ООО "ПРОПИОНИКС"
пн-пт с 09:00 до 18:00 | +7 (966) 348-80-35 |
прим. редактора - не путать с:
Создание современной технологии геномного редактирования, которая уже с успехом применяется на разных животных, растениях, грибах и бактериях, базируется на исследованиях бактериальных систем CRISPR-Cas. Изначально предполагалось, что они участвуют в ликвидации повреждений бактериальной ДНК, но в 2007 г. стало ясно, что истинное предназначение этих систем – борьба с вирусами бактерий, бактериофагами.
Бактериофаги – вирусы, которые при инфицировании прокариот влияют на все процессы жизнедеятельности бактериальной клетки, фактически превращая ее в фабрику по производству вирусного потомства. В конце концов, клетка разрушается, а вновь образованные вирусные частицы выходят наружу и могут заражать новые бактерии.
Несмотря на огромное число и разнообразие природных фагов, встречаемся мы с ними редко. Однако бывают ситуации, когда деятельность этих вирусов не остается незамеченной. Например, на предприятиях, где производят сыры, йогурты и другие кисломолочные продукты, часто приходится сталкиваться с вирусной атакой на бактерии, сбраживающие молоко. В большинстве таких случаев фаговая инфекция распространяется молниеносно, и полезные бактерии гибнут, что приводит к значительным экономическим потерям.
Именно благодаря прикладным исследованиям в интересах молочной промышленности, направленным на получение устойчивых к бактериофагам штаммов молочно-кислых бактерий, был открыт ряд механизмов, с помощью которых бактерии избегают инфекции. Параллельно были изучены способы, с помощью которых вирусы, в свою очередь, преодолевают бактериальные системы защиты.
Бактериофаги или фаги (от др.-греч. φᾰγω «пожираю») – вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК). Общая численность бактериофагов в природе примерно равна общей численности бактерий. Бактериофаги активно участвуют в круговороте химических веществ и энергии, оказывают заметное влияние на эволюцию микробов и бактерий.
Рис.1. Схема строения вириона фага семейства Myoviridae (слева), и микрофотография фага Т2, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Прим. ред.: Вирион - полноценная вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и капсида (оболочки, состоящей из белка и, реже, липидов) и находящаяся вне живой клетки. Вирионы большинства вирусов не проявляют никаких признаков биологической активности, пока не соприкоснутся с клеткой-хозяином, после чего образуют комплекс «вирус-клетка», способный жить и «производить» новые вирионы.
Большинство фагов состоит из головки диаметром 45–140 нм и отростка («хвоста») толщиной 10–40 нм и длиной 100–200 нм (рис. 1).
Так выглядят представители порядка Caudovirales («хвостатых фагов»), и именно их образ обычно извлекается из памяти при упоминании термина «бактериофаг». Содержимое головки состоит преимущественно из плотно упакованной молекулы ДНК или (реже) РНК, длина которой во много раз превышает размеры головки и достигает 60–70 мкм, и иногда небольшого количества белка — например, ферментов, которые осуществляют первичную транскрипцию генетического материала фага или способствуют ей. Капсид представляет собой белковую или (не у Caudovirales) липопротеиновую оболочку, собранную из множества копий одного или двух белков. Капсид может быть икосаэдрическим, сферическим, лимоновидным или плеоморфным [9], и именно он, по сути, определяет размер фагового генома.
Отросток представляет собой белковую трубку, окруженную у ряда бактериофагов (семейства Myoviridae, типовой представитель которого — фаг Т4) чехлом, состоящим из сократительных белков, подобных мышечным, благодаря чему он способен сокращаться, обнажая часть стержня. С головкой отросток стыкуется с помощью белкового кольца — «портала» («воротничка»). На противоположном конце, в основании, отросток содержит лизоцим (как домен белка, пронзающего клеточную стенку), служащий для точечного растворения пептидогликана. Возможно и нахождение в основании отростка АТФазы, обеспечивающей энергией инъекции нуклеиновой кислоты в бактерию [10]. Там же у фагов такого типа имеется гексагональная базальная пластинка с несколькими шиповидными выростами и тонкими длинными нитями, с помощью которых фаг распознает рецепторы «своих» бактерий и прикрепляется к ним.
Бактериофаги (фаги) – это вирусы, которые в ходе инфекции влияют на все процессы жизнедеятельности бактериальной клетки, фактически превращая ее в фабрику по производству вирусного потомства. В конце концов клетка разрушается, а вновь образованные вирусные частицы выходят наружу и могут заражать новые бактерии.
Фаги - облигатные внутриклеточные паразиты, так как у них нет механизмов для выработки энергии и рибосом для синтеза белка. Размножение фага происходит только внутри бактерии-хозяина и посредством ее синтетической машинерии. Важным свойством бактериофагов является их специфичность: фаги могут поражать определенный вид бактерий (моновалентные фаги) или же только избранные штаммы/варианты внутри вида (типовые фаги, например, фаги V. cholerae classica и El Tor), но некоторые не столь разборчивы и поражают бактерий разных видов и даже родов (поливалентные фаги) [11].
По характеру действия на бактерии различают вирулентные и умеренные фаги.
1) Взаимодействие вирулентного бактериофага с клеткой происходит по литическому пути и складывается из нескольких стадий: его адсорбции на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки и выхода вирионов из клетки [13].
Рис.2. Адсорбция фага PIcmlclr 100ts на поверхности Yersinia pestis.
Первоначально фаг обратимо, а затем и необратимо прикрепляется к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки (рис. 2). Ими могут быть компоненты пептидогликана и тейхоевых кислот грамположительных бактерий или внешней мембраны (порины, молекулы липополисахарида) грамотрицательных, белки капсул, половых пилей и жгутиков [14]. Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений (например, триптофана для фага Т2). При избытке фага в окружающей среде на одной клетке может адсорбироваться до 200–300 вирусных частиц [10].
С момента попадания фаговой нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку и до полного созревания в ней вирусных частиц проходит определенный отрезок времени, называемый латентным. Он уникален для каждой системы «бактерия — фаг» и может составлять от нескольких минут до нескольких часов [15].
Рис.3. Лизис E. coli и выход фаговых частиц. Справа — зрелая форма бактериофага.
Введенная ДНК фага вызывает полную перестройку метаболизма бактерии: прекращается синтез ее собственных ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага может начинать транскрибироваться его же РНК-полимеразой - например, фаг N4 впрыскивает этот фермент вместе с ДНК [16]. Или же, как в случае Т4, фаг впрыскивает фермент АДФ-рибозилтрансферазу, модифицирующий хозяйскую РНК-полимеразу так, что та переключается на транскрипцию исключительно фаговых генов [17]. Синтезирующиеся мРНК поступают на рибосомы бактерии, которые послушно производят белки бактериофага: ранние (ДНК-полимеразу, нуклеазы) и поздние (белки капсида, отростка, базальной пластинки и др.). Репликация ДНК бактериофага осуществляется его собственной ДНК-полимеразой. Поздние белки и копии фаговой ДНК объединяются, образуя зрелые инфекционные фаговые частицы [18]. Затем происходит лизис клетки-хозяина: фаговые лизины (гидролазы) и холины изнутри пробивают отверстия в ее мембране и пептидогликане, и в клетку начинает поступать вода. В итоге бактерия лопается с выходом зрелых бактериофагов (рис. 3). При этом в зависимости от типа фага количество образовавшихся вирионов будет различным - от единичных частиц до нескольких тысяч.
2). Умеренные фаги проникают в клетку так же, как и вирулентные. Умеренный фаг инициирует лизогенный цикл, при котором он вместо репликации обратимо взаимодействует с геномом бактерии-хозяина, интегрируясь в хромосому (фаг λ), либо поддерживается в клетке в виде низкокопийной плазмиды (фаги P1 и N15) [15]. В первом случае ДНК фага пассивно реплицируется в составе хромосомы. Так или иначе, при делении бактерии фаговый геном передается дочерним клеткам. Такое состояние фага называется профагом, в нём вирус может находиться во многих поколениях потомства первой зараженной им клетки. Бактерия, содержащая профаг, лизогенна до тех пор, пока при определенных условиях профаг не активируется и не вступит в литический цикл. Переход от лизогении к лизису называется лизогенной индукцией, или индукцией профага. На индукцию фага оказывают влияние условия внешней среды, состояние клетки хозяина, наличие питательных веществ и т.д.
На сегодня известно пять основных, весьма хитроумных механизмов защиты, которые бактерии выработали в непрестанной борьбе с вирусами: изменение рецептора на поверхности клетки; исключение суперинфекции; системы абортивной инфекции; системы рестрикции-модификации и, наконец, системы CRISPR/Cas.
Рис.4. На сегодня известно несколько стратегий, которые бактерии используют в борьбе с вирусами и плазмидами, в результате чего удается либо воспрепятствовать проникновению чужеродной ДНК в бактериальные клетки, либо уничтожить ее уже внутри бактерии. К таким способам защиты относятся изменение бактериальных клеточных рецепторов (1), исключение суперинфекции (множественного заражения) (2), системы рестрикции-модификации, разрушающие всю «чужую» неметилированную ДНК (3). В некоторых случаях бактериальная клетка даже идет на «самоубийство», чтобы ограничить численность вирусного потомства (системы абортивной инфекции) (4). Одним из самых впечатляющих примеров механизмов бактериального иммунитета являются системы CRISPR/Cas, основанные на «запоминании» патогенов (5)
Вирусная атака начинается с прикрепления фага к специфическому рецептору на поверхности бактериальной клетки, но при потере рецептора или изменении в его структуре связывания вируса не происходит. Бактерии могут менять рецепторы в зависимости от окружающих условий, таких как плотность и разнообразие микроорганизмов в среде, а также доступность питательных веществ.
Любопытный пример - бактерии вида Vibrio anguillarum, которые способны формировать биопленку, т. е. плотный слой клеток, прикрепленный к какой-либо поверхности. У этой бактерии имеется своего рода «чувство кворума», за счет чего при увеличении плотности клеток у них понижается выработка рецептора, с которым может связываться вирус. В результате биопленка становится почти полностью устойчивой к заражению.
Однако потеря рецепторов не всегда выгодна для бактерии, поскольку они выполняют разнообразные важные функции, например, транспорт питательных веществ или формирование межклеточных контактов. В результате для каждой пары «бактерия-бактериофаг» в ходе эволюции находится оптимальное решение, обеспечивающее приемлемый уровень защиты при сохранении возможности роста бактерий в различных условиях среды.
Следующий защитный механизм – исключение суперинфекции. Для бактериофагов известны два основных пути инфекции: литический, приводящий к быстрой гибели зараженной бактерии с высвобождением вирусного потомства, и затяжной лизогенный путь, когда наследственный материал вируса находится внутри генома бактерии, удваивается только с хозяйской ДНК, не причиняя клетке вреда. Когда клетка находится в состоянии лизогенной инфекции, то, с точки зрения «домашнего» вируса (профага), ее заражение другим вирусом нежелательно.
Действительно, многие вирусы, встроившие свою ДНК в геном клетки, ограничивают вновь проникшего в клетку бактериофага («суперинфекцию») посредством специальных белков-репрессоров, не позволяющих генам «пришельца» работать. А некоторые фаги даже препятствуют другим вирусным частицам проникнуть в инфицированную ими клетку, воздействуя на ее рецепторы. В результате бактерии – носительницы вируса имеют очевидное преимущество по сравнению с незараженными собратьями.
Во время инфекции все ресурсы бактериальной клетки направлены на производство новых вирусных частиц. Если рядом с такой клеткой будут находиться другие уязвимые бактерии, то инфекция быстро распространится и приведет к гибели большинства из них. Однако для таких случаев у бактерии имеются так называемые системы абортивной инфекции, которые приводят ее к запрограммированной гибели. Конечно, этот «альтруистичный» механизм не спасет саму зараженную клетку, но остановит распространение вирусной инфекции, что выгодно для всей популяции. Бактериальные системы абортивной инфекции очень разнообразны, но детали их функционирования пока изучены недостаточно.
К средствам противовирусной защиты бактерий относятся и системы рестрикции-модификации, в которые входят гены, кодирующие два белка-фермента - рестриктазу и метилазу. Рестриктаза узнает определенные последовательности ДНК длиной 4—6 нуклеотидов и вносит в них двуцепочечные разрывы. Метилаза, напротив, ковалентно модифицирует эти последовательности, добавляя к отдельным нуклеотидным основаниям метильные группы, что предотвращает их узнавание рестриктазой.
В ДНК бактерии, содержащей такую систему, все сайты модифицированы. И если бактерия заражается вирусом, ДНК которого не содержит подобной модификации, рестриктаза защитит от инфекции, разрушив вирусную ДНК. Многие вирусы «борются» с системами рестрикции-модификации, не используя в своих геномах последовательности, узнаваемые рестриктазой, – очевидно, что вирусные варианты с другой стратегией просто не оставили потомства.
Последней и в настоящее время самой интересной системой бактериального иммунитета является система CRISPR-Cas, с помощью которой бактерии способны «записывать» в собственный геном и передавать потомству информацию о фагах, с которыми они сталкивались в течение жизни. Наличие таких «воспоминаний» позволяет распознавать ДНК фага и эффективней противостоять ему при повторных инфекциях.
Таким образом, иммунитет бактерий многослойный. Во-первых, бактерия может быть изначально лишена рецепторов к тому или иному фагу или лишиться их посредством мутаций. Во-вторых, бактерия может быть иммунизирована уже «прописавшимися» в ней профагами, которые с помощью специфических репрессоров просто не дадут вновь прибывшим сородичам размножиться. В-третьих, бактерия (или ее мобильные генетические элементы) кодирует рестрикционно-модификационные системы, которые просто рубят на кусочки нуклеиновые кислоты, не содержащие особых метильных меток - подписей «я свой». А в-четвертых, в 2005 году стало известно, что функциональной основой бактериального иммунитета является система CRISPR [22], а в 2007-м году - что для работы этой системы критически важен белок Cas, а в 2012-м уже появилась возможность создания инженерных систем на основе CRISPR/Cas9 Streptococcus pyogenes [23].
CRISPR/Cas - система адаптивного иммунитета бактерий и архей
CRISPR - это система специфического иммунитета прокариот, характерная как для бактерий, так и для архей. CRISPR-системы состоят из геномных кассет, в которые записывается информация о вирусных или плазмидных инвазиях, и Cas-белков, обеспечивающих молекулярный механизм иммунитета. В ответ на инфекцию клетка с CRISPR вырезает из чужеродного генома небольшой фрагмент и встраивает его в кассету. Высокоэффективное узнавание ДНК, лежащее в основе работы CRISPR, оказалось привлекательно и для практического использования, и сейчас CRISPR-системы служат для точных манипуляций (технологий геномного редактирования) с самыми различными геномами (животных, растений, грибов и бактериях, в том числе и человека).
CRISPR (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – короткие палиндромные повторы регулярно расположенные группами) – особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивается клетка (бактериофагов, плазмид). РНК, транскрибирующиеся с локусов CRISPR, совместно с ассоциированными белакми Cas обеспечивают адаптивный иммунитет за счёт комплементарного связывания РНК с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующего разрушения их белками Cas.
Рис.5. Инфографика, образно показывающая структуру CRISPR-системы: в ДНК бактерий и архей выделяют особый участок - CRISPR-кассету. Она состоит из лидерного участка, регулярно повторяющихся (повторов) и уникальных участков ДНК (спейсеров). CRISPR-кассета вместе с Cas-генами и кодируемыми ими Cas-белками формирует CRISPR-систему
CRISPR-структуры были найдены у 45% всех известных бактерий и 85% архей [29]. В геномах эукариот и вирусов ничего подобного обнаружено не было. Со временем стало понятно, что CRISPR — это сложная многокомпонентная система, а повторы — только малая часть «айсберга». Из чего же состоит этот айсберг?
В первую очередь - из кассет, содержащих повторы и спейсеры. Число составных звеньев в CRISPR-кассете может варьировать от двух до нескольких сотен. Часто в геномах встречается более одной кассеты. Больше всего их обнаружено в ДНК метаногенной термофильной археи Methanocaldococcus jannaschii — 18 кассет занимают почти 1% ее генома.
СRISPR-структуры чаще располагаются на основной хромосоме (нуклеоиде), но иногда входят в состав плазмид (маленьких кольцевых, автономно реплицирующихся молекул ДНК). Повторы в кассете, как правило, строго совпадают между собой по длине и последовательности нуклеотидов. Лишь последний повтор иногда отличается от канонической последовательности остальных, да и то лишь в нескольких концевых позициях.
Для повторов характерна частичная диадная симметрия - участки последовательности в начале и в конце повтора обратно комплементарны. Благодаря этому концы палиндромных повторов могут взаимодействовать и образовывать устойчивые вторичные структуры, прежде всего шпильки.
Спейсеры в кассете часто равны по длине, но отличаются по последовательности нуклеотидов. Наборы спейсеров у штаммов одного вида тоже могут сильно различаться. Чередующиеся повторы и спейсеры образуют «тело» CRISPR-кассеты. «Головой» служит лидерная последовательность; она задает направление транскрипции кассеты (рис. 6). Средняя длина лидерной последовательности около 400 пар нуклеотидов; она не содержит открытых рамок считывания, т.е. не кодирует белки.
Рис.6. Структура CRISPR-кассеты. Спейсеры, повторы, лидерная последовательность: таков обобщенный портрет геномной CRISPR-структуры.
Лидерные последовательности отличаются высоким содержание аденина (A) и тимина (T). В AT-богатых регионах малая бороздка ДНК более узкая — такая топология служит характерным местом посадки для многих белков, взаимодействующих с ДНК. AT-богатые участки часто встречаются в регуляторных последовательностях и точках начала репликации. Предполагают, что лидерная последовательность регулирует транскрипцию CRISPR-кассеты, а значит и функционирование всей системы [33].
Никто не мог предположить, что практическая возможность лечить генетические болезни человека появится «благодаря» бактериям. В конце 80-х годов японские ученые частично секвенировали геном кишечной палочки и нашли интересный участок, который ничего не кодировал. Этот участок содержал повторяющиеся последовательности ДНК, разделенные вариабельными участками — спейсерами. Наличие протяженного некодирующего участка удивило японцев, так как бактерии экономно относятся к своей ДНК и обычно не несут лишних последовательностей. Позже подобные «кассеты» повторов и спейсеров найдут у большого количества бактерий и архей и назовут CRISPR.
Для бактерий одного вида характерно наличие многочисленных штаммов, которые часто сильно отличаются друг от друга. В некотором смысле штаммы можно рассматривать как аналог рас или пород животных. Один штамм одного и того же вида бактерии может быть совершенно безобидным, а другой — опасным патогеном. У разных штаммов бактерий обнаружилась вариабельность, или полиморфизм, по наличию, отсутствию или порядку спейсеров в CRISPR-кассетах.
Полиморфизм, по наличию, отсутствию или порядку спейсеров в CRISPR-кассетах, значение которого было совершенно неизвестно, стало широко использоваться для типирования штаммов и эпидемиологического анализа. В частности, компания Danisco, занимающаяся производством заквасок для молочной промышленности, стала использовать это свойство для классификации своих коммерческих штаммов. Это было удобно и из патентных соображений, ведь несанкционированное использование типированных штаммов Danisco можно было легко выявить и засудить нарушителей.
В начале 2000-х годов несколько ученых независимо друг от друга сравнили последовательности известных CRISPR-спейсеров с последовательностями ДНК, депонированными в публичные базы данных. Оказалось, что довольно часто последовательности спейсеров были похожи на последовательности вирусов. Это позволило предположить, что CRISPR-кассеты могут нести защитную функцию. Результаты были опубликованы в журналах, находящихся в нижней части научной «табели о рангах», и в общем мало кого заинтересовали. Тогда же были обнаружены Cas-гены, часто расположенные рядом с CRISPR-кассетами. Группа биоинформатика Евгения Кунина предложила довольно детальную гипотетическую схему механизма действия CRISPR/Cas-систем. Согласно их модели, при попадании вируса в клетку он обнаруживается с помощью белка Cas, использующего синтезированную c CRISPR РНК-копию. Если какой-либо фрагмент генома вируса совпал с записанным в спейсере, Cas разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате вся ДНК уничтожается.
Рис.7. Схематическое изображение системы CRISPR/Cas (Annual Review of Genetics)
При промышленном производстве кисломолочных продуктов вирусы-бактериофаги, случайно попадающие в ферментеры (огромные чаны с молоком и внесенными туда молочнокислыми бактериями), нарушают ферментацию, что приводит к огромным убыткам. Для того чтобы этого избежать, нужно использовать устойчивые к вирусам бактерии. Вывести такие бактерии просто: достаточно в лабораторных условиях отобрать клоны бактерий, способные к росту в присутствии вируса. Эту процедуру и провели в компании Danisco, но при выборке заметили одну важную особенность. Оказалось, что в CRISPR-кассетах клонов, ставших устойчивыми к вирусу, появлялись новые спейсеры, соответствовавшие участкам вирусного генома. Тогда ученые провели прямой эксперимент и методами молекулярной генетики вставили спейсер с последовательностью ДНК вируса в CRISPR-кассету бактерии. И такая генно-модифицированная бактерия действительно оказалась устойчивой к вирусу.
Эти результаты были опубликованы в журнале Science в 2007 году и были первым экспериментальным подтверждением защитного действия CRISPR/Cas-систем, опосредованного последовательностями спейсеров:
Эксперимент с термофильным стрептококком
Молочная промышленность постоянно обеспокоена подверженностью термофильного стрептококка S. thermophilus различным вирусным инфекциям. Неслучайно именно на этом модельном организме проведены ключевые эксперименты по уточнению функции CRISPR-систем.
Если заразить живую культуру Streptococcus thermophilus бактериофагами, то большинство бактерий погибнет, но очень небольшая часть выживет. Чем же выжившие отличаются от изначальной культуры? Оказалось, что их геном стал длиннее на 0.01% за счет того, что в CRISPR-кассету добавились 1–4 новых спейсера [45]. При повторном заражении этой культуры теми же бактериофагами все клоны выживали. Как будто, переболев вирусной инфекцией, бактерия стала немного опытнее и записала себе в «медицинскую карту» что-то важное об этом вирусе, и такая инфекция ей теперь не страшна. Действительно, новые спейсеры оказались комплементарны участкам генома заразившего ее вируса. Получается, что CRISPR-кассета — это история болезней бактерии, а спейсеры соответствуют записям об отдельных инфекциях. Если теперь искусственно вырезать из вирусного генома небольшие фрагменты и вставить их в виде новых спейсеров, то клетка окажется невосприимчива к исходному вирусу, даже если никогда раньше с ним не встречалась. Наблюдение оказалось верным и в обратную сторону: при удалении из CRISPR-кассет спейсеров, подобных последовательностям данного бактриофага, исчезала и устойчивость к нему [45]. Эта серия простых и изящных экспериментов на S. thermophilus полностью подтвердила гипотезу об иммунной функции CRISPR-систем. Благодаря полярной манере включения новых спейсеров, CRISPR-кассеты можно буквально читать как историю взаимоотношений прокариот и их вирусов на определённом эволюционном промежутке. CRISPR — это не только иммунитет, но ещё и память о недавних победах прокариотической клетки.
Что же происходит дальше с выжившей бактерией и вновь встроенным спейсером? По своему происхождению он полностью совпадает с участком фагового генома (протоспейсером) и обеспечивает полную защиту. Если клеток с таким спейсером много, то вирус вряд ли преуспеет в заражении большого числа бактерий и не сможет размножиться в массовых количествах, а, значит, вымрет. Не случись повторного заражения тем же вирусом, спейсер в кассете долго не задержится: со временем он будет утерян в результате рекомбинации между повторами кассеты.
Заметим, что вирус тоже не бездействует — он умеет «убегать» от CRISPR-иммунитета, накапливая точечные мутации в последовательности протоспейсера. Интересно, что единичные замены в некоторых из них сразу лишают бактерию устойчивости к вирусу, замены в других лишь несколько ослабляют ее. В любом случае, когда протоспейсер теряет сходство с бактериальным спейсером, как злоумышленник, сделавший серию пластических операций, становится непохож на себя, пропадает и устойчивость. Теперь клетку при заражения спасет только встраивание нового спейсера.
В нашем организме, после того, как мы переболели какой-то болезнью, остаются клетки памяти иммунной системы, которые при повторном попадании в организм вредителей активизируются и помогают ускоренно справиться с ними. Бактерии справляются со своими патогенами с помощью аналогичной «системы памяти»: CRISPR/Cas-системы обеспечивают иммунитет бактерий и архей против вирусов и плазмид.
Краткое описание работы системы CRISPR/Cas:
Работа системы CRISPR/Cas основана на том, что небольшой фрагмент, вырезанный из проникшей в бактериальную клетку фаговой ДНК, вставляется в специальный участок (локус CRISPR) генома бактерии. Каждый локус CRISPR содержит множество таких вставок (спейсеров, разделенных особыми короткими нуклеотидными повторами), представляющих собой фрагменты ДНК встреченных когда-либо фагов и плазмид. На основе спейсеров синтезируются молекулы РНК, комплементарные соответствующему участку фагового (или плазмидного) генома. Эти РНК в комплексе с белками Cas затем опознают и обезвреживают мишень - чужеродную ДНК с комплементарной последовательностью нуклеотидов. Таким образом, если в клетку однажды проникла фаговая ДНК, но клетка выжила и встроила фрагмент чужеродного генома в свой нуклеоид, то последующие попытки таких же фагов эксплуатировать клетку или ее потомков будут неэффективны.
Рис.8. При формировании адаптивного иммунитета бактерий бактериальные белки Cas1 и Cas2 встраивают фрагменты вирусной ДНК в качестве спейсеров в CRISPR-кассету, в которой соседние спейсеры отделены друг от друга повторами ДНК (Nuñez et al., 2014, 2015a, b). CRISPR-кассета транскрибируется с образованием длинной некодирующей РНК. Специальные белки Cas, а также, в некоторых случаях, другие белки бактерии нарезают эту РНК на короткие криспрРНК (крРНК или crРНК), каждая из которых содержит один спейсер и часть повтора. В ходе интерференции белки Cas вместе с крРНК образуют эффекторный комплекс, который сканирует ДНК клетки в поисках последовательностей, соответствующих спейсеру крРНК, и разрезает их (Westra et al., 2012; Jinek et al., 2012)
Системы CRISPR/Cas I и II типа
Наиболее изученной является система CRISPR/Cas I типа, которой обладает излюбленный объект молекулярно-биологических исследований – бактерия кишечная палочка (Esсherichia coli). Эффекторный комплекс в этой системе состоит из нескольких небольших белков Cas, каждый из которых отвечает за разные функции: разрезание длинной некодирующей CRISPR РНК, связывание коротких крРНК, поиск, а затем разрезание ДНК-мишени.
В системах II типа эффекторный комплекс образован единственным большим белком Cas9, который в одиночку справляется со всеми задачами. Именно простота и относительная компактность таких систем послужили основой для разработки технологии редактирования ДНК. Согласно этому методу, в клетки эукариот (например, человека) доставляют бактериальный белок Сas9 и крРНК, которую называют гидовой (гРНК). Вместо спейсера вирусного происхождения такая гРНК содержит целевую последовательность, соответствующую интересному для исследователя участку генома, например, где есть мутация, вызывающая какую-то болезнь. Получить же гРНК «на любой вкус» совсем несложно.
Эффекторный комплекс Cas9-гРНК вносит двуцепочечный разрыв в последовательность ДНК, точно соответствующую «гидовой» РНК. Если вместе с Cas9 и гРНК внести в клетку и последовательность ДНК, не содержащую мутацию, то место разрыва будет восстановлено по матрице «правильной» копии! Таким образом, используя разные гРНК, можно исправлять нежелательные мутации или вводить направленные изменения в гены-мишени.
Прим. ред.: Для решения инженерных задач больше всего подходит система II типа, т.к. она самая простая. Именно ее эффекторный белок Cas9 - то самое обозначение, что фигурирует в современных системах редактирования генома. Высокая точность программируемого узнавания мишеней комплексом Cas9-гРНК и простота метода привели к лавинообразному росту работ по редактированию геномов клеток животных и растений.
Итак, защитный комплекс CRISPR/Cas9 состоит из:
Рис.9. Схема работы комплекса Cas-РНК и CRISPR кассеты.
Иммунитет, обусловленный CRISPR/Cas, возникает за три стадии (см. рис. 9). В первой фазе бактерии или археи, у которых в геноме есть «блокнотик для записи» - CRISPR-кассета, - отвечают на появление вируса включением в конец кассеты коротких фрагментов чужеродной ДНК. На следующей стадии происходит транскрипция - считывание этой свежевключенной последовательности (образование описанных выше двух РНК) и обработка их нуклеазами. Теперь эти РНК могут специфично связаться с вирусной ДНК, и это взаимодействие через цепь событий приводит к ее расщеплению и «смерти» вредителя.
Грубо говоря, ситуация напоминает сказку про репку: первая РНК связывается с «репкой» - чужеродной ДНК - и «зовёт» вторую, вторая - специальный белок Cas9, который уже осуществляет двухцепочечный разрыв цепи чужой ДНК (См. также короткий занимательный видеоролик, просто объясняющий принцип работы CRISPR-Cas9).
Несмотря на то, что в природе две РНК системы Cas9 разделены, учёные показали, что химерная РНК, представляющая собой сшитые в одну цепь вышеуказанные РНК, так же способна направлять Cas9 к ДНК-мишени. Более того, при соблюдении ряда условий можно менять последовательность первой внутри химерной РНК так, чтобы нацеливать Cas9 на желаемые гены.
Молекулярные механизмы работы CRISPR/Cas
Какие молекулярные механизмы обеспечивают CRISPR-опосредованный иммунитет? Правильнее говорить о работе CRISPR/Cas-системы. Ведь только за счет сложных белковых машин из Cas-белков CRISPR-кассетам и удается реализовать защитную функцию. CRISPR/Cas-система работает в три такта: 1) адаптация, или приобретение новых спейсеров; 2) созревание эффекторных комплексов; 3) иммунный ответ, то есть разрушение чужеродной ДНК.
Адаптация.
Когда клетку с CRISPR-системой заражает вирус, из его генома вырезается небольшой фрагмент и встраивается в кассету в качестве спейсера [45]. При повторных заражениях одним и тем же агентом включение первого спейсера, особенно если он из-за случайных мутаций не обеспечивает полной защиты, ускоряет приобретение дополнительных спейсеров против того же самого чужеродного репликона. Это явление назвали праймированием [46]. Несколько спейсеров повышают шансы справиться с инфицирующим агентом даже при неполном совпадении спейсеров и протоспейсеров. Лидерная последовательность — это «точка роста» CRISPR-кассеты. С ней взаимодействуют белковые машины, отвечающие за включение новых спейсеров. Без лидерной последовательности кассеты не могут расти [47] (рис. 10).
Рис.10. Включение новых спейсеров в кассету
Привилегированных вирусных и плазмидных генов, служащих источником протоспейсеров, нет, однако это не совсем случайные последовательности. В вирусных геномах рядом с протоспейсерами находятся короткие, обычно длиной в два-три нуклеотида, PAM-мотивы (от. англ. protospacer adjacent motif) [48]. Это участки связывания белков, важных для выщепления протоспейсера и своеобразные подсказки для CRISPR-системы, что найденный спейсером участок относится к чужеродной ДНК.
Ключевые игроки на стадии приобретения новых спейсеров — белки Cas1 и Cas2 [49]. В некоторых случаях они даже слиты для удобства в один белок. Такая белковая машина работает последовательно: сканирует чужеродную ДНК в поисках PAM-последовательности; вырезает протоспейсер; распознает лидерную последовательность и вставляет новый спейсер с дополнительной копией повтора рядом с ней (рис. 10).
Созревание эффекторных комплексов.
Прим. ред.: Напомним, что в системах CRISPR/Cas II типа эффекторный комплекс образован единственным большим белком Cas9, который в одиночку справляется со всеми задачами.
Спейсеры - своего рода пассивная иммунная память. Для защиты от интервентов нужно перевести ее в активный иммунный ответ. Это тоже происходит в несколько стадий. Сначала СRISPR-кассета экспрессируется: она служит матрицей для синтеза длинной молекулы первичного РНК-предшественника. Экспрессия запускается благодаря регуляторной области в составе лидерной последовательности. Одновременно начинают синтезироваться Сas-белки. Из них строится скелет активного эффекторного комплекса. У кишечной палочки такой комплекс, названный Cascade [50], состоит из молекул пяти белков и по форме напоминает морского конька (рис. 3).
Рисунок 11. Структура Cascade-комплекса.
Комплекс из Cas-белков нарезает длинный первичный РНК-предшественник на короткие РНК (CRISPR-РНК или, кратко, crРНК), соответствующие последовательности одного спейсера, обрамленной неравными по длине участками повторов [50] (рис. 12). Субъединицы белкового комплекса расположены в пространстве так, что между ними образуется спиральная бороздка, в которую вкладывается crРНК. Cas-белки с намотанной на них crРНК составляют готовый к сражениям эффекторный комплекс.
Рисунок 12. Созревание эффекторных комплексов.
Иммунный ответ.
Правильно сориентированная сrРНК в составе комплекса может комплементарно взаимодействовать с протоспейсером в вирусной или плазмидной ДНК. Только этого мало: нужно не просто узнать чужеродную ДНК, но и уничтожить ее. У E. coliза это отвечает эндонуклеаза Cas3. Она может резать как одноцепочечную, так и двухцепочечную ДНК. Cas3 разрезает ДНК очень эффективно, но совсем не специфично. Эффекторные Cas-crРНК-комплексы, напротив, очень специфично узнают последовательности, комплементарные спейсеру, изменяют свою конформацию и только после этого рекрутируют и правильным образом усаживают на ДНК белок Cas3 [52]. Особенно важны для такого узнавания семь нуклеотидов на границе протоспейсера и PAM-мотива — якорный участок. Если между ним и сrРНК есть различия хотя бы в один нуклеотид, то CRISPR-иммунитет не сработает. Единичные отличия crРНК от протоспейсера вне этой области допускаются и уже не так драматически влияют на успех CRISPR-иммунитета. По мере накопления одноцепочечных разрывов в ДНК-мишени, сродство эффекторного комплекса к ней снижается: он отсоединяется и распадается на отдельные субъединицы. Cas3 вносит большое число разрывов, начиная с места посадки и далее в более или менее случайной манере, кроша ДНК-интервента (рис. 13). Возможно, короткие фрагменты ДНК, образованные в результате работы Cas3, служат заготовками для новых спейсеров. Такая преемственность между циклами работы CRISPR/Cas-систем могла бы объяснять эффект праймирования [46]. Описанный молекулярный сценарий позволяет CRISPR-системам нейтрализовать вирусные инфекции, предотвращать трансформацию плазмидами, нарушать процесс лизогенизации (перехода вирусов в покоящееся состояние за счет встраивания своего генома в геном прокариота-хозяина), а также препятствовать индукции провирусов (переходу покоящихся вирусов, интегрированных в геном, в активное состояние). Изначально считалось, что CRISPR-системы уничтожают только ДНК. Однако позднее открыли архейные CRISPR/Cas-системы, эффективные против вирусов с РНК-геномами [53].
Рис.13. Деградация чужеродной ДНК эффекторными комплексами CRISPR-систем.
«Гонка вооружений» между вирусами и бактериями
В ходе эволюции бактерии и бактериофаги выработали ряд приспособлений, которые должны обеспечить каждому из участников «гонки вооружений» преимущество в борьбе с противником или возможность уклониться от его атаки.
Что касается систем CRISPR-Cas, то если фаг обзаведется мутацией в протоспейсере, эффективность его узнавания эффекторным комплексом снижается, и фаг получает возможность заразить клетку. Но и бактерия не оставит без внимания такую попытку ускользнуть от CRISPR-Cas: в качестве ответной реакции она начинает с резко возросшей эффективностью приобретать новые дополнительные спейсеры из ДНК уже «знакомого» фага, пусть и мутировавшего. Такое явление, названное праймированной адаптацией, многократно повышает эффективность защитного действия систем CRISPR-Cas (Datsenko et al., 2012).
Некоторые бактериофаги реагируют на наличие в бактериальной клетке систем CRISPR-Cas выработкой особых анти CRISPR-белков, способных связываться с белками Cas и блокировать их функции (Bondy-Denomy et al., 2015). Еще одно ухищрение - обмен участков генома вируса, на которые нацелена система CRISPR-Cas, на участки геномов родственных вирусов, отличающихся по составу нуклеотидной последовательности (Paez-Espino et al., 2015).
Видео: занимательный мультик от научпоп-ресурса "Чердак", где очень просто показан принцип работы системы адаптивного иммунитета бактерий - CRISPR-Cas9. Этот механизм применим и для редактирования генома млекопитающих. Т.е. белок Cas9 может целенаправленно работать в эукариотических клетках.
Исходные системы, предсказанные учеными, кодировали большое количество Cas-белков, необходимых для бактериальной защиты. Но также был обнаружен класс систем, которые кодировали только один Cas-белок, правда очень большой. Защитное действие таких систем было продемонстрировано французской исследовательницей Эммануэль Шарпентье. Если в стандартных системах несколько белков собираются в сложный комплекс, связывающий CRISPR РНК, а затем этот комплекс узнает вирусную ДНК-мишень и привлекает еще один белок, «кусающий» вирусную ДНК, то в системе, которую повезло изучать Шарпентье, один белок, получивший название Cas9, выполняет все эти функции: и связывает CRISPR РНК, и узнает мишень, и «раскусывает» ее.
В 2012 году группы Шарпентье и Дженнифер Дудны из Университета Беркли опубликовали совместную статью в Science, где предложили способ перепрограммирования системы CRISPR/Cas таким образом, чтобы она стала направленно разрезать ДНК в участках, целенаправленно выбранных исследователем. В природе CRISPR РНК кодируется в CRISPR-кассете, связывается белками и потом узнает мишень. Оказалось, что можно получать неприродную CRISPR РНК с помощью химического или ферментативного синтеза. При этом место спейсера в такой РНК занимает последовательность, выбранная исследователем. Белок Cas9 способен «узнать» и связаться с такой синтетической СRISPR РНК (ее называют «гид») и становится запрограммированным на узнавание и разрезание соответствующего ей места в ДНК. Группы Шарпентье и Дудны продемонстрировали возможность такого подхода in vitro, то есть в пробирке.
Практически в это же время группы Джорджа Черча и его бывшего аспиранта Фенга Жанга (Feng Zhang) из Института Броуда в MIT показали, что бактериальный белок Cas9 и гид РНК способны «работать», узнавать и направленно разрезать ДНК в клетках высших организмов, в частности человека. MIT успел подать заявку на патент на день раньше, чем Беркли. С тех пор между двумя университетами начались патентные войны, которые продолжаются до сих пор.
Дополнительный материал
Рис.14. Система CRISPR-Cas, используемая для редактирования генома, включает в себя гидовую РНК (гРНК) и белок Cas9. С помощью белка Cas9 гРНК присоединяется к протоспейсеру – участку вирусной ДНК, соответствующему спейсеру гРНК (либо, в случае искусственной системы, участку целевого гена эукариотической клетки). После узнавания белок Cas9 разрезает цепь ДНК в одном строго определенном месте. Репарация ДНК в месте разреза может происходить по пути негомологичного соединения концов, в результате чего с большой частотой возникают мутации (а). Если же в клетку доставить искусственно синтезированную донорcкую молекулу, которая соответствует участку разрыва, то таким образом можно произвести либо замену участка гена (б), либо направленную встройку трансгена (в). Таким образом, с помощью системы CRISPR-Cas можно исправлять генетические нарушения или вносить желаемые изменения.
Мы диплоиды. Это значит, что у нас двойной набор хромосом — по одному от папы и мамы. Если одна из родительских хромосом «неправильная», то есть в ней изменена последовательность ДНК в каком-то важном гене, может возникнуть состояние носительства генетической болезни, а если обе копии неправильные — возникнет генетическая болезнь. Классический пример - гемофилия у царевича Алексея Романова. Его бабка Виктория передала ему неправильную копию гена на X-хромосоме, хотя сама от гемофилии не страдала, потому что у нее две X-хромосомы и вместо дефектной работала здоровая хромосома. А Алексею не повезло, ведь у него только одна Х-хромосома.
Для того чтобы вылечить генетическую болезнь, нужно исправить генетическую информацию, затронутую мутацией. Гемофилия, как и большинство генетических болезней, вызвана изменением только одной буквы ДНК, а всего в нашем геноме 6 миллиардов букв. Это тысячи книг размером с «Войну и мир». Мы должны найти только одну «опечатку» и исправить ее в заданном месте, не изменив ничего больше. Это и есть задача геномной медицины.
Видео: Редактирование генома с помощью системы CRISPR-Cas9
Чтобы исправить «неправильный» ген, нам нужен очень точный молекулярный «скальпель», который найдет мутантную последовательность нуклеотидов и сможет «вырезать» ее из ДНК. Таким «скальпелем» и является Cas9. С помощью гида РНК, последовательность которой совпадает с искомым местом, он может внести разрыв в нужное место генома. Узнавание мишени происходит на участке длиной в 20–30 нуклеотидов. В среднем последовательности такой длины встречаются в геноме человека единожды, что позволяет обеспечить точность. Клетка не умрет от внесения разрыва в ДНК, так как он будет исправлен по здоровой копии из парной хромосомы за счет естественного процесса репарации ДНК. Если парной хромосомы нет, как в случае гемофилии, можно внести в клетку участок «правильного» гена одновременно с Cas9 и РНК-гидом и использовать его как матрицу для залечивания внесенного разрыва.
С помощью CRISPR/Cas9 можно делать мультиплексное редактирование сразу нескольких неправильных генов. Для этого достаточно ввести белок Cas9 и несколько разных РНК-гидов. Каждый из них направит Cas9 к собственной мишени, и вместе они устранят генетическую проблему.
В целом описанный механизм функционирует за счет принципа комплементарности, который впервые был предложен Джимом Уотсоном и Френсисом Криком в их знаменитой модели двуцепочечной ДНК. Цепочки двойной спирали ДНК «узнают» друг друга по правилам комплементарности. CRISPR РНК узнает свои мишени в двуцепочечной ДНК таким же образом, при этом образуется необычная структура, содержащая двуцепочечный участок взаимокомплементарных РНК и одной из цепей ДНК-мишени, а другая цепь ДНК оказывается «вытесненной».
CRISPR/Cas9 в лечении наследственных заболеваний
В первую очередь с помощью CRISPR/Cas9 мы сможем лечить «простые», моногенные генетические заболевания: гемофилию, муковисцидоз, лейкемию. В этих случаях понятно, что именно нужно отредактировать, но существуют заболевания с высокой наследуемостью, генетическая природа которых очень сложна. Такие болезни — сложный результат взаимодействия разных генов и их вариантов. Поэтому надо понимать, что практическое применение CRISPR/Cas9 в медицине - это скорее отдаленное будущее, потребуется еще масса работы, улучшения технологии, ее надежности и безопасности.
К разделу: ДНК прокариот и эукариот
См. дополнительно: