Пробиотики - это живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью хозяина. На сегодняшний день на рынке появляется все больше коммерчески доступных продуктов, содержащих пробиотики. Профессионалы здравоохранения рекомендуют пробиотики по самым разным причинам - от их длительного иммуномодулирующего действия до доказанной пользы при лечении различных заболеваний. Что касается пробиотических продуктов, существует несколько важных аспектов, которые определяют степень успеха разработки от стенда (т.е. от лаборатории) к рынку. Целью этого обзора является изучение того, как современные знания о взаимодействиях микроб-микроб и хозяин-микроб могут быть использованы для разработки высококачественных, основанных на фактических данных пробиотических составов, в частности пробиотических пищевых добавок, с акцентом на выбор безопасных штаммов с соответствующими функциональными свойствами. Кроме того, мы выделим аспекты процесса производства пробиотиков, которые необходимо учитывать во время разработки продукта и последующего производственного процесса, чтобы гарантировать стабильную эффективность продукта с пробиотиками. Для каждой высококачественной пробиотической композиции важно провести скрининг нескольких штаммов и выбрать только те штаммы, которые демонстрируют соответствующие функциональные свойства и которые можно считать безопасными для потребления человеком. Кроме того, крайне важно уделять внимание процессу разработки и производства продукта, а также контролировать свойства безопасности и качества. Важно отметить, что положительные эффекты пробиотиков следует оценивать в исследованиях эффективности продукта и постмаркетинговых исследованиях, чтобы продемонстрировать их клиническую эффективность. Все эти аспекты должны быть оценены и подтверждены во время разработки успешного высококачественного пробиотика, готового к продаже.

1. Введение: Пробиотики и роль микроорганизмов в здоровье человека

Человеческое тело населено огромным количеством микроорганизмов, и большинство из них сосуществуют в человеческом теле или на нем, не причиняя вреда своему хозяину. В последние десятилетия мы начали ценить эти микроорганизмы не только за их вклад в переваривание нашей пищи. Хотя мы только начинаем понимать обширность сложной сети взаимодействий микроб-микроб и хозяин-микроб, которые происходят на каждой поверхности тела, мы признаем, что все эти взаимодействия чрезвычайно важны для нашего здоровья [1]. Поскольку наш организм не может самостоятельно выполнять все жизненно важные биохимические реакции, необходимые для гомеостаза здоровья, мы зависим от присутствия и активности комменсальных микроорганизмов. Достижения в области биотехнологии и медицины позволили нам не только выращивать, но и тщательно исследовать бактерии, обладающие потенциально полезными свойствами. Такие микроорганизмы можно использовать для специальной поддержки или восстановления гомеостаза и улучшения нашего здоровья; в данном случае мы называем эти микроорганизмы пробиотиками. Пробиотики - это живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью хозяина [2]. Наиболее широко используемые микроорганизмы, проявляющие пробиотические свойства и включаемые в пробиотические продукты, такие как функциональные продукты питания и пищевые добавки, - это Bifidobacterium spp. и молочнокислые бактерии.

В последние десятилетия большое количество состояний здоровья (болезней, расстройств, синдромов и недомоганий) было связано с изменениями в составе и активности микробиоты (теперь это обычно называется дисбиозом). Например, научные данные связывают дисбаланс кишечной микробиоты с растущим числом заболеваний или синдромов, таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника (СРК), острая, нозокомиальная диарея и диарея, связанная с антибиотиками (AAD), аллергические расстройства, такие как атопический дерматит (экзема) и аллергический ринит, колоректальный рак и метаболические нарушения, такие как ожирение, метаболический синдром, неалкогольная жировая болезнь печени и диабет 2 типа [3,4]. Точно так же дисбаланс, например, микробиоты влагалища был связан с вагинальными инфекциями. Большая часть этих исследований все еще носит косвенный или ассоциативный характер, а это означает, что неясно, является ли дисбаланс микробиоты причиной или следствием соответствующего заболевания. Тем не менее, тесная связь между микробиотой и болезнями человека подтверждается многими публикациями, и доказательства причинно-следственных исследований неуклонно растут [5]. Для большинства состояний здоровья пробиотики были изучены на предмет их способности предотвращать и / или улучшать соответствующее состояние или на их потенциал в качестве коадъювантов при лечении определенных состояний (например, сопутствующей терапии рака).

Количество имеющихся на рынке продуктов, содержащих пробиотики, постоянно увеличивается. Профессионалы здравоохранения рекомендуют пробиотики по самым разным причинам - от их длительного иммуномодулирующего действия до доказанной пользы при лечении различных заболеваний. Что касается пробиотических продуктов, независимо от того, классифицируются ли они как пищевые продукты, диетические добавки, функциональные продукты питания, медицинские продукты питания или лекарственные препараты, существует несколько важных аспектов, которые определяют степень успеха разработки рецептур пробиотиков от стенда к рынку. Целью настоящего обзора является изучение того, как современные знания о взаимодействии микроба с микробом и хозяина с микробом могут быть использованы для разработки высококачественных, научно обоснованных пробиотических рецептур с акцентом на отбор безопасных штаммов с соответствующими функциональными свойствами и разработку пробиотических пищевых добавок. Кроме того, мы выделим важные аспекты процесса производства пробиотиков, которые необходимо учитывать при разработке продукта и последующих производственных процессах, чтобы гарантировать последовательную эффективность и безопасность пробиотического продукта.

2. Отбор и разработка пробиотических штаммов

2.1. Концепция доказательных, индикативно-специфичных и многовидовых пробиотиков

Существует широкий спектр механизмов действия, с помощью которых пробиотические микроорганизмы могут оказывать свои биохимические, физиологические и, следовательно, клинические эффекты. Раскрытие новых и точных (молекулярных) механизмов действия в настоящее время является активной областью исследований, и поэтому эта тема также регулярно пересматривается [6,7]. Некоторые пробиотические действия непосредственно полезны для хозяина, потому что их благотворное воздействие непосредственно опосредовано через их метаболиты. В отличие от этого, другие виды деятельности требуют каскада (то есть сигнальных путей) (химических) реакций, чтобы в конечном итоге привести к пользе для здоровья хозяина. Основные механизмы действия пробиотиков включают, но не ограничиваются ими, действия, которые непосредственно влияют на взаимодействие микробов (например, перекрестное питание, конкуренция за питательные вещества, производство антимикробных веществ и производство молекул, чувствительных к кворуму), или действия, которые влияют на взаимодействие хозяина с микробом (например, регуляция проницаемости кишечного барьера, уровни цитопротекторных соединений (например, дефензинов) клетками хозяина, секреция слизи хозяина и моторика кишечника). Эти механизмы также включают воздействие, которое пробиотики могут оказывать на еще более сложные взаимодействия, такие как взаимодействие микроорганизмов с нашей иммунной системой (например, способствовать защите хозяина путем праймирования и кондиционирования специфических адаптивных иммунных реакций), эндокринной системой (например, влияя на уровень гормонов), системой кровообращения (например, влияя на систолическое кровяное давление) или неврологической системой (например, влияя на уровень нейромедиаторов). Несмотря на то, что мы только начали понимать механизмы действия пробиотиков, и дальнейшие исследования для выяснения точных молекулярных механизмов действия, безусловно, все еще оправданы, знания, которые уже существуют, могут быть использованы в качестве отправной точки для отбора штаммов с соответствующими функциональными свойствами.

Выбор того, какие функциональные свойства представляют интерес, зависит от целевого состояния здоровья (т.е. желаемая эффективность). Механическое понимание воздействия (определенных) микроорганизмов на физиологические процессы может быть преобразовано в критерии отбора штаммов для пробиотической композиции, которая предназначена для воздействия на конкретные состояния здоровья, при которых эти физиологические процессы нарушаются. Большинство состояний здоровья, на которые нацелены пробиотики, являются многофакторными, и поэтому нарушаются многие физиологические процессы. Учитывая огромное разнообразие взаимодействий микроб-микроб и хозяин-микроб, которые могут иметь место, это означает, что существует множество способов, которыми микроорганизмы поддерживают здоровье или положительно влияют на нарушенные физиологические процессы. Поскольку не существует такого понятия, как один штамм, способный самостоятельно выполнять все полезные действия, необходимо комбинировать разные штаммы пробиотиков с разной способностью, чтобы воздействовать на несколько нарушенных процессов. Существует большое разнообразие видов и штаммов микробов. Биохимические и физиологические свойства пробиотиков неоднородны и штаммоспецифичны. Свойства разных видов различаются между собой, и даже штаммы бактерий одного и того же вида могут иметь разные свойства. Например, некоторые штаммы Lactobacillus rhamnosus способны продуцировать связывающие слизь пили, в то время как другие штаммы L. rhamnosus - нет [8]. Чтобы воздействовать на многофакторные условия, пробиотический продукт должен состоять из комбинации нескольких штаммов, каждый со своим уникальным набором свойств. Следовательно, это означает, что конечный пробиотический состав часто будет содержать штаммы, принадлежащие к разным видам, что приводит к получению многовидового состава.

Важно выбрать штаммы пробиотиков, которые могут влиять на нарушенные физиологические процессы в состоянии здоровья, на которое нацелен соответствующий пробиотический продукт. В качестве иллюстрации для продукта, направленного на профилактику диабета 2 типа, будут выбраны другие штаммы, чем для продукта, направленного на профилактику аллергических заболеваний у детей, поскольку нарушаются другие физиологические процессы. Это можно назвать «специфическим указанием». Таким образом, для разработки наиболее эффективной пробиотической композиции по конкретному показанию необходимо сначала выявить нарушенные физиологические процессы в соответствующем состоянии здоровья (показание). Затем необходимо отобрать штаммы микроорганизмов, которые, как считается, способны влиять на эти нарушения. Свойства штаммов могут быть изучены с использованием широкого спектра скрининговых подходов. Эти знания в сочетании с выводами из научной литературы могут быть использованы в качестве научно обоснованного набора критериев отбора штаммов, обладающих уникальными функциональными свойствами и способных оказывать специфическое стимулирующее воздействие на здоровье, и, таким образом, могут быть включены в составы пробиотиков, специфичных для индикации и многовидовых пробиотиков.

2.2. Характеристика и функциональный скринингпробиотических штаммов (кандидатов)

Штаммы, включаемые в пробиотическую композицию, должны быть тщательно отобраны с учетом их индивидуальных особенностей. Широкий спектр скрининговых подходов может быть использован для скрининга коллекции (кандидатов) пробиотических штаммов и оценки того, какие штаммы соответствуют заданным критериям отбора штаммов. Эти модели скрининга варьируются от простых клеточных анализов in vitro до сложных ex vivo или животных моделей [9,10]. Хотя на бумаге клинические исследования in vivo могут быть наиболее подходящими для тестирования воздействия микроорганизмов на хозяина, поскольку они наиболее близки к реальным ситуациям, в большинстве случаев они не могут быть использованы для высокопроизводительного скрининга из-за их высокой стоимости и по этическим причинам. Кроме того, модели позволяют исследователям изучать и получать механистическое понимание состояния здоровья и болезни способами, которые были бы недоступны человеческому индивиду. Каждая модель имеет свои преимущества и недостатки, которые должны быть тщательно взвешены, прежде чем может быть сделан выбор подходящей модели. Для всех моделей следует понимать, что in vitro не всегда приводит к эффективности in vivo. Однако разработка сложных модельных систем in vitro и ex vivo идет быстрыми темпами, что делает их все более пригодными для предопределения или документирования пробиотических свойств. Учитывая разнообразие этой области исследований, мы выделим некоторые конкретные примеры скрининговых моделей, используемых для изучения взаимодействия пробиотиков и патогенов с акцентом на хорошо известном патогене Escherichia coli (кишечной палочке). Ключевые результаты этих анализов - понимание механизмов, используемых пробиотическими бактериями для ингибирования, в данном случае, кишечной палочки. Постулируемые антипатогенные стратегии пробиотических бактерий включают, но не ограничиваются ими, ингибирование роста, выработку антимикробных метаболитов, таких как молочная кислота, вмешательство в адгезию патогена путем исключения, конкуренции и вытеснения, коагрегацию с патогенами и стимуляцию иммунной защиты хозяина против патогенов [11]. Важно отметить, что поскольку эти механизмы сильно специфичны для вида или штамма, результаты, полученные с помощью конкретного пробиотического штамма или вида, не могут быть обобщены на все пробиотики [12]. В конечном счете, эти идеи способствуют нашему механистическому пониманию здоровья и болезней и помогают лучше разрабатывать пробиотические препараты.

Существует широкий спектр анализов in vitro, которые используются для скрининга (кандидатов) пробиотических штаммов. Эти анализы in vitro используются из-за их простоты и относительно низкой стоимости. Важным преимуществом анализов in vitro является их простота использования при одновременном скрининге нескольких штаммов. Были приняты соответствующие тесты in vitro для отбора штаммов на основе их способности выживать при прохождении через различные отделы желудочно-кишечного тракта. Кроме того, анализы in vitro можно использовать для изучения микробно-микробных взаимодействий. Эти модели также могут быть более сложными, например, моделирование сложных микробных экосистем in vitro, начиная от краткосрочных периодических инкубаций до многокомпонентных непрерывных систем. Подавление роста патогенов пробиотическими штаммами можно оценить с помощью методов совместного культивирования на агаровой основе. Например, рост E. coli DSM 1103 подавлялся Lactobacillus rhamnosus IMC501 и Lactobacillus paracasei IMC502 по сравнению с контролем с использованием как модифицированного метода перекрестных штрихов, так и метода радиальных штрихов [13]. Впоследствии зона ингибирования также была обнаружена с использованием бесклеточного супернатанта методом диффузии в лунках агара, что указывает на роль кислого pH или других антимикробных метаболитов. Было показано, что несколько видов Lactobacillus продуцируют биохимически активные соединения против патогенов. Например, вагинальный изолят Lactobacillus acidophilus CRL1259, как было показано, подавляет рост уропатогенной E. coli (UPEC) за счет выработки молочной кислоты [14]. Антимикробная активность пробиотических штаммов против E. coli также была продемонстрирована с использованием более сложных анализов in vitro: в качестве первого примера антипатогенная активность L. rhamnosus GG и S. cerevisiae boulardii CNCM-I-1079 против ЕТЕС - энтеротоксигенной E. coli LMG2092 имеет было продемонстрировано с использованием краткосрочных инкубаций микробиоты толстой кишки [15]. Эти инкубации адекватно моделируют нативную микробиоту и условия окружающей среды проксимального отдела толстой кишки доноров, включая слой слизистой оболочки толстой кишки. Чтобы учесть межиндивидуальные различия, два разных донора, взрослый и малыш, были использованы в качестве источника фонового сообщества толстой кишки. После инокуляции ЕТЕС в смоделированных дисбиотических условиях наблюдалось снижение концентрации ЕТЕС на 40% и 46% и снижение уровней токсина ЕТЕС на 57% и 46% при добавлении обоих штаммов во время экспериментов со взрослым донором и донором-малышом, соответственно. Во втором примере модель M-SHIME (динамическая имитационная модель пищеварительной системы человека в пробирке – ред.) была использована для демонстрации способности пробиотика Lactobacillus reuteri 1063 уменьшать колонизацию слизистой оболочки прикрепленным инвазивным патогеном E. coli (AIEC) [16]. Эта динамическая модель кишечника in vitro позволяет изучать микробиоту как просвета, так и слизистых оболочек кишечника. L. reuteri 1063 специально снижала количество AIEC в моделируемой слизистой оболочке среды M-SHIME, в то время как они не влияли на количество AIEC в просвете. В качестве возможного объяснения, обработка L. reuteri 1063 увеличивала уровни лактобацилл в слизи, что приводило к антимикробным эффектам против AIEC в слизи.

Кроме того, анализы in vitro используются для изучения взаимодействия хозяина и микроба. Примерами анализа in vitro является использование анализа клеточной линии человека для изучения бактериальной адгезии [17]. Адгезия также является механизмом, с помощью которого пробиотики могут ингибировать патогенные микроорганизмы (например, путем исключения, конкуренции и вытеснения механизмов, в которых предположительно могут играть роль стерические помехи и/или конкуренция за аналогичные рецепторы хозяина). Например, было показано, что специфические штаммы Lactobacillus jensenii и Lactobacillus gasseri ингибируют адгезию уропатогенных кишечных палочек (UPEC) к клеткам HeLa [18], а некоторые штаммы Lactobacillus crispatus могут исключать адгезию UPEC к клеткам вагинального эпителия [19]. Кроме того, было показано, что L. rhamnosus GG частично нарушает адгезию ETEC (энтеротоксигенной E. coli) к эпителиальным клеткам кишечника in vitro [20]. Клеточные линии, подобные этим, также используются для изучения влияния микроорганизмов на барьерную функцию эпителия. В пробиотических исследованиях анализы ко-культуры in vitro также часто используются для изучения взаимодействия с иммунной системой, поскольку модуляция иммунитета хозяина является одним из наиболее часто предлагаемых преимуществ для здоровья, приписываемых потреблению пробиотиков.

Модели ex vivo - это модели, культивируемые вне организма и содержащие функциональные живые ткани со сложной клеточной средой, найденной in vivo. Примером модели ex vivo, которая часто используется в пробиотических исследованиях, является камера Ussing [21,22]. Эта модель, в которой может быть установлен небольшой кусочек живой ткани млекопитающих или культивируемых клеток, является мощным инструментом ex vivo для изучения проницаемости или транспорта через клеточный слой. Недавние преимущества в моделях ex vivo привели к разработке новых перспективных моделей, таких как органоиды. Органоиды создаются из стволовых клеток, и одним из их самых больших преимуществ является то, что они содержат различные типы клеток и могут, например, воспроизводить нормальный эпителий. Новые инновационные модели, которые также начинают пробиваться в пробиотические исследования, - это модели «орган-на-чипе». Модели «орган-на-чипе» используют микрофлюидику, которая является недавним достижением в биоинженерии, и она демонстрирует большой потенциал для имитации сложных мультиорганных или многослойных систем, найденных in vivo [23]. Для демонстрации того, что пробиотический штамм может подавлять повреждение ворсинок, индуцированное специфическим патогеном, был использован микродевайс кишечника человека на чипе [24]. В этом исследовании модель кишечника на чипе была сначала колонизирована многовидовым пробиотиком с последующим добавлением иммунных клеток (PBMCs), энтероинвазивной кишечной палочки (EIEC) или обоих в комбинации. Повреждение, вызванное инфекцией EIEC, было значительно уменьшено при совместном культивировании мультиспецифического пробиотика в просвете эпителиального канала, о чем свидетельствует поддержание высоких значений TEER (трансэпителиальное электрическое сопротивление) и сохранение нормальной морфологии ворсинок. Несмотря на их потенциал, все еще существует много недостатков для всех этих новых более сложных моделей in vitro, поскольку они технически сложны, не подходят (пока) для высокопроизводительного скрининга, и работа с живыми микроорганизмами в этих модельных системах все еще довольно сложна.

Наше текущее понимание механизмов, лежащих в основе взаимодействий микробиома кишечника и хозяина, во многом основано на исследованиях на животных, особенно на грызунах. Однако эти модели не совсем подходят для скрининга нескольких штаммов, не говоря уже о больших коллекциях штаммов. Кроме того, актуальность этих моделей для взаимодействия микробиома кишечника и организма человека подвергается сомнению [25]. Однако в некоторых случаях модели на животных могут быть использованы для преодоления разрыва между лабораторией и клиникой [26], или доклинические испытания с использованием конкретных моделей на животных могут быть востребованы регулирующими органами.

В дополнение к скринингу функциональных свойств пробиотических штаммов с использованием моделей in vitro, ex vivo или животных, некоторые пробиотические функции также могут быть оценены на геномном уровне. С уменьшением затрат на секвенирование и улучшенными алгоритмами анализа геномов, анализ in silico стал мощным инструментом для проверки штаммов пробиотиков на предмет их потенциальных функциональных возможностей. Таким образом, применение функционального скрининга in silico может быть мощным подходом к предварительному отбору штаммов для последующих анализов in vitro, ex vivo или in vivo. Обычный скрининг in silico требует, чтобы нуклеотидная или аминокислотная последовательность интересующего гена или белка сравнивалась с геномами пробиотиков-кандидатов. Такой скрининг на основе гомологии требует, чтобы была известна генетическая основа (т.е. кодирующая последовательность) функциональности. Анализ in silico может быть мощной стратегией, когда нужно проверить штаммы на их способность синтезировать определенные хорошо изученные метаболиты. Например, гены, необходимые для производства бактериями короткоцепочечных жирных кислот или аминокислот, которые представляют собой метаболиты, важные для здоровья человека, хорошо описаны и, таким образом, делают их идеальными кандидатами для предварительного анализа in silico. Однако для функций, где точная генетическая основа остается неизвестной, такой традиционный подход in silico не подходит. В частности, для сложных функциональных признаков (таких как иммуномодуляция) генетическая основа чаще всего (пока) не раскрыта, поскольку они требуют взаимодействия и экспрессии широкого спектра генов как от штаммов микробов, так и от их хозяина. Очевидно, что быстрое продвижение исследований, связанных с функциональной геномикой, позволит получить больше знаний о генетической основе определенных функций, которые затем можно будет проверить с помощью обычных методов in silico. Примером может служить недавнее исследование, опубликованное Kenny et al. в котором авторы смогли предсказать и подтвердить новую группу микробных ферментов, участвующих в метаболизме холестерина [27]. Была использована мультидисциплинарная стратегия, объединяющая существующие наборы метагеномных и метаболомных данных, анализ микробного генома, а также биохимические и культуральные анализы in vitro. Используя этот подход, авторы смогли идентифицировать конкретные гены, ответственные за биохимические превращения, и связать это свойство с определенной кладой, в данном случае, еще некультивируемых видов бактерий. Благодаря повышенной вычислительной мощности и более умным алгоритмам теоретически также возможно применять сложные алгоритмы искусственного интеллекта для прогнозирования сложных функциональных характеристик микроорганизмов. Текущий недостаток заключается в том, что в эти алгоритмы необходимо вводить большие объемы генотипических и фенотипических данных для получения точных прогнозов, которые в настоящее время еще недоступны для сложных функциональных признаков. Однако такие алгоритмы, например, уже используются для прогнозирования устойчивости к противомикробным препаратам патогенных бактерий [28] или для разделения больных и здоровых людей на основе данных о составе микробиома [29]. Надежное использование таких методов для прогнозирования сложных функциональных характеристик микроорганизмов будет вопросом времени.

2.3. Идентификация и оценка безопасности (потенциальных) штаммов пробиотиков

Прежде чем намеренно подвергнуть человека воздействию большого количества микроорганизмов, существует моральное, но также и юридическое обязательство по обеспечению их безопасности. В Европейском союзе (ЕС), например, безопасность пищевых продуктов и, следовательно, внедрение микроорганизмов в пищевую цепочку регулируется постановлением (ЕС) № 178/2002. Несколько исследовательских групп, организаций и органов власти попытались предоставить руководящие принципы и / или рекомендации для определения безопасности микроорганизмов, предназначенных для использования людьми. Несмотря на то, что до сих пор нет единого мнения о методологии оценки безопасности микроорганизмов, существует общее признание некоторых аспектов оценки безопасности.

Все согласны с тем, что для установления профиля безопасности штамма должна быть проведена однозначная таксономическая идентификация. Следовательно, идентичность и таксономическое положение штаммов-кандидатов в пробиотики необходимо установить с использованием современных методов молекулярной биологии, биохимии и физиологии. На протяжении многих лет для идентификации и классификации организмов использовались разные подходы [30,31,32]. Классические подходы используют морфологические, физиологические и метаболические характеристики организмов. При таком подходе микробы группируются на основе легко наблюдаемых фенотипических характеристик (например, морфологии клеток, окрашивания по Граму, подвижности и структурных особенностей) и отличительных физиологических характеристик (например, моделей использования источника углерода и характеристик роста). Следуя этому подходу, фенотипические характеристики интересующего штамма сравнивают с характеристиками типовых штаммов родственных видов. Поскольку аналитические инструменты доступны для характеристики биохимических свойств клеток, микробы также группируются на основе хемотаксономических характеристик, таких как клеточные жирные кислоты или полярный липидный состав. К счастью, достижения в области молекулярных методов вносят важный вклад в определенную идентификацию и классификацию микроорганизмов на основе их генотипических характеристик. На протяжении последних десятилетий анализ последовательности гена 16S рРНК был золотым стандартом для идентификации бактерий и таксономической классификации. Однако одно заслуживающее внимания ограничение идентификации на основе этого маркерного гена состоит в том, что для некоторых видов бактерий последовательности гена 16S рРНК не обеспечивают достаточного разрешения и, следовательно, они не всегда позволяют идентифицировать видовой уровень и, следовательно, также не позволяют таксономическую классификацию. Кроме того, поскольку анализ последовательности гена 16S рРНК основан на одном гене, он никоим образом не подходит для идентификации на уровне штамма. Поскольку исследования показали, что пробиотическая активность может быть штаммоспецифичной [33], идентификация микробов на уровне штамма становится обязательной. Таким образом, анализ на основе последовательности всего генома становится все более популярным в качестве стандартного метода идентификации штаммов. Поскольку полногеномное секвенирование стало доступным, золотой стандарт таксономической классификации теперь также смещается в сторону анализа полногеномных последовательностей. Для таксономической классификации создаются филогенетические деревья на основе генома, чтобы установить таксономическое положение интересующего штамма по отношению к другим (общедоступным) геномам соответствующих и родственных видов. Однако следует признать, что современная классификация микробов сформирована историческими соображениями. Поскольку общепризнано, что классификация должна основываться на данных высочайшего качества, классификация постоянно пересматривается по мере того, как мы собираем больше молекулярных данных, и таксономические назначения должны быть соответствующим образом скорректированы. Изменения классификации могут привести к изменению названий штаммов. Недавним примером этого, который повлиял на пробиотическую область, была реклассификация рода Lactobacillus, что привело к новым названиям родов для многих хорошо известных штаммов пробиотиков [34]. Хотя основа для таксономических изменений является научно обоснованной, такие изменения действительно создают множество коммуникационных проблем как для науки, так и для промышленности, и, следовательно, потребуется время, прежде чем такие изменения названий будут полностью приняты всеми заинтересованными сторонами в области пробиотиков.

После детальной идентификации штаммов следует провести тщательную оценку безопасности. В научной литературе вопросы безопасности, связанные с потреблением живых микроорганизмов человеком, регулярно пересматриваются [35-42]. Принято считать, что безопасность штаммов микробов зависит от их внутренних свойств. биохимической и физиологической природы соответствующего микроорганизма. Ниже следует краткое изложение; живые микроорганизмы (включая комменсальные) могут быть ответственны за следующие побочные эффекты: (1) выработка метаболитов, вредных для хозяина (токсигенность), (2) вызывающие условно-патогенные (системные) инфекции (патогенность), (3) стимуляция чрезмерного иммунного ответа у восприимчивых людей и (4) перенос генов другим микроорганизмам (например, гены устойчивости к противомикробным препаратам). Исходя из этих соображений безопасности, обычно рекомендуется, чтобы перед использованием микроорганизма в его предполагаемой целевой популяции(популяциях) человека микроорганизм был должным образом охарактеризован и проверен на отсутствие переносимых генов устойчивости к противомикробным препаратам, а также на отсутствие токсических и/или патогенных свойств. Кроме того, безопасность зависит от предполагаемого использования микроорганизма, способа введения, уровня воздействия (дозы, продолжительности и частоты) и состояния здоровья потребителей (например, здоровых молодых людей, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом).

Для оценки безопасности микроорганизмов с использованием геномной информации такие (предварительные) руководства были предоставлены такими агентствами, как Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов (EFSA) [43,44]. Эти руководящие принципы содержат рекомендации по конкретным базам данных, которые можно использовать для сравнительного анализа генома, например, по базе данных факторов вирулентности (VFDB) [45]. Более того, что более важно, они предоставляют руководство о том, когда следует учитывать и сообщать о наличии гена вирулентности (включая пороговые значения для процентного покрытия последовательностей и процентного сходства последовательностей). Присутствие генов, кодирующих факторы вирулентности, может вызвать дальнейшее фенотипическое тестирование (например, тесты на цитотоксичность). Если оцениваемый штамм принадлежит к таксономической группе, содержащей известный продуцент (ы) токсинов млекопитающих, он должен быть исследован на предмет продукции токсина. Кроме того, если оцениваемый штамм принадлежит к группе с известным гемолитическим потенциалом, требуется определение гемолитической активности. В дополнение к оценке факторов вирулентности, важна тщательная оценка некоторых вредных метаболических процессов (например, выработка биогенных аминов). Как только фенотипическое тестирование подтвердит, что штамм обладает определенными свойствами вирулентности или вредоносной метаболической активностью, следует пересмотреть пригодность этого конкретного штамма в качестве штамма-кандидата в пробиотики.

В дополнение к возможным прямым пагубным последствиям, которые преднамеренно вводимые микроорганизмы могут оказывать на здоровье человека, существует общее мнение о том, что преднамеренное введение новых микроорганизмов в существующую экосистему увеличивает риск распространения устойчивости к противомикробным препаратам. Это рассматривается как общая проблема для здоровья. Следовательно, необходимо оценить профиль устойчивости к противомикробным препаратам штаммов-кандидатов в пробиотики, дополнить их оценкой способности штамма передавать устойчивость к противомикробным препаратам. Штаммы необходимо подвергнуть фенотипическому скринингу на устойчивость к противомикробным препаратам, и для каждого представляющего интерес противомикробного препарата полученную в результате измеренную минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) следует сравнить с пороговыми значениями, установленными для этого конкретного вида или группы микробов. Кроме того, для этих анализов были предоставлены руководящие принципы, например, EFSA, которое предоставило пороговые значения для определенных видов или групп микробов, которые в настоящее время добавляются в пищевую и кормовую цепочки [43,46]. При обнаружении значений MIC, превышающих эти пороговые значения, следует проводить анализ генома, чтобы изучить генетическую основу устойчивости к противомикробным препаратам. Первым шагом является специальный поиск генов, передающих устойчивость к противомикробным препаратам. Кроме того, для этих анализов отдельные (черновые) руководящие принципы, как, например, предоставленные EFSA [43,44], предоставляют рекомендации по конкретным базам данных, которые можно использовать для этих сравнительных анализов. Для этого анализа рекомендуется использовать как минимум две базы данных, такие как CARD [47] и ARG-ANNOT [48]. Кроме того, в этом случае руководящие принципы содержат рекомендации о том, когда следует рассматривать и сообщать о наличии гена (включая пороговые значения для процентного покрытия последовательностей и процентного сходства последовательностей). После подтверждения наличия генов устойчивости к противомикробным препаратам следующим шагом является оценка вероятности того, что эта специфическая устойчивость к противомикробным препаратам может передаваться другим микроорганизмам. Горизонтальный перенос генов является основным механизмом, облегчающим обмен генетической информацией между микроорганизмами. Горизонтальный перенос генов позволяет микроорганизмам приобретать гены устойчивости к противомикробным препаратам и тем самым способствует распространению генов устойчивости. Мобильные генетические элементы играют ключевую роль в горизонтальном переносе генов, и эти элементы включают те, которые способны перемещаться внутри или между молекулами ДНК (например, вставочные последовательности, транспозоны и генные кассеты / интегроны), а также те, которые способны переноситься между бактериальными клетки (например, плазмиды и интегративные конъюгативные элементы). Следовательно, локализация гена устойчивости к противомикробным препаратам является важным шагом, который необходимо предпринять после идентификации генов устойчивости к противомикробным препаратам [49]. Как только устойчивость к противомикробным препаратам помечается как потенциально передаваемая, этот штамм больше не следует рассматривать как кандидатный пробиотический штамм.

В общем, история безопасного использования в человеческой популяции обеспечивает сильный профиль безопасности пробиотического штамма с самого начала. Стандартизированный перечень микроорганизмов с документально подтвержденной историей безопасного использования в пищевых продуктах ведется Международной федерацией молочной промышленности (IDF) в сотрудничестве с Европейской ассоциацией пищевых и кормовых культур (EFFCA) с 2002 года [50,51]. Этот перечень содержит видовой обзор микроорганизмов, используемых пищевой промышленностью в пищевой промышленности в значительной степени, и тех, которые имеют долгую историю безопасного использования в пищевой промышленности без каких-либо побочных эффектов. В Европейском союзе (ЕС) EFSA ввело подход «Квалифицированная презумпция безопасности» (QPS) для облегчения и упрощения оценки безопасности микроорганизмов, требующих предварительного разрешения на рынок [50]. Это означает, что все штаммы, принадлежащие к определенному (под) виду, могут априори считаться безопасными в нескольких или большинстве аспектов, и только определенные оставшиеся аспекты безопасности требуют оценки на уровне штамма. Это включает в себя изучение отсутствия факторов вирулентности и/или специфических токсических метаболитов, представляющих интерес для определенных таксонов (например, для Bacillus spp.), и отсутствие трансмиссивных противомикробных сопротивлений для всех микроорганизмов. В ЕС статус QPS не является обязательным нормативным требованием для живых микроорганизмов, используемых в пищевых продуктах. Однако во всем мире существуют концептуальные различия в точных деталях оценки безопасности, необходимых для живых микроорганизмов, включенных в качестве пищевых ингредиентов в пищевые продукты. Например, в США продукция регулируется Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). FDA ввело концепцию «общепризнанных безопасных» (GRAS) в отношении пищевых продуктов и веществ (включая микроорганизмы), используемых в обычных пищевых продуктах [52]. Для микроорганизмов оценка GRAS проводится на уровне штамма, и оценки ограничиваются предполагаемыми условиями использования. В заключение следует отметить, что оценка безопасности пробиотического штамма-кандидата в целом соответствует общему подходу. Однако детали зависят от предполагаемого использования и целевого рынка готового пробиотического продукта.

2.4. Разработка процесса производства штаммов

Комбинируя усилия по идентификации и характеристике штаммов на основе функциональности и профиля безопасности, можно выбрать штаммы, которые демонстрируют соответствующие функциональные свойства и которые можно считать безопасными для потребления человеком. Однако еще одним важным препятствием является технологичность: перспективные штаммы могут не стать успешными пробиотическими штаммами, если они не пройдут этапы разработки производственного процесса. Начиная с конца, желаемая коммерческая пробиотическая композиция будет состоять из жизнеспособных концентрированных клеток, которые являются стабильными и будут иметь стабильную производительность в предполагаемом применении. Особенно для высококачественных пробиотических препаратов с дозами, установленными в ходе клинических испытаний, клиенты ожидают высокого количества клеток и длительной стабильности срока хранения в различных температурных и влажностных условиях. Чтобы контролировать процесс производства и тем самым качество каждого штамма в конечной пробиотической рецептуре, общепринятой практикой является то, что клеточная масса каждого штамма производится отдельно.

В общем, процесс производства микроорганизмов для пробиотических пищевых добавок следует ряду общих шагов, как это также недавно было рассмотрено [53]. Таким образом, окончательный коммерческий процесс производства необходимых количеств жизнеспособных, концентрированных и стабильных микробных клеток включает предшествующие этапы обработки (например, приготовление среды и приготовление инокулята), этап фактической ферментации, во время которого производится клеточная биомасса, и этапы последующей обработки (например, концентрирование клеток и сушка клеток), при котором клеточная масса восстанавливается, концентрируется и стабилизируется. Затем полученный материал можно использовать для смешивания с другими ингредиентами для производства готового пробиотического продукта. Однако, прежде чем штамм может быть успешно произведен в промышленном масштабе, необходимо выполнить дорогостоящие и трудоемкие работы по разработке производственного процесса, чтобы получить штамм в лабораторных условиях, а затем в пилотных масштабах и до крупномасштабного промышленного производства. Большое количество небольших изменений в производстве концентрированных пробиотических клеток может оказать большое общее влияние на качество и производительность продукта. Есть несколько важных аспектов, которые необходимо учитывать в процессе разработки штамма. Уже на стадии ферментации существует множество переменных, которые необходимо оценить и проверить до и во время масштабирования производственного процесса. Прежде всего, состав среды, а именно тип и количество источника углерода (например, глюкозы), тип и количество источника азота (например, дрожжевой экстракт), а также тип и количество других макро- и микронутриентов (например, магния) - необходимо тщательно установить. Б Кроме того, условия во время фактических ферментаций, такие как начальный рН и заданное значение рН во время ферментации, температура инкубации, скорость перемешивания и уровень растворенного кислорода, требуют внимания. Кроме того, фаза роста и объем посевного материала, количество стадий ферментации, а также время получения окончательного урожая (например, после истощения источника углерода) будут иметь влияние на конечное качество и производительность пробиотических клеток. Уже во время разработки процесса производства штаммов необходимо сделать важный выбор в отношении предполагаемого использования и применения готового пробиотического продукта, поскольку этот выбор повлияет на последующие этапы обработки. Обычно ожидается, что пробиотики, особенно когда они включены в пищевые добавки, будут иметь стабильность до 24 месяцев при температуре и влажности окружающей среды. Один из способов сохранить жизнеспособные бактериальные клетки в течение длительного времени - высушить их. Сушка микробных клеток обычно достигается сублимационной сушкой или сушкой распылением. Чтобы облегчить выживание клеток во время сушки, клетки часто готовят заранее. Композиция образует матрицу, которая встраивается в клетки и защищает их во время замораживания и сушки от различных вредных воздействий, оказываемых на клетки. Если был сделан выбор для получения штамма в виде сублимированных клеток в порошкообразной форме, то многие последующие шаги и переменные должны быть оценены и подтверждены, прежде чем будет иметь место масштабирование производственного процесса. Например, скорость и метод центрифугирования, а также то, какие криопротекторы (например, маннит), лиопротекторы (например, мальтодекстрин) и/или другие соединения (например, буферы) следует использовать для защиты во время начальной стадии замораживания и последующей стадии сублимационной сушки, являются важными аспектами для оценки. Кроме того, настройки сублимационной сушилки - в частности, температурные и вакуумные профили для эффективной первичной и вторичной сушки - имеют первостепенное значение. Таким образом, разработка производственного процесса является дорогостоящей, трудоемкой и требует специальных знаний, поскольку каждый этап процесса зависит от результатов предыдущих этапов. Кроме того, масштабирование процесса может быть очень сложным, поскольку во время масштабирования меняются некоторые переменные, такие как используемые объемы и оборудование. Например, процессы переноса, такие как массообмен газа (например, O₂ и CO₂) и процессы теплопередачи, часто не учитываются должным образом во время апскейлинга, поскольку они не масштабируются линейно. Кроме того, для каждого штамма необходима специальная разработка производственного процесса из-за его чувствительности к факторам окружающей среды.

3. Важные аспекты, которые необходимо учитывать при разработке рецептуры продукта и производственного процесса

3.1. Разработка рецептуры продукта и производственного процесса

Существует множество аспектов процесса производства, упаковки и обращения с пробиотическим продуктом, которые влияют на качество готового продукта. На первом этапе производства продукта стабилизированные (например, лиофилизированные) клетки составляются (смешиваются) с другими ингредиентами, такими как вспомогательные вещества (наполнители) и добавки, повышающие текучесть. Для обеспечения жизнеспособности микробов и эффективности продукта в пробиотический состав могут быть добавлены дополнительные активные ингредиенты для оптимизации таких свойств, как жизнеспособность, стабильность, метаболическая активность и выживаемость микробных клеток в желудочно-кишечном тракте. В дополнение к внутренним желудочно-кишечным свойствам, связанным с выживаемостью пробиотических штаммов (например, их чувствительность к кислоте, пищеварительным ферментам или желчи), одним из ключевых факторов выживания микробов является обеспечение того, чтобы микробные клетки были как можно более «пригодными», прежде чем они попадут в желудочно-кишечный тракт. Например, в результате длительного хранения или неправильного восстановления из их (сублимированного) высушенного состояния микробные клетки могли быть повреждены, что влияет на их чувствительность к условиям окружающей среды во время прохождения ЖКТ. Добавление дополнительных ингредиентов в рецептуру (таких как минералы и пребиотики) может повысить долгосрочную стабильность микробных клеток и обеспечить их жизнеспособность при повторной активации (регидратации) и тем самым повысить их метаболическую активность и желудочно-кишечную выживаемость. В конце концов, это приводит к повышению эффективности продукта. Кроме того, добавление других функциональных ингредиентов, таких как витамины или минералы, может быть желательным в свете предполагаемого использования продукта для обеспечения дополнительной пользы для здоровья. Все эти дополнительные ингредиенты могут влиять на ключевые свойства конечной рецептуры, и поэтому влияние этих ингредиентов на производительность пробиотических клеток должно быть оценено и подтверждено (тестирование совместимости ингредиентов). Однако, в отличие от других пищевых добавок, все пробиотические штаммы являются живыми организмами, и на их жизнеспособность и активность может сильно повлиять добавление большого количества дополнительных (функциональных) ингредиентов, поскольку эти соединения часто также участвуют в последующих микробных физиологических и метаболических процессах. Кроме того, обработка и условия длительного хранения также могут влиять на эффективность пробиотиков. Поэтому важно обратить внимание на формат конечного продукта и упаковку. Для пищевых добавок с пробиотиками чаще всего производятся порошковые саше или упаковка в виде карандашей, таблетки или капсулы, и обычно эти продукты могут храниться в условиях окружающей среды в течение длительных периодов времени. Во время разработки продукта и производственного процесса, воспроизводимость важна для обеспечения постоянной высокой производительности и качества. Для этого необходим контроль качества на протяжении всего производственного процесса, от сырья до готовой продукции, а документирование надлежащего контроля качества.

3.2. Качественные свойства пробиотических препаратов

3.2.1. Жизнеспособность в течение всего срока хранения (стабильность)

Пробиотики - это живые микроорганизмы по определению, и поэтому одним из наиболее важных аспектов качества является поддержание жизнеспособности пробиотических микроорганизмов с течением времени. Поэтому очень важно, чтобы готовый продукт содержал жизнеспособные клетки. Жизнеспособность обычно измеряется в колониеобразующих единицах. Кроме того, для оптимальной эффективности пробиотической композиции для конечного пользователя важно обеспечить жизнеспособность микробных клеток до конца срока годности (стабильность). Таким образом, количественная оценка жизнеспособности после производства имеет важное значение для обеспечения маркированного количества жизнеспособных пробиотических клеток также в конце срока годности. На стабильность пробиотиков может влиять множество различных факторов, включая факторы окружающей среды, такие как активность воды (A_w), температура, рН и воздействие кислорода. Для обеспечения жизнеспособности и стабильности пробиотиков следует уделять внимание технологическим аспектам продукта, таким как матричный дизайн, формат конечного продукта, упаковочный материал, условия хранения, транспортировка и логистика распределения, поскольку все эти факторы могут иметь большое влияние на жизнеспособность продукта на протяжении всего срока годности.

3.2.2. Выживание в ЖКТ

Чтобы выжить при прохождении через желудок и тонкий кишечник, пробиотические штаммы должны выдерживать враждебные условия, с которыми они столкнутся во время прохождения через желудочно-кишечный тракт. Относительно простые модели in vitro используются для моделирования прохождения пробиотических микроорганизмов по желудочно-кишечному тракту и оценки их выживаемости. Количественная экстраполяция моделей in vitro на эффективность пробиотиков in vivo остается сложной задачей. Однако эти модели in vitro полезны для оценки конкретных важных (экологических) факторов, таких как воздействие низкого рН, пищеварительных ферментов, включая пепсин, панкреатин и соли желчи. Хотя желудочно-кишечная выживаемость штамма в значительной степени зависит от внутренних физиологических свойств самих пробиотических штаммов, выбор дополнительных ингредиентов (например, дизайн пищевой матрицы) и формат конечного продукта могут влиять на желудочно-кишечную выживаемость микробных клеток в готовом продукте.

3.2.3. Активность

Метаболическая или биологическая активность - один из важнейших параметров качества пробиотического продукта. Это даже более важно, чем количество колониеобразующих единиц в продукте. Из-за добавления дополнительных ингредиентов к окончательной рецептуре или воздействия на продукт определенных условий окружающей среды (например, условий, встречающихся во время прохождения через желудочно-кишечный тракт), микробные клетки могут быть повреждены таким образом, что они все еще будут выживать, но уже не достигнут своего полного (метаболического) уровня активности. Эти клетки будут учитываться при подсчете жизнеспособных клеток, но потенциально не будут работать с механизмами, для которых они были выбраны. Для большинства пробиотических механизмов действия крайне важно, чтобы клетки были метаболически активны. Каждый штамм в продукте имеет свою собственную функциональную активность, для которой он был выбран, но есть также несколько общих пробиотических механизмов, которые могут быть использованы для оценки как метаболической активности, так и пробиотической активности одновременно, и таким образом эти активности могут быть использованы косвенно в качестве считывания для оценки общей функциональной эффективности готового продукта. Одним из примеров подхода к оценке метаболической активности микробных клеток является измерение образования конечных продуктов метаболизма. Поскольку в настоящее время большинство пробиотических штаммов являются (факультативными) анаэробами, кислоты являются типичными конечными продуктами метаболизма. Кроме того, более конкретно, поскольку большинство пробиотиков (не все), продаваемых в настоящее время, представляют собой молочнокислые бактерии, молочная кислота в качестве основного конечного метаболического продукта является «считывающим устройством», которое можно использовать для оценки метаболической активности. Таким образом, можно утверждать, что чем больше (молочной) кислоты продуцируют пробиотические микроорганизмы, тем более они метаболически активны. Как также обсуждалось в предыдущих абзацах, молочная кислота является одним из метаболитов, продуцируемых многими штаммами пробиотиков, с помощью которых они могут подавлять рост патогенов, и поэтому она также является индикатором пробиотической активности. Таким образом, измерение продукции (молочной) кислоты считается отличным методом для измерения как метаболической, так и пробиотической активности пробиотических штаммов. Производство (молочной) кислоты пробиотическими микроорганизмами также может быть измерено с течением времени, например после моделирования прохождения через желудок (путем добавления капли кислоты), и может быть снова использовано в качестве параметра метаболической активности пробиотического продукта.

3.3. Обширный мониторинг качества на протяжении всего производственного процесса

3.3.1. Проверка жизнеспособности и состава

Поскольку пробиотики являются живыми микроорганизмами, метод количественной оценки жизнеспособности клеток имеет важное значение. Традиционно жизнеспособность микроорганизмов оценивается на основе способности микробных клеток размножаться до обнаруживаемых уровней либо в виде колонии на агаре, либо по мутности в питательной среде бульона. До настоящего времени подсчет микробов с помощью методов подсчета на чашках является золотым стандартом для количественной оценки микроорганизмов в пробиотической промышленности, и общепринято, что количество пробиотических микроорганизмов следует указывать в колониеобразующих единицах (КОЕ) на грамм или порцию [54]. Несмотря на техническую простоту, этот подход сопряжен с множеством технических проблем, и в настоящее время разрабатываются альтернативные методы измерения жизнеспособности. В последние годы проточная цитометрия нашла свое применение в области микробиологии и была разработана как простой инструмент для быстрого анализа жизнеспособности. Несмотря на эти достижения в аналитических методах, проверка состава остается сложной ситуацией для продуктов, содержащих несколько штаммов, поскольку доступные методы часто не позволяют различить разные штаммы. Молекулярные методы предлагают еще одну многообещающую альтернативу традиционному подсчету пробиотических продуктов на чашках. Благодаря прогрессу в секвенировании генома и биоинформатике, этот подход имеет потенциал для быстрого и точного подсчета жизнеспособных пробиотиков до уровня штамма. Анализы штамм-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут быть разработаны с использованием штамм-специфичных наборов праймеров и зондов для ПЦР, нацеленных на уникальные вставки / делеции или однонуклеотидные полиморфизмы в последовательностях ДНК, на основе которых они могут даже различать филогенетически схожие штаммы. Кроме того, в настоящее время в этой области разрабатываются методы количественного определения жизнеспособных клеток с использованием метода ПЦР в сочетании с методами окрашивания живых и мертвых клеток [55,56]. Эти методы основаны на том подходе, что перед извлечением и амплификацией ДНК образцы обрабатывают красителем жизнеспособности-молекулой, которая избирательно проникает в клетки с поврежденными мембранами и интеркалируется в их ДНК. Поскольку живые клетки обычно исключают краситель, в результате только их немодифицированная ДНК избирательно амплифицируется методом ПЦР. В настоящее время существует несколько ДНК-интеркалирующих красителей, которые могут быть применены для разработки ПЦР-анализов жизнеспособности. Разработка ПЦР-анализов жизнеспособности в сочетании с разработкой высокоспецифичных (то есть штаммспецифичных) ПЦР-анализов имеет большие перспективы для пробиотической промышленности. Конечная цель состоит в том, чтобы иметь возможность оценить жизнеспособность каждого отдельного штамма на протяжении всего срока хранения пробиотического продукта.

3.3.2. Контроль безопасности и качества

Безопасность и качество продукции имеют большое значение, и производителям пробиотиков рекомендуется выбирать систему качества, отвечающую требованиям безопасности и качества продукции. В контексте пищевых добавок существуют системы управления безопасностью пищевых продуктов, которые обеспечивают системный подход к контролю рисков безопасности пищевых продуктов в рамках пищевого бизнеса. В ЕС операторы пищевой промышленности, например, обязаны в соответствии с регламентом (ЕС) № 852/2004 (который содержит общие правила гигиены пищевых продуктов) работать с системой управления безопасностью пищевых продуктов, основанной на принципах критической контрольной точки анализа опасности (HACCP или рус. ХАССП). Гигиена является важным пунктом внимания на протяжении всего производства, а также контроля сырья и логистического процесса. Кроме того, определенные необходимые действия при производстве, упаковке, маркировке и хранении пищевых добавок необходимы для обеспечения того, чтобы пищевая добавка соответствовала своей маркировке и не содержала вредных или нежелательных веществ, таких как микробные загрязнители, пестициды, тяжелые металлы или другие примеси. При разработке, внедрении и обслуживании системы управления качеством пищевых продуктов безопасность пищевых продуктов решается путем анализа и контроля биологических, химических и физических опасностей от производства сырья, закупок и обработки до производства, распределения и потребления готовой продукции. Существуют недавние обзоры, которые дают отличный обзор аспектов контроля качества и обеспечения качества, которые необходимо учитывать при производстве пробиотических пищевых добавок, чтобы соответствовать нормативным указаниям и отраслевым стандартам [53,54]. Рекомендации включают проведение сертификации независимыми сторонними организациями и соблюдение стандартов, установленных или требуемых правительственными и неправительственными учреждениями, такими как FDA, EFSA и Codex Alimentarius. Такие меры обеспечивают гарантию качества и облегчают соблюдение нормативных требований в отношении ингредиента или готового продукта.

4. Клиническая эффективность пробиотического продукта.

Несмотря на огромные усилия, которые часто вкладываются в разработку пробиотического продукта, его клиническую эффективность предсказать невозможно. Несмотря на то, что вышеупомянутые аспекты скрининга in silico, анализов in vitro и нормативных требований становятся все лучше, более продвинутыми и более строгими, клинические испытания готового продукта для подтверждения его эффективности остаются неизбежными. В настоящее время пробиотики являются предметом обширных исследований в области здравоохранения и медицины, поскольку их потенциальные показания неуклонно растут из-за растущего понимания воздействия микробиоты (кишечника) на здоровье человека. Исследуемые показания сильно различаются и варьируются от снятия дискомфорта со стороны желудочно-кишечного тракта (чаще всего AAD) до модуляции оси кишечник-мозг. Принимая во внимание предыдущие абзацы, важно, чтобы клинические исследования проводились с пробиотическим составом (и формой), имеющимся на полках, чтобы конечный потребитель мог ожидать таких же положительных эффектов, как продемонстрировано в соответствующем клиническом исследовании. В следующих параграфах обсуждаются некоторые из основных показаний и выделяются несколько примеров доступных клинических испытаний, в которых пробиотические составы показали клиническую эффективность. В этом контексте мы также рекомендуем отличные обзорные статьи Ritchie et al. [57], Zhao et al. [58] и Huang et al. [59], которые предоставляют систематический обзор имеющихся в настоящее время данных о клинической эффективности в отношении соответствующих показаний.

4.1. Антибиотик-Ассоциированная Диарея

Применение пробиотиков для лечения ААД относится к числу наиболее устоявшихся показаний. В исследовании, опубликованном в 2008 году в Американском журнале гастроэнтерологии, изучалось влияние пробиотиков на состав микробиоты кишечника здоровых добровольцев во время и после приема Амоксициллина с использованием многовидовой пробиотической композиции [60]. Исследование четко показало, что применение антибиотиков приводит к дестабилизации микробиоты кишечника и может быть косвенной причиной диареи. Пробиотическое вмешательство привело к значительному улучшению состава микробиома и его разнообразия. Пробиотическое вмешательство снизило частоту ААД (и, предположительно, также снизило связанные с этим расходы на здравоохранение) независимо от того, был ли пробиотик принят во время или после лечения антибиотиками.

Одним из конкретных патогенов, часто связанных с ААД, является Clostridioides difficile (ранее известная как Clostridium difficile). Тяжесть диареи, вызванной этим возбудителем, может варьироваться от легких случаев до псевдомембранозного колита. Исследование, проведенное Hell et al. показали, что тот же самый состав пробиотика, как упомянуто выше, приводит к значительному снижению инфекций, вызываемых C. difficile, во время приема ванкомицина. Этот эффект оказался устойчивым, так как также через 6 месяцев после вмешательства C. difficile не могла быть обнаружена в образцах стула [61]. Другое исследование, в котором изучалась эффективность пробиотиков в отношении AAD, было недавно проведено в голландских домах престарелых: исследование имело прагматический план совместной оценки и включало жителей с соматическими и / или психогериатрическими состояниями, часто принимающих антибиотики. Девяносто три жителя предоставили данные о 167 эпизодах использования антибиотиков, из которых 84 эпизода включали добавление пробиотиков, а 83 эпизода не включали добавление пробиотиков. Количество эпизодов ААД при использовании пробиотиков было значительно ниже, чем при отсутствии пробиотиков (20% против 36%; p = 0,022, хи-квадрат) [62].

4.2. Инфантильный микробиом и его влияние на созревание иммунной системы

Иммунологические исследования уже давно подтверждают важность микробиоты кишечника для созревания детской иммунной системы. Поскольку пробиотические бактерии обладают иммуномодулирующим действием, их влияние на иммунную систему млекопитающих было одним из первых признаков, которое было исследовано, когда клинические исследования пробиотиков набирали силу. На сегодняшний день есть многообещающие исследования конкретных пробиотиков, которые можно использовать во время беременности, чтобы снизить риск аллергии, астмы и атопической экземы у детей. Примером клинического рандомизированного контролируемого исследования в этом контексте является исследование PANDA 2009 года [63]. Испытание привело к профилактическому эффекту на частоту возникновения экземы у детей из группы высокого риска за счет многовидового пробиотического состава, который, по-видимому, сохранялся в течение первых 2 лет жизни. Кроме того, аналогичные испытания показали, что введение одной и той же пробиотической композиции матери в последние 8 недель беременности и ребенку в течение первых месяцев жизни приводит к значительному снижению частоты трехмесячных колик [64].

4.3. Метаболические заболевания

Исследования пробиотиков в настоящее время сосредоточены на лечении метаболических заболеваний, таких как ожирение и диабет 2 типа. Идея, лежащая в основе этой концепции, заключается в снижении метаболических заболеваний, вызванных эндотоксинами (из-за повышенной проницаемости кишечника). Поскольку определенные пробиотики, очевидно, способны укреплять кишечный барьер, их использование для снижения уровней циркулирующих эндотоксинов (то есть липополисахаридов (ЛПС)) в последние годы вызвало значительный интерес. Плацебо-контролируемое рандомизированное исследование проверило влияние многовидового пробиотического состава на метаболизм глюкозы, липидный профиль, подкожно-жировую клетчатку, уровень мочевой кислоты и концентрацию ЛПС в сыворотке крови тучных женщин в постменопаузе - и, наконец, клинически значимую оценку гомеостатической модели инсулинорезистентности (HOMA-IR) [65]. По всем указанным параметрам были достигнуты значительные положительные результаты. Аналогичные результаты были получены в другом клиническом плацебо-контролируемом рандомизированном исследовании, показавшем статистически значимое улучшение инсулинорезистентности и абдоминального ожирения после приема той же самой пробиотической композиции [66]. Эта конкретная пара независимых исследований рассматривается как важная отличительная черта пробиотических исследований, поскольку она демонстрирует, что существуют воспроизводимые доказательства в клинических условиях. Таким образом, применение многовидовых пробиотиков следует рассматривать как важную научно-обоснованную адъювантную терапию при метаболических заболеваниях.

4.4. Воздействие пробиотиков на ось кишечник – мозг

Микробиота кишечника играет важную роль не только в функции желудочно-кишечного тракта, но также в регулировании настроения, беспокойства и познания посредством двунаправленной связи с мозгом через блуждающий нерв и / или биохимический поток малых молекул из толстой кишки в мозг. На данный момент исследования, изучающие клиническую значимость оси кишечник-мозг, предоставляют многомерные доказательства того, что введение многовидового пробиотического состава и связанные с ним изменения в составе микробиоты кишечника оказывают значительное взаимосвязанное влияние на поведение субъектов и характеристики эмоциональной памяти [67,68]. Дополнительные исследования того же многовидового пробиотика показали его положительное влияние на когнитивные функции и нейровоспаление у пациентов с психическими [69] и нейродегенеративными [70] заболеваниями. Дополнительные доказательства предоставлены несколькими испытаниями, проведенными с другим многовидовым пробиотическим составом. Эти исследования показали положительное влияние на настроение и депрессивное поведение у крыс и продемонстрировали защиту от побуждающих к депрессивному поведению эффектов диеты с высоким содержанием жиров [71,72]. Доказательства дополнительно подтверждаются той же формулировкой, показывающей положительное влияние на когнитивную реактивность на грустное настроение у здоровых людей [73] и пациентов с легкой и умеренной депрессией [74], а также демонстрирующей значительное увеличение производительности рабочей памяти во время стресса [75]. Хотя ось кишечник-мозг и ее пробиотическая модуляция все еще являются относительно молодой областью исследований, первоначальные рандомизированные контролируемые исследования показывают многообещающие результаты. Есть еще много открытых вопросов, на которые нужно ответить, особенно в контексте молекулярных причинно–следственных связей между кишечником и мозгом.

4.5. Заболевания печени

Постоянно растущие знания о характеристиках различных микробных штаммов (например, укрепление кишечного барьера и расщепление липополисахаридов) привели к разработке пробиотических составов, направленных на защиту печени, оказывая положительное влияние на нарушение функции печени у пациентов с циррозом печени за счет модуляции микробиома кишечника. Например, клиническое исследование, проведенное Horvath et al. [76] показали, что стабилизация и даже улучшение функции печени у пациентов с циррозом печени может быть достигнуто путем введения многовидового пробиотического препарата в достаточно высокой дозе 1,5 × 10¹⁰ жизнеспособных клеток. Хотя современное состояние исследований в этом контексте все еще является недостаточным, вышеупомянутые положительные эффекты пробиотиков на метаболические заболевания и циркулирующие уровни ЛПС предвещают значительный клинический потенциал в лечении заболеваний печени, поскольку основной молекулярный патогенез аналогичен, показывая повышенный приток провоспалительных метаболитов из кишечника в печень и кровообращение.

4.6. Выводы и перспективы

Как обсуждается в этом обзоре и резюмируется на Рисунке 1, существует множество важных аспектов, которые необходимо оценить при разработке основанного на фактических данных, ориентированного на показания, многовидового и готового к продаже пробиотика. Тщательное рассмотрение всех этих аспектов увеличит вероятность успеха разработки пробиотиков от лаборатории до рынка. Очевидная гарантия качества, чистоты и эффективности пробиотических пищевых добавок имеет первостепенное значение, поскольку медицинские работники и конечные потребители должны быть уверены, что теоретические свойства штаммов проявляются также фактически, когда пробиотические микроорганизмы достигают места своего действия, которым в настоящее время чаще всего является кишечник человека. В то время как количество пробиотиков, доступных в настоящее время на рынке, велико (и постоянно растет), клинически рандомизированные испытания, которые фактически доказывают их эффективность, остаются редкими. Тем не менее, как обсуждается в обзоре, существуют многовидовые пробиотические составы, которые уже показали эффективность в многочисленных клинических испытаниях и при широком спектре состояний здоровья. В ближайшие годы мы ожидаем, что исследования пробиотиков по-прежнему будут сосредоточены на разработке пробиотических пищевых добавок для конкретных показаний. Они могут быть использованы в качестве сопутствующей терапии наряду с традиционными методами лечения, не вызывая побочных эффектов и не требуя фазы физиологической адаптации. Благодаря новым научным открытиям, мы предвидим, что разработка научно обоснованных многовидовых пробиотиков для широкого спектра новых медицинских показаний, не обсуждаемых в этой статье, также будет расти. Кроме того, поскольку инструменты диагностики и прогнозирования стремительно развиваются, мы ожидаем, что пробиотики укрепят свои позиции в персонализированном здравоохранении, адаптируя пищевые и медицинские методы лечения к потребностям каждого отдельного пациента. Повышение единообразия и стандартов с точки зрения детерминант безопасности, качества и эффективности также укрепит позиции пробиотических пищевых добавок и, таким образом, расширит глобальный рынок пробиотиков, что, в свою очередь, увеличит потребность в дополнительных (клинических) исследованиях с целью установления этих детерминант на практике. Все эти разработки будут также способствовать продолжающимся дебатам о нормативной классификации пробиотиков. Результат этих дебатов также повлияет на функциональные, нормативные требования и требования к качеству, которые необходимо будет оценить и подтвердить в ходе разработки успешного высококачественного и готового к продаже пробиотика.

Рисунок 1. Схематический обзор междисциплинарного подхода, необходимого для разработки научно обоснованного, специфичного по показаниям, многовидового и готового к продаже пробиотика. Все шаги, необходимые для создания штамма и разработки продукта, формируются функциональными, нормативными и качественными требованиями конечного продукта. В ходе этого процесса отбрасываются несколько кандидатов (штаммы, добавки, чертежи производственного процесса и упаковочные идеи). Кроме того, производственные процессы тщательно отлажены, и необходимо разработать аналитические методы, гарантирующие постоянную эффективность и безопасность готового пробиотического продукта. Разработка штамма и продукта сопровождается исследованиями эффективности продукта и постмаркетинговыми исследованиями с целью демонстрации клинической эффективности готового пробиотического продукта. На рисунке под номерами (перевод наименований стадий):

Обнаружение штаммов: изоляция и идентификация
Оценка безопасности штамма
Скрининг штаммов на предмет соответствующих функциональных свойств
Разработка процесса производства штаммов
Разработка рецептуры продукта
Тестирование совместимости ингредиентов
Разработка процесса производства продукции
Разработка аналитического метода
Разработка упаковки

Дополнительная информация

Литература

Lynch, S.V.; Pedersen, O. The human intestinal microbiome in health and disease. N. Engl. J. Med. 2016, 375, 2369–2379. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Hill, C.; Guarner, F.; Reid, G.; Gibson, G.R.; Merenstein, D.J.; Pot, B.; Morelli, L.; Canani, R.B.; Flint, H.J.; Salminen, S.; et al. Expert consensus document: The international scientific association for probiotics and prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2014, 11, 506–514. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Alonso, V.R.; Guarner, F. Linking the gut microbiota to human health. Br. J. Nutr. 2013, 109. [Google Scholar] [CrossRef]
Gerritsen, J.; Smidt, H.; Rijkers, G.T.; de Vos, W.M. Intestinal microbiota in human health and disease: The impact of probiotics. Genes Nutr. 2011, 6, 209–240. [Google Scholar] [CrossRef]
De Vos, W.M.; de Vos, E.A.J. Role of the intestinal microbiome in health and disease: From correlation to causation. Nutr. Rev. 2012, 70. [Google Scholar] [CrossRef]
Plaza-Diaz, J.; Ruiz-Ojeda, F.J.; Gil-Campos, M.; Gil, A. Mechanisms of Action of Probiotics. Adv. Nutr. 2019. [Google Scholar] [CrossRef]
Gareau, M.G.; Sherman, P.M.; Walker, W.A. Probiotics and the gut microbiota in intestinal health and disease. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2010, 7, 503–514. [Google Scholar] [CrossRef]
Kankainen, M.; Paulin, L.; Tynkkynen, S.; von Ossowski, I.; Reunanen, J.; Partanen, P.; Satokari, R.; Vesterlund, S.; Hendrickx, A.P.A.; Lebeer, S.; et al. Comparative genomic analysis of Lactobacillus rhamnosus GG reveals pili containing a human-mucus binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106, 17193–17198. [Google Scholar] [CrossRef]
Papadimitriou, K.; Zoumpopoulou, G.; Foligné, B.; Alexandraki, V.; Kazou, M.; Pot, B.; Tsakalidou, E. Discovering probiotic microorganisms: In vitro, in vivo, genetic and omics approaches. Front. Microbiol. 2015, 6. [Google Scholar] [CrossRef]
Pearce, S.C.; Coia, H.G.; Karl, J.P.; Pantoja-Feliciano, I.G.; Zachos, N.C.; Racicot, K. Intestinal in vitro and ex vivo models to study host-microbiome interactions and acute stressors. Front. Physiol. 2018, 9. [Google Scholar] [CrossRef]
Younes, J.A.; Lievens, E.; Hummelen, R.; van der Westen, R.; Reid, G.; Petrova, M.I. Women and Their Microbes: The Unexpected Friendship. Trends Microbiol. 2018, 26, 16–32. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Lebeer, S.; Vanderleyden, J.; de Keersmaecker, S.C.J. Genes and Molecules of Lactobacilli Supporting Probiotic Action. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2008, 72, 728–764. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Coman, M.M.; Verdenelli, M.C.; Cecchini, C.; Silvi, S.; Orpianesi, C.; Boylo, N.; Cresci, A. In vitro evaluation of antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus IMC 501^®, Lactobacillus paracasei IMC 502^® and SYNBIO^® against pathogens. J. Appl. Microbiol. 2014, 117, 518–527. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Tomás, M.S.J.; Ocaña, V.S.; Wiese, B.; Nader-Macías, M.E. Growth and lactic acid production by vaginal Lactobacillus acidophilus CRL 1259, and inhibition of uropathogenic Escherichia coli. J. Med. Microbiol. 2003, 52, 1117–1124. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Moens, F.; Weckx, S.; de Vuyst, L. Bifidobacterial inulin-type fructan degradation capacity determines cross-feeding interactions between bifidobacteria and Faecalibacterium prausnitzii. Int. J. Food Microbiol. 2016. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Van Den Abbeele, P.; Marzorati, M.; Derde, M.; De Weirdt, R.; Vermeiren, J.; Possemiers, S.; Van de Wiele, T. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. npj Biofilms Microbiomes 2016, 2. [Google Scholar] [CrossRef]
Ouwehand, A.C.; Salminen, S. In vitro Adhesion Assays for Probiotics and their in vivo Relevance: A Review. Microb. Ecol. Health Dis. 2003, 15, 175–184. [Google Scholar] [CrossRef]
Atassi, F.; Brassart, D.; Grob, P.; Graf, F.; Servin, A.L. Vaginal Lactobacillus isolates inhibit uropathogenic Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 2006, 257, 132–138. [Google Scholar] [CrossRef]
Osset, J.; Bartolomé, R.M.; García, E.; Andreu, A. Assessment of the capacity of Lactobacillus to inhibit the growth of uropathogens and block their adhesion to vaginal epithelial cells. J. Infect. Dis. 2001, 183, 485–491. [Google Scholar] [CrossRef]
Roselli, M.; Finamore, A.; Britti, M.S.; Mengheri, E. Probiotic bacteria Bifidobacterium animalis MB5 and Lactobacillus rhamnosus GG protect intestinal Caco-2 cells from the inflammation-associated response induced by enterotoxigenic Escherichia coli K88. Br. J. Nutr. 2006, 95, 1177–1184. [Google Scholar] [CrossRef]
Ussing, H.H.; Zerahn, K. Active Transport of Sodium as the Source of Electric Current in the Short-circuited Isolated Frog Skin. Acta Physiol. Scand. 1951, 23, 110–127. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Thomson, A.; Smart, K.; Somerville, M.S.; Lauder, S.N.; Appanna, G.; Horwood, G.; Raj, L.S.; Srivastava, B.; Durai, D.; Scurret, M.J.; et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 2019, 19, 98. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Shah, P.; Fritz, J.V.; Glaab, E.; Desai, M.S.; Greenhalgh, K.; Frachet, A.; Niegowska, M.; Estes, M.; Jäger, C.; Seguin-Devaux, C.; et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat. Commun. 2016, 7, 1–15. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Kim, H.J.; Li, H.; Collins, J.J.; Ingber, D.E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 113, E7–E15. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Douglas, A.E. Which experimental systems should we use for human microbiome science? PLoS Biol. 2018, 16, e2005245. [Google Scholar] [CrossRef]
Kostic, A.D.; Howitt, M.R.; Garrett, W.S. Exploring host-microbiota interactions in animal models and humans. Genes Dev. 2013, 27, 701–718. [Google Scholar] [CrossRef]
Kenny, D.J.; Plichta, D.R.; Vlamakis, H.; Balskus, E.P.; Correspondence, R.J.X. Cholesterol Metabolism by Uncultured Human Gut Bacteria Influences Host Cholesterol Level. Cell Host Microbe 2020. [Google Scholar] [CrossRef]
Nguyen, M.; Long, S.W.; McDermott, P.F.; Olsen, R.J.; Olson, R.; Stevens, R.L.; Tyson, G.H.; Zhao, S.; Davis, J.J. Using machine learning to predict antimicrobial MICs and associated genomic features for nontyphoidal Salmonella. J. Clin. Microbiol. 2019, 57. [Google Scholar] [CrossRef]
Armour, C.R.; Nayfach, S.; Pollard, K.S.; Sharpton, T.J. A Metagenomic Meta-analysis Reveals Functional Signatures of Health and Disease in the Human Gut Microbiome. mSystems 2019, 4. [Google Scholar] [CrossRef]
Rosenberg, E.; De Long, E.F.; Thompson, F.; Lory, S.; Stackebrandt, E. The Prokaryotes: Prokaryotic Biology and Symbiotic Associations; Springer: Berlin/Heidelberg, Germany, 2013. [Google Scholar]
Schleifer, K.H. Classification of Bacteria and Archaea: Past, present and future. Syst. Appl. Microbiol. 2009, 32, 533–542. [Google Scholar] [CrossRef]
Tindall, B.J.; Rosselló-Móra, R.; Busse, H.J.; Ludwig, W.; Kämpfer, P. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010, 60, 249–266. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Sanders, M.E.; Merenstein, D.; Merrifield, C.A.; Hutkins, R. Probiotics for human use. Nutr. Bull. 2018, 43, 212–225. [Google Scholar] [CrossRef]
Zheng, J.; Wittouck, S.; Salvetti, E.; Franz, C.M.A.P.; Harris, H.M.B.; Mattarelli, P.; O’Toole, P.W.; Pot, B.; Vandamme, P.; Walter, J.; et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020, 70, 2782–2858. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Doron, S.; Snydman, D.R. Risk and Safety of Probiotics. Clin. Infect. Dis. 2015, 60, 129–134. [Google Scholar] [CrossRef]
Kumar, H.; Salminen, S.; Verhagen, H.; Rowland, I.; Heimbach, J.; Bañares, S.; Young, T.; Nomoto, K.; Lalonde, M. Novel probiotics and prebiotics: Road to the market. Curr. Opin. Biotechnol. 2015, 32, 99–103. [Google Scholar] [CrossRef]
Marteau, P. Safety aspects of probiotic products. Scand. J. Nutr. Naringsforsk. 2001, 45, 22–24. [Google Scholar] [CrossRef]
Miquel, S.; Beaumont, M.; Martín, R.; Langella, P.; Braesco, V.; Thomas, M. A proposed framework for an appropriate evaluation scheme for microorganisms as novel foods with a health claim in Europe. Microb. Cell Factories 2015, 14, 48. [Google Scholar] [CrossRef]
Pariza, M.W.; Gillies, K.O.; Kraak-Ripple, S.F.; Leyer, G.; Smith, A.B. Determining the safety of microbial cultures for consumption by humans and animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2015, 73, 164–171. [Google Scholar] [CrossRef]
Salminen, S.; von Wright, A.; Morelli, L.; Marteau, P.; Brassart, D.; de Vos, W.M.; Fondén, R.; Saxelin, M.; Collins, K.; Mogensen, G.; et al. Demonstration of safety of probiotics—A review. Int. J. Food Microbiol. 1998, 44, 93–106. [Google Scholar] [CrossRef]
Sanders, M.E.; Akkermans, L.M.A.; Haller, D.; Hammerman, C.; Heimbach, J.; Hörmannsperger, G.; Huys, G.; Levy, D.D.; Lutgendorff, F.; Mack, D.; et al. Safety assessment of probiotics for human use. Gut Microbes 2010, 1, 1–22. [Google Scholar] [CrossRef]
Bringing a Probiotic-Containing Functional Food to the Market: Microbiological, Product, Regulatory and Labeling Issues—PubMed. Available online: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10532385/ (accessed on 29 June 2020).
Rychen, G.; Aquilina, G.; Azimonti, G.; Bampidis, V.; de Lourdes, B.M.; Bories, G.; Chesson, A.; Cocconcelli, P.S.; Flachowsky, G.; Gropp, J.; et al. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms. EFSA J. 2018, 16. [Google Scholar] [CrossRef]
Public Consultation on the EFSA Statement on the Requirements for. Available online: https://www.efsa.europa.eu/en/consultations/call/public-consultation-efsa-statement-requirements-whole-genome (accessed on 29 June 2020).
Chen, L.; Yang, J.; Yu, J.; Yao, Z.; Sun, L.; Shen, Y.; Jin, Q. VFDB: A reference database for bacterial virulence factors. Nucleic Acids Res. 2005, 33, D325–D328. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA J. 2012, 10. [CrossRef]
McArthur, A.G.; Waglechner, N.; Nizam, F.; Yan, A.; Azad, M.A.; Baylay, A.J.; Bhullar, K.; Canova, M.J.; De Pascale, G.; Ejim, L.; et al. The comprehensive antibiotic resistance database. Antimicrob. Agents Chemother. 2013, 57, 3348–3357. [Google Scholar] [CrossRef]
Gupta, S.K.; Padmanabhan, B.R.; Diene, S.M.; Lopez-Rojas, R.; Kempf, M.; Landraud, L.; Rolain, J.-M. ARG-annot, a new bioinformatic tool to discover antibiotic resistance genes in bacterial genomes. Antimicrob. Agents Chemother. 2014, 58, 212–220. [Google Scholar] [CrossRef]
Partridge, S.R.; Kwong, S.M.; Firth, N.; Jensen, S.O. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 2018, 31. [Google Scholar] [CrossRef]
Bourdichon, F.; Laulund, S.; Tenning, P. Inventory of microbial species with a rationale: A comparison of the IDF/EFFCA inventory of microbial food cultures with the EFSA Biohazard Panel qualified presumption of safety. FEMS Microbiol. Lett. 2019, 366. [Google Scholar] [CrossRef]
Mogensen, G.; Salminen, S.; O’Brien, J.; Ouwehand, A.; Holzapfel, W.; Shortt, C.; Fondén, R.; Miller, G.D.; Donohue, D.; Playne, M.; et al. Food microorganisms—Health benefits, safety evaluation and strains with documented history of use in foods & Inventory of microorganisms with a documented history of use in food. Bull. IDF 2002, 377, 4–19. [Google Scholar]
Generally Recognized as Safe (GRAS) Notification Program FDA. Available online: https://www.fda.gov/animal-veterinary/animal-food-feeds/generally-recognized-safe-gras-notification-program (accessed on 29 June 2020).
Fenster, K.; Freeburg, B.; Hollard, C.; Wong, C.; Laursen, R.R.; Ouwehand, A. The Production and Delivery of Probiotics: A Review of a Practical Approach. Microorganisms 2019, 7, 83. [Google Scholar] [CrossRef]
Jackson, S.A.; Schoeni, J.L.; Vegge, C.; Pane, M.; Stahl, B.; Bradley, M.; Goldman, V.S.; Burguière, P.; Atwater, J.B.; Sanders, M.E.; et al. Improving end-user trust in the quality of commercial probiotic products. Front. Microbiol. 2019, 10. [Google Scholar] [CrossRef]
Hansen, S.J.Z.; Tang, P.; Kiefer, A.; Galles, K.; Wong, C.; Morovic, W. Droplet Digital PCR Is an Improved Alternative Method for High-Quality Enumeration of Viable Probiotic Strains. Front. Microbiol. 2010, 10. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Kiefer, A.; Tang, P.; Arndt, S.; Fallico, V.; Wong, C. Optimization of Viability Treatment Essential for Accurate Droplet Digital PCR Enumeration of Probiotics. Front. Microbiol. 2010, 11, 1811. [Google Scholar] [CrossRef]
Ritchie, M.L.; Romanuk, T.N. A meta-analysis of probiotic efficacy for gastrointestinal diseases. PLoS ONE 2012, 7. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Zhao, M.; Shen, C.; Ma, L. Treatment efficacy of probiotics on atopic dermatitis, zooming in on infants: A systematic review and meta-analysis. Int. J. Dermatol. 2018, 57, 635–641. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Huang, R.; Wang, K.; Hu, J. Effect of probiotics on depression: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Nutrients 2016, 8, 483. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Koning, C.J.M.; Jonkers, D.M.A.E.; Stobberingh, E.E.; Mulder, L.; Rombouts, F.M.; Stockbrügger, R.W. The effect of a multispecies probiotic on the intestinal microbiota and bowel movements in healthy volunteers taking the antibiotic amoxycillin. Am. J. Gastroenterol. 2008, 103, 178–189. [Google Scholar] [CrossRef]
Hell, M.; Bernhofer, C.; Stalzer, P.; Kern, J.M.; Claassen, E. Probiotics in Clostridium difficile infection: Reviewing the need for a multistrain probiotic. Benef. Microbes 2013, 4, 39–51. [Google Scholar] [CrossRef]
Van Wietmarschen, H.A.; Busch, M.; van Oostveen, A.; Pot, G.; Jong, M.C. Probiotics use for antibiotic-associated diarrhea: A pragmatic participatory evaluation in nursing homes. BMC Gastroenterol. 2020, 20, 151. [Google Scholar] [CrossRef]
Niers, L.; Martín, R.; Rijkers, G.; Sengers, F.; Timmerman, H.; van Uden, N.; Smidt, H.; Kimpen, J.; Hoekstra, M. The effects of selected probiotic strains on the development of eczema (the PandA study). Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol. 2009, 64, 1349–1358. [Google Scholar] [CrossRef]
Hofmann, H. Probiotikum gegen Verdauungsbeschwerden in der Schwangerschaft und Säuglingskoliken. Gynäkologie Akt. 2015, 8–9. [Google Scholar] [CrossRef]
Szulińska, M.; Łoniewski, I.; van Hemert, S.; Sobieska, M.; Bogdański, P. Dose-dependent effects of multispecies probiotic supplementation on the lipopolysaccharide (LPS) level and cardiometabolic profile in obese postmenopausal women: A 12-week randomized clinical trial. Nutrients 2018, 10, 773. [Google Scholar] [CrossRef]
Sabico, S.; Al-Mashharawi, A.; Al-Daghri, N.M.; Yakout, S.; Alnaami, A.M.; Alokail, M.S.; McTernan, P.G. Effects of a multi-strain probiotic supplement for 12 weeks in circulating endotoxin levels and cardiometabolic profiles of medication naïve T2DM patients: A randomized clinical trial. J. Transl. Med. 2017, 15, 249. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Bagga, D.; Reichert, J.L.; Koschutnig, K.; Aigner, C.S.; Holzer, P.; Koskinen, K.; Moissl-Eichinger, C.; Schöpf, V. Probiotics drive gut microbiome triggering emotional brain signatures. Gut Microbes 2018. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Bagga, D.; Aigner, C.S.; Reichert, J.L.; Cecchetto, C.; Fischmeister, F.P.S.; Holzer, P.; Moissl-Eichinger, C.; Schöpf, V. Influence of 4-week multi-strain probiotic administration on resting-state functional connectivity in healthy volunteers. Eur. J. Nutr. 2018. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Reininghaus, E.Z.; Wetzlmair, L.-C.; Fellendorf, F.T.; Platzer, M.; Queissner, R.; Birner, A.; Pilz, R.; Hamm, C.; Maget, A.; Koidl, C.; et al. The Impact of Probiotic Supplements on Cognitive Parameters in Euthymic Individuals with Bipolar Disorder: A Pilot Study. Neuropsychobiology 2018, 1–8. [Google Scholar] [CrossRef]
Leblhuber, F.; Steiner, K.; Schuetz, B.; Fuchs, D.; Gostner, J.M. Probiotic Supplementation in Patients with Alzheimer’s Dementia—An Explorative Intervention Study. Curr. Alzheimer Res. 2018. [Google Scholar] [CrossRef]
Abildgaard, A.; Elfving, B.; Hokland, M.; Lund, S.; Wegener, G. Probiotic treatment protects against the pro-depressant-like effect of high-fat diet in Flinders Sensitive Line rats. Brain Behav. Immun. 2017, 65, 33–42. [Google Scholar] [CrossRef]
Abildgaard, A.; Elfving, B.; Hokland, M.; Wegener, G.; Lund, S. Probiotic treatment reduces depressive-like behaviour in rats independently of diet. Psychoneuroendocrinology 2017, 79, 40–48. [Google Scholar] [CrossRef]
Steenbergen, L.; Sellaro, R.; van Hemert, S.; Bosch, J.A.; Colzato, L.S. A randomized controlled trial to test the effect of multispecies probiotics on cognitive reactivity to sad mood. Brain Behav. Immun. 2015, 48, 258–264. [Google Scholar] [CrossRef]
Chahwan, B.; Kwan, S.; Isik, A.; van Hemert, S.; Burke, C.; Roberts, L. Gut feelings: A randomised, triple-blind, placebo-controlled trial of probiotics for depressive symptoms. J. Affect. Disord. 2019, 253, 317–326. [Google Scholar] [CrossRef]
Papalini, S.; Michels, F.; Kohn, N.; Wegman, J.; van Hemert, S.; Roelofs, K.; Arias-Vasquez, A.; Aarts, E. Stress matters: Randomized controlled trial on the effect of probiotics on neurocognition. Neurobiol. Stress 2019, 10, 100141. [Google Scholar] [CrossRef]
Horvath, A.; Leber, B.; Schmerboeck, B.; Tawdrous, M.; Zettel, G.; Hartl, A.; Madl, T.; Stryeck, S.; Fuchs, D.; Lemesch, S.; et al. Randomised clinical trial: The effects of a multispecies probiotic vs. placebo on innate immune function, bacterial translocation and gut permeability in patients with cirrhosis. Aliment. Pharmacol. Ther. 2016, 44, 926–935. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Будьте здоровы!

Перейти к ссылкам к основным разделам