Главная \ 6. Микробная биотехнология \ Микробиологический синтез витамина В12

Микробиологический синтез витамина В12

СИНТЕЗ ВИТАМИНА В12 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ PROPIONIBACTERIUM

микробиологический синтез витамина В12

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Получение витамина В12


Из всех витаминов, методом микробиологического синтеза производят в основном витамин В12 и его коферментную форму. Продуцентами в этом процессе служат пропионовокислые бактерии. Для получения кормовых концентратов, содержащих витамин В12, на отходах бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) применяют комплекс метанообразующих бактерий.


Физиология прокариот (бактерий) - центральное направление микробиологии, формирующее целостное представление о жизнедеятельности организма. Изучение физиолого-биохимических свойств практически значимых микроорганизмов актуально в плане решения общечеловеческой задачи - улучшения качества жизни. Пропионовокислые бактерии (ПКБ) имеют разнообразное практическое применение. Достаточно напомнить, что Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii - основная и незаменимая культура, используемая в мировом производстве «твёрдых» сыров, а в России - и в производстве витамина B12, однако области применения ПКБ этим не ограничены. Поэтому биология ПКБ находится под постоянным «прицелом» специалистов разных профилей. Регулярно проводится международный тематический симпозиум "Propionibacteria". В различных исследованиях значительное внимание уделено роли кобальта и кобаламина (истинного витамина В12) в биосинтезе корриноидов - соединений группы витамина В12. Также сегодня весьма актуально и изучение значения ионов кобальта и корриноидов для жизнедеятельности самих пропионовокислых бактерий...

Молекулярная структура кобаламинов (витамина В12)

Витамин B12 - первое органометаллическое соединение, выделенное из биологической системы. Из неполимерных органических соединений имеет наиболее сложное строение, изображенное на рисунке. Молекула состоит из двух почти планарных циклических структур и линейного участка. Металл Со+3 связан с макроциклом, сильно напоминающим порфириновое ядро гема. Это тетрапиррольная структура, но имеющая ту особенность, что вместо метановых мостиков, связывающих 4 пиррольных кольца, кольца А и D непосредственно связаны. Вторая кольцевая структура - азотистое основание - 5,6-диметилбензимидазол (5,6 ДМБ}. 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой системой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ Na-гликозидной связью.Структура витамина В12 не только очень сложная, но содержит некоторые необычные части: 1) корриновая структура ранее не была известна в органической химии (до открытия витамина В12 в 1948 г. независимо Риксом и Смитом); 2) Na-гликозидная связь встречается в природе очень редко и обнаружена лишь в нескольких соединениях, содержащих рибозо-3-фосфат; 3) 5,6 ДМБ тоже принадлежит к уникальным соединениям и встречается в природе только в составе кобаламинов.Атом кобальта имеет 6 координационных связей; 4 из них заняты пиррольными кольцами. Одна - N-3-5,6 ДМБ и последняя - верхним лигандом (у), природа которого может варьировать. В коммерческом витамине В12 (цианкобаламине) лиганд-CN-группа (артефакт процесса выделения). In vivo чаще всего встречаются дезоксиаденозильная группа (Co-B12-I), метильная группа (метилкобаламии, СН3-B12-CoB-II) или оксогруппа (оксокобаламин). Кроме этих соединений, известных как кобаламины, есть другие корриноидные соединения с иным нуклеотид-аным основанием. Нижний лиганд (х) -5,6 ДМБ может быть заменен на аденин {псевдовитамин В12), на гуанин (фактор С), 2-метиладенин (фактор А) и др. Они могут проявлять активность для некоторых микроорганизмов, но неактивны для людей. Из всех витамин В12-подобных соединений только Со-В12-I и Со-В12-II (СНз12) активны на клеточном уровне и как кофакторы вовлекаются в катализ двух типов реакций. Аденозил B12 используется в реакциях, в которых имеет место перестройка углерод-углеродных связей. Метил В12 вовлекается в реакциях переноса метильных групп, например в синтезе метионина из гомоцистеина (Воробьева, 1982).

структура кобаламинов

Продуценты витамина B12.

В природе витамин В12 и родственные корриноидные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В12 в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В12 представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0—8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii M.- 82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. В семействе Propionibacteriaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витаминами В12 в клетках. Это, прежде всего, Eubacterium limosum (Batyribacterium retteerii). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин В12 в значительных количествах синтезирует Nocardia rugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В12. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. purpureae, M. echinospora, M. halophitica, M. fusca, M. chalceae.

Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечено ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена. Корриноиды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. У Clostridium tetanomorphum и Cl. Sticklandii аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образуют витамин В12 ацетогенные клостридии Cl. thermoaceticum, Cl. formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО2. Известны активные продуценты витамина B12 у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans MB-2436 - мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Корриноиды синтезируют Rhodopseudomonas, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphericus , Rh. Capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Chromatium vinosum и ряд других видов. Наряду с витамином В12 они образуют бескобальтовые корриноиды, роль которых для продуцентов не установлена. Значительные количества витамина В12 образует цианобактерия Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus. Продуценты витамина B12 культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья.

Получение и применение витамина В12

Мировая продукция витамина В12 составляет 9 - 11 тыс. кг в год; из них 6,5 тыс кг используют на медицинские цели, а остальное - для животноводства. Производство витамина В12 основано главным образом на культивировании пропионовокислых бактерий (Великобритании, Венгрии), мезофильных и термофильных меганогенных бактерий (Венгрия), а также актиномицетов и родственных форм (Италия).

В СНГ в качестве продуцента витамина В12 используют пропионовокислые бактерии P. shermanii. Для получения витамина B12 бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, который непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч. в среду вносят предшественник - 5,6-ДМБ (5,6-диметилбензимидазол). Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В12 (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин B12 сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 - 5,0 при 85 - 90°С в течение 60 мин. с добавлением в качестве стабилизатора 0,25 % NaNO2.

Водный раствор витамина В12 охлаждают, доводят рН до 6,8-7,0 50%-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Al2(SO4)3* 18Н2О и безводный FeCl3 для коагуляции белков и фильтруют через фильтр - пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с Аl2О3, с окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают 24 - 48 ч. при 3 - 4°С. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над Р2О5. Для предотвращения разложения В12 все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом.

цианокобаламин

Промышленность выпускает различные формы лечебных препаратов кобаламинов: ампулы со стерильным раствором CN – B12, приготовленного на 0,9 % растворе NaCl, таблетки CN - В12 и в смеси с фолиевой кислотой, таблетки, (муковита), содержащие CN - B12 и мукопротеид. Лечебные препараты в ампулах: камполон, антианемин и гепавит содержат водный экстракт печени крупного рогатого скота. Перспективны исследования по мутагенезу пропионовокислых бактерий как один из способов повышения продуктивности штамма, а также проверки и внедрения в производственные условия других продуцентов, растущих на дешевом непищевом сырье.


Допополнительная информация по технологиям получения витамина В12 из Propionibacterium

цианокобаламин

Общая технология получения витамина В12 из пропионовокислых бактерий по сути везде одна и та же: наращивание микробной массы, концентрирование клеток, выделение целевого продукта (эндометаболита) и его очистка. Однако практические подходы к культивированию ПКБ, очистке витамина и т.п. могут отличаться. Приведем еще несколько примеров из литературы:

1) Описание получения витамина В12 из книги М.Е. Бекера "Введение в биотехнологию" - 1974 г. (перевод 1978 г)

Прим.: Для синтеза молекулы витамина В12 в питательной среде должен быть кобальт, а также 5,6-диметилбензимидазол, которые некоторые микроорганизмы синтезируют сами.

Для получения медицинского препарата витамина В12 широко используют P. freudenreichii или P. shermanii, их выращивают по методу глубинной ферментации, на среде, содержащей 1% гидролизата казеина, 1% пептона, 1,25% лактата натрия, 0,3% дрожжевого экстракта, соли кобальта и 5,6-диметилбензимидазол. В анаэробных условиях ферментация культуры Propionibacterium длится 72 часа при температуре 28-30 °C.

За это время в культуральной жидкости накапливается 3000 – 10000 мкг/л витамина В12 (см. рис.).

Образование биомассы культуры Propionibacterium shermanii

Рис.1. Образование биомассы культуры Propionibacterium shermanii: X –биомасса (г/л); P – витамин В12 (мг/л), t – продолжительность ферментации (ч)

Биосинтез витамина В12 может идти и при аэробных условиях, используя актиномицеты, например Actinomyces olivaceus. В этом случае среду готовят из кукурузного экстракта или барды спиртовой промышленности, rидроля, крахмала, глюкозы, сульфата аммония и солей кобальта. Образование активной формы витамина и в этом случае стимулируют добавки 5,6-диметилбензимидазола.

Для получения кристаллов витамина В12 культуральную жидкость центрифугируют и выделяют содержащую витамин клеточную массу. Затем ее гидролизуют и очищают полученный раствор витамина. Очистку витамина В12 из водных растворов можно провести, обрабатывая раствор:

  1. бензиловым спиртом, добавляя к экстракту хлороформ и экстрагируя витамин водой;
  2. гидроокисью цинка;
  3. смесью крезола и тетрахлоруглерода (1 : 1);
  4. хроматографически, пропуская через колонку с Аl2O3 и элюируя витамин 50% смесью вода-ацетон.

Очищенный раствор витамина кристаллизуют. Получают темно-фиолетовые кристаллы витамина В12 с 75-76%-ной степенью чистоты. Выход витамина составляет 67-70%.

Себестоимость витамина, полученного в процессе стерильной ферментации, сравнительно высока, поэтому для нужд животноводства его получают по более простому методу метанового брожения, используя в качестве сырья отходы пищевой промышленности.

2) Описание получения витамина В12 из курса лекций по технологии микробного синтеза (Минск : БГТУ, 2014)

Витамин В12 для медицинских целей можно получать культивированием бактерий Propionibacterium shermanii периодическим методом при температуре 28…30°С в анаэробных условиях с соблюдением правил асептики на питательной среде, содержащей глюкозу (40 г/л), кукурузный экстракт (40 г/л), сульфат аммония (2 г/л) и хлорид кобальта (0,005 г/л); рН среды 6,8–7,0. Ферментация протекает в две фазы. В первой фазе продолжительностью 65–70 ч бактерии интенсивно размножаются с накоплением пропионовой и уксусной кислот, подлежащих нейтрализации, и предшественника витамина В12 – фактора В (без нижнего лиганда). На долю фактора В приходится более 80% от всех синтезированных корриноидов (остальное – цианкобаламин (8–10%), псевдовитамин В12 и фактор А).

Вторая фаза ферментации начинается с момента внесения в среду 5,6-ДМБ (5,6-диметилбензимидазол) в количестве 10–20 г/м3, в результате чего происходит трансформация неактивных аналогов в истинный витамин В12. Продолжительность второй фазы 24 ч. К концу процесса культуральная жидкость содержит около 30 мг/л витамина В12, накопленного в клетках бактерий.

Биомассу отделяют сепарацией и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5–5,0, при температуре 85…90°С в течение часа. После отделения остатка биомассы раствор охлаждают, доводят рН до 6,8–7,0 и осаждают белки коагуляцией в присутствии Al2(SO4)3 или FeCl3. Осадок отделяют фильтрованием, а раствор витамина очищают на ионообменной смоле СГ-1, с которой витамин В12 элюируют водным раствором аммиака. Элюат упаривают и дополнительно очищают на колонке с окисью алюминия (очистка кобаламинов от аналогов). Элюируют витамин В12 водным ацетоном и кристаллизуют из раствора при температуре 3…4°С в течение 24–48 ч. Кристаллы промывают ацетоном, затем диэтиловым эфиром и сушат под вакуумом.

3) Описание получения витамина В12 из учебно-методических пособий профильных ВУЗов

В настоящее время для получения витамина В12 используют следующие микроорганизмы P. freudenreichii ATCC 6207, P. shermanii ATCC 13673, P. shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1 стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирования и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезируют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную мелассу (10 - 100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10 - 100 мг/л), источники азота. В среду добавляют кукурузный экстракт (30 - 70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии культивируют при 30°С, поддерживая рН на уровне 6,5-7,0 путем введения (NH4)OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возможны некоторые вариации в культивировании. Витамин В12 сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:

  1. выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;
  2. выделение неочищенного продукта (80% чистоты), который можно использовать в животноводстве;
  3. дальнейшую очистку до уровня 91-98% (для медицинских целей).

Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80°-120° в течение 10-30 мин при рН 6,1-8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутствии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, Аl2О3, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом, или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом. При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0 - 8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii М-82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода - 216 мг/л.

Дополнительную информацию о 2-стадийном процессе получение витамина В12 на основе пропионовокислых бактерий, способных к самостоятельному синтезу аденозилкобаламина 5,6 ДМБ (коэнзима В12), где в качетсве источника азота применялся (NH4)2SO4 (сульфат аммония) см. по ссылке
***
4) Описание получения витамина В12 (с технологической схемой)
источник: Разговоров, П.Б.. Технология получения биологически активных веществ: учеб. пособие / ИГХТУ, 2010. - 72 с.

Технология получения витамина В12

Витамин В12 получают путем микробиологического синтеза из Propionobacterium, а также Pseudomonas и смешанных структурных бактерий. Основной метод включает использование Propionobacterium. Процесс ведут в реакторе объемом 1 м3 при коэффициенте заполнения 0,65-0,7. Технология получения В12 включает две стадии:

1) перемешивание в реакторе в течение 80-88 ч в анаэробных условиях до полной утилизации сахара, после чего полученную массу центрифугируют;

2) процесс обработки суспензии во втором аппарате, уже при доступе воздуха; расход воздуха составляет 2м3/ч (рис. 6.10). Для питательной среды используют глюкозу, до 10% солей железа, марганца, магния и кобальта (кон­центрация соли колеблется от 10 до 100 мг/л), сульфат аммония. 

Выход кристаллического витамина В12 составляет 40 мг/л.

  Технологическая схема получения витамина В12
Рис. 1. Технологическая схема получения витамина В12

Закваска ПРОПИОНИКСПромышленное получение витамина В12 с помощью молочных пропионовокислых бактерий позволяет полностью удовлетворить потребности медицины. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином В12 используют пропионовокислые бактерии как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке.

Об ультразвуковой модуляции ПКБ, являющейся перспективным направлением для интенсификации промышленного получения витамина В12 см. ниже по ссылке→.


На заметку (о В12 и метанобразующих бактериях)

Для нужд животноводства (где не требуется высокая чистота целевого продукта) витамин В12 получают, используя смешанную культуру, содержащую термофильные метанообразующие бактерии. Однако установлено образование корриноидов не только в смешанной, но и в чистой культуре метанобразующих бактерий Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum при росте в присутствии Н2 и СО2. (прим. редактора: в животноводстве для обеспечения витамином В12 можно использовать и добавки на основе пропионовокислых бактерий. Тому примером может служить гранулированный кормовой препарат "Пропиовит", разработанный еще в 80-х годах XX в при СССР, в котором продуцентом кобаламина являлись ПКБ, выделенные из рубца коровы...).

Содержание корриноидов у метанобразующих бактерий составляет 1,0 - 6,5 мг/г сухой биомассы. С помощью смешанной культуры метанобразующих бактерий разработан метод получения кормового препарата витамина В12 - КМБ12. Субстратом для метанового брожения служит ацетоно-бутиловая и спиртовая барда. Ацетоно-бутиловую барду получают в результате удаления растворителей из культуральной жидкости Clostridium acetobutylicum, сбраживающей паточно-мучные заторы. Для метанового брожения используют декантат барды, содержащий 2,0 - 2,5 % сухих веществ. К декантированной барде добавляют 4 г/м3 СоСlи 0,5 % метанола как стимуляторов синтеза кобаламинов. В качестве биостимуляторов вносят также карбамид и диаммонийфосфат, 5,6-ДМБ не вносят, поскольку CN = B12 и фактор III, обладающие биологической активностью, составляют до 80% от суммы всех корриноидов.

Исходная барда имеет температуру около 100°С и практически стерильна. Перед поступлением в ферментеры барда охлаждается до 55 - 57°С. В качестве исходной культуры используют смешанную культуру метанообразующих бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожение сточных вод. Получение концентрата витамина В12 включает следующие технологические стадии: непрерывное сбраживание барды комплексом бактерий, сгущение метановой бражки и сушку сгущенной массы на распылительной сушилке. Брожение проводят в железобетонных ферментерах непрерывным способом в течение года.

Важное условие нормального процесса брожения - контроль уровня жирных кислот и аммонийного азота. Витамин В12 неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде. Поэтому перед выпариванием к метановой бражке добавляют НСl до оптимального значения рН 5,0 - 5,3 и сульфит (оптимальное содержание 0,07 - 0,1 %). Перед поступлением на установку выпаривания метановая бражка дегазируется путем нагревания до 90 - 95°С при атмосферном давлении. Бражку сгущают до 20% сухих веществ в четырехкорпусных выпарных аппаратах. Сгущенная метановая бражка высушивается на распылительной сушилке.

Сухой концентрат КМБ-12, помимо витамина В12 (100 мг/кг препарата), содержит ряд других ростстимулирующих веществ. Особенно хорошие результаты в животноводстве получают при сочетании витамина В12 с малыми дозами антибиотиков, в частности, с биомицином.

Одну из ранних работ по получению В12 с помощью метанобразующих бактерий см. в источнике: Быховский, В.Я. Биохимические основы получения витамина В12 с помощью метанобразующих бактерий : автореферат дис. ... к.б.н. / В.Я. Быховский .— Москва : Институт биохимии имени А. Н. Баха РАН, 1964


Ультразвуковая модуляция метаболической активности P. freudenreichii subsp. shermanii при получении пищевых продуктов, обогащённых витамином В12

Витамин В12 – одно из важнейших биологически-активных соединений, участвующих во многих процессах в организме человека. В современных условиях жизни часто наблюдается его дефицит, из-за чего необходимо введение в рацион специальных обогащѐнных продуктов. Однако его синтез очень сложен и в настоящее время он является одним из наиболее дорогостоящих витаминов. Статья посвящена модуляции ультразвуком метаболизма основного промышленного продуцента витамина В12 Propionibacterium shermanii с целью повышения эффективности биотехнологического процесса его производства.

Витамин В12 – группа кобальтсодержащих биологически-активных корриноидных соединений, известных как кобаламины. Он также известен как экзогенный (внешний) фактор Кастла, или животный белковый фактор. Витамин В12 осуществляет биокаталитические реакции, обеспечивающие кроветворную функцию организма. Он также способствует нормализации функции печени, благоприятно влияет на регенерацию нервных волокон и активирует созревание форменных элементов крови [2]. Наиболее важными для производства кобаламинами являются цианокобаламин и оксикобаламин благодаря своей стабильности при хранении и высокой биологической активности. Всасывание витамина происходит в тонком кишечнике после взаимодействия в желудке с гастромукопротеином - «внутренним фактором Кастла», который секретируется клетками слизистой оболочки желудка и обеспечивает его абсорбцию. Основным источником витамина являются пищевые продукты животного происхождения, а также микрофлора желудка и кишечника. В организме человека кишечные бактерии также синтезируют витамин В12, но в обычных условиях осуществляют этот синтез в тех областях, где всасывание витамина в кровь не происходит, так как не происходит связывание витамина с внутренним фактором, поэтому основное его количество должно поступать с пищей [2]. В12-гиповитаминоз может возникать при различных обстоятельствах: длительном вегетарианском питании, беременности, хроническом алкоголизме, а также в связи с различными нарушениями его усвоения при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, а относительная алиментарная недостаточность витамина наблюдается практически повсеместно, что может быть исправлено введением в рацион специальных обогащѐнных витамином В12 пищевых продуктов. Однако химический синтез витамина В12 отличается высокой сложностью, и в настоящее время его производят биотехнологическими методами.

Одним из важнейших продуцентов витамина являются пропионовокислые бактерии. Морфологически это неподвижные бесспоровые палочки разной величины, от коккообразных до длинных, располагаются единично, парами или короткими цепочками, способные расти как в анаэробных, так и в аэробных условиях. Они активно сбраживают глюкозу, сахарозу, лактозу и пентозы, благодаря чему способны активно развиваться на различных субстратах, например в молочной сыворотке [6]. В клетках Propionibacterium shermanii корриноиды находятся в 5'-аденозильной форме, в виде которой они проявляют свое биокаталитическое действие и осуществляет метаболические функции и в организме человека, однако для их максимального накопления в культуральной среде необходимо создавать специальные условия культивирования [3].

Одним из способов направленного изменения метаболизма в клетках бактерий является обработка жидких сред ультразвуком, под действием которого ускоряются реакции механохимического происхождения, имевшие место в озвучиваемой среде до воздействия ультразвука и инициируются специфические сонохимические реакции, в основе которых лежит механизм разрыва химических связей и образования свободных радикалов [1].

Таким образом, с помощью ультразвуковой обработки можно проводить направленную модуляцию метаболической активности бактерий для обеспечения увеличения конечного выхода витамина В12 без увеличения длительности производственного процесса [5]. Для определения влияния ультразвука на метаболизм бактерий производилось культивирование клеток штамма Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii I-63, используемого в промышленном производстве витамина В12, в субстрате на основе восстановленной молочной сыворотки с концентрацией лактозы 5%, а также добавками 0,002% CoCl2·6H2O и 0,001% MgSO4. рН в процессе культивирования удерживался на уровне порядка 6,9 с помощью периодической нейтрализации среды.

Во время культивирования раз в сутки производилось кратковременное озвучивание сред ультразвуком низкой интенсивности и различной частоты. Для исследования метаболической активности бактерий в процессе культивирования были выбраны метод определения титруемой кислотности для определения количества синтезируемых бактериями органических кислот, по результатам титрования выяснено, что обработка ультразвуком вызывает повышение титруемой кислотности, причѐм на частоте 20 КГц этот эффект более выражен, чем на 22 КГц при одинаковой интенсивности облучения. Следующим этапом был выбор длительности озвучивания; при этом производилось культивирование пропионовокислых бактерий на аналогичной среде с обработкой субстрата ультразвуком на частоте 20 КГц в течение 10 и 20 минут каждые 24 часа.

Для сравнения различных режимов обработки использовались метод определения титруемой кислотности и спектрофотометрический метод для мониторинга состава сброженной сыворотки [4], а также микроскопический метод для сравнения морфологии клеток.

а б в
а
б
в

Рис. 1. Микроскопические препараты сброженной сыворотки при различных режимах озвучивания: а) без озвучивания; б) 10 минут; в) 20 минут

При этом выяснено, что при увеличении длительности обработки также увеличивается нарастание титруемой кислотности, а значит, ускоряются процессы брожения и увеличивается активность бактерий; кроме того, как видно на микроскопических препаратах, наблюдаются изменения в морфологии клеток, подвергающихся ультразвуковой обработке, в частности уменьшение их размеров по сравнению с контролем. При фотометрировании сброженной сыворотки после предварительной деструкции клеток и фильтрации среды были получены следующие спектры поглощения:

Спектры поглощения сброженной сыворотки при различных режимах озвучивания

Рис. 2. Спектры поглощения сброженной сыворотки при различных режимах озвучивания: 1) без озвучивания; 2) 10 минут; 3) 20 минут

Максимумы поглощения света в видимой области образуемых в процессе роста пропионовокислых бактерий корриноидов относятся к порфириновому кольцу и имеют следующие значения: для цианокобаламина – 361 и 548 нм, оксикобаламина – 351 и 525 нм, 5'-дезоксиаденозилкобаламина - 375 нм; а также менее выраженные максимумы при 315, 340 и 522 нм [2,4]. Полученные спектры имеют ярко выраженные максимумы поглощения в областях, близких длине волны 351 (для второго образца), 361 (для первого образца) и 375 нм (для третьего образца), при этом спектры поглощения озвученных проб в коротковолновой части спектра практически совпадают. Благодаря полученным результатам можно сделать вывод, что подбором определѐнных условий озвучивания сред можно также направленно изменять соотношение различных форм витамина в среде при культивировании.

Таким образом, ультразвуковая модуляция метаболизма пропионовокислых бактерий является перспективным направлением для интенсификации промышленного получения витамина В12 и может быть использована также в производстве различных ферментированных пищевых продуктов, обогащѐнных витамином В12 и его аналогами.

Источник: Шершенков Б.С. и др. Ультразвуковая модуляция метаболической активности Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii при получении пищевых продуктов, обогащённых витамином В12 / Б.С. Шершенков, Е.П. Сучкова // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств», 2013. - №4.

Список литературы:

  1. Акопян Б.В., Ершов Ю.А. Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами: Учеб. пособие / Под ред. С. И. Щукина. – М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2005. – 224 с.
  2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч.: Учебн. пособие. – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: МЕДпресс-информ, 2007. – 624 с.
  3. Воробъѐва Л.И. Промышленная микробиология: Учеб. пособие. – М.: изд-во МГУ, 1989. – 294 с.
  4. Долгов В.В., Ованесов Е.Н., Щетникович К.А. Фотометрия в лабораторной практике. - М.: Российская медицинская академия последипломного образования, 2004.- 142 с.
  5. Сучкова Е.П., Шершенков Б.С. Технологические решения при получении обогащѐнной витамином В12 молочной сыворотки. / Б.С. Шершенков, Е.П. Сучкова // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств», 2013. - №1. [Электронный ресурс]: http://www.processes.ihbt.ifmo.ru
  6. Шершенков Б.С. Производство витаминизированных продуктов на основе молочной сыворотки. – Сборник трудов молодых учѐных. Ч. I: Сб. тр., с. 3-6. – СПб.: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2012. - 89 с.

Дополнительно о микробиологическом синтезе витамина В12 см. в дополнительной информации к статье: "Пропионибактерии - источник важных для промышленности метаболитов", где присутствует ссылка на статью о Стратегии биопроцессов для получения витамина В12 путем микробиологической ферментации (от 2022 г.), а также о Разработке стратегии одностадийного непрерывного технологического процесса для производства витамина B12 с помощью Propionibacterium freudenreichii (от 2023 г.).

См. отдельно:

Будьте здоровы!

Перейти к ссылкам к основным разделам

ссылки к основным разделам

Этот сайт использует файлы cookie и метаданные. Продолжая просматривать его, вы соглашаетесь на использование нами файлов cookie и метаданных в соответствии с Политикой конфиденциальности.
Продолжить