2. P. 109–112. Ekinci F.Y., Gurel M. // J. Dairy Sci. 2008. V. 91. № 3. P. 892–899. Aguilar-Toalá J.E., Garcia-Varela R., Garcia H.S., Mata-Haro V., González-Córdova A.F., Vallejo-Cordoba B., Hernández-Mendoza A. // Trends Food Sci. Technol. 2018. V. 75. P. 105–114. Фёдорова Т.В., Васина Д.В., Бегунова А.В., Рожкова И.В., Раскошная Т.А., Габриэлян Н.И. // Прикл. биохимия и микробиология. 2018. Т. 54. № 3. С. 264–276. Coman M.M., Verdenelli M.C., Cecchini C., Silvi S., Orpianesi C., Boyko N., Cresci A. // J. Appl. Microbiol. 2014. V. 117. № 2. P. 518–527. Глушанова Н.А., Блинов А.И., Бахаев В.В. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004. № 6. С. 37–39. 18. Thierry A., Madec M.N. // Lait. 1995. V. 75. № 4–5. P. 315–323. Tharmaraj N., Shah N.P. // J. Dairy Sci. 2003. V. 86. № 7. P. 2288–2296. Торкова А.А., Рязанцева К.А., Агаркова Е.Ю., Кручи- нин А.Г., Центалович М.Ю., Фёдорова Т.В. // Прикл. биохимия и микробиология. 2017. Т. 53. №  6.  С. 580–591. Conceição-Vertamatti A.G., Borghi F., Canova F., Grassi-Kassisse D.M. // Vasa. 2017. V. 46. № 6. P. 431–439. Самохина Л.С., Комолова Г.С., Ганина В.И., Ионова И.И., Семенов Г.В. // Известия ВУЗОВ. Пищевая техно- логия. 2012. № 5–6. С. 17–20. Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Бегунова А.В., Федорова Т.В., Ширшова Т.И. // Вопросы питания. 2018. Т. 87. № 5. С. 52–62. Rabah H., do Carmo F.L., Jan G. // Microorganisms. 2017. V. 5. № 2: 24. Shihata A., Shah N.P. // Int. Dairy J. 2000. V. 10. № 5. P. 401–408. Gagnaire V., Thierry A., Léonil J. // Lait. 2001. V. 81. № 3. P. 339–353. Smid E.J., Lacroix C. // Curr. Opin. Biotechnol. 2013. V. 24. № 2. P. 148–154. Akalın A.S. // Trends Food Sci. Technol. 2014. V. 36. № 2. P. 79–95. Linares D.M., Gómez C., Renes E., Fresno J.M., Tornadijo M.E., Ross R.P., Stanton C. // Front. Microbiol. 2017. V. 8. P. 846. Choi J., Sabikhi L., Hassan A., Anand S. // Int. J. Dairy Technol. 2012. Vol. 65, № 1. P. 1–12. Schwenninger S.M., Lacroix C., Truttmann S., Jans C., Spörndli C., Bigler L., Meile L. // J. Food Prot. 2008. V. 71. № 12. P. 2481–2487. Reis J.A., Paula A.T., Casarotti S.N., Penna A.L.B. // Food Eng. Rev. 2012. V. 4. № 2. P. 124–140. Özcelik S., Kuley E., Özogul F. // LWT. 2016. V. 73. P. 536–542. Gerez C.L., Carbajo M.S., Rollán G., Torres Leal G., Font de Valdez G. // J. Food Sci. 2010. V. 75. № 6.  P. M354–M359. Rodríguez-Figueroa J.C., González-Córdova A.F., Astiazaran-García H., Hernández-Mendoza A., Vallejo-Cordoba B. // J. Dairy Sci. 2013. V. 96. № 7. P. 4094–4099. Beltrán-Barrientos L.M., Hernández-Mendoza A., Torres-Llanez M.J., González-Córdova A.F., Vallejo-Córdoba B. // J. Dairy Sci. 2016. V. 99. № 6. P. 4099–4110. Ricci I., Artacho R., Olalla M. // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2010. V. 50. № 5. P. 390–402. Roland N., Bouglé D., Lebeurrier F., Arhan P., Maubois J.-L. // Int. Dairy J. 1998. V. 8. P. 587–588. Isawa K., Hojo K., Yoda N., Kamiyama T., Makino S., Saito M., Sugano H., Mizoguchi C., Kurama S., Shibasaki M., Endo N., Sato Y. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. № 3. P. 679–681.