Микробиом и COVID-19

МИКРОБИОМ И COVID-19

СОДЕРЖАНИЕ

• I. Новая коронавирусная инфекция 2019 и желудочно-кишечный тракт 
• II. Управляемые микробиотой тонические интерфероновые сигналы в стромальных клетках легких защищают от заражения вирусом гриппа (исследование)
• Резюме
• Вступление
• Результаты
• Обсуждение
• III. Заключение

Новая коронавирусная инфекция 2019 и желудочно-кишечный тракт 

С декабря 2019 года несколько случаев пневмонии неизвестной этиологии были зарегистрированы в Ухане, провинция Хубэй, Китай. 7 января 2020 года Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний выявил новый коронавирус в образце мазка из горла пациента, который впоследствии был назван Всемирной Организацией Здравоохранения новым коронавирусом 2019 года (COVID‐19). По состоянию на 21 февраля 2020 года в Китае было подтверждено почти 75 114 случаев инфицирования человека COVID‐19, причем по меньшей мере 2239 человек погибли. Дополнительные случаи заболевания распространились на другие страны Азии, Европы, Америки, Океании и Африки.

Известно, что шесть видов коронавирусов вызывают заболевания человека, в том числе тяжелый острый респираторный синдром (SARS‐CoV) и ближневосточный респираторный синдром (MERS-CoV), которые являются зоонозными по своему происхождению, что может привести к тяжелым респираторным заболеваниям и высокой смертности. И COVID‐19 - седьмой. Филогенетический анализ полного вирусного генома (29 903 нуклеотида) показал, что COVID‐19 наиболее тесно связан (89,1% сходства нуклеотидов) с группой атипичных коронавирусов.¹ Этот факт может отчасти объяснить поведение этого нового коронавируса при заражении человека.

Ретроспективные исследования из Уханя показали, что основными клиническими проявлениями COVID‐19 являются лихорадка, кашель и одышка. Более менее общие симптомы включают продукцию мокроты, головной боли, кровохарканья и некоторых желудочно-кишечных симптомов. Похоже, что желудочно-кишечные симптомы, такие как диарея (2%-10,1%), а также тошнота и рвота (1%-3,6%), в настоящее время не очень распространены,²,³ однако, значительная часть пациентов первоначально предъявляла эти атипичные желудочно-кишечные симптомы.

Имеются данные не только о передаче вируса от человека к животному, но и о передаче вируса COVID‐19 от человека к человеку при близких контактах или через вирусные аэрозоли. Хотя необходимы дополнительные доказательства, Zhang et al ⁴ из Народной больницы Уханьского университета сообщили о присутствии вирусных нуклеиновых кислот в образцах фекалий и анальных мазках пациентов с COVID‐19. Таким образом, существует возможность фекально-оральной передачи инфекции COVID‐19. Больше внимания следует уделять гигиене рук и дезинфекции рвотных масс пациентов, фекалий и других жидкостей организма.

Предыдущие исследования выявили несколько рецепторов, с которыми связываются различные коронавирусы, такие как ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) для SARS‐CoV. Одно исследование показало с помощью молекулярного моделирования, что существует структурное сходство между рецептор‐связывающими доменами SARS‐CoV и COVID‐19, что означает, что COVID‐19 может использовать ACE2 в качестве рецептора, несмотря на наличие аминокислотных мутаций в рецептор‐связывающем домене COVID‐19.⁵ Этот результат был впоследствии подтвержден в другом исследовании, в котором предполагалось, что аномалии печени могут также возникать у пациентов с COVID-19, поскольку холангиоциты поражаются этими вирусами через ACE2.⁶ Известно, что ACE2 в изобилии содержится в эпителии легких и кишечника у людей, что может усилить доказательства этого возможного маршрута для COVID‐19. Однако другие авторы указывают, что экспрессия ACE2 в первую очередь локализуется на люминальной поверхности дифференцированных клеток тонкого кишечного эпителия, тогда как более низкая экспрессия наблюдается в криптовых клетках и толстой кишке.⁷ Они также связали аминокислотную транспортную функцию ACE2 с микробной экологией в желудочно-кишечном тракте, в которой мутанты ACE2 проявляют пониженную экспрессию антимикробных пептидов и показывают измененный микробный состав кишечника. Поэтому мы предполагаем, что COVID‐19 может быть в какой-то степени связан с микробиотой кишечника.

Однако связь между легкими и желудочно-кишечным трактом до конца не изучена. Хорошо известно, что в респираторном тракте обитает своя микробиота, но у пациентов с респираторными инфекциями обычно наблюдается дисфункция кишечника или вторичные осложнения дисфункции кишечника, которые связаны с более тяжелым клиническим течением заболевания, что свидетельствует о кишечно–легочной перекрестности. Этот феномен также может наблюдаться у пациентов с COVID-19. Многочисленные исследования показали, что модулирование микробиоты кишечника может уменьшить энтерит и связанную с ИВЛ пневмонию, а также может обратить вспять некоторые побочные эффекты антибиотиков, чтобы избежать ранней репликации вируса гриппа в эпителии легких.⁸ В настоящее время нет прямых клинических доказательств того, что модуляция микробиоты кишечника играет терапевтическую роль в лечении COVID‐19, но мы предполагаем, что таргетирование микробиоты кишечника может быть новым терапевтическим вариантом или, по крайней мере, адъювантным терапевтическим выбором. В начале февраля Национальной комиссией здравоохранения Китая и Национальным управлением традиционной китайской Медицины⁹ было создано руководство (версия 5), в котором рекомендуется, чтобы в лечении пациентов с тяжелой инфекцией COVID‐19 для поддержания баланса кишечной микроэкологии и предотвращения вторичной бактериальной инфекции могли использоваться пробиотики, что показывает, что правительство Китая и медицинские работники первой линии признают важность роли микробиоты кишечника в инфекции COVID‐19.

За этот период были предприняты огромные усилия со стороны китайского правительства и ускорены соответствующие исследования. Несмотря на то, что до настоящего времени не было рекомендовано никакого специфического противовирусного лечения, мы предполагаем, что пробиотики могут модулировать микробиоту кишечника, чтобы благоприятно изменить желудочно-кишечные симптомы, а также защитить дыхательную систему. Дальнейшие исследования могут быть сосредоточены на этом вопросе. Было бы интересно изучить, могут ли преимущества ACE2 в отношении легочных заболеваний опосредоваться через модуляцию кишечной и/или легочной микробиоты. Наконец, мы призываем всех медицинских работников первой линии проявлять осторожность и уделять больше внимания нетипичным пациентам с начальным проявлением желудочно-кишечных симптомов, особенно тем, кто находится в зоне эпидемии. Мы надеемся, что при совместных усилиях и большой поддержке COVID‐19 вскоре будет преодолен.

P.S.Информацию по ангиотензинпревращающему ферменту 2 (ACE2) см. по ссылкам [5, 6, 7]. Для понимания взаимосвязи микробиома и вырусной инфекции отдельно рассмотрим одно исследование по приведенной выше ссылке [8], касающееся вируса гриппа и сигнатуры интерферона типа I.

Управляемые микробиотой тонические интерфероновые сигналы в стромальных клетках легких защищают от заражения вирусом гриппа

На рис.: Зависимость тяжести гриппа от состояния кишечной микробиоты

Основные моменты

• Микробиота управляет сигнатурой интерферона (IFN) в клетках стромы легких.
• Повышенная сигнатура IFN препятствует ранней репликации вируса гриппа в эпителии легких.
• Уровни рецепторов IFN точно настраивают сигнатуру IFN
• Антибиотики уменьшают сигнатуру IFN и облегчают раннюю репликацию вируса

Резюме

Примечание редактора: Интерфероны - это белки, которые обладают противовирусной и иммуномодулирующей активностью. IFN типа I (кислотоустойчивые IFN альфа, бета, омега  и тау) - вырабатываются и секретируются большинством клеток в ответ на действие вирусов или двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК). Индукторами IFN типа I являются также липополисахариды бактерий и цитокины. IFN-альфа синтезируется в основном лейкоцитами и моноцитами, а IFN-бета – фибробластами.

Пути интерферона I типа (IFNa/β) точно настроены для получения противовирусной защиты при минимизации иммунопатологии; однако инициирующие стимулы, ткани-мишени и лежащие в их основе механизмы неясны. Используя модели физиологической и дисрегулированной поверхностной экспрессии IFNa/β-рецептора (IFNAR1), мы показываем здесь, что IFNAR1-зависимые сигналы задают стационарную сигнатуру IFN как в гемопоэтических, так и в стромальных клетках. Повышенные уровни IFNAR1 способствуют развитию легочной среды, рефрактерной к ранней репликации вируса гриппа, повышая базовую сигнатуру интерферона. Комменсальная микробиота управляет сигнатурой IFN специфически в строме легких, как показано при лечении антибиотиками и фекальной трансплантации. Эксперименты с химерами костного мозга определяют стромальные клетки легких как критически важные для раннего противовирусного иммунитета и взаимодействия строма-иммунных клеток для поздней противовирусной резистентности. Мы предполагаем, что управляемая микробиотой сигнатура интерферона в эпителии легких препятствует ранней репликации вируса и что поверхностные уровни рецепторов IFNAR1 точно настраивают эту сигнатуру. Наши выводы подчеркивают взаимосвязь между бактериальным и вирусным воздействием, что имеет важное значение для использования антибиотиков.

Вступление

Интерфероны (IFN) были обнаружены в качестве продуцируемых хозяином противовирусных веществ. Более чем за 60 лет исследований было установлено критическое значение для здоровья человека IFN I типа (IFNα / β), поскольку он индуцирует транскрипцию интерферон-стимулированных генов (ISGs), кодирующих белки с различными противовирусными функциями как в инфицированных, так и в соседних клетках.

Интерферон активирует сигнальный путь JAK-STAT для индуцирования транскрипции ISGs – ред.

Противовирусная защита устанавливается либо путем прямого воздействия на жизненный цикл вируса, либо путем нарушения клеточного метаболизма и подавления трансляционного механизма. Индукция противовирусного состояния необходима для ограничения ущерба, наносимого вирусными патогенами; однако появляющиеся данные показывают, что чрезмерная выработка IFN, вызванная одним из патогенов, может вызвать тяжелое заболевание, как это было ранее продемонстрировано для гриппа, ВИЧ-инфекции, туберкулеза, волчанки и синдрома Айкарди-Гутьера.

Двойственная природа IFNα/β делает их предпочтительной мишенью для регуляции как вторгающимися патогенами, так и регуляторными механизмами хозяина. На самом деле, вирусные изоляты, которые не способны модулировать реакцию IFNα/β (например, лабораторно спасенные вирусы гриппа ΔNS1), сильно ослаблены in vitro и in vivo, но могут реплицироваться в IFN-некомпетентных клеточных линиях Vero, что подчеркивает важность иммуномодуляции для вирусной приспособленности. Многие исследования были сосредоточены на понимании мириадов механизмов, с помощью которых вирус гриппа А ингибирует ответ IFNa/β.

Чтобы избежать повреждения тканей и иммунного паралича из-за чрезмерной сигнализации IFNα/β, организмы-хозяева также развили несколько уровней регуляции сигнализации IFNα/β. Важным механизмом регуляции IFNα / β является транзиторное снижение экспрессии поверхности IFNAR1 путем направленной убиквитинации после передачи сигнала, что, как было показано, имеет решающее значение для защиты от индуцированного каэрулином панкреатита и других воспалительных процессов. Важность этой стратегии хозяина при вирусной инфекции еще предстоит установить. Поэтому мы стремились понять, как транзиторное снижение регуляции IFNAR1 после стимуляции может повлиять на чрезмерную сигнализацию IFNα / β. Мы использовали мышей, гомозиготных по точечной мутации в остатке 526 Серина IFNAR1 (Ifnar1^S526A; далее Ifnar1^SA или SA⁺), которые не способны убиквитинировать IFNAR1 после стимуляции рецепторного комплекса, предотвращая последующее снижение регуляции IFNAR1 и тем самым усиливая сигнал IFN. Мы находим, что регуляция поверхностных уровней IFNAR1 является ключом к точной настройке степени прайминга IFNα/β в наивном легком. Как следствие, мыши Ifnar1^SA более устойчивы к вирусной инфекции гриппа из-за повышенного исходного уровня ISG. Кроме того, мы показываем, что как у мышей дикого типа (WT - wild type), так и у мышей ^Ifnar1SA микробиота усиливает экспрессию IFNAR1-управляемого ISG, особенно в эпителиальных клетках. Таким образом, эпителии легких являются важными приемниками тонических сигналов, которые определяют силу последующей, индуцированной инфекцией сигнализации IFNa/β и способствуют устойчивости к вирусной инфекции.

Результаты

IFNAR1-зависимые сигналы управляют сигнатурой ISG в стромальных и кроветворных клетках легких

Было выдвинуто предположение, что исходная активация пути IFN у неинфицированных животных обусловлена тонической сигнализацией IFNβ. Чтобы выяснить, относится ли это как к кроветворным, так и к стромальным клеткам, мы измерили уровень ISG в CD45-положительных и CD45-отрицательных клетках легких. Во-первых, мы доставили две дозы блокирующего антитела αIFNAR1 (MAR1), разделенные 48 часами, а затем собирали легкие на 2-й день после второй инъекции мышам C57BL/6. Обе клеточные популяции показали явную пониженную регуляцию классических ISG, таких как Rsad2 и Oasl2, после лечения, что указывает на то, что тонические уровни IFN-сигнализации приводят к исходному уровню ISG в этих клеточных компартментах (рис.1А). Соответственно, более низкие уровни экспрессии ISG были обнаружены в обеих клеточных популяциях в легких у мышей с дефицитом IFNAR1 (Ifnar1^−/−), у которых передача сигналов IFNα/β отсутствует (рис. 1B), что указывает на то, что установившиеся уровни ISG управляются IFNAR1-зависимыми сигналами как в кроветворных, так и в стромальных клетках.

Рисунок 1. IFNAR1-опосредованные сигналы определяют исходные сигнатуры ISG в стромальных и кроветворных клетках легких

(A) Экспрессия ISG, определенная с помощью qRT-PCR в клетках CD45⁺ и CD45^-, отделенных от магнитно-активированной сортировки клеток (MACS), из легких мышей C57BL/6 (n = 6 образцов от шести животных), получавших антитело против αIFNAR1 в дни 0 и 2. Легкие были собраны в день 4.
(B) Как в (A) из легких необработанных мышей C57BL/6 Ifnar1^+/+ и C57BL/6 Ifnar1 ^-/- (n = 4 или 5 образцов от четырех или пяти животных). Уровни экспрессии Oasl2 и Rsad2 показаны относительно транскрипции хозяйствующего гена Hprt. Все столбцы представляют среднее значение ± SEM. Значимость определяли с использованием U-критерия Манна-Уитни: * р <0,05, ** р <0,01 и *** р <0,001.

Уровни IFNAR1 регулируют исходную экспрессию ISG и обусловленные IFN иммунные реакции 

Приведенные выше результаты показывают, что опосредованные IFNAR1 сигналы необходимы для поддержания базовой сигнатуры ISG легких, и настройка уровней IFNAR1 является одним из способов управления величиной сигнала IFN. Поэтому мы использовали мышей ^IFNAR1SA, которые экспрессируют вариант рецепторной цепи IFNAR1, который не убиквитинирован и в результате не может быть деградирован после связывания лиганда и передачи сигнала по пути JAK/STAT, что приводит к длительной передаче сигнала IFN из-за невозможности отключить сигнал. Чтобы подтвердить это отсутствие пониженной регуляции IFNAR1, мы сначала обработали макрофаги, полученные из костного мозга (BMDMs), предельными разведениями IFNα₄. После обработки IFN BMDMs от мышей Ifnar1^+/+ C57BL/6 понижали поверхностную экспрессию IFNAR1 дозозависимым образом, в то время как клетки, полученные от мышей Ifnar1^SA, поддерживали почти постоянную экспрессию IFNAR1 для более низких концентраций IFNα₄ (рис.2А и S1A). Анализ флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) клеток наивных легких Ifnar1^SA показал повышенные исходные уровни экспрессии IFNAR1 как на CD45⁺ иммунных клетках, так и на CD45⁻ эпителиальных и эндотелиальных клетках (рис.2B, 2C, S1B и S1C), что указывает на то, что непрерывная деградация IFNAR1 способствует установлению физиологического уровня IFNAR1 на поверхности клеток в динамическом равновесии. Стационарная экспрессия ISG была повышена в легких мышей Ifnar1^SA (рис. 2D), что показывает, что поверхностные уровни IFNAR1 контролируют сигнатуру ISG. Блокада IFNAR1 привела к быстрому снижению уровней ISG, что указывает на то, что сигнатура ISG находится в динамическом равновесии, требующем постоянных сигналов IFN (рис.2Е). Важно отметить, что мы обнаружили повышенный уровень ISG как в стромальных, так и в гемопоэтических клетках (рис.2F), а поверхностная экспрессия IFN-индуцибельных белков Sca-1 и PDCA1 была повышена на иммунных клетках легких Ifnar1^SA по сравнению с C57BL/6 (рис. S1D). Вместе эти данные показывают, что уровни IFNAR1 на поверхности клеток регулируют физиологические уровни экспрессии ISG как в стромальных, так и в гемопоэтических клеточных компартментах. Это открытие имеет важное значение для иммунитета легких, поскольку конститутивная активация пути IFN I типа становится важным механизмом иммунного гомеостаза в слизистых оболочках неинфицированных мышей.

Рис.2. Уровни IFNAR1 настраивают базовую экспрессию ISG в строме легких и иммунных клетках

(A) Поверхностная экспрессия IFNAR1, определенная с помощью проточной цитометрии макрофагов, происходящих из костного мозга (BMDM), стимулированных различными концентрациями IFN_α4 в течение 24 часов. Экспрессия IFNAR1 была нормализована к соответствующим имитационным BMDM. n = 3 мыши на группу, 2 x10⁵ клеток на животное.
(B и C) Относительная экспрессия IFNAR1 на эпителиальных клетках (CD45^-, EPCAM⁺) (B) или эндотелиальных клетках (CD45^-, CD31⁺) (C), определенная методом проточной цитометрии и нормализованная для соответствующих популяций клеток C57BL/6. Пунктирная линия показывает среднее значение клеток, полученных из C57BL/6. n = 15 мышей на группу.
(D) Экспрессия ISG, определенная с помощью qRT-PCR, в целых легких мышей C57BL/6 или Ifnar1^SA (n = 17 на группу).
(E) экспрессия ISG, определяемая с помощью qRT-PCR, быстро снижается в легких у мышей ^Ifnar1SA
(n = 3–6 на группу) после лечения антителом αIFNAR1. Лечение проводится либо один раз в день 0 (день 1 и день 2 сбора), либо каждые 48 часов (день 6) сбора).
(F) CD45⁺ и CD45^- MACS-отделенные клетки из целых легких мышей C57BL/6 или Ifnar1^SA (n = 5–12 на группу) анализировали на экспрессию ISG с помощью qRT-PCR.
(G) Истощение pDC не снижает исходную экспрессию ISG у мышей Ifnar1^SA. Мышей (n = 3 на группу), получавших 400 мг αPDCA1 в день 0, день 2 и день 4. Целые легкие собирали на день 6 для анализа экспрессии генов с помощью qRT-PCR.
Все генные выражения показаны как относящиеся к хозяйствующему гену Hprt. Все столбцы представляют среднее значение ± SEM. Результаты составлены как минимум из двух экспериментов. Значимость определяли с использованием U-критерия Манна-Уитни (B, C, D и G), двухстороннего ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюки (A и F) или однофакторного ANOVA (E): * p <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001 и **** р <0,0001.

Изменения базовой экспрессии ISG в иммунных клетках не соответствовали изменениям в составе иммунных клеток легких мышей Ifnar1^SA (рис. S1E). Это согласуется с неизменным составом иммунных клеток в легких мышей типа Ifnar1^−/− (рис. S1F), что указывает на то, что тонический сигнал IFN типа I поддерживает сигнатуру IFN в иммунных клетках, но не их устойчивую выживаемость или рекрутирование. Заметным исключением являются плазмацитоидные дендритные клетки (pDCs), численность которых снижается в отсутствие сигнала IFN (рис.S1F), что согласуется с опубликованными наблюдениями. pDCs одновременно обслуживаются и являются важным источником IFN типа I. Чтобы определить, была ли экспрессия ISG, наблюдаемая у мышей WT и Ifnar1^SA, обусловлена pDC-производным IFN, мы использовали истощающие антитела против PDCA1, основного маркера pDCs. Истощение pDCs не изменило экспрессию ISG в легких (рис.2G), что указывает на то, что другие клетки ответственны за установление базовой экспрессии ISG у мышей WT и Ifnar1^SA.

Мыши ^Ifnar1SA менее восприимчивы к вирусной инфекции гриппа

Учитывая защитный и патологический потенциал IFNs I типа, мы хотели проверить, усиливает ли пониженная регуляция IFNAR1 иммунопатологию или облегчает иммунно-опосредованную защиту при вирусной инфекции гриппа. Мы обнаружили, что мыши ^Ifnar1SA были более устойчивы к вирусной инфекции гриппа, чем мыши WT (рис. 3А). Экспрессия вирусных генов была значительно снижена через 8 ч, а репликация вируса гриппа была значительно снижена через 2 дня после заражения у мышей Ifnar1^SA (рис. 3B и 3C). Чтобы подтвердить это в более клинически релевантной модели инфекции, мы провели заражение вирусом гриппа мышей WT или Ifnar1^SA, которые несут трансген, кодирующий человеческий MxA, основной фактор рестрикции вируса гриппа у людей. Когда эти мыши были инфицированы высоковирулентным вариантом вируса PR8 с усечением у антагониста IFN NS1, мы обнаружили меньшую потерю веса у мышей Ifnar1^SAMxAt^g/tg, чем у контролей (фигура 3D), аналогично приведенным выше результатам (рис. 3А).

Рисунок 3.  Повышенная сигнатура ISG легких защищает от заражения вирусом гриппа путем притупления инфекции на ранних стадиях

В соответствии с этой интерпретацией мы обнаружили снижение, а не увеличение уровня белка IFN в течение 48 ч после заражения (рис.S2A) у мышей Ifnar1^SA. В этот момент времени набор иммунных клеток в легкие не отличается между мышами WT и Ifnar1^SA (рис. S2B). Провоспалительные цитокины также были снижены через 5 дней после заражения у мышей Ifnar1^SAMxA^tg/tg (рис. S2C). Вместе эти данные демонстрируют, что управляемая IFN устойчивая сигнатура ISG в строме легких является важным детерминантом раннего противогриппозного контроля, который впоследствии приводит к снижению иммунных реакций из-за снижения вирусной нагрузки.

Альтернативным объяснением снижения иммунного ответа было то, что мыши Ifnar1SA по своей природе менее реактивны. Мы проверили это и обнаружили in vitro более высокую реактивность эпителиальных культур дыхательных путей Ifnar1^SA к IFNα и in vivo более высокий рекрутинг иммунных клеток в легкие, обработанные поли (I:C) Ifnar1^SA, по сравнению с контролями WT, подтверждая предыдущие выводы; Рисунки S2F и S2G. Таким образом, снижение иммунного ответа, которое мы наблюдаем у мышей Ifnar1^SA, инфицированных вирусом гриппа, является прямым следствием снижения вирусной нагрузки уже через 8 ч после заражения.

Повышенная экспрессия ISG в CD45-клетках имеет решающее значение для ранней защиты от вирусной инфекции гриппа.

Чтобы продемонстрировать относительный вклад как CD45⁺, так и CD45⁻ клеток в устойчивость мышей ^Ifnar1SA к вирусу гриппа, мы создали химеры костного мозга (BM) между мышами C57BL/6 и Ifnar1^SA. Химеры были заражены через 6-8 недель после восстановления BM. Как и в предыдущих экспериментах, все химеры ^Ifnar1SA демонстрировали значительно меньшую потерю веса, чем их аналоги C57BL / 6 (рис.4А). Кроме того, мыши C57BL/6, получавшие Ifnar1^SA BM, демонстрировали значительно большую потерю веса, чем реципиенты Ifnar1^SA (рис.4B). В частности, эти мыши демонстрировали более серьезные признаки заболевания в первые дни вирусной инфекции, что позволяет предположить, что CD45⁻ клетки имеют решающее значение для раннего притупления вызванного вирусом заболевания. И наоборот, мыши ^Ifnar1SA, получавшие WT BM, теряли больше веса в конце заражения по сравнению с контрольными группами, получавшими Ifnar1^SA BM (рис. 4С). Чтобы подтвердить, что различные клеточные компартменты способствуют защите на ранних и поздних стадиях инфекции, мы выполнили двухфакторную ANOVA для значений относительной массы тела на 3 и 9 день после заражения. Мы находим, что источником вариаций на 3-й день является генотип стромы, а источником вариаций на 9-й день является взаимодействие между генотипами стромы и BM (рис. 4D). Эти данные демонстрируют, что управляемые IFNAR1 сигналы в CD45^-клетках необходимы для обеспечения ранней защиты, в то время как IFNAR1-управляемые сигналы на гемопоэтических клетках способствуют защите на более поздней стадии инфекции.

Рисунок 4. Cтромальные и иммунные клетки вносят свой вклад в устойчивость мышей линии Ifnar1 ^SA к гриппозной инфекции

Микробиота управляет установившейся сигнатурой ISG в строме легких, но не в иммунных клетках 

Чтобы лучше понять причину повышенного уровня ISG у мышей Ifnar1^SA, мы сначала проверили гипотезу об уникальной микрофлоре в колонии Ifnar1^SA. При совместном размещении мышей WT в течение 1 месяца с мышами ^Ifnar1SA гомогенаты всего легкого не выявили никаких изменений в экспрессии ISG ни у мышей WT, ни у мышей ^Ifnar1SA, ни из-за совместного размещения, и увеличение Ifnar1^SA по сравнению с мышами WT сохранялось (рис.S3A). Эти результаты указывают на то, что повышенная экспрессия ISG у мышей Ifnar1^SA не обусловлена их специфической микрофлорой.

Мыши, получающие пероральные антибиотики, более восприимчивы к вирусным инфекциям, включая вирус гриппа А, частично регулируя порог активации иммунного ответа. Чтобы определить, была ли экспрессия ISG в легких непосредственно затронута микробиотой, мы обрабатывали мышей коктейлем антибиотиков через их питьевую воду в течение 4 недель и сравнивали экспрессию ISG в легких необработанных и обработанных антибиотиками мышей WT и Ifnar1^SA. При оценке состояния всех легких, вызванных лечением, не было обнаружено различий в ISG (рис. 5А); однако разделение CD45⁻ и CD45⁺ клеток выявило снижение экспрессии ISG в стромальном компартменте, но не в клетках гемопоэтического происхождения (рис.5В и 5С).

Рисунок 5.  Снижение экспрессии ISG в Стромальном компартменте мышей, получавших антибиотики, предрасполагает их к тяжелому гриппу

 Микробиота обеспечивает Антигриппозную вирусную защиту в строме легких

Чтобы увидеть, может ли повышенная экспрессия ISG и связанное с ней противовирусное состояние привести к более сильной резистентности, мы сначала проверили, действительно ли у мышей ^Ifnar1SA снижение ISG антибиотиками снимает вирусный блок репликации. Чтобы проверить эту гипотезу, мышей WT и Ifnar1^SA лечили антибиотиками или без них в течение 4 недель с последующим заражением вирусом гриппа. Как показано выше (рис.3А), необработанные мыши ^Ifnar1SA были более устойчивы к вирусной инфекции гриппа по сравнению с их аналогами C57BL/6. Однако обработанные антибиотиками мыши ^Ifnar1SA были так же восприимчивы, как и контрольные группы WT, что указывает на то, что управляемые микробиотой сигналы ответственны за фенотип резистентности, обнаруженный у мышей ^Ifnar1SA (рис.5D). Однако лечение антибиотиками не привело к значительным изменениям резистентности мышей WT, что может быть связано с отсутствием критического фактора рестрикции гриппа MX1 у большинства инбредных штаммов мышей, включая мышей C57BL/6. Поэтому мы повторили эксперименты на МХ1-компетентных мышах, модель которых более точно отражает ситуацию с человеческим хозяином, в которой присутствует функциональный ген Mx (MxA). Мы обнаружили, что у мышей Mx1^+/+ лечение антибиотиками значительно увеличивало экспрессию вирусных генов и вирусную репликацию на ранних стадиях инфекции (рис.5E и 5F), что указывает на то, что наличие соответствующего фактора рестрикции гриппа выявляет влияние микробиоты на ранний контроль вируса гриппа.

Мы расширили эти данные и обнаружили, что как у мышей Mx1^+/+Ifnar1^wt, так и у мышей Mx1^+/+Ifnar1^SA лечение антибиотиками значительно увеличивало потерю веса и смертность, в то время как мыши Mx1^+/+, экспрессирующие IFNAR1^SA, все еще имели тенденцию быть лучше защищены, чем их коллеги по WT (рис.6А). В соответствии с потерей раннего вирусного контроля мы обнаруживаем повышенную вирусную нагрузку через 16 ч после заражения у мышей, получавших антибиотики (рис. 6В). Поскольку лечение антибиотиками уменьшает противовирусное состояние, особенно в стромальных клетках легких (рис.5В и 5С), наши результаты показывают, что микробиологически управляемое IFN-праймирование в легких действует на стромальные клетки, чтобы установить противовирусное состояние, способное притупить вирусную инфекцию гриппа на самых ранних стадиях.

Для дальнейшего подтверждения того, что микробиота кишечника действительно ответственна за наблюдаемые изменения в исходной экспрессии ISG, мы обработали мышей, подвергнутых воздействию антибиотиков, фекальным материалом контрольных мышей с помощью перорального гаважа (Fecal transplantation [FT]). Это лечение обратило вспять вызванное антибиотиками снижение ISG в стромальных клетках легких (рис.6 С).

Эти эффекты были обнаружены как у мышей ^Ifnar1wt, так и у мышей Ifnar1^SA. В более глобальном анализе мы провели секвенирование РНК на строме легких от необработанных, обработанных антибиотиками (Abx) и AbX/FT-обработанных мышей (рис.6D). Непредвзятый анализ обогащения набора генов (GSEA), выполненный с использованием базы данных MsigDB, показал, что верхний путь, сниженный в строме легких мышей Abx, является сигналом IFNa/β,  и среди десяти наиболее значимых путей были обнаружены еще несколько иммунных и связанных с IFN  (рис.6D и 6E). Кроме того, все эти пути были усилены лечением FT. В таблице S1 (см. в источнике) перечислены гены из двух (в значительной степени перекрывающихся) топовых путей, связанных с IFN, которые мы обнаружили дифференцированно выраженными в наших группах лечения и которые показаны на рисунке 6E. Последовательно лечение FT обращало вспять вызванную антибиотиками восприимчивость к вирусной инфекции гриппа (рис.6F). Вместе взятые, эти результаты демонстрируют, что присутствие микробиоты увеличивает управляемое IFN противовирусное состояние в строме легких и тем самым повышает защиту от вирусной инфекции гриппа.

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь мы идентифицируем тонические, управляемые микробиотой сигналы к стромальным клеткам легких как гомеостатический механизм, который удерживает эпителиальные клетки в IFN-начальном состоянии и тем самым делает мышей устойчивыми к вирусной инфекции гриппа через раннее притупление вирусного жизненного цикла. Мы показываем, что требуется постоянная сигнализация IFNa/β, так как антитело-опосредованная блокада IFNAR1 уменьшает начальное состояние в течение 24-48 ч лечения. Используя преимущества мышей, у которых пониженная регуляция IFNAR1 нарушается целевой мутацией одного аминокислотного остатка в молекуле IFNAR1 (IFNAR1^SA), мы также обнаруживаем, что установка поверхностных уровней IFNAR1 – это механизм, постоянно работающий для точной настройки базовой сигнатуры ISG. Используя этих мышей для экспериментов с химерами BM, мы демонстрируем важность сигналов IFN стромальных клеток для раннего контроля вирусной нагрузки гриппа, в то время как компартмент иммунных клеток играет определенную роль позже во время инфекции. Профилирование экспрессии стромы легких у мышей, получавших антибиотики, показывает, что микробиота поддерживает преимущественно сигнатуру IFN и дополнительные иммунные пути в этих клетках, а FT обращает вспять вызванное антибиотиками снижение ISG.

Ранее было показано, что мыши, свободные от микробов, более восприимчивы к вирусной инфекции гриппа, но сигналы, вызванные IFN типа I, специально не оценивались у этих мышей. Исследования на мышах, получавших антибиотики, показали, что вызванная микробиотой вирусная резистентность была связана либо с повышением уровня транскриптов IL-1β и IL-18, либо с IFNa/β. В этих предыдущих исследованиях противовирусные функции, требующие тонизирующего сигнала IL-1β, IL-18 или IFN, были идентифицированы в естественных киллерных клетках (NK) и макрофагах. Кроме того, когда обработанные антибиотиками мыши были инфицированы относительно низкой инфекционной дозой вируса гриппа, адаптивный иммунитет, включая антитела, CD4 и CD8 реакции, был снижен, что привело к повышению уровня вируса на 12-й или 14-й день инфекции. Эксперименты, в которых систематически вводились инокуляты вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) и мышиного цитомегаловируса (MCMV), показали, что микробиота усиливает активацию иммунных клеток. Таким образом, воздействие на врожденный или адаптивный иммунитет подразумевается в микробиологически обусловленной противовирусной резистентности.  Здесь мы показываем, что абляция микробиоты наиболее сильно влияет на сигнатуру ISG в легких в стромальных клетках, включая эпителиальные клетки, а не в иммунном клеточном компартменте. Кроме того, обратная корреляция между уровнем ISG и уровнями вирусной транскрипции и репликации в ранние моменты времени, до продукции IFN и индукции ISG инфекцией, указывает на то, что управляемая микробиотой противовирусная резистентность предшествует как адаптивному иммунитету, так и функции врожденных иммунных клеток и зависит от присущих клеткам противовирусных эффектов в клетках-мишенях вируса - эпителии легких. Вместе эти и предыдущие исследования показывают, что сигналы, управляемые микробиотой, могут действовать на нескольких уровнях, индуцируя противовирусное состояние в невосприимчивых клетках на слизистых барьерах для контроля инфекции на ранних стадиях и повышая функциональность иммунных клеток, что приводит к улучшению врожденного и адаптивного иммунитета позже при инфекции.

Мы обнаружили, что лечение антибиотиками снижает экспрессию ISG главным образом в стромальных клетках, но в меньшей степени в кроветворных клетках, демонстрируя, что основными реципиентами микробиологически управляемого сигнала IFN являются невосприимчивые клетки. Следствием этой микробиотозависимой, заранее установленной сигнатуры ISG в эпителии является то, что уже самые ранние стадии вирусной инфекции гриппа притупляются, причем транскрипты вируса значительно снижаются в течение первых 8 ч инфекции, а титры снижаются более чем в 5 раз в течение первых 2 дней (рис.5E и 5F). Последующие противовирусные иммунные реакции значительно уменьшаются, потому что сам вирусный стимул уменьшается рано. Это объясняет очевидное противоречие, что мыши ^Ifnar1SA, которые явно имеют повышенные реакции на IFN и демонстрируют повышенные иммунные реакции на инертные стимулы (рис.S2G), демонстрируют менее сильный ответ IFN во время вирусной инфекции по сравнению с контролем WT (рис. S2A и S2C). Важно отметить, что это позволяет нам четко определить основу усиленной защиты у мышей ^Ifnar1SA. Поскольку эти мыши имеют более высокий исходный уровень ISGs, но более слабый инфекционно-индуцированный ответ IFN, защита обусловлена исходными эффектами, а не усиленными острыми реакциями.

Здесь мы показываем, что лечение антибиотиками повышает восприимчивость мышей ^Ifnar1wt, экспрессирующих центральный фактор рестрикции вируса гриппа Mx1 (рис.6А), который более близко напоминает присутствие гомолога MxA у человека. У этих мышей мы наблюдаем раннее притупление инфекции, а не усиленные (адаптивные) иммунные реакции позже при инфекции, как это было показано в предыдущих исследованиях. Скорее всего, высокоэффективный МХ-управляемый внутриклеточный противовирусный ответ действует более быстро и непосредственно и, таким образом, подчеркивает ранние эффекты лечения антибиотиками.

Точное происхождение и характер сигнала, ведущего от микробиоты к усиленным эпителиальным сигнатурам ISG, еще предстоит определить. Предыдущие исследования показали, что управляемый микробиотой сигнал, стимулирующий сигнатуру ISG в стромальных клетках легких, может исходить либо из кишечника, либо из легких. Однако в работе, представленной здесь, спасение фенотипа фекальной трансплантацией через пероральное гаважирование сильно предполагает участие кишечника в этом эффекте.

Хотя системное воздействие лечения антибиотиками задокументировано, интересно, что в легких иммунные клетки, которые предположительно более подвержены системному воздействию, проявляют меньшее воздействие, чем эпителиальные клетки, которые могут легко получать сигналы от бактерий в просвете дыхательных путей. Также неизвестно, является ли повышенная экспрессия ISG, отмеченная в стромальном компартменте мышей ^Ifnar1SA, следствием прямого распознавания бактериальных патоген-ассоциированных молекулярных паттернов эпителиальными клетками легких или ответом на IFNs, продуцируемый легочной резидентной иммунной клеткой или системным источником. Мы протестировали и исключили pDCs как клеточный источник IFNa/β, приводящий к повышенным уровням экспрессии ISG в легких Ifnar1^SA (рис. 2G). Альтернативно, легкие-резидентные иммунные клетки, такие как альвеолярные макрофаги, могут производить тонизирующий сигнал IFNβ, легко обнаруживаемый эпителиальными клетками легких. Хотя наши химеры BM ясно указывают на то, что генотип стромы определяет тяжесть инфекции на ранних стадиях, мы не можем формально исключить возможность того, что очень ранний инфильтрат иммунных клеток также способствует раннему вирусному контролю у мышей ^Ifnar1SA. Это и вовлечение бактериальных метаболитов, которые действуют локально или системно, должны быть исследованы в будущем.

Наше исследование доказывает, что при лечении пациентов антибиотиками следует соблюдать осторожность. В период с 2000 по 2015 год общемировое потребление антибиотиков, как полагают, увеличилось на 65%, что в значительной степени может быть связано с неадекватным лечением заболеваний, связанных с загрязнением окружающей среды и вирусными заболеваниями. Наши результаты свидетельствуют о том, что неправильное применение пероральных антибиотиков может предрасполагать пациентов к более тяжелому гриппу из-за снижения противовирусной резистентности эпителия.

Мы и другие ранее показали, что эпителий легких продуцирует и реагирует как на IFN III типа, так и на IFN I типа. Приведенные здесь данные свидетельствуют о том, что базовая сигнатура ISG не поддерживается IFN типа III, который будет создаваться параллельно IFN типа I. Эти результаты согласуются с предыдущими предположениями, указывающими на важную роль IFNβ в поддержании тонической сигнализации. Мы не смогли обнаружить исходную тоническую экспрессию IFNa, IFNß, IFNy или IFNλ белка у мышей ^Ifnar1SA или WT; однако сильная регуляция экспрессии ISG во многих типах клеток, включая те, которые не экспрессируют рецептор IFN типа III, и абляция этой сигнатуры моноклональными антителами (MAB), блокирующими рецептор IFNa/β, указывают на то, что IFN типа I присутствуют и активны.

Интересно, что стратегия повышенного исходного уровня ISGs используется другими тканями в организме для защиты критических популяций клеток от инфекции. В сердце повышенный исходный уровень ISG в кардиомиоцитах защищает эту критическую клеточную популяцию, а сердечные фибробласты экспрессируют повышенные уровни IFNAR1 на поверхности, что делает их более чувствительными к стимуляции IFNβ, предотвращая их превращение в резервуар для вирусной инфекции. Аналогичные результаты недавно были получены в отношении эндотелиальных клеток, в которых Интерферон-индуцированный трансмембранный белок 3 (IFITM3), как известно, конститутивно экспрессируется и помогает предотвратить системное распространение и вирусопосредованное разрушение эндотелиального барьера вирусом гриппа. Наконец, гемопоэтические стволовые клетки (HSCs) также экспрессируют повышенные уровни ISGs, предотвращая инфекцию от широкого спектра вирусов.

Учитывая повышенную защиту, обеспечиваемую повышенной экспрессией поверхности IFNAR1, возникает вопрос, почему система IFN физиологически не настроена на более высокую заданную точку. Предыдущие исследования с использованием мышей ^Ifnar1SA показали, что у этих мышей усиливается целый ряд воспалительных состояний, что указывает на то, что необходимо заплатить определенную цену за конститутивную настройку системы IFN. В человеческой популяции было показано, что для высокоактивных полиморфизмов в гене к рецептору MDA5 существует компромисс между улучшением противовирусной защиты и усилением воспаления. Использование мышей ^Ifnar1SA позволило нам оценить роль уровней рецепторов IFNa/β в установлении исходного уровня ISG. Мы находим, что небольшое повышение поверхностной экспрессии IFNAR1 в клетках Ifnar1^SA достаточно для увеличения экспрессии ISG в иммунных клетках и стромальном компартменте. Это клинически важно, поскольку клетки людей с синдромом Дауна, которые несут дополнительную копию генов Ifnar1/2 на хромосоме 21, как было показано, экспрессируют повышенные поверхностные уровни IFNAR1. Клетки крови этих людей продуцируют повышенное количество провоспалительных цитокинов в ответ на вирус, и недавние исследования показали повышенную сигнатуру ISG крови у пациентов с синдромом Дауна. Изменения протеомики крови у лиц с синдромом Дауна напоминают изменения, обнаруженные при интерферонопатиях I типа и других аутовоспалительных состояниях. Используя мышей ^Ifnar1SA, мы демонстрируем здесь, что тонкая настройка поверхностных уровней IFNAR1 имеет решающее значение для сбалансирования противовирусных и провоспалительных свойств системы IFN.

Методы, ссылочную литературу и доп. табл. см. в первоисточнике

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ОТ РЕДАКТОРА

В заключение следует отметить, что состояние иммунной системы несомненно влияет на степень риска заболевания COVID-19, а также степень тяжести протекания данной болезни. С учетом вышеописанных рекомендаций по пробиотическому вмешательству с целью устранения ЖКТ-симптомов и защиты дыхательной системы, отметим, что данный вопрос требует грамотного подхода, особенно с учетом межиндивидуальной вариабельности кишечного микробиома. В идеале нужно знать этот самый свой здоровый микробиом, что без соответствующих исследований сделать невозможно, т.к. помимо наличия энтеротипов имеются дисбиотические состояния, затрудняющие выявление состава индивидуальной нормофлоры. Однако, несмотря на эти сложности, существует системный подход в плане восстановления микробиоценоза. В данном случае используют физиологичные для человека пробиотические штаммы с доказанной безопасностью (например, бифидобактерии) и общим положительным действием на кишечный микробиом. Особого внимания заслуживают т.н. пробиотики мутуалистической природы, к которым, в частноси, относятся молочные пропионовокислые бактерии, названные учеными как "универсальные пробиотики". Их универсальное действие проявляется в способности продуцировать бифидогенные стимуляторы роста (BGS - bifidogenic growth stimulation), такие как 1,4-дигидрокси-2-нафтойная кислота (DHNA) и 2-амино-3-карбокси-1,4-нафтохинон (ACNQ). Благодаря им, а также продукции короткоцепочечных пропионовой и уксусной кислот, в кишечнике происходит заметное повышение содержания бифидобактерий и соспутствующее повышение продукции масляной кислоты (за счет стимуляции бутират-продуцирующих комменсалов). При этом проявляется толерантность к лактобациллам, и в ряде случаев стимуляция их роста. О свойствах BGS будет рассказано в отдельной статье.

Дополнительно см. также:

• Роль пробиотиков в управлении COVID-19
• COVID-19 и сопутствующие нарушения здоровья
• Питание пациентов и пробиотическая терапия при COVID-19
• Ферментированное молоко, обогащенное мёдом, и его польза для здоровья (в контексте COVID-19)
• Является ли микробиом кишечника мишенью для адъювантного лечения COVID-19?
• Пробиотики нового поколения и их метаболиты при COVID-19
• Без сероконверсии: Т-клетки сформировали иммунитет против COVID-19
• Роль микробиоты в вирусных инфекциях
• Применение пробиотиков при острых инфекциях дыхательных путей
• Иммунорегуляторная роль пробиотических микроорганизмов при легочных заболеваниях
• О важной роли диеты при коронавирусной инфекции
• Грипп и борьба с пневмококовой инфекцией с помощью микробиоты
• Вирусные инфекции, микробиом и пробиотики
• Связь между региональным статусом селена и исходами случаев COVID-19
• Дефицит селена связан с риском смертности от COVID-19

К разделу: Микробиота и ось кишечник-легкие