Казеин и Мицеллообразование казеинов молока

Казеин и мицеллообразование
казеинов молока
мицелла и субмицелла казеина
На рис.: Казеиновая мицелла формируется из субмицелл, состоящих (в разном соотношении) из αS1-, αS2-, β- и κ-казеинов (альфа-, бета и каппа-казеины - это основные 4 фракции казеина)

Для лучшего понимания данной страницы рекомендуется иметь представление о понятии гидрофобного эффекта и полярности молекул - ред.

1. Казеин: Основные фракции и форма

Используя современные способы разделения и выделения белков, исследователи установили, что в состав молока входят три группы бел­ков: казеин, сывороточные белки и белки оболочек жировых шариков. Казеин яв­ляется собственно пищевым белком, выполняющим в организме новорож­денного структурную функцию. Кроме того, казеин транспортирует в со­ставе своих частиц кальций, фосфор и магний.

Казеи́н (лат. caseus — сыр) — сложный белок (фосфопротеид) молока. Казеин присутствует в молоке в связанном виде как соль кальция (казеинат кальция).

КОРОВА

Молоко коров разных пород, при производстве кисломолочных продуктов и сыра, значительно различается по времени свертывания под действием сычужного фермента, нарастанию кислотности, динамике синерезиса, плотности сгустка. Свертывающая способность молока зависит от целого ряда факторов: количества белка в молоке, его структуры, размера и массы мицелл казеина, температуры и кислотности молока, содержания в нем солей кальция.

Казеин является главным белком молока, его содержание в коровьем молоке — 78—85% от всех белков (2,8—3,5 % от общей массы). Казеин не содержится в крови и в молочной железе синтезируется из свободных аминокислот крови. Так же, как и любой другой белок, казеин разрушается при термической обработке, но он значительно более термоустойчив. Для его коагуляции необходима выдержка при температуре в 130 градусов Цельсия. Элементарный состав казеина (в %) следующий: углерод - 53,1; водород - 7,1; кислород - 22,8; азот - 15,4; сера - 0,8; фосфор - 0,8.

атомы

Казеин — комплекс четырех фракций. Казеин имеет несколько фракций, отличающихся аминокислот­ным составом, отношением к ионам кальция и сычужному ферменту. По данным Т. А. Остроумовой [Химия и физика молока: монография / Т. А. Остроумова. - Воронеж: Воронежский ГУИТ, 2014.-196с], основной структурный компонент белков молока - казеин - представлен четырьмя основными фракциями: αS1, αS2, β и κ (альфа-, бета- и каппа-казеинами). Выделяемый γ-казеин является фрагментом β-казеина. Эти фракции имеют различный аминокислотный состав и отличаются друг от лруга заменой одного или двух аминокислотных остатков в полипептидной цепи.

казеин Все фракции казеина друг от друга отличаются количеством фосфорных остатков, входящих в молекулу казеина: αs-казеин 45-55% - 8 фосфорных остатков; β-казеин 25-35% - 4 фосфорных остатка; к-казеин 8-15% - 1 фосфорный остаток. Все фракции казеина являются фосфопротеидами, (см. рис. слева) т.е. содержат ос­татки фосфорной кислоты (органический фосфор), присоединенные к аминокислоте серину моноэфирной связью (О—Р).

Казеин, как и все белки, содержит одновременно аминные NH2 и карбоксильные СООН группы, которые в растворе находятся в виде NH3+ и СОО-. Следовательно, казеин обладает свойствами амфотерного электролита. Количество свободных карбоксильных групп в казеине больше, чем аминных, поэтому при pH, близком к нейтральному, он имеет отрицательный заряд. Таким образом, казеин, содержащий различные реакционноспособные группы, может образовывать целый ряд соединений со многими химическими веществами: кислотами, основаниями, альдегидами, металлами и др.

Электронно-микроскопический снимоквысокого разрешения мицеллы казеина
Электронная микрофотография отдельной мицеллы казеина

Как будет описано ниже, казеин в молокое содержится в основном в мицеллярной форме - т.е. включен в состав сложного белкового комплекса, имеющего вид казеиновых мицелл (см. рис. слева), состоящих из более мелких субмицелл. В молоке казеиновые мицеллы довольно стабильны (связанная вода образует вокруг казеиновых мицелл защитную гидратную оболочку) и именно они обусловливают коллоидно-дисперсное состояние казеина. Напомним, что коллоидные растворы (иногда их называют золями) это растворы, где растворенное вещество образует частицы (молекулы / скопления молекул) размером 1×10-9-5×10-7м - это "среднее состояние" между растворами грубодисперсными (грубые взвеси, суспензии, эмульсии, порошки) и растворами истинными (молекулярным, ионными). Казеин в молоке находится в соединении с кальциевыми солями. Он представляет собой так называемый казеинаткальцийфосфатный комплекс (ККФК) - сложный комплекс казеината кальция с коллоидным фосфатом кальция. В состав ККФК также вхо­дит небольшое количество лимонной кислоты, магния, калия и натрия. Как было уже указано ранее, ККФК (казеин) в молоке представлен в мицеллярной форме. Диаметр этой шарообразной формы составляет от 0,03 до 0,30 мкм.

структура мицеллы казеина Стоит отетить, что при уменьшении содержания ионов кальция (Ca2+) дисперсность частиц сдвигается в сторону увеличения числа более мелких мицелл казеина, а при увеличении - в сторону увеличения числа субмицелл (т.е. к укрупнению мицелл, т.к. они состоят из субмицелл - ред.). При этом чем крупнее мицелла, тем больше в ней содержание фракции αs-казеина и, наоборот, если мицелла мельче, в ней больше фракций β- и γ-казеина (особенностью γ-казеинов является то, что под действием сычужного фермента белки этой фракции не выпадают в осадок и остаются в сыворотке).

сырА вот главный особенностью αs- и β-казеинов является способность выпадать в осадок под воздействием ионов кальция (Ca2+), образуя казеиновый сгусток. При этом к-казеин, располагаясь на поверхности мицеллы и, являясь кальций-устойчивой фракцией, выполняет роль защитного коллоида, предотвращая осаждение αs- и β-казеинов ионами кальция в свежем молоке. При этом к-казеин подвержен воздействию сычужного фермента с последующим его гидролизом, что приводит к потере отрицательного заряда и дестабилизации кальций неустойчивых αs- и β-казеинов, составляя основу технологии изготовления сычужных сыров →  κ-казеин под воздействием сычужного фермента распадается на 2 части: гидрофобный пара-κ-казеин и гидрофильный гликомакропептид (последний уходит в сыворотку - ред.).

Молекулярная модель поверхности К-казеина Примечание ред.: слева на рис. показана молуекулярная модель белковой поверхности каппа-казеина. Этот к-казеин представляет собой белок молока млекопитающих, участвующий в нескольких важных физиологических процессах. Химозин расщепляет к-казеин на нерастворимый пептид (пара-каппа-казеин) и водорастворимый гликомакропептид (ГМП). ГМП отвечает за повышение эффективности пищеварения, предотвращение гиперчувствительности новорожденных к проглоченным белкам и подавление желудочных патогенов.

Как было указано выше, в молоке казеин находится в виде специфических частиц, или мицелл, представляющих собой сложные комплексы фракций казеина с коллоидным фосфатом кальция. В свежем молоке мицеллы имеют почти сферическую форму. Средний диаметр частиц составляет 70 – 100 нм. Казеиновые мицеллы состоят из субмицелл диаметром 10 – 20 нм. Субмицеллы представляют собой агрегированные фракции казеина, соединенные между собой гидрофобными связями и кальциевыми мостиками. При этом κ-казеин как таковой в состав субмицелл не входит, он располагается на поверхности мицелл. Соединение субмицелл в мицеллы происходит с помощью фосфата кальция и гидрофобных связей.


Об устойчивости казеиновых мицелл

Гидратная оболочка и заряд белка

Устойчивость белковым растворам придают два фактора: заряд белковой молекулы и гидратная оболочка.

Гидратная оболочка белковой молекулы
Образование гидратной оболочки вокруг молекулы белка.
На рис.: Пример образования гидратной оболочки вокруг белка. Первый водный слой (ориентированные неподвижные молекулы воды, прочно связанные с белком) называют гидратной или водной оболочкой. От свойств гидратных оболочек зависит стабильность белковых частиц.

Полярные группы, находящиеся на поверхности и внутри казеиновых мицелл (-NH2, -COOH, -ОН и др.), свя­зывают значительное количество воды — около 3,7 г на 1 г белка. Спо­собность казеина связывать воду характеризует его гидрофильные свойства. Гидрофильные свойства казеина зависят от структуры, величины заряда белковой молекулы, рН среды, концентрации солей и других фак­торов. Они имеют большое практическое значение. Мицеллерный казеин, сильно гидратирован, и поэтому вода не только окружает мицеллу казеина в виде гидратной оболочки, но и заполняет большую часть ее объема, т.е. иммобилизуется мицеллой. При гидратировании белков диполи воды располагаются несколькими слоями. Первый слой (мономолекулярный) более прочно связан с белком, последующие (диффузные) - с меньшей энергией связи. Прочность гидратной оболочки определяет стабильность мицелл белка. При повышении температуры, внесении электролитов и других воздействиях слабосвязанные диффузные слои коллоида легко теряют влагу, происходит его дегидратация

схематичное изображение субмицеллы и мицеллв казеина гидратная оболочка
На рис: вариант схематичного изображения
а) субмицеллы и б) мицеллы казеина
Общий принцип образования гидратной оболочки - применим и для субмицелл и для мицелл

В свежем молоке мицеллы казеина устойчивы - снижение их устойчивости и коагуляции наблюдается лишь при ↓ pН молока, ↑ концентрации Ca2+, внесении сычужного фермента. А устойчивость и коагуляция коллоидных растворов зависит от соотношения молекулярных сил притяжения и электростатических сил отталкивания между коллоидными частицами. В свежем молоке последние силы превалируют над силами притяжения, и коллоидная система находится в устойчивом состоянии (электростатические илы имеют преимущество, потому что они действуют на гораздо больших расстояниях, чем силы Ван-дер-Ваальса - ред.)...

... И для того, чтобы вызвать соединение и коагуляцию мицелл казеина, необходимо снизить отрицательный заряд, т.е. перевести мицеллы в изоэлектрическое состояние (суммарный заряд молекулы белка ≈ 0), или близкое к нему, и разрушить гидратные оболочки.

Итак, казеиновые мицеллы на своей поверхности несут положительно и отрицательно заряженные группы с преобладанием последних, т.е. имеют отрицательный заряд. Между заряженными коллоидными частицами действуют силы взаимного притяжения и отталкивания. Если между частицами преобладают силы отталкивания, система в целом устойчива.  При уменьшении сил отталкивания, коллоидные частицы при сближении слипаются, укрупняются и коагулируют. Минимальные силы отталкивания наблюдаются у белков в изоэлектрической точке (ИЭТ). В состоянии ИЭТ суммарный заряд молекулы белка равен нулю.

Нейтрализация заряда белка при подкислении среды

На рис.: Нейтрализация заряда белка при подкислении среды (снижегнии pH) - В состоянии изоэлектрической точки (ИЭТ) суммарный заряд молекулы белка равен нулю.

Кислотность молока очень важный показатель, т.к. ионизация различных функциональных групп белка определяется рН среды (речь идет об ионизации кислотных групп (СООН - группы – доноры Н+) и щелочных групп (NH2-группы - акцепторы Н+). При определенном значении pH среды (для каждого белка неодинаковое) количество ионизированных карбоксильных и аминогрупп уравнивается и белковая молекула становится электронейтральной, т.е. находится в ИЭТ. В ИЭТ растворимость белка минимальна, так как его молекулы в таком состоянии электронейтральны и между ними нет сил взаимного отталкивания, поэтому они могут «слипаться» за счет водородных и ионных связей, гидрофобных взаимодействий, ван-дер-ваальсовых сил. 

белковые молекулы при разных значениях водородного показателя pH

На рис.: При нормальном значении рН молока, рН 6,6, молекула белка имеет суммарный отрицательный заряд → Молекулы белка остаются разделенными, потому что одинаковые заряды отталкивают друг друга. Если добавить ионы водорода, они адсорбируются молекулами белка. При значении рН, при котором положительный заряд белка равен отрицательному заряду, т.е. когда количество NH3+ и COO– групп в боковых цепях равно, чистый суммарный заряд белка = 0.

Коагуляцию белков можно вызвать различными способами, но любой из них должен сопровождаться снижением отрицательного заряда казеиновых мицелл → о коагуляции казеина см. подробнее по ссылке.

К основным технологическим свойствам молока относят термоустой­чивость и сычужную свертываемость.

Молоко, полученное от здоровых животных, обладает термоустойчивостью - способностью при высоких температу­рах сохранять первоначальные свойства. Оно обладает стойкостью при нагревании до 100°С в течение нескольких десятков минут. При более высоких температурах и продолжительной выдержке его белки могут ко­агулировать. Продолжительность нагревания при 130°С до коагуляции белков в различных образцах молока колеблется от 2 до 60 мин и выше. Видимая коагуляция белков молока наблюдается только при осажде­нии казеина. Таким образом, термоустойчивость молока зависит, в основном, от устойчивости казеиновых мицелл. Свежее молоко кислотностью 18°Т выдерживает высо­котемпературную обработку без явных признаков коагуляции казеина. Повышение кислотности молока в резуль­тате молочнокислого брожения значительно влияет на термоустойчи­вость. Увеличение количества ионов кальция в молоке при по­вышенной кислотности приводит к агрегации казеиновых частиц, кото­рые легко коагулируют при нагревании. Основными причинами низкой термоустойчивости молока являются повышенная кислотность и нарушенный солевой и бел­ковый состав. Колебания состава молока зависят от времени года, ста­дии лактации, болезней, породы, индивидуальных особенностей живот­ных, рационов кормления.

Под сычужной свертываемостью молока понимают способность его белков коагулировать под действием внесенного сычужного фермента с образованием относительно плотного сгустка. Способность молока к сычужной свертываемости определяется, в пер­вую очередь, содержанием в нем казеина и солей кальция  - чем оно больше, тем выше скорость свертывания молока и плотность образующихся белковых сгустков, и наоборот (о сычужной свёртываемости см. отдельно ).


О структурообразующем свойстве кальция

Кальциевые и кальций-фосфатные мостики

кальциевые- фосфатные мостики мицелл казеина

На рис.: Казеиновая мицелла сформирована из субмицелл, которые связаны между собой фосфатно-кальциевыми мостиками

Итак, казеин является сложным белком и представляет собой комплекс казеината кальция с коллоидным фосфатом кальция — так называемый казеинаткальцийфосфатный комплекс (ККФК). Образование подобного комплекса обусловлено присутствием большого количества серинфосфатных групп в казеиновой молекуле, которые способны образовывать казеинаты кальция (казеинат кальцияхимическое соединение казеина и двухвалентного кальция (прим. ред.: Кальций является двухвалентным катионом, что позволяет ему образовывать связи с несколькими анионами казеината. Это приводит к образованию нескольких ковалентных связей между анионами казеината, что в конечном итоге может привести к образованию в сшитом казеинате карманов гидрофобных областей). Благодаря структурообразующей способности кальция казеины самоассоциируются в мицеллы.

Взаимодействия: В моло­ке казеин содержится в виде казеинатов кальция, соединенных с колло­идным фосфатом кальция. Ионы кальция могут присоединяться к карбоксильным группам казеина:

image011

Но, вероятно, в первую очередь они взаимодействуют с остатками фосфорной кислоты казеина. При этом кальций может соединяться с одной или двумя ОН-группами фосфорной кислоты:

image013
image015

В первом случае кальций имеет свободную связь и может образовать кальциевый мостик между расположенными друг против друга серинфосфатными группами двух молекул казеина. Такой кальций играет определенную роль при образовании казеиновых мицелл и называется структурообразующим.

image017
Кальциевые мостики способствуют агрегации коллоидных частиц казеина при сычужной и кальциевой коагуляции.

К серин-фосфатным группам казеиновых молекул наряду с ионами кальция (Ca2+) может присоединяться коллоидный фосфат кальция молока в виде (СаНРО4)n или [Са3(РО4)2]n (см. также здесь→). Фосфор коллоидного фосфата каль­ция в отличие от фосфора органического (входящего в состав казеина) называют неорганическим. Фосфат кальция, по-видимому, может соеди­нить молекулы казеина между собой наподобие кальциевых мостиков. В упрощенном виде это можно изобразить следующим образом:

image019
На рис.: Кальций-фосфатный мостик в ККФК

Следовательно, исходя из состава казеина, можно предположить то, о чем было уже сказано выше: казеин в молоке содержится в виде сложного комплекса казеи­ната кальция с коллоидным фосфатом кальция, так называемого казеинаткальцийфосфатного комплекса (ККФК). Всостав ККФК также вхо­дит небольшое количество лимонной кислоты, магния, калия и натрия.

В изоэлектрической точке (при pH 4,6) казеин, который в молоке находится в коллоидном растворе в виде растворимой кальциевой соли, переходит в неустойчивое состояние и выпадает в осадок → В молоке казеин свертывается (коагулирует) и выпадает в осадок не только под действием кислот или кислых солей, но также под действием сычужного фермента (или его аналога). В связи с этим казеин легко доступен для пищеварительных протеиназ уже в нативном состоянии, в то время как все глобулярные белки приобретают это свойство при денатурации. При частичном протеолизе казеина, происходящем при ассимиляции молока новорожденными, образуются физиологически активные пептиды, регулирующие такие важные функции, как пищеварительную, кровоснабжение мозга, активность центральной нервной системы и др.

Следует отметить, что осажденный казеин (например, в результате подкисления молока до pH 4,6-4,7) содержит практически все необходимые организму аминокислоты (в том числе незаменимые) и является главной составной частью творога и сыра. В казеине отмечается дефицит лишь серосодержащих аминокислот, но ими богаты сывороточные белки молока. Вообще, белки молока подразделяются на три группы: казеиновые (78—85%); сывороточные (19%); белки оболочек жировых шариков (1%). После осаждения казеина из молока кислотой в сыворотке остается около 0,6% белков (или 15—22% от всех белков), которые называют сывороточны­ми. Они состоят из β-лактоглобулина, α-лактальбумина, иммуноглобу­линов, альбумина сыворотки крови, лактоферрина и других минорных белков.


Дополнительно о мицеллах казеина (от редактора)

Субмицеллярная модель

Мицеллы казеина являются ассоциированными образованиями, формирование которых протекает в вакуолях аппарата Гольджи. Процесс протекает поэтапно. Вначале, после завершения биосинтеза полипептидных цепочек казеина на рибосомах клетки, они поступают в вакуоли аппарата Гольджи, где подвергаются гликозилированию (т.е. осуществляется присоединение углеводов к поверхности белковой глобулы), а также фосфорилированию.

вымя В присутствии ионов кальция (Са2+) образуются субмицеллы казеина. Затем по мере насыщения субмицелл ионами Са2+ и фосфатов, субмицеллы могут сливаться, образуя мицеллы. После слияния с мембраной клетки мицеллы казеина выталкиваются в просвет альвеол (молоко вырабатывается в секреторном эпителии мельчайших полостей — альвеол, расположенных вокруг молочных протоков, последние открываются в молочные цистерны (см. на рис. слева - Вымя в разрезе: 1. Цистерна вымени, 2. Цистерна соска, 3. Млечный сосковый канал, 4. Альвеолы).

мицелла казеина
На рис.: Модель (субмицеллярная) казеиновой мицеллы, состоящая из сферических субмицелл, связанных друг с другом коллоидным фосфатом кальция, показывающая простирающиеся в среду цепочки макропептида каппа-казеина.

Субмицеллярная модель полагает, что мицеллы составлены из сотен дискретных частиц - субмицелл диаметром 10-20 нм, в которых молекулы казеинов гидрофобно связаны друг с другом. Существуют два типа субмицелл: F2 и F3 (Ono & Tagaki, 1986; Ono & Obata, 1989; Aori, 1989). Субмицеллы F2 состоят из αs1- и каппа-казеинов, их диаметр равен 20 нм; субмицеллы F3 диаметром 10 нм состоят из α- и β-казеинов. Субмицеллы удерживаются в составе мицелл, главным образом, коллоидным фосфатом кальция (ККФ).

коровье вымяРазмер мицелл казеина может изменяться и зависит от времени года, породы и кормления животных. В образовании устойчивых мицелл казеина принимает участие находящийся в растворе фосфат кальция, который образует казеинаткальцийфосфатный комплекс (ККФК) → В молоке казеин присутствует в виде казеинатов кальция, в образовании которых участвуют остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот, имеющие карбоксильные группы.

Фосфорилированию подвергаются белки, на поверхности которых располагаются аминокислотные остатки, содержащие гидроксильные группы (серин, треонин, тирозин). При этом кальций может присоединяться к гидроксильной группе остатка фосфорной кислоты. Кроме того, ион кальция (Ca2+) способен образовать кальциевый мостик (соединяя между собой два и более белков) за счет образования связи с расположенными на поверхности этих белков остатками фосфорной кислоты. Эта способность кальция проявляется при формировании мицелл казеин, в образовании которых принимают участие ионы кальция и фосфора.

мицелла казеина На рис. слева: Структура казеиновой мицеллы. Таким образом, мицеллы казеина  представляют собой упорядоченные белковые структуры, сформированные из субмицелл (с учетом различия гидрофобности их поверхностей - ред.), в образовании которых принимают участие ионы кальция (Ca2+) и остатки фосфорной кислоты, формирующие так называемые кальций-фосфатные мостики, связывающие между собой молекулы казеина. Поэтому казеин в молоке присутствует в виде сложного ККФК, в состав которого могут входить и некоторые полярные соединения (лимонная, уксусная кислоты, витамины и др.) и ионы (Na+, К+, Mg2+, Cl- и др.). В мицелле присутствует 35-65% кальция, 25-50% неорганического фосфора, 25-30% магния и 8-10% цитрата.

структура субмицеллы казеина Увеличение в молоке содержания кальция, связанного с казеином, может приводить к понижению термоустойчивости казеиновых мицелл. Это необходимо учитывать при изучении свертывания молока при нагревании и при установлении скорости сычужной коагуляции. Стабильность казеиновых мицелл зависит от содержания в молоке ионов кальция, фосфора, состава казеинов, pH молока, t°C среды.  На рис. справаСтруктура субмицеллы

Размеры мицелл казеина являются определяющими при выявлении технологических свойств молока, в особенности при определении пригодности молока для производства сыров. При этом проявляется способность молока к свертыванию под действием сычужного фермента.


Дополнительная специализированная информация

2. Мицеллообразование

На рис.: Еще некоторые варианты изображений казеиновой мицеллы

Мицеллообразование казеинов молока

Около 95 % казеина находится в молоке в виде сравнительно крупных частиц – мицелл. Мицеллы казеина - близкие к сферической форме частицы размером от 30 до 300 нм и молекулярной массой от 2,6·107 до 5·109 (чаще от 6·10до 6·109). Каждая мицелла содержит от нескольких тысяч до сотен тысяч молекул всех четырех типов казеинов (αs1-, αs2-, β- и κ-казеин). Шарообраз­ная форма мицелл играет важную роль в обеспечении их высокой устой­чивости, так как при одинаковой массе удельная поверхность минималь­на у частиц шарообразной формы. В то же время, чем ниже удельная поверхность коллоидных частиц, тем ниже у них запас свобод­ной энергии, тем выше стабильность при прочих равных условиях. Диа­метр мицелл уменьшается при снижении в среде содержания неоргани­ческих компонентов, особенно кальция и фосфора. Структура мицеллы казеина окончательно не установлена, несмотря на интенсивное ее изучение. Предложены два принципиальных типа мо­дели мицеллы казеина: каркасная (скелетная) и субмицеллярная (см. выше). 

Мицеллообразование – это самопроизвольный процесс агрегатирования казеиновых молекул в более крупные частицы. Поэтому можно дать определение казеинов как группы гетерогенных фосфопротеинов, ассоциирующихся в мицеллы в присутствии ионов кальция, фосфатов и цитратов кальция. С помощью методов электронной микроскопии, ультрацентрифугирования и светорассеяния установлены физические параметры казеиновых мицелл (табл. 2.1.).

Табл. 2.1. Физические параметры казеиновых мицелл

Параметр
Значение
Диаметр
130-160 нм
Площадь поверхности
8⋅10-10 см2
Объем
2,1⋅10-15 см3
Масса
2,2⋅10-15 г
Массовая доля воды
63 %
Молекулярная масса мицеллы:
- гидратированной
1,3⋅109
- дегидратированной
5⋅108
Число мицелл в 1 см3 молока
1014-1016
Среднее расстояние между мицеллами
240 нм

Особенностью казеиновых мицелл является очень высокое содержание воды (около 63 %). Такое количество воды не может удерживаться за счет адсорбционных сил только на поверхности мицеллы. Основное ее количество находится в объеме мицеллы, в том числе, и в виде конденсированной жидкости. По своей природе мицеллярная вода является сорбционной и обусловлена особой структурой казеиновых мицелл.

Структурными компонентами мицелл являются сферические субмицеллы диаметром 10-20 нм. Субмицеллы состоят из 25-30 молекул казеинатов кальция, молекулярная масса субмицеллы (2,5-6,0)⋅105. Казеиновые фракции αs1 αs2 и β самоассоциируются, главным образом, за счет гидрофобных взаимодействий. Гидрофобия в буквальном переводе означает «водобоязнь». Соответственно, гидрофобный эффект, приводящий к образованию определенных пространственных структур, проявляется только в водной среде.

Обширные исследования посвящены растворимости алифатических и ароматических углеводородов, поскольку именно углеводороды обладают наиболее выраженными гидрофобными свойствами. Кроме того, простейший из них – метан – образует кристаллогидрат СН4⋅5,75Н2О, свойства которого тщательно изучены. Основные выводы, которые были получены при изучении растворимости, состоят в следующем.

Растворение низших углеводородов от метана до пентана проходит с выделением теплоты:

Н0(р-р)–Н0(ч.в)=ΔН0(раств)<0,

где Н0(р-р) – парциальная мольная энтальпия углеводорода в растворе воды; Н0(ч.в)– мольная энтальпия чистого углеводорода.

Так, для процесса

C3H8 (ж) → C3H8 (водный раствор)

экспериментально установлено, что ΔН0(раств)(298 К) равна≈-8,0 кДж/моль. Для гексана энтальпия растворения равна нулю. Для углеводородов с более высокой молекулярной массой она становится положительной и эндотермичность процесса нарастает с увеличением длины углеводородной цепи. В отличие от энтальпийной характеристики, энтропия растворения отрицательна для всех типов гидрофобных веществ.

Аналогичные закономерности наблюдаются и для алифатических спиртов, обладающих гидрофобными (дифильными) свойствами. Важным представляется и тот факт, что парциальные мольные объемы гидрофобных соединений меньше, чем мольные объемы чистых веществ. Эта особенность, а также отрицательная энтропия растворения свидетельствуют о более упорядоченном состоянии гидрофобного вещества в растворе. Под действием воды плотность растворенного вещества увеличивается, оно как бы подвергается определенному сжатию со стороны растворителя.

Эти не совсем обычные явления обусловлены особенностями строения жидкой воды. Элементный состав и биполярное строение молекул воды предопределяет образование между молекулами прежде всего водородных связей. При этом каждая молекула воды проявляет свойства как донора, так и акцептора водорода. Поэтому у воды в жидком состоянии молекулы связаны между собой водородными мостиками с образованием ассоциатов, находящихся в динамическом равновесии (рис. 2.1).

Схема тетраэдрического связывания в жидкой воде
Рис. 2.1. Схема тетраэдрического связывания в жидкой воде

Образуются тетраэдрические структуры, так называемые кластеры воды, в которых молекула воды взаимодействует с четырьмя тетраэдрически ориентированными соседями. Таким образом, молекулы воды образуют подвижную сетку, причем каждая молекула ориентирована таким образом, чтобы по возможности были реализованы все водородные взаимодействия с соседними молекулами.

При растворении гидрофобных веществ происходит разрыв водородных связей в определенном объеме растворителя, и в образовавшейся полости размещаются молекулы растворенного вещества. Полости вызывают энергетическую дестабилизацию воды, поскольку в результате их образования мольная энтальпия растворения увеличивается. Уменьшение дестабилизирующего эффекта происходит за счет самопроизвольной реорганизации воды, непосредственно примыкающей к полости. Молекулы воды стремятся расположиться таким образом, чтобы восстановить максимальное число водородных связей: три из них направлены к молекулам, окружающим полость, а четвертая связывает молекулы воды из окружения полости с молекулами в объеме.

Дестабилизация уменьшается также за счет межмолекулярного взаимодействия между растворенным веществом в полости и водой из окружения. Для дифильных веществ, кроме этого типа взаимодействий, существует межмолекулярное взаимодействие между гидрофильным фрагментом и водой, подобное по своей природе взаимодействию в сольватном окружении полярных веществ. Энергия межмолекулярного взаимодействия значительна по своей абсолютной величине даже в случае только дисперсионной его природы. Например, энергия взаимодействия между метаном и водой составляет – 19 кДж/моль при 293 К.

Однако полной стабилизации воды в результате этих процессов (реорганизация растворителя и межмолекулярное взаимодействие с растворенным веществом) не происходит. Так, расчетным путем с использованием физико-химических характеристик воды и метана было установлено, что изменение энтальпии при образовании полости для растворенного метана составляет 4,7 кДж/моль при 293 К. Из этого расчета следует, что вода с полостями энергетически дестабилизирована, поскольку имеет более высокое значение мольной энтальпии по сравнению с обычной водой:

ΔH = Н (вода с полостями)Н (чистая вода) = 4,7 кДж/моль.

Прим. ред.: Для эндотермических (теплопоглощающих) процессов изменение ΔH является положительным значением; для экзотермических (тепловыделяющих) процессов – отрицательным.

Молекулы воды в объеме, примыкающем к полости, испытывают определенные ограничения, накладываемые на степень свободы крутильных колебаний относительно водородной связи:

крутильные колебания  относительно водородной связи

Упрощенно можно сказать, что молекулы воды, формируя полость для гидрофобного вещества, «изгибаются», становятся напряженными. При этом молекула неполярного углеводорода оказывается как бы заключенной в «клетку» растворителя (рис. 2.2,а).

Кроме того, вода, примыкающая к полости, вероятнее всего, более плотная, чем в объеме, поскольку с увеличением плотности вещества растет энергия межмолекулярного взаимодействия, которая в данном случае снижает энергию дестабилизации растворителя, поэтому вода, контактирующая с полостью, более упорядочена и ее энтропия понижена:

ΔS = S(вода с полостями) – S (чистая вода) < 0.

Схема ориентации связанных водородными связями молекул воды вокруг одной молекулы неполярного углеводорода (а) и двух молекул (б)

Рис. 2.2. Схема ориентации связанных водородными связями молекул воды вокруг одной молекулы неполярного углеводорода (а) и двух молекул (б) (гидрофобный углеводород схематично представлен сферическим) 

Энтропийный фактор ТΔS вносит свой вклад в дестабилизирующий эффект воды, выраженный через изменение ΔG:

ΔG = ΔH – ТΔS,


Доп. информация от редактора: Вероятность протекания процесса определяется соотношением энтальпийного и энтропийного факторов. Энтальпийный фактор (ΔH) характеризует стремление системы к упорядоченности, к минимуму энергии, т.к. сопровождается уменьшением внутренней энергии. Энтропийный фактор (ТΔS) – стремление системы к хаотичному и вероятному состоянию (Т добавляется для соотношения размерностей). Разность между ними ΔG – изменение свободной энергии Гиббса: ΔG=ΔH–ТΔS,


При положительном энтальпийном и отрицательном энтропийном факторе значение ΔG, отражающее с термодинамической позиции, насколько дестабилизирована вода, является положительным:

ΔG = G (вода с полостями)G (чистая вода) > 0.

Уменьшение дестабилизации растворителя происходит в результате самопроизвольного процесса кооперативного объединения молекул растворенного вещества в одной полости.

Схема объединения молекул растворенного дифильного веществав полости растворителя

Рис. 2.3. Схема объединения молекул растворенного дифильного вещества в полости растворителя: Х – полярный фрагмент дифильной молекулы; R – гидрофобный (неполярный) фрагмент дифильной молекулы.

В полости II (рис. 2.3) неизбежно сближение молекул дифильного вещества, и оно происходит таким образом, чтобы было как можно больше контактов между гидрофобными фрагментами, усиливающих дисперсионное взаимодействие между ними. Энергия дисперсионного взаимодействия определяется выражением:
Энергия дисперсионного взаимодействия определяется выражением
Где IA, IB – потенциалы ионизации взаимодействующих молекул; αA и αB – поляризуемость взаимодействующих молекул; r – расстояние между центрами взаимодействующих молекул (энергия дисперсионного взаимодействия пропорциональна поляризуемостям αA и αB обеих молекул и, так же, как энергии диполь-дипольного и индукционного взаимодействий, обратно пропорциональна 6-й степени расстояния между молекулами).

Дисперсионные силы очень короткодействующие (U ~ 1/r6). С другой стороны, из соотношения (определяющего U) следует, что энергия дисперсионного взаимодействия сильно возрастает даже при незначительном сближении взаимодействующих фрагментов R.

В агломерате III (рис. 2.3.) гидрофильные фрагменты Х растворенного дифильного вещества направлены в сторону воды. Такое расположение обеспечивает сильное сольватационное взаимодействие между этим фрагментом и растворителем, что ведет к значительному снижению уровня дестабилизации молекул воды.

Оба этих фактора – дисперсионное взаимодействие и сольватация полярных фрагментов – определяют термодинамическую стабильность агломерата III. Расположение молекул растворенного вещества в структуре, подобной III, более упорядоченное, и оно объясняет уменьшение энтропии при растворении дифильных соединений. Рассмотренные закономерности ассоциации дифильных молекул в воде в более крупные агломераты часто и объединяют термином «гидрофобный эффект».

Большинство белков за счет наличия в полипептидной цепи как полярных, так и неполярных фрагментов аминокислот могут рассматриваться как дифильные или содержащие дифильные участки. В качестве дополнительной информации, можно отметить, что κ-Кн включает гидрофильный участок на С-конце (гликомакропептидная часть) и гидрофобный N-конец (остатки 1-105), занимающий две трети полипептидной цепи; αs2-Кн содержит три гидрофильных участка, расположенных между 8-16, 56-61, 129-133 аминокислотными остатками, и один гидрофобный С-конец (остатки 160-207).


Прим. ред.: Эффект взаимодействия полярных групп белка с полярными молекулами воды связан с преобладанием полярных аминокислотных остатков на поверхности белковой молекулы. Наряду с этим возможно также взаимодействие посредством водородных связей между пептидными группами (N – H ∙∙∙ O = C), которые принадлежат разным участкам полипептидной цепи.

взаимодействие посредством водородных связей между пептидными группами

Энергия водородных связей между пептидными группами в белке и между ними и водой примерно одинакова. Это должно было бы привести к рыхлой структуре молекулы белка в водном растворе. Однако реально существующая структура белка упорядочена и компактна, поскольку она определяется гидрофобными взаимодействиями.

Отдельные аминокислотные остатки различаются по своим гидрофобным свойствам и могут вести себя как полярные и неполярные соединения. Термодинамическую оценку степени гидрофобности дают по величине изменения ∆G, приходящегося на боковую группу аминокислоты при ее переносе из этанола в воду.

Взаимодействие неполярных групп с водой приводит к их преимущественному «заталкиванию» внутрь белковой молекулы и соответственно к выходу наружу полярных групп. В предельном случае общая топография белковой молекулы предполагает существования ядра глобулы, заполненного гидрофобными аминокислотами и защищенного слоем обращенных в воду полярных групп. На основании этих представлений немецкий химик Фишер (лауреат Нобелевской премии по химии – ред.) приближенно оценил форму глобулы, разбив все аминокислоты на две группы: 1) Полярные и гидрофильные (АРГ, АСП, ГИС, ГЛУ, ЛИЗ, СЕР, ТИР, ТРЕ); 2) Гидрофобные (остальные 12 аминокислот).


По-видимому, поведение казеинов в воде будет подчиняться тем же закономерностям, что и неполярных углеводородов и низкомолекулярных дифильных соединений.

Склонность веществ к гидрофобным взаимодействиям часто оценивают через гидрофобность. В частности, гидрофобность аминокислот определяется экспериментально по величине констант равновесного распределения аминокислот между водой и слабополярным растворителем, обычно высокомолекулярным спиртом, например октанолом:

К = хвода / хнепол 

Где K – константа распределения аминокислоты между неполярным растворителем и водой; хнепол и хвода – равновесные мольные доли аминокислоты в неполярном растворителе и воде соответственно.

Эти эксперименты достаточно сложны, так как одни аминокислоты практически не растворяются в воде, а другие – в органическом неполярном растворителе. Приходится специально подбирать, вместо неполярного, слабополярный растворитель, удовлетворительный и для более, и для менее полярных аминокислот. При этом в зависимости от используемых слабополярных растворителей получаются несколько расходящиеся результаты, особенно для ионогенных и сильнополярных аминокислот.

Величина изменения свободной энергии Гиббса при переходе аминокислоты из слабополярного растворителя в воду характеризует гидрофобность аминокислот и равна:

ΔG0298 = - RT lnК,

Где R - универсальная газовая постоянная = 8,31 Дж/(моль∙К); Т=298 К (25оС); K – константа распределения аминокислоты между неполярным растворителем и водой (см. выше).


Примечание редактора: По значению знака и величины энергии Гиббса можно судить о возможности протекания химического процесса в данном направлении. Если ΔG < 0 процесс идет самопроизвольно, ΔG = O система находится в равновесии, ΔG > 0 самопроизвольный процесс невозможен. При ΔG < 0 – реакция возможна, но неизвестно какова ее скорость, т.к. для протекания реакции реагирующая частица должна обладать определенной энергией активации.


Чаще всего значения величины изменения свободной энергии Гиббса корректируются для характеристики гидрофобности только боковых фрагментов аминокислот (табл. 2.2).

Таблица 2.2. Гидрофобные свойства аминокислотных остатков, кДж/моль

Аминокислота
Гли
Глу
Глн
Асп
Асн
Сер
Гис
Лиз
Арг
Ала
ΔG0298 (спирт→вода) 0,0 -3,8 -1,3 -4,6 -3,3 -0,4 0,8 -6,3 -6,3 1,7
Аминокислота
Тре
Вал
Иле
Лей
Мет
Фен
Тир
Цис
Три
Про
ΔG0298 (спирт→вода) 1,2 10,0 6,7 9,6 6,7 10,0 5,4 8,8 12,5 4,2

Из табл. 1.2 видно, что чем больше гидрофобная поверхность аминокислотного остатка, тем выше значение гидрофобности (рис. 2.4), поскольку при растворении аминокислоты с объемным гидрофобным фрагментом в воде за счет разрыва водородных связей образуется большая полость.

Так, для неполярных ароматических аминокислот (триптофан, фенил-аланин), разветвленных алифатических (валин, лейцин, изолейцин) гидрофобность достаточно высока и положительна по знаку. В то же время для неполярного аланина, имеющего относительно небольшую гидрофобную поверхность, значение гидрофобности составляет всего 1,7 кДж/моль. В среднем энергия гидрофобного эффекта составляет около 0,08 – 0,1 кДж/моль на каждый квадратный ангстрем поверхности неполярного фрагмента, с которым вынуждена контактировать вода, переходя при этом в термодинамически невыгодное состояние (рис. 2.2, а).

Стереоконфигурации аминокислот

Рис. 2.4. Стереоконфигурации аминокислот: а – глицина; б – аланина; в - изолейцина

Известно, что фракции казеина при небольшой молекулярной массе обладают высокой средней гидрофобностью (табл. 2.3), которая находится в пределах от 1,84 до 8,45 кДж/остаток, причем 80% всех изученных белков имеют сравнительно низкую гидрофобность в пределах 3,8-5,0 кДж/остаток.

Таблица 2.3. Некоторые показатели фракций казеина

Показатель
αs1-Кн
αs1-Кн
β-Кн
κ-Кн
- Молекулярная масса
- Количество аминокислотных остатков
- Количество фосфатных групп
- Количество цистеина
- Средняя гидрофобность, кДж/остаток
23600
199
8(8-9)
0
4,43-5,19
25200
207
11(10-13)
2
4,17
24000
209
5
0
5,15-5,56
19000
169
1(1-2)
2
4,64-5,36

Гидрофобный эффект в казеиновой фракции молока проявляется в том, что неполярные фрагменты казеинов локализуются внутри гидрофобного ядра, а заряженные гидрофильные фрагменты – на его поверхности. Таким образом, в поверхностном слое субмицелл содержатся фосфосериновые остатки αs1-, αs2- и β-казеинов, а также гликомакропептидная часть κ-казеина; последний занимает при этом значительную часть поверхности субмицеллы. Удаление из водной фазы гидрофобных фрагментов казеинов снижает структурные напряжения воды. Хотя организация самих казеиновых молекул в субмицеллы и сопровождается уменьшением энтропии, в целом, за счет роста энтропийной составляющей всей системы и малых изменений энтальпии изменение функции Гиббса становится отрицательным (табл. 2.4).

Табл. 2.4. Термодинамические параметры ассоциации αs1-казеина при рН 6,4 и Т=287 К

Вид ассоциации
ΔG0, кДж/моль
ΔН0, кДж/моль
ΔS0, Дж/моль К
Димеризация
Тримеризация
Тетрамеризация
Пентамеризация
-13,7
-14,6
-13,4
-14,0
27,3
55,4
-2,5
13,8
143
244
38
97

Гидрофобные взаимодействия по энергии малы (0,84-8,3 кДж/моль), однако, высокое содержание неполярных аминокислот в казеинах дает заметный выигрыш в энергии при образовании гидрофобного ядра. Гидрофобные взаимодействия усиливаются при повышении температуры до 600С, а затем ослабевают. Минимум энергии гидрофобного взаимодействия приходится на температуру 50С.

Хотя принцип формирования субмицелл является общепризнанным, единая точка зрения на химический состав субмицелл до настоящего времени отсутствует. Согласно одной точки зрения, выдвинутой Мором в 1983 г., все субмицеллы имеют одинаковый состав, причем отношение αS:β:κ равно 3:2:1. Согласно другой, более правдоподобной теории, белковый состав субмицелл различается: отдельные субмицеллы обогащены κ-казеином, другие его содержат в меньшем количестве, в третьих κ-казеин может отсутствовать. Стабилизация последних осуществляется только за счет фосфосериновых фрагментов αS1- и β-казеинов, которые не в состоянии полностью экранировать от контакта с водой гидрофобное ядро субмицеллы. Наличие на поверхности субмицелл гидрофобных, так называемых «липких» участков, предопределяет механизм ихдальнейшей агрегации.

Особая роль в образовании субмицелл отводится ионам Са2+, которые могут играть роль солевого мостика, соединяющего αs1-, αs2- и β-казеины. Кроме того, присоединение ионов кальция к фосфосериновым фрагментам αs1-, αs2- и β-казеинов снижает их отрицательный заряд, и создается предпосылка для их гидрофобных взаимодействий. При низкой концентрации ионов кальция они взаимодействуют с фосфосериновыми фрагментами, при высокой – с остатками глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Роль ионов кальция в формировании субмицелл особенно наглядно иллюстрируется в модели субмицеллы Уофа, так называемой розетки. Мономеры αS- и β-Кн представлены в виде компактных гидрофобных тел, имеющих заряженные участки с фосфосериновыми группами, изображенными в виде заштрихованных петель (см. ниже рис. 2.5).

При отсутствии ионов кальция мономеры соединяются за счет гидрофобных взаимодействий в тетрамеры, имеющие конфигурацию радиально ориентированных молекул. При этом отрицательно заряженные петли испытывают взаимное отталкивание, предотвращающее дальнейшую агрегацию казеина. В присутствии ионов кальция, которые, присоединяясь по фосфосериновым фрагментам, снижают отрицательный заряд и образуют солевые мостики, создается возможность для последующей ассоциации. В результате формируются октамеры, затем более сложные полимеры в виде розеток, напоминающие типичные мицеллы поверхностно-активных веществ. Поверхность розетки экранирована κ-казеином, и структура приобретает стабильность.

Модель субмицеллы по Уофу
Рис. 2.5. Модель субмицеллы по Уофу: а – мономер αS- и β-Кн; б – тетрамер; в – полимер «розетка», экранированная κ-казеином

В настоящее время наиболее признанной является модель строения субмицеллы по Шмидту (рис 2.6,а). Субмицелла является плотно упакованной, в отличие от модели Уофа, сферической единицей, состоящей из гидрофобного ядра, сформированного из неполярных фрагментов четырех фракций казеина, экранированного гидрофильной оболочкой, в состав которой входят фосфатные группы αs1-, αs2- и β-казеинов, а также гликомакропептиды κ-казеина, соотношение между фракциями казеинов может меняться, при этом в некоторых субмицеллах κ-казеин может отсутствовать.

Примерно одинаковые по размеру субмицеллы разного белкового состава объединяются в более крупные мицеллы. Учитывая современные представления о строении и составе субмицелл, можно однозначно предположить, что движущей силой мицеллообразования являются по аналогии с субмицеллообразованием гидрофобные взаимодействия. В центре мицеллы располагаются наиболее гидрофобные субмицеллы, содержащие минимальное количество κ-казеина и имеющие на поверхности большие области (до 50 %) гидрофобного характера. Ближе к поверхности мицелл распределяются субмицеллы с более высоким содержанием κ-Кн. Агрегация продолжается до тех пор, пока все участки поверхности гидрофобного ядра мицеллы не будут экранированы от контакта с водой полярными группами κ-казеина. Таким образом, ограничение роста мицелл казеина определяется в основном содержанием в системе κ-казеина. Агрегация субмицелл прекращается в том случае, когда в мицелле содержится не менее 15 % κ-казеина (рис. 2.6). При этом соотношение белковых фракций примерно постоянное, равное αs1 : αs2 : β : κ = 3:1:3:1, или 3:0,8:3:1, могут быть другие близкие соотношения.

Главными компонентами минеральной части мицеллы являются фосфор и кальций. В целом коллоидному фосфату кальция отводится одна из главных ролей в мицеллообразовании. Даже при наличии движущей силы мицеллообразования в виде высокой тенденции к гидрофобным взаимодействиям в отсутствие коллоидного фосфата кальция мицеллы не образуются.

Модель субмицеллы (а) и мицеллы казеина (б)

Рис. 2.6. Модель субмицеллы (а) и мицеллы казеина (б) (точками отмечено нахождение коллоидного фосфата кальция)

По теоретическим подсчетам, на одну казеиновую мицеллу с молекулярной массой 108 приходится около 25000 фосфатных групп, причем 40 % из них включаются в коллоидный фосфат кальция, остальные связаны непосредственно с ионами кальция (рис. 2.7).

Фрагмент схемы соединения двух субмицеллпри участии коллоидного фосфата кальция

Рис. 2.7. Фрагмент схемы соединения двух субмицелл при участии коллоидного фосфата кальция. Обозначение: Сер - серин; Ca9(PO4)6 - коллоидный фосфат кальция (прим. ред.: в молоке фосфат кальция существует в коллоидной форме (в мицеллах) в связке с казеином, магнием, цинком и цитратом. Состав коллоидного фосфата кальция, присутствующий в частицах казеина и характер его связи до сих пор неизвестны. Это может быть гидрофосфат или фосфат кальция, их смесь, а также кальций-фосфат-цитратный комплекс и др. Фосфор коллоидного фосфата кальция в отличие от фосфора органического, входящего в состав казеина, называют неорганическим. Фосфат кальция, по-видимому, может взаимодействовать с серин-фосфатными группами казеина соединяя его молекулы между собой наподобие кальциевых мостиков).

Вероятно, присоединение коллоидного фосфата кальция к казеинам будет определяться количеством в них фосфатных групп. Фосфатные группы содержат все четыре фракции казеина, но в разных количествах: αs2-Кн – 10-13 групп, αs1-Кн 8-9, β-Кн – 4-5, κ-Кн – 1. Если учесть, что содержание αs2-казеина в мицелле невысокое, а κ-Кн содержит всего одну серинфосфатную группу, то основными фракциями, через которые включается коллоидный фосфат кальция, должны быть αs1–Кн и β-Кн.

Вместе с тем, довольно легкий выход β-казеина из состава мицелл при понижении температуры свидетельствует о том, что β-казеин не столь прочно связан с внутренней структурой мицеллы. Таким образом, мицеллярную структуру формирует в основном αs1-Кн с присоединенным к нему коллоидным фосфатом (цитратом) кальция, а уже к этому каркасу прикрепляются с помощью солевых мостиков β – и κ-казеины.

В небольших количествах в состав мицелл входят цитраты, ионы магния, натрия, калия. Углеводная часть представлена сиаловой кислотой, галактозой и галактозамином в количестве 0,3, 0,2 и 0,2 % к массе мицелл.

Предполагаемая модель казеиновой мицеллы подтверждается обратным процессом их разрушения. На состояние коллоидного фосфата кальция существенное влияние оказывает рН среды. Так, если понижать рН, то коллоидный фосфат кальция переходит в водорастворимый дигидроортофосфат кальция, который удаляется в молочную сыворотку:

CaHPO4 + H3PO4 
Са(H2PO4)2

Удаление более 20-30 % коллоидного фосфата кальция сопровождается распадом мицелл на небольшие частицы казеинатов кальция размером около 30 нм, вплоть до субмицелл с размером 10-20 нм.

Удаление кальция из казеинатов кальция, например с помощью оксалата аммония, приводит к распаду субмицелл до водорастворимых казеиновых комплексов (димеров, тримеров, других низкомолекулярных олигомеров). Наконец, при внесении мочевины, этилендиаминтетраацетата, увеличении рН до 9,0 разрушаются практически все водородные связи, гидрофобные, электростатические взаимодействия, солевые мостики между отдельными казеиновыми молекулами, что приводит к образованию казеиновых мономеров (субъединиц).

Структура мицелл казеина и факторы устойчивости

micelle-structure

Хотя окончательно вопрос структуры мицелл казеина не решен, на базе исследований последних лет с использованием электронно-микроскопических и других методов предпочтение отдается модели субмицеллярного строения рыхлых пористых мицелл. Согласно этому представлению мицеллы казеина имеют почти сферическую форму, средний диаметр около 100 нм (колебания от 40 до 300 нм) и молекулярную массу в среднем 6.108. Количество мицелл казеина в молоке намного больше, чем жировых шариков (до 15.1015 против 15.108 в 1 см3).

Мицеллы казеина состоят из нескольких сотен субмицелл диаметром 10-15 нм. Субмицеллы – это агрегаты основных фракций казеина (αS-, β- и κ-), соединенных между собой гидрофобными, электростатическими, водородными связями и кальциевыми мостиками. Полипептидные цепи фракций казеина свертываются в субмицелле таким образом, что большинство гидрофобных групп составляют ее ядро, а гидрофильные располагаются на поверхности субмицелл. Гидрофильная часть содержит отрицательно заряженные кислотные группы аспарагиновой и глютаминовой кислот (СОО-) и фосфорной кислоты (РО32-). Гидрофильные свойства субмицелл и мицелл усиливают ориентированные наружу гликомакропептиды κ-казеина, располагающегося большей частью на поверхности субмицелл, причем субмицеллы различаются содержанием κ-казеина. Субмицеллы с незначительным содержанием κ-казеина расположены внутри мицелл, а с высоким содержанием – на поверхности. Пептидная часть гликомакропептидов κ-казеина содержит большое количество оксиаминокислот (серина и треонина), глютаминовой и аспарагиновой кислот, а углеводная – свободные карбоксильные группы сиаловой кислоты. Объединение субмицелл в мицеллы происходит, по мнению многих исследователей, с помощью коллоидного фосфата кальция и, возможно, за счет цитрата кальция и гидрофобных взаимодействий. Точный состав коллоидного фосфата кальция и механизм его взаимодействия с казеином пока не установлен, но выяснено, что удаление его из молока вызывает нарушение структуры мицелл. В соответствии с последними представлениями о строении мицеллы казеина поверхность ее имеет «волосковый слой», который распространяется в дисперсную среду на 10-15 нм и препятствует сближению мицелл. «Волосковый слой» представляет собой выступающие с поверхности мицелл гидрофильные участки полипептидных цепей κ-казеина – гликомакропептиды. Мицеллы имеют пористую структуру, что обусловливает проникновение внутрь мицелл, воды и ферментов.

Диссоциация присутствующих на поверхности мицелл карбоксильных групп глутаминовой, аспарагиновой и сиаловой кислот, а также фосфатных групп сообщает мицеллам отрицательный заряд, что обусловливает силы электростатического отталкивания между коллоидными частицами.

В свежем молоке мицеллы казеина обладают относительной устойчивостью – не коагулируют при механических воздействиях (очистка, сепарирование, гомогенизация) и при нагревании молока до высоких температур. Для снижения их устойчивости, то есть для коагуляции, необходимо воздействие таких факторов, как понижение рН, повышение концентрации ионов кальция, внесение сычужного фермента.


Дополнение от редактора: Согласно теории ДЛФО (теория, разработанная Дерягиным, Ландау, Фервеем и Овербеком), коллоидные частицы в растворе вследствие броуновского движения могут беспрепятственно сближаться друг с другом, пока не соприкоснутся своими жидкими диффузными оболочками или слоями. При этом между ними не возникает никаких сил взаимодействия. Для дальнейшего сближения частицы должны деформировать свои диффузные оболочки, чтобы произошло их взаимное перекрывание (или проникновение друг в друга). Но жидкости плохо сжимаются, и в ответ на деформацию с их стороны появляются так называемые силы расклинивающего давления, препятствующие осуществлению данного процесса. Причем чем больше размеры диффузного слоя, тем значительнее силы расклинивающего давления.

Если столкнувшиеся частицы обладают достаточным запасом кинетической энергии для преодоления действия этих сил, то их диффузные слои перекроются, но в этот момент между ними и гранулами возникнут электростатические силы расталкивания (т.к. они имеют заряды одинакового знака).

Схема взаимодействия коллоидных частиц

Рис.: Схема взаимодействия коллоидных частиц: а – агрегативно устойчивая система; 
б – перекрывание диффузных слоев; в – коагуляция

В случае преодоления этих сил и сближения гранул на расстояние ≈ 10–7см и меньше (т.е. на расстояние, равное или меньшее размерам одной молекулы дисперсионной среды) между ними возникают так называемые Ван-дер-Ваальсовые силы притяжения, имеющие физическую природу. Они и вызывают сцепление (соединение) коллоидных частиц друг с другом.


Итак, можно выделить несколько факторов, стабилизирующих казеиновые мицеллы:

Во-первых, для объяснения необычайно высокой агрегативной устойчивости мицелл можно применить упомянутую выше теорию ДЛФО. Согласно этой теории, устойчивость коллоидных систем определяется соотношением сил межмолекулярного притяжения и электростатического отталкивания между коллоидными частицами. Силы электростатического отталкивания обусловлены наличием отрицательного заряда казеиновой мицеллы, который создают серинфосфатные группы αS-, β-казеинов и карбоксильные группы сиаловой кислоты каппа-казеина (к-казеин содержит углеводы и сиаловую кислоту - ред.). Вокруг заряженной мицеллы ориентируются противоионы, содержащиеся в молочной сыворотке, такие как ионы натрия, калия, магния, кальция, вследствие чего формируется ДЭС с характерными для него адсорбционной и диффузионной частями.

Двойной электрический слой (межфазный) (ДЭС) — слой ионов, образующийся на поверхности твёрдого тела в результате адсорбции ионов из раствора, диссоциации поверхностного соединения или ориентирования полярных молекул на границе раздела фаз. Ионы, непосредственно связанные с поверхностью, называются потенциалопределяющими. Заряд этого слоя компенсируется зарядом второго слоя ионов, называемых противоионами.

Диффузионная часть ДЭС может тангенциально смещаться относительно неподвижного адсорбционного слоя. В месте расположения поверхности скольжения, разделяющей слой Гельмгольца и диффузионный, возникает электрический потенциал, называемый электрокинетическим, или дзета-потенциалом.

Дзета-потенциал (ξ) - это электрический потенциал в плоскости скольжения. Эта плоскость является границей раздела, которая отделяет подвижную жидкость от жидкости, которая остается прикрепленной к поверхности. Дзета-потенциал - это научный термин, обозначающий электрокинетический потенциал в коллоидных дисперсиях

Дзета-потенциал казеиновых мицелл при 20-250С составляет -15...-20 мВ. При сближении мицелл ДЭС перекрываются, в результате перераспределения заряда в перекрывающейся области ДЭС возникает эффективное электростатическое отталкивание между мицеллами, что во многом определяет агрегативную устойчивость казеиновых мицелл.

Во-вторых, мицеллы стабилизируются сольватными оболочками вокруг их полярных поверхностей. Гидратная оболочка формируется за счет дипольдипольных и ион-дипольных взаимодействий фрагментов гидрофильной оболочки мицеллы с водой.

В-третьих, стабилизирующим фактором является неэлектростатическое отталкивание гибких полипептидных фрагментов казеинов, выступающих над поверхностью казеиновых мицелл. Дело в том, что казеиновые мицеллы не являются совершенно сферическими частицами, над их поверхностью выступают так называемые «волоски» - достаточно длинные гидрофильные С-концевые фрагменты полипептидной цепи κ-казеина и гидрофильные N-концевые участки β-казеина. Эти выступающие фрагменты препятствуют тесному сближению мицелл. По приближенным данным, на 100 нм2 поверхности мицеллы приходится 1-2 волоска, их содержание не менее 0,1% массы мицелл.


Дополнительная информация (к разделу о сычужных ферментах)

3. О сычужной коагуляции с точки зрения физико-химических процессов

коллоид и коагулянт

3.1. Структурообразование в белково-молочных системах

Структурообразование в белково-молочных системах начинается с изменения состояния поверхности казеиновых мицелл. При действии различных факторов (сычужного фермента, органических кислот, например молочной, продуцируемой молочнокислыми бактериями, колебаний температур и других) происходят:

  • конформационные изменения белковых молекул и, как следствие, формирование на поверхности мицелл гидрофобных участков;
  • нейтрализация отрицательного заряда, приводящая к снижению эффекта электростатического отталкивания между мицеллами;
  • уменьшение степени гидратации и толщины сольватной оболочки.

Все эти факторы приводят к нарушению стабильности казеиновых мицелл и снижению их агрегативной устойчивости. Следует отметить, что при полной потере агрегативной устойчивости столкновение мицелл приводит к коагуляции – объединению в более крупные образования с последующим осаждением в виде осадка-коагулята. Причем объединение частиц может происходить случайно по любому участку или нескольким участкам поверхности мицеллы (рис. 3.1, а).

Схематичное изображение коагулята (а) и геля (б)
Рис. 3.1. Схематичное изображение коагулята (а) и геля (б)

При частичной потере агрегативной устойчивости казеиновыми мицеллами, т. е. при формировании мозаичной структуры поверхности с повышением доли гидрофобных участков, мицеллы агрегатируются друг с другом только за счет взаимодействия по гидрофобным участкам, где ослаблены или совсем сняты факторы устойчивости. Объединяясь по этим участкам, мицеллы образуют пространственную сетчатую структуру, в которой они теряют свою подвижность и переходят из свободнодисперсного в связаннодисперсное состояние, а пустоты сетчатого каркаса заполняются дисперсионной средой – молочной сывороткой (рис. 3.1, б). Происходит так называемое гелеобразование, а образующиеся пространственные структуры называются гелями.

Кроме воды, заполняющей пустоты, в состав геля входит вода гидратных оболочек мицелл и капиллярная вода, поскольку молочный гель можно рассматривать как открытую капиллярную систему.

За счет гелеобразования белково-молочная система приобретает целый комплекс новых структурно-механических свойств (реологических), характеризующих сопротивление деформации через такие показатели, как твердость, упругость, жесткость, эластичность, пластичность, вязкость.

Твердость отражает способность системы сопротивляться сжатию; упругость – способность быстро возвращаться в исходное состояние после снятия нагрузки; жесткость – сопротивляемость деформациям сдвига; эластичность – способность под действием внешних сил к большим остаточным деформациям, которые, в отличие от упругих деформаций, исчезают после снятия нагрузки не сразу, а в течение определенного, иногда довольно продолжительного времени; пластичность – способность к необратимым деформациям, которые остаются после снятия нагрузки; вязкость характеризует способность системы сопротивляться перемещению одного слоя по отношению к другому под действием внешних сил.

Количественно эти свойства характеризуются реологическими параметрами, определяющими связь между напряжением (отношением внешних сил к площади сечения, поперечного вектору этих сил) и величиной, вызываемых этими напряжениями относительных деформаций. Так, сопротивляемость сдвигу определяется модулем сдвига G, который равен отношению напряжения сдвига к деформации сдвига; вязкость – коэффициентом вязкости, равным отношению напряжения сдвига к скорости деформации.

Молочные гели как структурированные системы занимают промежуточное положение между жидкими и твердыми телами, то есть обладают вязкоэластичными свойствами, в связи с чем для их характеристики требуется несколько реологических параметров. Чаще всего используются модуль сдвига и коэффициент вязкости.

Структурно-механические свойства гелей во многом зависят от химического состава, типа взаимосвязей между компонентами, а также количества этих взаимодействий.

В зависимости от природы взаимодействий между частицами пространственные структуры классифицируют на коагуляционные и конденсационные (или конденсационно-кристаллизационные).

В коагуляционных структурах взаимодействие между частицами носит характер межмолекулярных связей Ван-дер-Ваальса. Между частицами при этом остаются тонкие устойчивые прослойки дисперсионной среды, препятствующие их дальнейшему сближению. Наличие тонких прослоек дисперсионной среды обусловливает меньшую прочность структуры, но придает ей пластичность и эластичность. Для таких структур свойственно явление тиксотропии. Под тиксотропией понимают способность системы возвращаться самопроизвольно в исходное состояние после их разрушения под действием внешних факторов (тиксотропно-обратимые системы).

В конденсационных структурах взаимодействия между частицами не только ван-дер-ваальсовые, но и могут иметь химическую природу. Главными при этом являются дисульфидные связи, возникающие при взаимодействии сульфгидрильных групп цистеина; солевые мостики, образующиеся при участии ионов кальция, фосфосериновых фрагментов, карбоксилатных групп Глу и Асп. При действии внешних факторов такие связи разрушаются, как правило, без восстановления (тиксотропно-необратимые системы).

Молочные гели по характеру связей между мицеллами являются коагуляционно-конденсационными.

Структурообразование начинается после появления нестабильных мицелл, поверхность которых имеет мозаичное строение, т.е. имеются и гидрофильные, и гидрофобные участки в равной степени. Нарушение стабильности мицелл может быть вызвано протеолизом κ-казеина, понижением рН, термической обработкой и другими факторами.

Процесс структурообразования идет во времени. На первом этапе (индукционный период) возникают агрегаты казеиновых мицелл. Прочность структуры практически равна нулю. Тиксотропный характер агрегатирующейся системы связан, прежде всего, с гидрофобными взаимодействиями между неполярными участками поверхности дестабилизированных мицелл.

На втором этапе прочность структуры нарастает при одновременном снижении тиксотропии. Это объясняется тем, что коагуляционные контакты между агрегатами казеиновых мицелл постепенно заменяются более прочными (и необратимо разрушающимися) фазовыми контактами. Здесь возможно образование водородных, дисульфидных связей, роль сшивающих мостиков могут выполнять ионы кальция, коллоидный фосфат кальция, денатурированные сывороточные белки и др. В качестве структурных элементов в молочных сгустках могут выступать: липидная фаза, фрагменты клеток молочнокислых бактерий, микробные полисахариды. В результате образуется коагуляционно-конденсационная белковая структура.

Одна из главных особенностей молочных гелей – способность к набуханию, а также к обратному сжатию после набухания. Явление самопроизвольной отдачи воды без участия внешних сил при одновременном сжатии объема называется синерезисом. Теоретически синерезис можно рассматривать как самопроизвольное снижение водосвязующей способности казеинов за счет возрастания числа контактов между казеиновыми частицами. Другими словами, при формировании геля между казеиновыми частицами образуется сравнительно малое число контактов, которое не соответствует предельно уплотненному состоянию структуры. Затем в течение времени в результате перегруппировки частиц, обусловленной тепловым движением, число этих контактов увеличивается, что неизбежно приводит к сжатию геля. Если не действуют никакие внешние силы, структурные частицы геля сохраняют свою первоначальную форму, но при этом наблюдается сжатие объема. При  t < 16 0C синерезис отсутствует, если t > 45 0С, наблюдается изменение структуры геля. Значение объема геля в диапазоне температур от 16 до 45 0С определяется по экспоненциальному закону

Значение объема геля в диапазоне температур от 16 до 45 0С определяется по экспоненциальному закону

где V – объем кубика геля через некоторое время τ; V0 – объем кубика геля через 30 мин после разрезки; К – константа геля, равная 0,225⋅10-3мин-1⋅град-1 для временного интервала 30 мин; t – температура протекания синерезиса; t0 – нулевая температура замораживания синерезиса (t0 = 16 0С).

При синерезисе быстрее всех отделяется вода, заполняющая пустоты. Вода, не отделившаяся из пустот, часто становится причиной образования пороков, например, при производстве сыра.

Капиллярная вода при синерезисе отделяется не полностью. Она образует резервную воду, которая (например, при созревании сыра) поглощается как гидратная.

Поскольку вода, входящая в сольватную оболочку белковых молекул и казеиновых мицелл, удерживается силами межмолекулярного взаимодействия Ван-дер-Ваальса, она при синерезисе практически не отделяется. Поддержание синерезиса за счет воды сольватных оболочек и воды, заполняющей капилляры геля, происходит только при повышенных температурах, например, при отваривании сыра (нагревание до 500С в производстве твердых сыров).

Увеличение числа гидрофильных групп способствует увеличению толщины сольватной оболочки мицелл. Это происходит при использовании заквасок, быстро расщепляющих белок, при созревании молока, при повышенных концентрациях ферментов.

Синерезис в молочном производстве может быть как желательным явлением, так и нежелательным. Так, в производстве сычужных сыров обеспечивают условия для протекания синерезиса и ускоряют процесс отделения сыворотки путем соответствующей обработки сгустка. В производстве йогурта синерезис, наоборот, ухудшает качество продукта, и его следует предотвращать.

Наиболее сильное влияние на синерезис оказывают колебания температуры, низкие рН (ниже рI, т.е. ниже pH в ИЭТ)), механические воздействия – вибрация, перемешивание. Если одновременно действуют два из указанных факторов или все три, то синерезис неизбежен. Особенно это следует учитывать при получении кислотных гелей, где синерезис – явление нежелательное.

Наряду с синерезисом важную роль в образовании молочных гелей играет диффузия. Казеиновый гель представляет собой открытую со всех сторон капиллярную систему, в которую легко диффундируют ионы (например, при посоле сыра).

3.2. Сычужная коагуляция

Казеиновая сеть

На рис.: Казеиновая сеть (сеть белков казеина - структура из цепочек казеиновых мицелл, "слипшихся" под действием сычужного фермента (коагулянта)): Сканирующая электронная микроскопия (SEM) визуализирует сеть казеинового геля, полученную из молока с малыми мицеллами казеина (слева) и молока с крупными мицеллами казеина (справа). Изображения представлены с увеличением в 10 000 раз, масштабная линейка = 1 мкм. Как правило, казеиновая сеть простирается во всех направлениях, образуя клетку, жесткость которой зависит от степени открытости, количества воды, связанной с казеином, и присутствия жира и свободной воды.

Сычужная коагуляция казеинов лежит в основе производства сыров и в меньшей степени творога. Целью сычужного свертывания молока является перевод казеина и молочного жира в такое состояние, в котором они могут быть отделены от большей части сыворотки сравнительно мягкими физико-химическими методами. При сычужной коагуляции происходит ферментативное воздействие на κ-Кн поверхности мицеллы с отщеплением наиболее гидрофильной части – гликомакропептида. Отщепление гликомакропептида снижает отрицательный дзета-потенциал с -15 – -20 мВ до -5 – -7 мВ, уменьшает степень сольватации мицелл, ликвидирует ворсистый внешний слой, вследствие чего резко снижается агрегативная устойчивость казеиновых мицелл. κ-Казеин, от которого ферментативно отщеплен гликомакропептид, так называемый пара-κ-казеин, как отмечалось ранее, утрачивает способность стабилизировать структуру казеиновых мицелл.

Гидрофобные участки по месту отщепления гликомакропептида определяют последующую агрегацию мицелл в пространственную структуру геля.

Ферменты, осуществляющие коагуляцию, обусловленную отщеплением от κ-казеина гидрофильных фрагментов, называются молокосвертывающими. Следует отметить, что гидролизовать κ-казеин с отщеплением гликомакропептида могут многие протеолитические ферменты. Однако действие большинства известных протеолитических ферментов не ограничивается только отщеплением от казеиновой мицеллы гликомакропептида. Как правило, гидролиз казеинов идет более глубоко по многим пептидным связям, что, в конечном итоге, может привести к растворению образующихся гелей. Так, трипсин очень быстро образует гель, но так же быстро его разрушает за счет гидролиза пептидных связей в казеинах.

В технологии сыроделия пригодны только те ферменты, которые очень быстро гидролизуют пептидную связь между гидрофильным и гидрофобным участками κ-казеина. Обычно это связь, образованная фенилаланином (остаток 105) и метионином (остаток 106). Способность быстро гидролизовать связь Фен105–Мет106 в κ-Кн называют молокосвертывающей активностью, в отличие от способности гидролизовать другие связи в белках, получившей название протеолитической активности. Общая протеолитическая активность молокосвертывающих ферментов должна быть как можно более низкой по отношению к молокосвертывающей.

Оптимальным соотношением между молокосвертывающей и протеолитической активностью обладает фермент химозин, или реннин (табл. 3.1). Химозин гидролизует в κ-казеине связь Фен105-Мет106 в 200 раз быстрее, чем другие пептидные связи. Именно на этом свойстве и основано его предпочтительное применение в сыроделии. Химозин специфичен к связи Фен105-Мет106 только в составе казеина, не гидролизуя ее в ди-, три- и тетрапептидах. Для взаимодействия фермента и субстрата большое значение имеют и длина полипептидной цепи, и, что не менее важно, аминокислотное окружение связи Фен105-Мет106. Установлено, что протеолиз ускоряется при наличии серина в положении 104, одного из трех остатков гистидина в положениях 98, 100 или 102, лизина в положении 111 и (или) 112, пролина в положениях 99, 101, 109, 110.  В результате определенного аминокислотного окружения связь Фен105-Мет106 выступает из молекулы κ-казеина и легко входит в карман специфичности химозина.

Интересно отметить, что связь Фен105-Мет106 содержится в белках не всех видов молока. Так, κ-казеины женского молока и молока свиньи содержат в положении 106 изолейцин вместо метионина, тем не менее, эта пептидная связь, хотя и немного медленнее, гидролизуется химозином. Это еще раз подтверждает, что для проявления каталитической активности химозина важна не только сама связь Фен105-Мет106, а ее окружение, поэтому незначительные изменения структуры субстрата влияют на действие фермента.

В коммерческих препаратах, которые называются сычужными ферментами, кроме химозина содержатся другие протеолитические ферменты, главным образом, пепсины. Сырьем для получения препарата является четвертый отдел желудка (сычужка) молодых телят и ягнят. От одного теленка по сухой массе можно получить всего 25 г сырья, а от ягненка – 8 г. Составляющими компонентами сычужного препарата являются два фермента – химозин (реннин) и пепсин А, реже пепсин В (табл. 3.1).

В зависимости от содержания химозина различают два вида ферментных препаратов. Наиболее качественный, который предпочтителен в сыроделии, получают из сычужек телят и ягнят в возрасте от трех дней до четырех месяцев с обязательным условием, чтобы животные питались только молоком. Такой препарат содержит 56-92 % химозина, 9-45 % пепсина А и от 0,2 до 1,5% пепсина B.

Второй вид сычужного препарата получают из желудков более взрослых телят, часто с нарушением пищевого рациона. Он содержит 67,5-100 % пепсина А от 0 до 35,6 % химозина и от 0 до 2,9 % пепсина В. Этот препарат, хотя и приемлем в сыроделии, заметно уступает по качественным и функциональным характеристикам первому. Отношение молокосвертывающей активности к общей протеолитической у химозина равно 40:1, а у говяжьего пепсина 4:3. Неспецифический протеолиз (избыточный по отношению к химозину) после трех-часовой инкубации для свиного пепсина составил 0,275 мг, для говяжьего – 0,10 мг, для смеси химозина с говяжьим пепсином – 0,05 мг, что составляет 87,9; 30 и 12 % к протеолизу под действием химозина.

В связи с дефицитом сычужного фермента в сыроделии начали применять и другие препараты: пепсины жвачных и некоторых других животных, протеазы микробного происхождения (табл. 3.1).

Таблица 3.1. Номенклатура и источники молокосвертывающих ферментов

Тривиальное название
Название (МКФ)*
Другие названия
Источники
Пепсин
Пепсин А (3.4.23.1)
Пепсин II
Жвачные, цыплята, свиньи
Гастриксин
Пепсин С (3.4.23.3)
Пепсин I, парапепсин II, пепсин В
Жвачньые, свиньи
Химозин
Химозин (3.4.23.4)
Реннин
Жвачные
М. miehei
Протеиназа (ММР)
(3.4.23.6)
Реннилаза, ханилаза, фромаза, марзим
Mucor Miehei
М. pusillus
Протеиназа (МРР)
(3.4.23.6)
Емпораза
Mucor pusillus var. Lindt
Е. parasitica (ЕРР)
(3.4.23.6)
 
Endothia parasitica

* Международная классификация ферментов.

Образование сычужного геля представляет собой двухстадийный процесс. Первая стадия является ферментативной, вторая – формирование пространственной структуры сычужного геля, или сгустка.

Молокосвертывающие ферменты относятся к кислым протеазам (КФ 3.4.23), которые активны при рН ниже 5, в формировании каталитического центра у этих ферментов участвуют остатки дикарбоновых аминокислот аспарагиновой или глутаминовой. Например, каталитический центр пепсина содержит два фрагмента аспарагиновой кислоты, причем в активном ферменте одна группа аспарагиновой кислоты находится в протонированной форме, а другая в депротонированной, ионной.

Карбоксильная группа аспарагиновой кислоты каталитического центра фермента в депротонированной форме выступает в качестве нуклеофильного активатора воды. Протонированная карбоксилатная группа аспарагиновой кислоты каталитического центра за счет образования водородной связи с кислородом карбонильной группы пептидной связи работает как электрофильный активатор субстрата:
Протонированная карбоксилатная группа аспарагиновой кислоты каталитического центра
Реакция начинается с атаки нуклеофильноактивной воды электрофильно-активного атома углерода карбонильной группы субстрата с образованием новой связи, одновременно согласованно и синхронно разрывается пептидная связь, вследствие чего повышается основность фрагмента NH, и на него с образованием новой связи переходит водород карбоксилатной группы аспарагиновой кислоты каталитического центра, ионизируя эту группу:
повышается основность фрагмента NH
После завершения реакции, пептидная связь разрывается, а в активном центре пепсина снова один из фрагментов аспарагиновой кислоты находится в ионной форме, а другой – в нейтральной, и каталитический цикл может продолжаться:
3
Отщепление от мицеллы гликомакропептида сопровождается снижением ее заряда примерно в два раза, уменьшением радиуса примерно на 5 нм, объем гидратированной мицеллы снижается до 2/3 от ее величины для нативной мицеллы, количество связанной воды при рН 6,6 уменьшается почти в 1,5 раза. Частичная утрата стабилизирующих факторов приводит к снижению агрегативной устойчивости мицелл.

Если принять среднюю молекулярную массу мицеллы равной 8⋅108, содержание κ-казеина в мицелле 15 % и молекулярную массу κ-Кн 1,9⋅104, то на каждую мицеллу приходится примерно 5100 молекул κ-казеина. Для образования ассоциата из двух мицелл требуется осуществить гидролиз 10 тыс. связей Фен105-Мет106. При тех концентрациях химозина, который используется в технологии, на одну молекулу фермента приходится до 100 мицелл.

Вторая неферментативная стадия неизбежно запаздывает, поскольку требуется определенное время для изменения состояния поверхности мицеллы. Однако при некотором запаздывании процесс агрегации пара-κ-казеиновых мицелл протекает параллельно с ферментативной стадией.

Визуально образование сычужного геля становится заметным после протеолиза значительного количества κ-Кн (80-85 %). Сначала образуются линейные агрегаты белковых частиц. Эта стадия сопровождается повышением вязкости молока. На следующей стадии при продолжающемся гидролизе κ–казеина гидрофобность поверхности мицелл возрастает, линейные цепочки начинают соединяться так называемыми перекрестными связями, т.е. начинается формирование пространственной сетки. Состояние с минимальным количеством межмицеллярных связей, которых достаточно для образования пространственной структуры геля, называется гель-точкой. До гель-точки система сохраняет свойства золя, после – образуется гель. Время достижения гель-точки называется временем сычужного свертывания.

Степень сычужной коагуляции зависит от температуры и рН среды. Оптимальная температура для сычужного фермента 42,5 0С. Дальнейшее повышение температуры приводит к увеличению продолжительности свертывания вследствие взаимодействия с денатурированным β-лактоглобулином, вызывающим экранирование чувствительной к химозину пептидной связи. По этой же причине молоко, предназначенное для производства сыра, пастеризуют в щадящем режиме, с целью снижения степени денатурации сывороточных белков.

При температуре ниже 10 0С молоко практически не свертывается. При этом первая ферментативная стадия протекает, но вторая – агрегация дестабилизированных мицелл – не происходит, поскольку эффективность гидрофобных взаимодействий при понижении температуры резко снижается.

Температура сычужной коагуляции определяется с учетом не только оптимальной температуры активности фермента, но и обеспечения благоприятных условий для развития необходимой микрофлоры и получения определенных органолептических показателей продукта.

Ускоряет коагуляцию увеличение концентрации вносимого фермента, при этом соблюдается закономерность: произведение концентрации сычужного фермента и продолжительности образования сгустка является постоянной величиной. Обычно используют такие концентрации фермента, которые обеспечат сычужную коагуляцию молока при температуре 30-34 0С в течение 30 минут. На 100 кг молока вносят около 2,5 г сычужного фермента с активностью 1,0⋅105 ед. активности.

Как уже отмечалось ранее, молокосвертывающие ферменты относятся к кислым протеазам, и их активность является максимальной при значении рН, близком к 5,0. С точки зрения строения каталитического центра рН-оптимум позволяет поддерживать одну из двух карбоксилатных групп аспартата (или глутамата) в протонированной форме, а другую – в депротонированной. Снижение рН ниже значения рКа боковых фрагментов аспарагиновой или глутаминовой кислот приведет к изменению ионного состояния каталитического центра – все карбоксилатные группы будут протонированы, и активность фермента уменьшится. С другой стороны, при увеличении рН обе карбоксилатные группы каталитического центра депротонируются, активность фермента также падает. Тем не менее, сычужную коагуляцию проводят при значении рН, равном 6,5-6,7, которое не является оптимальным для ферментативной стадии. Необходимость поддержания достаточно высокого значения рН обусловлена недопустимостью изменения состава и структуры казеиновых мицелл, особенно в ферментативной стадии. При снижении рН до значения около 6,0 будет происходить деминерализация мицелл – коллоидный фосфат кальция частично перейдет в водорастворимую форму дигидроортофосфата кальция, вследствие чего структура мицелл нарушается.

В то же время при выработке сыра за счет протекающих биохимических процессов рН может незначительно снижаться. Однако некоторое незначительное снижение рН уже после гидролиза κ-казеина для качества сыра не является опасным.

В технологии сыра имеет значение, кроме первых двух стадий, третья фаза, которая определяется поведением фермента уже в сформировавшемся сгустке при созревании сыра. Химозин очень медленно гидролизует казеин, только слегка изменяя консистенцию сычужного геля, и накопление небелкового азота практически не наблюдается. Но, тем не менее, учитывая длительность созревания, сычужные ферменты способны участвовать в протеолизе других связей и способствовать формированию органолептических свойств сыров. Сгусток казеина, образовавшийся при действии других кислых протеиназ, при последующем выдерживании подвергается их интенсивному воздействию, при этом наблюдается накопление небелкового азота, сгусток постепенно размягчается и растворяется.

В формировании сычужного геля важную роль играют способы обработки молока, поступающего в технологический процесс производства сыра. Во-первых, влияют условия термической обработки, или пастеризации, которая в настоящее время является практически единственными промышленным способом уничтожения патогенных микроорганизмов в молоке перед его использованием. Отрицательный эффект высокотемпературной пастеризации молока проявляется в том, что основная часть β-лактоглобулина денатурирует. Денатурированные и скоагулированные в очень небольшие по размерам хлопьевидные частицы сывороточные белки осаждаются, в том числе и на поверхности казеиновых мицелл, при этом образуют за счет дисульфидных связей прочные комплексы с κ-казеином. В результате экранирования денатурированными сывороточными белками κ-казеинов понижается их способность к реакции с сычужным ферментом.

В целях предотвращения денатурации β-лактоглобулина молоко в производстве большинства сыров пастеризуют при температуре не выше 75 0С (обычно 72-74 0С) в течение 15-20 с. При таком режиме пастеризации денатурирует всего от 7,5 до 9,0 % сывороточных белков. В то же время, если повысить температуру пастеризации до 80 0С с 15-секундной выдержкой, то количество денатурированных белков увеличивается до 27,5 %, полная денатурация происходит при выдерживании молока при температуре 85 0С в течение 10-40 минут.

Повышение температуры пастеризации молока (с выдержкой 20 с) с 70 до 80 0С увеличивает время сычужной коагуляции примерно в 1,5 раза.

Другим отрицательным следствием тепловой обработки молока является образование менее плотных сычужных гелей, обладающих свойством плохо отделять сыворотку. Это опять-таки связано с включением в казеиновые сгустки денатурированных сывороточных белков, которые повышают водосвязующую способность и придают сгусткам определенную мягкость. Вместе с тем, можно отметить, что переход в сгусток сывороточных белков, повышает биологическую ценность готового продукта.

При тепловой обработке снижается концентрация ионов кальция, поскольку растворимые соли кальция, прежде всего Са(Н2РО4)2, переходят в нерастворимое состояние Са3(РО4)2.

Твердые частицы ортофосфата кальция способны осаждаться на поверхности казеиновых мицелл в составе молочного камня, вследствие чего экранируется гидролизуемая сычужным ферментом пептидная связь в κ-казеине. После тепловой обработки как вследствие ассоциации казеина с денатурированным β-лактоглобулином, так и отложения на поверхности мицелл ортофосфата кальция, наблюдается увеличение размера казеиновых мицелл.

Так, пастеризация молока при 72-80 0С вызывает увеличение казеиновых мицелл на 1-4 %, ультравысокотемпературная обработка – на 7-25 %, а стерилизация – в 2 и более раза.

В молоке, пастеризованном при 72 0С в течение 20 с, содержание ионов кальция снижается примерно на 15 % по сравнению с его содержанием в исходном молоке. В то же время коагуляция пара-κ-казеиновых мицелл может происходить только при определенной концентрации ионов кальция (не менее 8 мг/100 г). Оптимальной концентрацией ионизированной формы кальция в молоке считается 11 мг/100г. При ее снижении ниже 8 мг/100 г молоко становится сычужновялым, а при повышении до 16 мг/100 г и более снижается стабильность молока, в частности при нагревании.

Роль ионов кальция в образовании геля состоит в том, что при их участии через образование солевых мостиков осуществляются перекрестные взаимодействия между пара-κ-казеиновыми мицеллами. Ионы кальция нейтрализуют также отрицательный поверхностный заряд мицеллы, повышая гидрофобность и склонность к агрегатированию.

Для восстановления сычужной свертываемости пастеризованного молока в него обязательно вносят хлористый кальций, обычно в количестве от 10 до 30 г на 100 кг молока. Вместе с тем, при внесении в молоко более 50 мМ хлорида кальция, поверхностный заряд мицелл изменяется на положительный, и между мицеллами усиливается электростатическое отталкивание, вязкость снижается, тиксотропность повышается, а сгусток становится непригодным для сыроделия.

Поскольку при пастеризации осаждается и часть ортофосфата кальция, то для восстановления сычужной свертываемости пастеризованного молока целесообразно добавлять хлорид кальция в сочетании с фосфатами кальция, даже возможна его полная замена на фосфаты. Следует отметить, что для сыроделия важным является соотношение Са/Р, которое должно быть больше единицы, в противном случае увеличивается продолжительность сычужной коагуляции.

Высокотемпературная обработка молока повышает бактериальное качество сыра, в частности, при обработке молока при температурах выше 100 0С можно предотвратить порчу сыров под действием маслянокислых бактерий, споры которых не уничтожаются при обычной пастеризации. Однако высокотемпературную обработку можно применять только в сочетании со специальными технологическими приемами, позволяющими восстановить сычужную свертываемость молока.

На сычужную коагуляцию оказывают влияние и условия хранения молока. При хранении молока в течение нескольких дней при 3-4 0С ослабляются гидрофобные взаимодействия между неполярными фрагмента казеиновых молекул, вследствие чего повышается растворимость β-казеина, который переходит из мицеллы в молочную сыворотку, вследствие чего уменьшаются размеры казеиновых мицелл, с одной стороны; с другой – β-казеин в молекулярной форме становится более доступным для гидролиза ферментом плазмином, который приводит к увеличению количества γ-казеинов. Эти изменения ухудшают сычужную свертываемость молока. В то же время эти изменения носят обратимый характер. При повышении температуры до 20 0С для частичного восстановления сычужной свертываемости требуется 18-20 ч, при 60 0С – 35 мин, при пастеризации – 15-20 с. Однако доля восстановления у различных партий молока не одинакова. В табл. 3.2 приведено влияние некоторых факторов на восстановление технологических свойств молока, длительно хранившегося при низких положительных температурах.

Таблица 3.2. Оценка факторов, влияющих на восстановление свойств охлажденного молока*

Показатели
Молоко после 48 ч хранения при 3 0С
Добавление CаCl2
Выдержка
2ч при 30 0С
Подкисление до рН 6,5
Созревание
25 ч при 10 0С с 0,1% закваски
Время
свертывания
111 (4)
64 (2)
103 (1)
74 (16)
91 (4)
Прочность на
разрыв
72 (5)
200 (63)
94 (33)
164 (65)
100 (31)
Сопротивление деформации
90 (6)
124 (15)
108 (9)
111 (11)
101 (5)
Влажность сгустка
102 (5)
104 (7)
103 (1)
103 (6)
101 (7)

* Средние значения пяти опытов (стандартные отклонения) указаны в % к молоку, не подвергшемуся хранению при низкой температуре.

Гомогенизация молока может повлиять на ферментативную стадию сычужной коагуляции. Дело в том, что во время гомогенизации повышается дисперсность жировой фазы молока вследствие увеличения поверхности жировой фазы. Белков оболочек жировых шариков становится недостаточно для стабилизации молочной эмульсии. В результате в стабилизирующие белковые оболочки новых жировых шариков включаются белки казеиновых мицелл, что приводит к меньшей доступности для фермента гидролизуемой связи в κ-казеине, время сычужного свертывания увеличивается.

К разделу: Сычужный фермент и механизм свертывания молока

Этот сайт использует файлы cookie и метаданные. Продолжая просматривать его, вы соглашаетесь на использование нами файлов cookie и метаданных в соответствии с Политикой конфиденциальности.
Продолжить