Влияние солей хлористого кобальта и ультразвука на биосинтез витамина В12

О влиянии ионов кобальта на выход биомассы и синтез витамина В12 см. также по ниже приведенным ссылкам:

Физиология прокариот – одно из центральных направлений в микробиологии, формирующее целостное представление о жизнедеятельности организма. Изучение физиолого-биохимических свойств практически значимых микроорганизмов актуально в плане решения общечеловеческой задачи – улучшения качества жизни.

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) интересны как организмы, неоднозначно относящиеся к молекулярному кислороду и образующие в норме большие количества корриноидов – соединений группы витамина В12. Так, пропионовокислые бактерии вида Propionibacterium freudenreichii практически значимы как пробиотики, как источники консервантов, а так же как продуценты биологически активных веществ и прежде всего витамина В12 [1].

Изучение физиологии Propionibacterium freudenreichii в связи с её удивительной способностью к образованию корриноидов в больших количествах – ключ к пониманию новых особенностей биологии организма, его статуса в эволюции, расширению представления о биологическом разнообразии в мире прокариот и целенаправленному их использованию [2].

Прим. ред.: Корриноиды — группа веществ, в основе которых лежит углеродный скелет коррина, который состоит из четырёх пиррольных колец. Коррин является родительской структурой корриноидов и ряда коферментов. К наиболее известным веществам этой группы относятся кобаламины (витамины B12).

Корриноиды (соединения группы витамина В12) – особые тетрапирролы древнего происхождения, отличающиеся химической и биохимической полифункциональностью. Являясь древними полифункциональными биокатализаторами они вовлечены в центральные метаболические процессы современных прокариот. Ионы металлов в этих соединениях находятся в комплексе с органическими лигандами, а в коферментах В12 атом кобальта связан с углеродом. Ко-В12 – единственное металлорганическое соединение, обнаруженное в живых организмах, которое является уникальным биокатализатором. К настоящему времени открыто и изучено более тридцати биохимических реакций, катализируемых корриноидсодержащими ферментами. Открытие новых функций корриноидов продолжается. Но, несмотря на обнаружение всё новых биохимических реакций, протекающих при участии корриноидов, актуален вопрос о физиологическом значении их высокого естественного уровня образования в клетках некоторых бактерий и архей [3].

Новый взгляд на роль кобальта и корриноидов в жизнедеятельности Propionibacterium freudenreichii неизбежно ускорил бы изучение этого явления у других прокариотических организмов. Однако известно, что в естественных питательных средах содержание кобальта минимально. Поэтому целью нашей работы являлось изучение влияния различных концентраций солей хлористого кобальта на биосинтез витамина В12 пропионовокислыми бактериями вида Propionibacterium freudenreichii.

На начальном этапе работы производилось изучение влияния различных концентраций кобальта на содержание кобаламина в биомассе ПКБ. Для исследования накопления биомассы и витамина В12, использовалась глюкозоминеральная среда с разным содержанием солей кобальта: 0,5 мкг/л, 1,0 мкг/л, 1,5 мкг/л. Контролем служила среда, не содержащая солей кобальта. При проведении экспериментальных исследований использовались общепринятые и современные методы анализов. Содержание витамина В12 определяли спектрофотометрическим методом; среднюю удельную скорость роста бактерий – по приросту биомассы [4]. Результаты зависимости биосинтеза витамина В12 от дозы солей хлористого кобальта представлены на рисунке 1.

Рисунок 1– Влияние дозы солей кобальта на синтез витамина В12

Как видно из рисунка 1, максимальное накопление витамина В12 было достигнуто на третьи сутки культивирования бактерий при концентрации ионов кобальта в среде 1,5 мкг/л и составило – 381,5 мкг/л.

Так же было изучено влияние различных концентраций солей кобальта на накопление биомассы пропионовокислых бактерий. В ходе эксперимента определялась абсолютно сухая биомасса (АСБ) ПКБ. Результаты представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 – Влияние дозы солей кобальта на накопление биомассы Propionibacterium freudenreichii

Из рисунка 2 видно, что во всех средах с внесением ионов кобальта наблюдалось наращивание биомассы бактерий, по сравнению с контролем. При дозе солей кобальта 1,5 мкг/л содержание сухой биомассы бактерий достигло 3,54 г/л.

В дальнейшей работе для наглядного сравнения влияния концентраций солей кобальта в среде на рост исследуемых бактерий были изучены средние удельные скорости роста культур. Результаты эксперимента приведены на рисунке 3.

Рисунок 3 – Влияние содержания различных концентраций солей кобальта на среднюю удельную скорость роста Propionibacterium freudenreichii

Как видно из рисунка 3 внесение в глюкозоминеральную среду солей хлористого кобальта в количестве 1,5 мкг/л позволяет повысить темпы наращивания биомассы Propionibacterium freudenreichii в 1,7 раза, по сравнению с безкобальтовой средой.

Таким образом, полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что содержание корриноидов в клетках Propionibacterium freudenreichii напрямую зависит от концентрации ионов кобальта в среде. Так же установлено, что во всех опытах, наибольший выход витамина В12 и наибольшее накопление биомассы наблюдается на третьи сутки культивирования. В результате эксперимента была подобрана оптимальная доза солей хлористого кобальта в количестве 1,5 мкг/л, которая позволяет повысить темпы наращивания биомассы Propionibacterium freudenreichii в 1,7 раза по сравнению с контролем и увеличить содержание витамина В12 до 381,5 мкг/л.

Литература

1. Хамагаева И.С. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий / И.С. Хамагаева. – Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. – 172 с.
2. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии / Л.И. Воробьева. – М.: Изд-во МГУ, 1995. – 288 с.
3. Рыжкова Е.П. Кобальт и корриноиды в биологии Propionibacterium freudenreichii: Автореф. дис. док. биол. наук – Москва, 2003. – 266 c.
4. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высшучеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; под. ред. А.И. Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.

О получении кисломолочного биопродукта на закваске пропионовокислых бактерий Propionibacterium shermanii c большим содержанием витамина В12 (1200 мкг/мл) см. в описании изобретения к патенту РФ № 2195127: Способ получения кисломолочного пролдукта "Целебный"

---

2. Ультразвуковая модуляция метаболической активности P. freudenreichii subsp. shermanii при получении пищевых продуктов, обогащённых витамином В12

Витамин В12 – одно из важнейших биологически-активных соединений, участвующих во многих процессах в организме человека. В современных условиях жизни часто наблюдается его дефицит, из-за чего необходимо введение в рацион специальных обогащѐнных продуктов. Однако его синтез очень сложен и в настоящее время он является одним из наиболее дорогостоящих витаминов. Статья посвящена модуляции ультразвуком метаболизма основного промышленного продуцента витамина В12 Propionibacterium shermanii с целью повышения эффективности биотехнологического процесса его производства.

Витамин В12 – группа кобальтсодержащих биологически-активных корриноидных соединений, известных как кобаламины. Он также известен как экзогенный (внешний) фактор Кастла, или животный белковый фактор. Витамин В12 осуществляет биокаталитические реакции, обеспечивающие кроветворную функцию организма. Он также способствует нормализации функции печени, благоприятно влияет на регенерацию нервных волокон и активирует созревание форменных элементов крови [2]. Наиболее важными для производства кобаламинами являются цианокобаламин и оксикобаламин благодаря своей стабильности при хранении и высокой биологической активности. Всасывание витамина происходит в тонком кишечнике после взаимодействия в желудке с гастромукопротеином - «внутренним фактором Кастла», который секретируется клетками слизистой оболочки желудка и обеспечивает его абсорбцию. Основным источником витамина являются пищевые продукты животного происхождения, а также микрофлора желудка и кишечника. В организме человека кишечные бактерии также синтезируют витамин В12, но в обычных условиях осуществляют этот синтез в тех областях, где всасывание витамина в кровь не происходит, так как не происходит связывание витамина с внутренним фактором, поэтому основное его количество должно поступать с пищей [2]. В12-гиповитаминоз может возникать при различных обстоятельствах: длительном вегетарианском питании, беременности, хроническом алкоголизме, а также в связи с различными нарушениями его усвоения при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, а относительная алиментарная недостаточность витамина наблюдается практически повсеместно, что может быть исправлено введением в рацион специальных обогащѐнных витамином В12 пищевых продуктов. Однако химический синтез витамина В12 отличается высокой сложностью, и в настоящее время его производят биотехнологическими методами.

Одним из важнейших продуцентов витамина являются пропионовокислые бактерии. Морфологически это неподвижные бесспоровые палочки разной величины, от коккообразных до длинных, располагаются единично, парами или короткими цепочками, способные расти как в анаэробных, так и в аэробных условиях. Они активно сбраживают глюкозу, сахарозу, лактозу и пентозы, благодаря чему способны активно развиваться на различных субстратах, например в молочной сыворотке [6]. В клетках Propionibacterium shermanii корриноиды находятся в 5'-аденозильной форме, в виде которой они проявляют свое биокаталитическое действие и осуществляет метаболические функции и в организме человека, однако для их максимального накопления в культуральной среде необходимо создавать специальные условия культивирования [3].

Одним из способов направленного изменения метаболизма в клетках бактерий является обработка жидких сред ультразвуком, под действием которого ускоряются реакции механохимического происхождения, имевшие место в озвучиваемой среде до воздействия ультразвука и инициируются специфические сонохимические реакции, в основе которых лежит механизм разрыва химических связей и образования свободных радикалов [1].

Таким образом, с помощью ультразвуковой обработки можно проводить направленную модуляцию метаболической активности бактерий для обеспечения увеличения конечного выхода витамина В12 без увеличения длительности производственного процесса [5]. Для определения влияния ультразвука на метаболизм бактерий производилось культивирование клеток штамма Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii I-63, используемого в промышленном производстве витамина В12, в субстрате на основе восстановленной молочной сыворотки с концентрацией лактозы 5%, а также добавками 0,002% CoCl₂·6H₂O и 0,001% MgSO₄. рН в процессе культивирования удерживался на уровне порядка 6,9 с помощью периодической нейтрализации среды.

Во время культивирования раз в сутки производилось кратковременное озвучивание сред ультразвуком низкой интенсивности и различной частоты. Для исследования метаболической активности бактерий в процессе культивирования были выбраны метод определения титруемой кислотности для определения количества синтезируемых бактериями органических кислот, по результатам титрования выяснено, что обработка ультразвуком вызывает повышение титруемой кислотности, причѐм на частоте 20 КГц этот эффект более выражен, чем на 22 КГц при одинаковой интенсивности облучения. Следующим этапом был выбор длительности озвучивания; при этом производилось культивирование пропионовокислых бактерий на аналогичной среде с обработкой субстрата ультразвуком на частоте 20 КГц в течение 10 и 20 минут каждые 24 часа.

Для сравнения различных режимов обработки использовались метод определения титруемой кислотности и спектрофотометрический метод для мониторинга состава сброженной сыворотки [4], а также микроскопический метод для сравнения морфологии клеток.

а	б	в

Рис. 1. Микроскопические препараты сброженной сыворотки при различных режимах озвучивания: а) без озвучивания; б) 10 минут; в) 20 минут

При этом выяснено, что при увеличении длительности обработки также увеличивается нарастание титруемой кислотности, а значит, ускоряются процессы брожения и увеличивается активность бактерий; кроме того, как видно на микроскопических препаратах, наблюдаются изменения в морфологии клеток, подвергающихся ультразвуковой обработке, в частности уменьшение их размеров по сравнению с контролем. При фотометрировании сброженной сыворотки после предварительной деструкции клеток и фильтрации среды были получены следующие спектры поглощения:

Рис. 2. Спектры поглощения сброженной сыворотки при различных режимах озвучивания: 1) без озвучивания; 2) 10 минут; 3) 20 минут

Максимумы поглощения света в видимой области образуемых в процессе роста пропионовокислых бактерий корриноидов относятся к порфириновому кольцу и имеют следующие значения: для цианокобаламина – 361 и 548 нм, оксикобаламина – 351 и 525 нм, 5'-дезоксиаденозилкобаламина - 375 нм; а также менее выраженные максимумы при 315, 340 и 522 нм [2,4]. Полученные спектры имеют ярко выраженные максимумы поглощения в областях, близких длине волны 351 (для второго образца), 361 (для первого образца) и 375 нм (для третьего образца), при этом спектры поглощения озвученных проб в коротковолновой части спектра практически совпадают. Благодаря полученным результатам можно сделать вывод, что подбором определѐнных условий озвучивания сред можно также направленно изменять соотношение различных форм витамина в среде при культивировании.

Таким образом, ультразвуковая модуляция метаболизма пропионовокислых бактерий является перспективным направлением для интенсификации промышленного получения витамина В12 и может быть использована также в производстве различных ферментированных пищевых продуктов, обогащѐнных витамином В12 и его аналогами.

Источник: Шершенков Б.С. и др. Ультразвуковая модуляция метаболической активности Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii при получении пищевых продуктов, обогащённых витамином В12 / Б.С. Шершенков, Е.П. Сучкова // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств», 2013. - №4.

Список литературы:

1. Акопян Б.В., Ершов Ю.А. Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами: Учеб. пособие / Под ред. С. И. Щукина. – М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2005. – 224 с.
2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч.: Учебн. пособие. – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: МЕДпресс-информ, 2007. – 624 с.
3. Воробъѐва Л.И. Промышленная микробиология: Учеб. пособие. – М.: изд-во МГУ, 1989. – 294 с.
4. Долгов В.В., Ованесов Е.Н., Щетникович К.А. Фотометрия в лабораторной практике. - М.: Российская медицинская академия последипломного образования, 2004.- 142 с.
5. Сучкова Е.П., Шершенков Б.С. Технологические решения при получении обогащѐнной витамином В12 молочной сыворотки. / Б.С. Шершенков, Е.П. Сучкова // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств», 2013. - №1. [Электронный ресурс]: http://www.processes.ihbt.ifmo.ru
6. Шершенков Б.С. Производство витаминизированных продуктов на основе молочной сыворотки. – Сборник трудов молодых учѐных. Ч. I: Сб. тр., с. 3-6. – СПб.: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2012. - 89 с.

Основные разделы:

Будьте здоровы!