Получение биомассы пропионибактерий и их метаболитов на отходах производств

Получение биомассы Propionibacterium shermanii и витамина В12 на отработанных средах

Аннотация

Цели: Пропионовокислые бактерии имеют важное коммерческое значение благодаря их использованию в сыроделии, и растет интерес к их пробиотическим эффектам. Было отмечено стимулирующее воздействие молочнокислых бактерий (МКБ) на пропионовокислые бактерии. Цель данного исследования - изучить возможность использования отработанной среды, ранее применявшейся для выращивания МКБ, для получения биомассы и метаболитов Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii.

Методы и результаты: Семнадцать сред MRS и овощных соков были предварительно ферментированы различными МКБ и оценены на предмет их способности впоследствии поддерживать рост Propionibacterium с помощью автоматизированной спектрофотометрии (AS). На рост Propionibacterium в отработанных средах сильно влиял штамм МКБ, использованный для производства отработанной среды. Нативная среда MRS (без предварительной ферментации) давала самые высокие значения оптической плотности, за ней следовали среды, предварительно ферментированные Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum и Lactococcus lactis. Предварительно ферментированный капустный сок обеспечил хороший рост Propionibacterium. Для производства органических кислот и витамина B12 клетки Propionibacterium были сконцентрированы и иммобилизованы в альгинатные бусины с целью ускорения биоконверсии. В отработанной среде было получено больше пропионовой кислоты, чем в нативной среде MRS. Концентрация витамина B12 была выше в средах, ферментированных свободными клетками, чем в средах с иммобилизованными культурами; в средах со свободными клетками его концентрация варьировала от 900 до 1800 нг·мл^-1 среды.

Выводы: Было продемонстрировано, что отработанные среды могут быть переработаны для производства пропионибактерий и их метаболитов, в зависимости от штамма молочнокислых бактерий, который был выращен ранее. Восстановление среды необходимо для улучшения производства витамина B12, особенно с иммобилизованными клетками.

Значение и влияние исследования: В этом исследовании представлен вариант переработки отработанных сред, полученных производителями молочнокислых бактерий или производителями ферментированных овощей. В результате пропионовой ферментации можно получить три коммерческих продукта: биомассу, витамин B12 или органические кислоты, которые можно использовать в качестве заквасок, добавок или пищевых консервантов. Это привлекательный процесс с экономической и экологической точек зрения.

ВВЕДЕНИЕ

Пропионибактерии приобрели коммерческое значение благодаря их использованию в производстве сыров швейцарского типа для образования глазков и развития вкуса (Thierry et al. 2004). Однако появляется все больше доказательств того, что пропионибактерии обладают пробиотическим действием, основанным на производстве пропионовой кислоты, витамина B12, фолацинов, бактериоцинов, стимуляции роста полезных молочнокислых бактерий (МКБ) и устойчивости к желудочному пищеварению (Rinta-Koski et al. 2001; Jan et al. 2002).

При производстве сыров швейцарского типа первичная молочнокислая ферментация происходит во время производства сырной матрицы, а затем пропионовокислая ферментация - в период созревания. Поскольку в начале периода созревания сырная матрица содержит мало углеводов, пропионовая ферментация возможна благодаря способности пропионибактерий метаболизировать лактат в качестве углеродного субстрата. Кроме того, было отмечено стимулирующее воздействие МКБ на пропионовокислые бактерии (ПКБ) (Marcoux et al. 1992; Piveteau 1999). Эти данные показывают, что ПКБ может расти на среде, на которой ранее развивались МКБ. Хотя во многих исследованиях изучалась последовательная схема роста МКБ и ПКБ на сыродельных заводах, ни одно исследование не касалось сред компаний, производящих коммерческие стартовые культуры и пробиотики. Таким образом, неизвестно, можно ли получить высокую плотность ПКБ на отработанных средах, ранее использовавшихся для производства биомассы МКБ. Поэтому одной из целей данного исследования было изучение возможности использования сред, которые ранее использовались для выращивания различных штаммов МКБ, для получения Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Среда MRS была выбрана из-за ее широкого использования в качестве промышленной среды для выращивания МКБ. Кроме того, анализы проводились на побочных продуктах, получаемых на пищевых предприятиях, где МКБ используются в процессах ферментации. Сырная сыворотка является лучшим примером такого побочного продукта, и Marcoux et al. (1992) показали, что она действительно может успешно использоваться в качестве субстрата для производства ПКБ. Однако нет данных об использовании побочных продуктов производителей ферментированных овощей, поэтому в исследование были включены овощные соки, полученные при производстве овощей типа квашеной капусты.

Метаболиты ПКБ также представляют промышленный интерес, особенно витамин B12. ПКБ не обладают высокой скоростью роста. Поэтому они плохо конкурируют с бактериальными загрязнителями. Действия, которые ускорят и улучшат ферментацию Propionibacterium, а также снизят стоимость производства среды, сделают производство биомассы и метаболитов и использование в качестве пробиотиков более привлекательным. С этой целью также было изучено влияние иммобилизации культур в альгинатных бусинах на производство вторичных метаболитов. Действительно, клетки, помещенные в альгинатный гель, могут достигать очень высокой плотности клеток и они защищены от внешнего загрязнения (Champagne et al. 1992). Таким образом, второй целью данного исследования было использование отработанной среды в качестве промышленного субстрата для производства витамина B12 с использованием высокой плотности клеток PAB, помещенных в альгинатные гелевые шарики.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий и условия роста

Все бактериальные штаммы были получены из коллекции культур Центра пищевых исследований и разработок (FRDC) или любезно предоставлены компанией Rosell-Lallemand (Монреаль, Канада). Фондовые культуры МКБ (табл. 1) и Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Pr1 были приготовлены путем добавления суспензии клеток в среду, содержащую 10% (w/v) восстановленного обезжиренного молока и 10% (w/v) глицерина, и замораживания этой суспензии клеток при 70°C в криопробирках объемом 2 мл.

Прекультуры Propionibacterium получали путем инокуляции 1 мл размороженной бульонной культуры в 100 мл лактатной среды, содержащей 0,2 г·л^-1 лактата, 0,05 г·л^-1 казитона и 0,05 г·л-1 дрожжевого экстракта (Difco, Детройт, США), и инкубировали в течение 72 ч при 30°C. Штаммы МКБ перечислены в таблице 1 вместе с условиями их выращивания. Аналогичным образом, для получения инокулята МКБ 1 мл размороженной бульонной культуры инокулировали в бульон MRS и инкубировали в соответствующих условиях роста (табл. 1).

Иммобилизация Propionibacterium

Прекультуру Propionibacterium, полученную на лактатной среде, смешивали с равным объемом стерильного альгината 2% (w/w) (Grinsted FD126, Danisco, США) и добавляли по каплям к стерильному раствору CaCl₂ объемом 1 моль·л^-1. Бусинам давали затвердеть в растворе кальция в течение 30 мин, после чего их извлекали и промывали 0,1% (w/v) стерильной пептонной водой. Популяция в этих бусинах составляла примерно 1•10⁹ КОЕ·г^-1 геля, и ее увеличивали, инкубируя альгинатные бусины в лактатной среде при 30°C в течение 48 ч; это приводило к высокой плотности микрозахваченных культур (7•10¹⁰ КОЕ·г^-1 геля). После инкубации бусины промывали стерильной пептонной водой и использовали для инокуляции предварительно обработанного MRS (20 г бусин на литр среды). При этом общий уровень инокуляции составлял 1,4•10⁹ КОЕ·мл^-1 отработанной среды.

Получение отработанных сред на основе MRS

Нативный (неферментированный) MRS-бульон был получен из Института Rosell-Lallemand (Монреаль, QC, Канада). Бульон Lactobacilli MRS содержал на литр: 10 г пептона протеозы, 10 г говяжьего экстракта, 5 г дрожжевого экстракта, 20 г декстрозы, 1 г сорбитан моноолеата, 2 г цитрата диаммония, 5 г ацетата натрия, 0,1 г сульфата магния, 0,05 г сульфата марганца и 2 г фосфата калия. Среда готовилась в соответствии с рекомендациями путем регидратации при 55 г·л^-1 и стерилизовалась автоклавированием (121°C, 15 мин). Если не указано иное, отработанные среды были приготовлены путем проведения молочнокислого брожения в лабораторных условиях, как описано в таблице 1. Бульоны MRS инокулировали 1% (v/v) соответствующей прекультуры и проводили ферментацию в биореакторах New-Brunswick Bio-Flo 3000 (NBS Scientific, Edison, NJ, USA) объемом 2 л. Показатель pH контролировали с помощью NH₄OH 6 моль·л^-1 и слегка перемешивали (60 об·мин^-1) для обеспечения хорошего распределения основы. Ферментированную среду MRS собирали, когда подкисление прекращалось, на что указывало отсутствие добавления основания. Для каждого микроорганизма было проведено три независимых молочнокислых ферментации.

Таблица 1. Среды, используемые для получения Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii Pr1

Кодовое название	Описание отработанных носителей	Условия роста *	Strain origin
Нативный MRS	MRS, контроль	Предварительно не ферментированный
Нативный лактат	Лактатная среда, контроль	Предварительно не ферментированный
MRS Pediococcus	МРС, ферментированный Pediococcus acidilactici S2	37°C – 6,0	Rosell
MRS Leuconostoc	MRS, ферментированный Leuconostoc mesenteroides S4	30°C – 6,0	FRDC и Caldwell biofermentations
MRS Lactobacillus plantarum	MRS, ферментированный Lact. plantarum S1	30°C – 6,0	Rosell
MRS Bifidobacterium longum	MRS, ферментированный Bif. longum RO23	37°C – 6,5	Rosell
MRS Lactococcus	MRS, ферментированный Lactococcus lactis ssp. lactis HPL	30°C – 6,0	FRDC
MRS Lactobacillus casei RO215	MRS, ферментированный Lact. casei RO215	37°C – 6,0	Rosell
MRS Lactobacillus casei RO256	MRS, ферментированный Lact. casei RO256	37°C – 6,0	Rosell
MRS Lactobacillus acidophilus	MRS, ферментированный Lact. acidophilus RO52	45°C – 6,5	Rosell
Нативная капуста	Стерильный капустный сок	Предварительно не ферментированный
Ферментированная капуста	Капустный сок, заквашенный смешанной закваской (BLAC)	19°C – в начале 6,2‡	FRDC и Caldwell biofermentations
Морковь	Морковный сок, ферментированный смешанной молочно-кислой закваской (BLAC)	19°C – в начале 6,2‡	FRDC и Caldwell biofermentations
Среда бифидобактериальная промышленная	МРС из промышленного производства Bif. longum RO23	Конфиденциально	Rosel†
MRS пропионовый	MRS, ферментированный Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii Pr1, и дополненный 2% лактата	30°C – 6,0	FRDC
Капуста пропионовая	Капустный сок, ферментированный Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii Pr1, а затем дополненный 2% лактата	30°C – 6,0	FRDC
Лактат пропионовый	Лактатная среда, ферментированная Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii Pr1, затем дополненная 2% лактата	30°C – 6,0	FRDC

Для получения результатов, представляющих коммерческий интерес, некоторые образцы были получены из промышленных ферментаций, проведенных с теми же штаммами, которые использовались в лабораторных анализах. Так, компания Lallemand/Rosell предоставила отработанные среды, полученные из двух разных партий одного и того же промышленного процесса. Промышленное производство МКБ осуществлялось на аналогичной среде типа MRS, но имелись некоторые различия в технологическом процессе (служебная информация). Супернатанты промышленного производства МКБ были заморожены сразу после извлечения клеток и отправлены в FRDC.

После первоначальной МКБ-ферментации отработанную среду MRS центрифугировали (10 000 g в течение 20 мин) и супернатант замораживали при -20°C. Перед пропионовой ферментацией среду размораживали в течение ночи при 4°C, добавляли 10 мг·л^-1 CoCl₂*7H₂O в качестве предшественника B12 и стерилизовали (121°C, 10 мин). При ферментации для получения витамина B12 в среду добавляли стерильный хлорид кальция (раствор 3,4 моль·л^-1) до конечной концентрации 0,1 моль·л^-1 для поддержания целостности альгинатных шариков.

Среда с овощным соком

Компания Caldwell BioFermentation (Комптон, QC, Канада) предоставила нативные овощные соки. Две различные смеси были составлены в лаборатории в соответствии с промышленными практиками, используемыми для ферментации овощей: сок на основе моркови и сок на основе капусты. Овощная соковая среда была изготовлена из соков органически выращенных овощей в следующих пропорциях: (i) морковная смесь: 45% моркови, 20% капусты, 10% лука, 23% воды и 2% соли (ii) смесь капусты: 45% капусты, 20% моркови, 10% лука, 23% воды и 2% соли. Эти смеси пастеризовали при 60°C на водяной бане в течение 30 минут.

Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici и Lactobacillus plantarum (BLAC starter, Caldwell BioFermentation, Канада) выращивались отдельно на MRS-бульоне, а затем смешивались в равных соотношениях. Для приготовления молочнокислых овощных соков смеси на основе капусты или моркови инокулировали 1% (v/v) этой смешанной культуры. Молочнокислое брожение проводили в биореакторах New-Brunswick Bio-Flo 3000 объемом 2 л. Величину pH не контролировали. Ферментированные овощные соки собирали, когда прекращалось подкисление. Хотя коммерческие рецепты были запатентованы, рецептуры на основе капусты и моркови были разработаны таким образом, чтобы имитировать коммерческие продукты.

После молочнокислой ферментации смеси нейтрализовали при pH 6,7 и стерилизовали (121°C, 10 мин). Для спектрофотометрических анализов использовали осветленные соки. Для этого их центрифугировали для удаления осадка и большей части мякоти (10 000 g в течение 20 мин), затем надосадочную жидкость фильтровали (0,22 мкм, Millipore, Milford, MA, USA) и хранили в стерильных контейнерах. Как и для сред на основе MRS, для каждой овощной смеси было проведено три независимых молочнокислых ферментации.

Контрольные среды

В качестве контроля использовали неферментированные нативные лактат и MRS. Кроме того, чтобы оценить влияние предыдущего роста на среду, первую пропионовую ферментацию проводили на средах MRS и капустного сока. Перед инокуляцией все pH были скорректированы до 6,7 с помощью NH₄OH. Затем контрольные среды и MRS инокулировали Propionibacterium shermanii Pr1, и ферментацию проводили, как описано ранее для отработанных сред, обработанных МКБ. После центрифугирования ПКБ в отработанную среду добавляли 2% лактата, стерилизовали и замораживали.

Скрининг сред для роста Propionibacterium

Для определения штамма МКБ, пригодного для последующего производства ПКБ, использовали автоматизированную спектрофотометрию (AS). Для этого 200 мл отработанной или контрольной среды асептически распределяли в многолуночном планшете. Прекультуру Propionibacterium shermanii Pr1 дважды центрифугировали (8000 g в течение 15 мин) и промывали клетки 0,05 моль·л^-1 калийно-фосфатным буфером при pH 6,5. Оптическая плотность клеточной суспензии была доведена до 0,6 при 600 нм путем разбавления буфером. Затем лунки инокулировали 20 мкл прекультуры пропионибактерий и инкубировали при 34°C в течение 48 ч. Считывание проводили автоматически каждые 15 мин при 600 нм с помощью прибора AS (Bioscreen C, Labsystems Corp., Хельсинки, Финляндия) с 30-секундным перемешиванием планшета перед каждым считыванием. В некоторых анализах перед инокуляцией среду разбавляли 1 : 1 добавлением 0,05 моль·л^-1 калийно-фосфатного буфера при pH 6,5. Было проведено три независимых анализа, каждый из которых был выполнен в двух экземплярах. Для каждого анализа использовали разные партии отработанной среды.

Анализировались два аспекта кривой роста: максимальная полученная биомасса (оптическая плотность (OD_max)) и максимальная удельная скорость роста (μ_max). Эти значения отражают различные свойства ростовой среды. Поскольку μ_max находится в начале кривой роста, влияние на рост связано с присутствием эссенциальных и стимулирующих компонентов, и высокие концентрации этих компонентов в данный момент не требуются. Однако для OD_max концентрация всех основных факторов роста имеет первостепенное значение, так как рост прекратится, когда в среде будет исчерпан хотя бы один основной фактор.

Производство биомассы или метаболитов на отработанных средах

Для ферментации в колбах 100 мл отобранной отработанной среды дозировали в стерильные бутылки и инокулировали 1 мл прекультуры Propionibacterium. Затем колбы инкубировали при 30°C в течение 72 ч в перчаточном боксе камеры с контролируемой средой, которую продували газовой смесью, состоящей из 85% N₂, 5% CO₂ и 10% H₂, для получения анаэробных условий. Для отбора проб каждый раз отбирали по 2 мл, в общей сложности 8 мл на эксперимент.

Для ферментации в биореакторах отмеренные объемы выбранной среды по 2 л распределяли в ферментерах New-Brunswick Bio-Flo 3000 и инокулировали 20 мл предварительной культуры свободных клеток Propionibacterium или 20 г альгинатных шариков. Отработанный MRS инкубировали при 30°C при 60 об·мин^-1 под контролем pH 6,0 с NH₄OH (6 моль·л^-1). Для каждой среды проводили три независимых анализа ферментации пропионовой кислоты.

Анализы

Для определения химического состава образцы центрифугировали (8000 g в течение 20 мин), а надосадочную жидкость фильтровали с использованием мембраны 0,45 мкм (фильтры HVLP, Millipore, Milford, MA, США). Пробы вводили с помощью пробоотборника 717 (Waters, Mississauga, Ont., Canada) на колонку Aminex HPX 87H (300 x 7,8 мм) от BioRad (Mississauga, Ont., Canada) при температуре 40°C. Скорость потока поддерживалась на уровне 0,4 мл·мин^-1. Метаболиты определяли с помощью монитора индекса преломления 410 (Waters), а данные собирали с помощью программного обеспечения Millennium 32.

Образцы для микробного анализа сначала разводили 1:100 цитратом натрия (1%) и клеточные суспензии гомогенизировали с использованием гомогенизатора TH-115 (Omni International, Уоррентон, Вирджиния, США) при максимальной скорости в течение 30 с. Этот первоначальный этап был разработан для разрушения бактериальных цепочек комков, а последующие разведения проводились в 0,1% пептоне. Для подсчета жизнеспособных ПКБ серийные разведения высевали на лактатный агар, который готовили с использованием того же состава, что и лактатная среда (описанная выше), к которой добавляли 1,5% агара. Планшеты инкубировали в анаэробных условиях (камера с контролируемой средой) в течение 96 часов. Для клеток, иммобилизованных альгинатом, 1 г шариков суспендировали в 100 мл цитрата натрия (1%) и инкубировали 15 минут при 25°C для инициирования растворения шариков. Затем суспензию гомогенизировали и высевали, как описано выше для свободных клеток.

Анализ витамина B12 проводился методом микробиологического анализа с использованием штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC 7830, используемого для биоанализа B12. Один грамм образца разводили в следующем растворе для извлечения витамина B12: 1,3% безводного Na₂HPO₄, 1,2% моногидрата лимонной кислоты и 1% бисульфита натрия. Смесь автоклавировали 10 минут при 121°C, затем охлажденный образец отфильтровали. pH доводили до 6,0 и 1 мл образца добавляли в пробирку с 5 мл среды для определения B12 (Difco, Sparks, MD, USA) и 4 мл воды. Пробирки автоклавировали (121°C, 5 мин) и охлаждали перед инокуляцией. Каждый раз при проведении анализа строилась стандартная кривая с использованием стандартного раствора цианокобаламина (Sigma, Oakville, ON, Canada). Тестовый организм культивировали в затравочном бульоне B12 (Difco) и инкубировали при 37°C в течение 24 ч. Затем клетки центрифугировали (8000 g, 20 мин) и трижды промывали в стерильном солевом растворе (0,85%). Конечную суспензию клеток разбавляли 1 : 100 стерильным физиологическим раствором. В пробирки вносили по 100 мкл культуры Lactobacillus и инкубировали при 37°C в течение 24 ч. Рост испытуемого микроорганизма измеряли спектрофотометрически при 540 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Состав отработанных сред

Таблица 2. Химический состав среды для выращивания Propionibacterium (г·100 мл^-1)

Кодовое название*	Глюкоза	Фруктоза	Молочная кислота	Уксусная кислота	Этанол (% v/v)
Нативный MRS	2			0.5
Нативный лактат			2
MRS Pediococcus	0,8	0.4	0.6	0.5	0.2
MRS Leuconostoc			1.6	0.6	1.1
MRS Lact. plantarum			1.8	0.3
MRS Bif. longum	0.8	0.4	1.2	0.5
MRS Lactococcus	0.6	0.6	1.6	0.5
MRS Lact. casei RO256	0.1	0.1	3	0.6
MRS Lact. casei RO215	0.2	0.2	2.7	0.6
MRS Lact. acidophilus			2.5	0.7	0.3
Нативная капуста	0.7	0.6	0.1	0.1
Ферментированная капуста	0.5	0.2	0.8	0.3
Ферментированная морковь	0.8	0.4	0.6	0.5	0.2
Среда бифидобактериальная промышленная	1.4	0.2	1.0	2.1
MRS пропионовый	0.1		1.1	0.6	0.5
Капуста пропионовая			2	0.3
Лактат пропионовый			2	0.2

* Полное описание штаммов и подготовки сред см. в Таблице 1.

Химический состав среды, ферментированной МКБ, в основном MRS, заметно различался. Что касается субстратов, то многие штаммы МКБ были способны полностью метаболизировать углеводы, не оставляя их для ПКБ (табл. 2). Бульон MRS изначально содержал 2,0% глюкозы и 0,5% ацетата натрия. Во всех лабораторных МКБ-ферментациях содержание глюкозы снижалось до значения менее 0,8%. При использовании гомоферментативных МКБ содержание молочной кислоты в отработанном MRS обычно варьировалось между 1,2 и 1,6%. При использовании гетероферментативных культур обнаруживались этанол и уксусная кислота. Так, в MRS, ферментированном Leuconostoc, было получено 1,1% этанола и 0,6% уксусной кислоты. В ферментированных овощных соках концентрация молочной кислоты была ниже (0,6-0,8%) из-за более низкой концентрации углеводов в начале роста МКБ и отсутствия контроля рН. Что касается ацетата, то в отработанной среде лабораторного производства было обнаружено в среднем 0,57% ацетата, большая часть которого приходилась на 0,5%, первоначально содержавшиеся в MRS. Отработанная среда MRS промышленного производства содержала самые высокие уровни ацетата (2,1%). В овощных соках смешанная культура, содержащая Leuconostoc, продуцировала в среднем 0,3% уксусной кислоты.

Скрининг сред с помощью автоматизированной спектрофотометрии (AS)

Метод AS был использован для выбора наиболее подходящих сред для последующего пропионовокислого брожения. Учитывая потенциальное ингибирующее действие ацетата на ПКБ, а также потенциальное снижение pH в средах, все еще содержащих сахара, также проводились спектрофотометрические анализы со средами, разведенными в буфере. Разбавление среды для роста AS помогает поддерживать показания OD на уровне менее 1,0. Органические кислоты, образующиеся во время молочнокислого брожения и являющиеся потенциальными ингибиторами, также разбавлялись с помощью этой процедуры (Potvin et al. 1997).

Среди исследуемых сред неферментированный бульон MRS давал наибольшие значения OD_max (табл. 3), а наибольшее значение μ_max было получено в разбавленном нативном MRS.

Таблица 3. Показания автоматической спектрофотометрии максимальной оптической плотности (OD_max) при 600 нм и максимальной скорости роста (μ_max), достигнутой Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii Pr1 после роста в различных неферментированных контрольных средах (нативный MRS, лактат или капуста) или в отработанной среде.

Среда*	Неразбавленные среды		Разбавленные среды
	ODmax	μmax (ч-1)	ODmax	μmax (ч-1)
Нативный MRS	1.78	0.25	1.48	0.43
Нативный лактат	0.62	0.08	0.15	0.02
MRS Pediococcus	0.65	0.23	0.95	0.31
MRS Leuconostoc	1.04	0.20	0.78	0.13
MRS Lact. plantarum	0.28	0.06	0.32	0.09
MRS Bif. longum	1.30	0.26	1.35	0.28
MRS Lactococcus	1.12	0.25	1.24	0.30
MRS Lact. casei 256	0.92	0.32	0.60	0.24
MRS Lact. casei 215	0.12	0.08	0.55	0.26
MRS Lact. acidophilus	1.37	0.27	1.21	0.23
Нативная капуста	0.75	0.17	0.82	0.25
Квашеная капуста	1.06	0.31	0.95	0.30
Ферментированная морковь	0.73	0.19	0.95	0.21
Среда бифидобактериальная промышленная	0.56	0.23	1.36	0.27
MRS пропионовый	0.46	0.21	0.47	0.16
Капуста пропионовая	0.17	0.04	0.03	0.12

* См. Таблицу 1 для полного описания сред (штаммы и подготовка).

При этом значение OD_max, полученное в нативной среде MRS (Таблица 3), недооценивает истинную биомассу в среде, поскольку зависимость OD от биомассы не имеет первого порядка при значениях OD выше 1,0; таким образом, максимальная плотность OD в MRS была по меньшей мере в три раза выше, чем в нативной лактатной среде (Таблица 3).

Большинство сред давали более высокую биомассу, чем контрольная нативная лактатная среда. Нативные лактатные среды показали низкую плотность OD и низкую скорость роста в AS-анализах. Предыдущее выращивание МКБ в MRS всегда приводило к образованию сред с более низкой биомассой Propionibacterium, чем нативная среда MRS. Отработанный бульон MRS, полученный от Lact. acidophilus RO52, Bif. longum RO2 или Lactococcus, тем не менее, обеспечивал хороший рост пропионибактерий, со значениями OD_max выше 1 (Таблица 3). Примечательно, что разбавление именно этих сред на 50% не приводило к резкому снижению значений OD_max, как это было в случае с нативными MRS или лактатными бульонами (табл. 3). Разбавление среды в некоторых случаях благоприятно сказывалось на конечной плотности Propionibacterium и ускоряло скорость роста. Предыдущий рост некоторых штаммов МКБ в MRS, особенно Lact. plantarum и Lact. casei 215, был явно вреден для последующего развития пропионибактерий. В обоих случаях рост был лучше в разбавленной отработанной среде MRS.

Штамм Bif. longum, использованный в лабораторных анализах, был тем же, что и в промышленной ферментации. Поэтому ожидалось, что данные OD_max для Bif. longum RO23 из лабораторных и промышленных образцов будут схожими. Этого не произошло с отработанной средой, но произошло с разбавленной средой (Таблица 3). Также были отмечены резкие различия в уровнях молочной и уксусной кислот в двух отработанных MRS-средах Bif. longum, причем в коммерческой среде уровень органических кислот после производства МКБ был значительно выше (Таблица 2).

Среды (MRS и капустная), которые ранее были ферментированы Propionibacterium, дали низкую биомассу при последующем выращивании той же культуры Propionibacterium. Добавление 2% лактата к отработанной среде не улучшило конечный выход.

Ферментированный капустный сок, полученный при производстве квашеной капусты с использованием коммерческой стартовой культуры BLAC (Leuc. mesenteroides, Ped. acidilactici и Lact. plantarum), был способен поддерживать хороший рост Propionibacterium. На средах с капустным соком предшествующая МКБ-ферментация улучшала OD_max и μ_max Propionibacterium, чего нельзя сказать о MRS. Конечная численность и скорость роста, полученные в морковном соке, были аналогичны неферментированному капустному соку (табл. 3).

Пакетные ферментации для получения биомассы пропионибактерий

Рис. 1. Рост свободных клеток Propionibacterium на отработанных средах. Столбики ошибок представляют SD; для наглядности они помещены только на одну кривую (ферментированная капуста), которая является репрезентативной для остальных. ·, нативный MRS; ○, нативный лактат; ■, MRS Leuconostoc; □, ферментированная капуста; ▲, MRS Lb. acidophilus; ∆ MRS Bif. longum и ▼, MRS Lactococcus

Автоматизированная спектрофотометрия (АS) позволила отобрать лучшие ассоциации МКБ-ПКБ, которые необходимо было проверить в больших объемах и в условиях, напоминающих параметры производства. Поэтому были проведены серийные ферментации в стеклянных бутылках (100 мл) на преферментированных средах, давших наибольшую популяцию Propionibacterium в ходе AS-анализов. Данные по росту в колбах через 24 ч (рис. 1) согласуются с AS-данными по μ_max (табл. 3) в том смысле, что скорость роста может быть выше в некоторых преферментированных средах, чем в нативной MRS.

Взаимосвязь между AS-данными OD_max и популяциями в колбах через 48 ч также была хорошей, хотя в одном случае, в MRS, предварительно ферментированной лактококком, популяции были неожиданно выше, чем в нативной MRS. Как и в AS-анализе, нативная лактатная среда обеспечивала более низкий рост ПАБ, чем MRS-среда (рис. 1). Помимо Lactococcus, предварительный рост штаммов Lact. acidophilus RO52 и Bif. longum RO23 в MRS увеличивал последующую скорость и степень роста Propionibacterium. Известно, что ПКБ стимулируют рост Bifidobacterium, но это первое сообщение о стимуляции роста Propionibacterium отработанной средой, созданной Bifidobacterium. Поэтому для последующей выработки метаболитов и роста Propionibacterium shermanii Pr1 были выбраны среды с преферментацией Bif. longum RO23 и Lactococcus.

pH ниже 6,0 губителен для пропионибактерий (Hsu and Yang 1991), а значения ниже 5,0 сильно ингибируют их (Hettinga and Reinbold 1972). Во время ферментации ПАБ в стеклянных бутылках pH МКБ-ферментированного MRS снизился с 6,5 до 5,5, что, вероятно, не сильно ограничивало рост Propionibacterium. pH ферментированного капустного сока и нативного MRS снизился до 5,2 и 4,8, соответственно. Поскольку рост пропионибактерий значительно замедляется при значениях рН ниже 5,0 (Hettinga and Reinbold 1972), проведение ферментации под контролем рН может потенциально улучшить выход биомассы в неферментированном MRS. Конечный рН ферментированной нативной лактатной среды без углеводов снизился до 6,2. Таким образом, плохой рост, полученный на среде с нативным лактатом, не может быть связан с ингибированием рН, а скорее с недостатком питательных веществ.

Производство метаболитов альгинатно-микрозахваченными Propionibacterium

Для увеличения скорости производства органических кислот и витамина B12 Propionibacterium бактерии были иммобилизованы в альгинате с высокой концентрацией клеток, что позволило обеспечить высокую скорость инокуляции. При содержании 7 • 10¹⁰ КОЕ·г^-1 геля в самом начале ферментации популяция клеток в альгинатных шариках существенно не увеличивалась во время ферментации (данные не показаны). Следовательно, не было обнаружено влияния среды на конечное количество клеток в альгинатных шариках. Однако при использовании свободных клеток отработанная среда поддерживала рост пропионибактерий способом, аналогичным тому, который наблюдался в колбах, за исключением нативного MRS, в котором при ферментации под контролем рН были получены более высокие выходы свободных клеток.

Скорость производства пропионовой кислоты была медленнее при использовании свободных клеток, чем при использовании иммобилизованных. Так, ферментация с микро-захваченными культурами обычно завершалась через 48 ч инкубации, в то время как со свободными клетками требовалось не менее 72 ч. Это объясняется тем, что при использовании микро-захваченной культуры скорость инокуляции была в 100 раз выше.

Рис. 2. Производство пропионовой кислоты на отработанной среде после 72 ч ферментации Propionibacterium в биореакторах. Планки ошибок представляют SD. ■, Микрозахваченные и ■, свободные клетки

Концентрация пропионовой кислоты была наиболее высокой в среде с нативным лактатом и среде Bif. longum с микрозахваченными клетками Propionibacterium (рис. 2). Конечная концентрация пропионовой кислоты в этих средах достигала 1,8%. Иммобилизация ПКБ не дала преимущества перед свободными клетками по конечной концентрации пропионовой кислоты в нативной среде MRS или отработанной среде L. lactis.

Рис. 3. Производство витамина B12 Propionibacterium на отработанной среде в биореакторах. Планки ошибок представляют SD. ■, Микрозахваченные и ■, свободные клетки

В большинстве случаев иммобилизованные клетки продуцировали меньше витамина B12, чем свободные клетки, для всех сред, за исключением среды Bif. longum (рис. 3), где концентрация обоих витаминов была одинаковой. При использовании иммобилизованных клеток концентрация полученного витамина B12 составляла от 500 до 1350 нг·мл^-1 среды. Для свободных клеток концентрация варьировала от 900 до 1800 нг·мл^-1 среды (рис. 3). Нативная лактатная среда дала самую высокую концентрацию витамина B12, за ней следовала среда MRS, но эти различия не были статистически значимыми (P > 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что стимулирующий эффект последовательной ферментации (от МКБ к ПКБ) зависит от штамма. Соединения, связанные с этой стимуляцией в молоке, скорее всего, являются пептидами, образующимися в результате деградации казеина (Piveteau 1999). В настоящем исследовании была выбрана среда MRS, поскольку этот тип среды обычно используется в качестве субстрата для промышленного производства МКБ. По сравнению с молоком, среда MRS более богата свободными азотистыми соединениями за счет состава пептона, говяжьего и дрожжевого экстрактов. Стимулирующий эффект протеолитической активности на предшествующий рост МКБ, вероятно, был менее значительным в MRS, чем в молоке или сыре, учитывая высокую доступность свободного азота в MRS. Поэтому взаимоотношения между ПКБ и МКБ, описанные в литературе, касающейся молочных продуктов, могут отличаться от таковых в отработанных средах MRS.

Для получения Propionibacterium отработанную среду необходимо было автоклавировать. Автоклавирование вызывает реакцию подрумянивания, при которой свободные аминогруппы белка вступают в реакцию с углеводами, что приводит к потере питательных веществ в отработанной среде, что снижает рост ПКБ. Также могут образовываться токсичные вещества и ингибиторы метаболизма, которые, вероятно, были в более низких концентрациях в контрольной MRS. Такая обработка могла подавить рост Propionibacterium по сравнению с нативной средой MRS. Anderson et al. (1986) продемонстрировали, что рост Propionibacterium shermanii был подавлен в термически стерилизованной сыворотке по сравнению с пастеризованной сывороткой. Для повышения эффективности отработанной среды может быть полезно избежать повторного автоклавирования, заменив его стерилизацией фильтров. Если производитель закваски использует ультрафильтрацию или микрофильтрацию для восстановления биомассы МКБ, производственная линия может быть спроектирована таким образом, чтобы асептически переносить фильтрат (отработанную среду) в предварительно простерилизованный чан для производства ПКБ. Таким образом, операция восстановления МКБ может представлять собой этап стерилизации отработанной среды.

Химический состав отработанной среды отличался от одного к другому в зависимости от МКБ, которые росли ранее (табл. 2). Это, безусловно, влияло на выход клеточной биомассы и метаболитов Propionibacterium. Например, промышленная среда MRS, на которой росли Bifidobacterium, имела концентрацию уксусной кислоты 2,1%. Было показано, что такая концентрация снижает скорость роста в два раза в непрерывной системе для производства B12 (Nanba et al. 1983). Это объясняет более высокую максимальную оптическую плотность, полученную в разбавленной среде по сравнению с неразбавленной промышленной средой MRS во время AS-анализов. Таким образом, необходимо быть осторожным при использовании отработанной среды для получения биомассы Propionibacterium или ее метаболитов. Если прогнозируется ингибирование органическими кислотами в отработанной среде, можно рассмотреть возможность разбавления отработанной среды и добавления в нее факторов роста для компенсации снижения концентрации субстрата. Такая стратегия, вероятно, экономически невыгодна, и лучшим решением будет проведение ферментации в режиме «feed-batch» (периоическая ферментация с продпиткой – ред.). При порционном питании, благодаря соответствующей скорости подачи среды в ферментер, органические кислоты будут постоянно усваиваться и никогда не достигнут высоких ингибирующих концентраций. Тем не менее, возможно, что некоторые среды, содержащие МКБ, не будут поддерживать хороший рост штаммов ПКБ даже при использовании разбавленных сред или технологии ферментации в режиме «feed-batch». Данные AS-анализа показывают, что отработанная среда, полученная при производстве Lact. plantarum, была непригодна для последующего производства Propionibacterium, даже после разбавления (Таблица 3).

Согласно литературным данным, большинство ПКБ используют L-лактат быстрее, чем D-лактат (Crow 1986; Piveteau 1999). Хотя значения μ_max в AS были выше у культур, которые, как предполагается (De Roissard and Luquet 1994), продуцируют L-молочную кислоту (Bif. longum, Lact. casei 256 и L. lactis), форма продуцируемой молочной кислоты, по-видимому, не была наиболее критичным фактором скорости роста. Так, адекватные темпы роста были получены с Leuc. mesenteroides, видом, который, предположительно, продуцирует D-молочную кислоту, а слабый рост был отмечен с Lact. casei 215 (Таблица 2).

В некоторых отработанных средах оставалось некоторое количество углеводов, оставленных МКБ. Несмотря на то, что большинство ПКБ будут преимущественно использовать лактат, потребление углеводов будет происходить после полного усвоения лактата (Lee et al. 1974). Это приведет к снижению pH культуральной среды и ингибированию роста ПКБ. В этом случае необходим внешний контроль рН.

Взаимодействие между МКБ и ПКБ было изучено главным образом потому, что эти штаммы часто растут вместе в сыре, где действие обоих микроорганизмов необходимо для надлежащего качества конечного продукта. Совместные культуры Bif. longum и Propionibacterium freudenreichii были также предложены для производства органических кислот (Tanigushi et al. 1998). Однако совместное культивирование ПКБ–МКБ ограничено периодическими процессами из-за низкой скорости роста ПКБ (Blanc and Goma, 1989). В связи с растущим интересом к пробиотическим штаммам было сообщено о стимулирующем действии ПКБ на рост бифидобактерий (Mori et al. 1997; Warminska-Radyko et al. 2002). В этом исследовании наблюдалось обратное, поскольку было показано, что отработанная среда бифидобактерий является одной из лучших сред для последующего роста пропионибактерий.

Микрозахват (удержание высокой плотности) микроорганизмов повышает производительность периодических или непрерывных ферментаций (Champagne et al. 1989). Многие авторы (Lewis and Yang 1992; Paik and Glatz 1994) показали, что иммобилизованные клетки достигают более высоких концентраций и продуктивности органических кислот из-за более высокой концентрации клеток в реакторе. Однако использование иммобилизованных клеток снижало производство витамина B12, что подтверждает отчет Czaczyk et al. (1997). Эти авторы показали, что альгинатный гель обладает способностью поглощать ионы металлов из среды. Можно предположить, что ионы Co²⁺, которые являются структурной частью витамина B12, были частично захвачены из среды альгинатом, прежде чем попали в клетки. Необходимы дополнительные данные для изучения биодоступности ионов металлов в альгинатных бусинах.

Использование недорогих субстратов, таких как отработанная культуральная среда, в сочетании с сокращением времени ферментации за счет иммобилизации высокой плотности клеток Propionibacterium, делает процесс ферментации более привлекательным для производства органических кислот, используемых в качестве пищевых консервантов. ПКБ являются единственными микробными продуцентами B12, которые признаны безопасными. Для данного применения необходимо дальнейшее повышение производительности на отработанной среде.

Некоторые потребители требуют продукты на растительной основе, и среды на основе MRS могут показаться непривлекательными для некоторых потребительских ниш. Данное исследование продемонстрировало, что побочные продукты ферментации овощей могут быть использованы для выращивания ПКБ и потенциального производства полезных метаболитов, получаемых из ПКБ.

С экологической точки зрения желательно повторное использование отработанных сред, полученных в результате производства МКБ или ферментации овощей. Данные этого исследования показывают, что отработанную среду можно использовать для производства ПКБ, но на последующий рост пропионового штамма сильно влияет исходный штамм МКБ. Данное исследование также показывает, что отработанная среда может быть использована для производства органических кислот и витамина B12. В этом процессе иммобилизованные клетки полезны для увеличения скорости производства кислоты, но при этом может наблюдаться более низкий выход B12.

Дополнительная информация:

• Пропионовая кислота: микробиологический способ получения
• Использование P. freudenreichii T82 для биосинтеза пропионовой кислоты и трегалозы в среде отходов пищевой промышленности
• Биосинтез пропионовой кислоты (заметка)
• Биосинтез витамина В12
• Многогранные свойства пропионовокислых бактерий
• Проиводство белка одноклеточных (заметка)
• Биотехнология пищевого белка (PDF)

Литература:

1. Anderson, T.M., Bodie, E.A., Goodman, N. and Schwartz, R.D. (1986) Inhibitory effect of autoclaving whey-based medium on propionic acid production by Propionibacterium shermanii. Appl Environ Microbiol 51, 427–428.
2. Blanc, P. and Goma, G. (1989) Propionic acid and biomass production using continuous ultrafiltration fermentation of whey. Biotechnol Lett 11, 189–194.
3. Champagne, C.P., Baillargeon-Cote´, C. and Goulet, J. (1989) Whey fermentation by immobilized cells of Propionibacterium shermanii. J Appl Bacteriol 66, 175–184.
4. Champagne, C.P., Morin, N., Couture, R., Gagnon, C., Jelen, P. and Lacroix, C. (1992) The potential of immobilized cell technology to produce freeze-dried, phage-protected cultures of Lactococcus lactis. Food Res Int 25, 419–427.
5. Crow, V.L. (1986) Utilisation of lactate isomers by Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii: regulatory role of intracellular pyruvate. Appl Environ Microbiol 52, 352–358.
6. Czaczyk, K., Trojanowska, K. and Grajek, W. (1997) The influence of a specific microelemental environment in alginate gel beads on the course of propionic acid fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 48, 630–635.
7. De Roissard, H. and Luquet, F.M. (1994) Bacte´ries Lactiques, Vol. 1. Uriages France: Lorica, p. 614.
8. Hettinga, D.H. and Reinbold, G.W. (1972) The propionic-acid bacteria-a review. 1. Growth. J Milk Food Technol 35, 295–301.
9. Hsu, S.T. and Yang, S.T. (1991) Propionic acid fermentation of lactose by Propionibacterium acidipropionici: effects of pH. Biotechnol Bioeng 38, 571–578.
10. Jan, G., Leverrier, P., Proudy, I. and Roland, N. (2002) Survival and beneficial effects of propionibacteria in the human gut: in vivo and in vitro investigations. Lait 82, 131–144.
11. Lee, I.H., Fredrickson, A.G. and Tsuchiya, H.M. (1974) Diauxic growth of Propionibacterium shermanii. Appl Microbiol 28, 831–835.
12. Lewis, V.P. and Yang, S.T. (1992) Continuous propionic acid fermentation by immobilized Propionibacterium acidipropionici in a novel packed-bed bioreactor. Biotechnol Bioeng 40, 465–474.
13. Marcoux, V., Beaulieu, Y., Champagne, C.P. and Goulet, J. (1992) Production of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii in whey-based media. J Ferment Bioeng 74, 95–99.
14. Mori, H., Sato, Y., Takeromo, N., Kamiyama, T., Yoshiyama, Y., Meguro, S., Sato, H. and Kaneko, T. (1997) Isolation and structural identification of bifidogenic growth stimulator produced by Propionibacterium freudenreichii. J Dairy Sci 80, 1959– 1964.
15. Nanba, A., Nukada, R. and Nagai, S. (1983) Inhibition by acetic and propionic acids of the growth of Propionibacterium shermanii. J Ferment Technol 61, 551–556.
16. Paik, H.D. and Glatz, B.A. (1994) Propionic acid production by immobilized cells of a propionate-tolerant strain of Propionibacterium acidipropionici. Appl Microbiol Biotechnol 42, 22–27.
17. Piveteau, P. (1999) Metabolism of lactate and sugars by dairy propionibacteria: A review. Lait 79, 23–41.
18. Potvin, J., Fonchy, E., Conway, J. and Champagne, C.P. (1997) An automatic turbidimetric method to screen yeasts extracts as fermentation ingredients. J Microbiol Methods 27, 153–160.
19. Rinta-Koski, M., Beasly, S., Montonen, L. and Mantere-Alhonen, S. (2001) Propionibacteria isolated from rumen used as possible probiotics together with bifidobacteria. Milchwissenschaft 56, 11–13.
20. Tanigushi, M., Nakazawa, H., Takeda, O., Kaneko, T., Hoshino, K. and Tanaka, T. (1998) Production of a mixture of antimicrobial organic acids from lactose by co-culture of Bifidobacterium longum and Propionibacterium freudenreichii. Biosci Biotechnol Biochem 62, 1522–1527.
21. Thierry, A., Maillard, M.B., Herve, C., Richoux, R. and Lortal, S. (2004) Varied volatile compounds are produced by Propionibacterium freudenreichii in Emmental cheese. Food Chem 87, 439–446.
22. Warminska-Radyko, I., Laniewska-Moroz, L. and Babuchowski, A. (2002) Possibilities for stimulation of Bifidobacterium growth by propionibacteria. Lait 82, 113–121.