Пробиотическая смесь устраняет вредные последствия у детей, получавших антибиотики или рожденных путем кесарева сечения

Смесь бифидо-, лакто- и пропионовокислых бактерий устраняет вредные последствия у детей, рожденных путем кесарева сечения или получавших антибиотики 

Добавки с пробиотиками восстанавливают нормальный состав и функции микробиоты у детей, получавших антибиотики, и у детей, родившихся путем кесарева сечения

Фон

Младенцы, рожденные путем кесарева сечения или получающие антибиотики, подвергаются повышенному риску развития метаболических, воспалительных и иммунологических заболеваний, возможно, из-за нарушения нормальной микробиоты кишечника в критическое временное окно развития. В двойном слепом плацебо-контролируемом рандомизированном клиническом исследовании мы исследовали, могут ли добавки с пробиотиками улучшить влияние использования антибиотиков или кесарева сечения на микробиоту младенцев. Матери получали многовидовой пробиотик, состоящий из Bifidobacterium breve Bb99 (Bp99 2×10⁸ КОЕ), Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii JS (2×10⁹ КОЕ), Lactobacillus rhamnosus Lc705 (5×10⁹ КОЕ) и Lactobacillus rhamnosus GG (5×10⁹ КОЕ) (N = 168 на грудном вскармливании и 31 на искусственном вскармливании) или добавку плацебо (N = 201 на грудном вскармливании и 22 на искусственном вскармливании) во время беременности, и младенцам давали ту же добавку.  Образцы фекалий младенцев были собраны через 3 месяца и проанализированы с использованием таксономического, метагеномного и метапротеомного подходов.

Полученные результаты

Добавка с пробиотиками оказывала сильное общее влияние на состав микробиоты, но эффект зависел от диеты младенца. Только младенцы, находящиеся на грудном вскармливании, показали ожидаемое увеличение бифидобактерий и снижение протеобактерий и клостридий. В группе плацебо, как способ рождения, так и использование антибиотиков были в значительной степени связаны с изменением состава и функции микробиоты, особенно с уменьшением численности Bifidobacterium. В группе пробиотиков неблагоприятные эффекты антибиотиков и режима родов были либо полностью устранены, либо уменьшены.

Выводы

Результаты показывают, что можно исправить нежелательные изменения в составе и функции микробиоты, вызванные лечением антибиотиками или кесаревым сечением, добавляя младенцам смесь пробиотиков вместе, или по крайней мере, с частичным грудным вскармливанием.

Вступление

Массивная микробная колонизация кишечника человека начинается с рождения и начинает пониматься как тонко отлаженный процесс [1, 2]. Вероятно, что младенцы адаптированы к получению определенных микробных сигналов в критические временные окна на раннем этапе своего развития. Микробиота кишечника становится регулятором эпигенетического программирования [3] и критически влияет на развитие иммунной системы, оказывая потенциально необратимые эффекты на восприимчивость к болезням [4, 5]. Кроме того, микробиота кишечника играет центральную роль в питании детей грудного возраста, влияя на рост и энергетический обмен [6]. В целом развитие кишечной микробиоты в раннем возрасте, вероятно, в значительной степени способствует долгосрочному здоровью хозяина.

Естественный процесс колонизации и развития бактерий нарушается, когда ребенок рождается путем кесарева сечения [7–9] или получает антибиотики [10, 11]. Было обнаружено, что факторы, нарушающие микробиоту в раннем возрасте, связаны с более поздними метаболическими и иммунологическими заболеваниями, такими как избыточный вес [11–13], аллергические заболевания [14, 15], диабет 1 типа [16] и воспалительные заболевания кишечника [17, 18]. Исследования на мышах показывают, что нарушение микробиоты в раннем возрасте играет причинную роль в развитии фенотипа хозяина [19, 20]. Раннее воздействие антибиотиков и роды посредством кесарева сечения - очень распространенная практика, затрагивающая более 50% младенцев в некоторых группах населения [21, 22], что делает проблему нарушения микробиоты в раннем возрасте серьезной проблемой для общественного здравоохранения.

Хотя кесарево сечение и лечение антибиотиками являются медицинскими необходимостями, становится все более очевидным, что предотвращение или уменьшение разрушительного воздействия на микробиоту важно для здорового развития ребенка. Однако до сих пор существует очень мало доказательств в поддержку конкретных методов лечения. Лактобациллы и бифидобактерии открывают большие перспективы, так как эти бактерии, естественно, являются важным компонентом детской микробиоты и, как было обнаружено, снижают риск диареи, связанной с антибиотиками [1, 23]. Двойное слепое плацебо-контролируемое исследование в когорте из более чем 1000 детей с повышенным риском аллергии показало, что риск аллергических заболеваний среди младенцев, рожденных после кесарева сечения, можно снизить за счет дородового и послеродового приема мультивидовых пробиотиков, включая Bifidobacterium breve Bb99 (Bp99). 2 × 10⁸ КОЕ) Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii JS (2 × 10⁹ КОЕ), Lactobacillus rhamnosus Lc705 (5 × 10⁹ КОЕ) и Lactobacillus rhamnosus GG (5 × 10⁹ КОЕ) [24]. Здесь мы сообщаем о мультиомном анализе кишечной микробиоты у этих младенцев и обнаруживаем, что добавка эффективно уменьшила большинство последствий кесарева сечения и использования антибиотиков для микробиоты младенцев.

Полученные результаты

Изменения микробиоты, вызванные добавками

Сначала мы исследовали влияние вмешательства на микробиоту кишечника новорожденных, рожденных естественным путем, без лечения антибиотиками. Количество обитающих в кишечнике видов, присутствующих в добавке, Bifidobacterium breve и Lactobacillus rhamnosus, было значительно увеличено в группе, получавшей добавку, более чем в десять раз у детей, находящихся на грудном вскармливании, но меньше у детей, вскармливаемых смесью (рис. 1 a-b). Доминирующим видом был B. breve у 84% младенцев на грудном вскармливании и у 35% младенцев на искусственном вскармливании в группе с добавками. В контрольной группе ни один из детей, вскармливаемых смесью, но 12% младенцев, вскармливаемых грудью, не имел B. breve в качестве доминирующего вида, что позволяет предположить, что B. breve является естественным колонизатором младенцев на грудном вскармливании. Чтобы подтвердить эти результаты с помощью независимого от ПЦР подхода, мы также секвенировали весь метагеном подмножества образцов фекалий грудных детей. Этот метагеномный анализ подтвердил филогенетический подход, и данные захватили также вид Propionibacterium freundenreichii, присутствующий в добавке (рис. 1c – e), который не был идентифицирован в данных гена 16S рРНК.

Рисунок 1. Влияние дополнительного лечения и режима кормления на состав микробиоты у новорожденных, рожденных естественным путем, без лечения антибиотиками. a – b Относительное содержание видов в пробиотической смеси в последовательностях ампликонов гена 16S рРНК, полученных из образцов фекалий; c – e Относительное содержание пробиотических видов в полных последовательностях метагенома младенцев, вскармливаемых грудью. Количество младенцев в группе указано внизу каждой панели (a – e); f Анализ основных координат (несходство Брея-Кертиса) на данных гена 16S рРНК на уровне вида; g Состав популяции Bifidobacterium по группам обработки и типу кормления.

Добавка повлияла на общий состав микробиоты (рис. 1f). Среди новорожденных, рожденных естественным путем, без лечения антибиотиками, основным фактором межиндивидуальных различий в составе кишечной микробиоты на уровне видов была группа лечения, объясняющая 19% вариации (p = 0,001 в пермутационном многомерном дисперсионном анализе ANOVA, рис. 1f). Этот результат следует интерпретировать с осторожностью из-за композиционного характера данных (с суммированием относительной численности до 1). При изучении сообщества бифидобактерий мы наблюдали более слабую реакцию на добавку у детей, находящихся на искусственном вскармливании, по сравнению с младенцами, находящимися на грудном вскармливании (рис. 1g).

Дополнительные доказательства опосредующего эффекта типа кормления получены из анализа специфических бактериальных таксонов (рис. 2): большинство изменений, вызванных добавками, наблюдаемых у младенцев, находящихся на грудном вскармливании, отсутствовали у младенцев, находящихся на искусственном вскармливании. В группе, получавшей грудное вскармливание, количество лактобактерий увеличилось на 100% (в два раза), а количество бифидобактерий увеличилось на 29% в ответ на добавку (р < 0,0001, обобщенная модель наименьших квадратов, GLS, Дополнительный файл 1: Таблица S1). Большинство других таксонов были сокращены в изобилии (рис. 2a, Дополнительный файл 1: Таблица S1): Клостридии (Clostridia) на 66% (р < 0,0001, GLS) и гаммапротеобактерии (Gammaproteobacteria) на 58% (р < 0,0001, обобщенная линейная модель, GLM, с отрицательным биномиальным распределением). Напротив, у младенцев на искусственном вскармливании общее количество бифидобактерий было незначительно, но значительно снижено в группе, получавшей добавку (на 7%, р < 0,0001, GLM, Дополнительный файл 1: Таблица S2), несмотря на специфическое увеличение B. breve. Кроме того, в группе с добавлением смеси было увеличено количество таксонов фирмикутов (Firmicutes) и протеобактерий (Proteobacteria) по сравнению с контрольной группой, получавшей смесь (рис. 2): анаэростипес (Anaerostipes) в четыре раза (р = 0,05, GLM), вейлонелла (Veillonella) в семь раз (р < 0,0001, GLM) и клебсиелла (Klebsiella) в шесть раз (р = 0,05, GLM).

Рисунок 2. Эффект дополнительного лечения у новорожденных, рожденных естественным путем, младенцев, находящихся на грудном вскармливании, не получавших антибиотики, и младенцев, вскармливаемых смесями. Кратные изменения представляют собой разницу в относительной численности таксона между группой, получавшей добавку, и контрольной группой. Звездочки указывают на значимость разницы (на основе GLM или GLS, см. Дополнительный файл 1: Таблицы S1 и S2): * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001

Добавка предотвратила потерю бифидобактерий, связанную с кесаревым сечением, и нормализовала функции микробиоты

После установления сильного общего эффекта лечения мы проверили, улучшила ли добавка некоторые изменения в составе микробиоты, вызванные кесаревым сечением. В контрольной группе микробиота новорожденных, родившихся после кесарева сечения, явно отличалась от младенцев, рожденных естественным путем (рис. 3а), в первую очередь из-за более низкой численности наиболее распространенных родов, Bifidobacterium (снижение на 75%, p = 0,01, GLS, дополнительный файл 1: таблица S3) и Bacteroides (снижение 96%, p <0,0001, GLM). В целом, 6% (p = 0,001) межличностных вариаций в составе микробиоты было статистически отнесено к способу рождения в контрольной группе в соответствии с пермутационным многофакторным дисперсионным анализом ANOVA. Примечательно, что в группе, получавшей добавку, режим рождения не оказал значительного влияния на состав микробиоты (1% p = 0,08). Относительное увеличение Enterococcaceae, Clostridiaceae и Veillonellaceae, которое наблюдалось у новорожденных из контрольной группы, рожденных кесаревым сечением, не наблюдалось в группе, получавшей добавку (рис. 3b, дополнительный файл 1: таблица S3). Кроме того, благодаря добавке было предотвращено снижение количества Bifidobacteriaceae, а уменьшение количества Coriobacteriaceae, Porphyromonadaceae и Bacteroidaceae было уменьшено по величине (рис. 3b, дополнительный файл 1: таблица S3).

Рисунок 3. Влияние добавок и режима родов на микробиоту. Общий средний состав микробиоты на уровне класса в различных группах, основанный на данных ампликона 16S рРНК (а). Значительные групповые различия на уровне семьи по сравнению с контрольной группой, рожденной естественным путем (b). Влияние дополнительного лечения и способа родов на метапротеом (c) и метагеном (d) в анализе основных координат (различия Брея-Кертиса)

Связанное с кесаревым сечением сокращение Bifidobacterium и Bacteroides spp., двух наиболее важных групп бактерий с точки зрения деградации углеводов у младенцев, было отражено в прогнозируемом потенциале деградации углеводов микробиоты. Основываясь на таксономическом составе (количество таксонов в образцах) и базе данных CAZy [25] (углеводно-активные ферменты, присутствующие в таксонах), был предсказан потенциал деградации углеводов в образцах. Прогнозируемое суммарное содержание углеводно-активных ферментов (CAZymes), участвующих в деградации различных типов углеводов, включая олигосахариды грудного молока, было значительно снижено среди младенцев, рожденных после кесарева сечения (дополнительный файл 2: Рисунок S1). Прогнозируемые количества этих групп ферментов были увеличены у младенцев, получавших добавки, независимо от способа рождения.

Мы провели анализ метапротеома в подгруппе когорты, включающей 11 контрольных младенцев, рожденных вагинально, 12 контрольных младенцев, рожденных кесаревым сечением, 13 дополненных младенцев, рожденных вагинально, и 12 дополненных младенцев, рожденных кесаревым сечением. Все они находились на полном грудном вскармливании и не получали лечения антибиотиками. Бактериальные метапротеомы различались между режимами рождения в контрольной группе, но были схожи между режимами рождения в дополненной группе (рис. 3c). Таким образом, лечение добавкой, по-видимому, устраняло влияние режима родов на функции, производные от метапротеома (дополнительный файл 1: таблица S4). Это подтверждается выводом о том, что группы, получавшие добавку (младенцы, рожденные кесаревым сечением и родившиеся через естественные родовые пути) по сравнению с контрольной группой, рожденной естественным путем, показали высокий уровень индукции (до 50 раз; дополнительный файл 1: таблица S4) бета-галактозидазы и бета-галактозил N-ацетилгексозаминфосфорилазы (синоним: LNBP - lacto-N-biose phosphorylase), обычные бифидобактериальные ферменты, участвующие в деградации лактозы и олигосахаридов грудного молока (HMOs), соответственно [26]. Напротив, бактерии у младенцев, рожденных после кесарева сечения, экспрессировали сравнительно более высокие уровни аспартатаминотрансферазы и аспартатаммиаклиазы, ферментов, участвующих в потенциально нежелательной деградации белка. Данные метапротеома также использовались для прогнозирования таксономического происхождения белков, и полученные результаты оказались аналогичными результатам, полученным при исследовании гена 16S рРНК (дополнительный файл 2: рисунок S2).

Хотя размер выборки в нашем метагеномном анализе был небольшим, основываясь на визуальном осмотре участка PCoA, геномное содержание микробиоты, по-видимому, группировалось по способу рождения и лечению: метагеномы разделялись в соответствии с режимами рождения в контрольной группе, но группировались вместе в дополненной группе (рис. 3d). Поскольку способы рождения четко не различались в дополненной группе, мы сгруппировали фекальные метагеномы дополненных младенцев для статистического анализа. По сравнению с метагеномами в контрольной группе, рожденной вагинально, наблюдалось сильное увеличение генов деградации лактозы/галактозы и рамнозы (примерно в 20 и 4 раза соответственно), в то время как несколько путей синтеза аминокислот и витамина В (особенно фолиевой кислоты) были значительно снижены (почти в 30 раз) в контрольной группе, рожденной кесаревым сечением (дополнительный файл 1: таблица S5). Эти пути были увеличены или не изменились в дополненной группе (дополнительный файл 1: Таблица S5).

Добавка предотвращает искажение микробиоты, связанное с антибиотиками

Затем мы оценили влияние антибиотиков на микробиоту и предотвратила ли пробиотическая добавка эти эффекты. В контрольной группе младенцы, которых лечили одним или несколькими курсами антибиотиков, демонстрировали явно другой состав микробиоты по сравнению с детьми, не получавшими антибиотики (рис. 4a, дополнительный файл 1: таблица S6). В контрольной группе использование антибиотиков объясняло 4% (p = 0,001) состава микробиоты, в то время как в группе лечения пробиотиком использование антибиотиков не имело значительного общего воздействия (<1%, p = 0,56). В контрольной группе использование антибиотиков было связано с уменьшением количества бифидобактерий на 17% (p = 0,015) и увеличением Enterococcus и грамотрицательных классов Gammaproteobacteria и Bacteroidia в два, два и шесть раз (p = 0,017, p = 0,04 и p <0,0001) соответственно. Добавка предотвратила или скорректировала связанное с антибиотиками увеличение Bacteroidaceae, Enterococcaceae и Enterobacteriaceae и снижение Bifidobacteriaceae (рис. 4b).

Рисунок 4. Влияние дополнительного лечения и использования антибиотиков на состав микробиоты в данных ампликона 16S рРНК. (а) Общий средний состав микробиоты на уровне класса в различных группах; (b) Значительные различия в группах на уровне семьи по сравнению с контрольной группой, не получавшей антибиотики.

Обсуждение

Используя комбинацию таксономического, метагеномного и метапротеомного подходов, мы показали, что большинство изменений фекальной микробиоты младенцев, связанных с антибиотиками и кесаревым сечением, можно скорректировать или уменьшить путем добавления пробиотиков матери и младенцу. Результаты показывают, что грудное вскармливание вместе с добавкой пробиотиков дает оптимальные результаты с точки зрения поддержки развития микробиоты у этих младенцев. И мать, и младенец получали одни и те же пробиотические добавки. Основываясь на результатах, мы не можем сделать вывод о том, какую роль (если вообще) имел пробиотик, принимаемый матерью, на микробиоту младенца.

Хотя добавка содержала олигосахариды, влияние добавки на состав микробиоты зависело от грудного вскармливания, что позволяет предположить, что количество олигосахаридов в добавке было недостаточным для продвижения пробиотических штаммов. Фактически, относительное количество бифидобактерий снизилось в группе, получавшей питательные смеси, что указывает на недостаточную доступность субстрата для поддержки сообщества бифидобактерий. Грудное молоко содержит разнообразную смесь олигосахаридов грудного молока (HMOs), общее количество которых составляет примерно 1 г / дл [27, 28], что соответствует общему потреблению 5–13 г в день у младенца, потребляющего от 5 до 13 дл грудного молока [29]. Это значительно больше, чем количество галактоолигосахаридов (0,8 г / день) в нашей исследуемой добавке. Дозозависимый бифидогенный эффект добавок олигосахаридов в диапазоне 0,4–0,8 г / дл ранее был показан у детей, вскармливаемых смесями [30], и было показано, что добавление пребиотиков в дозе 0,8 г/дл приводит к таким же уровням бифидобактерий, как и при полном грудном вскармливании [31]. Вероятно, для достижения полного бифидогенного эффекта требуется количество олигосахаридов, близкое к количеству олигосахаридов, которое наблюдается в грудном молоке. В дополнение к количеству олигосахаридов, их состав может играть определенную роль. В этом отношении HMOs предлагают более разнообразную смесь субстратов, чем галактоолигосахариды, и несколько штаммов B. breve способны использовать HMOs [32]. Результаты показывают, что младенцам, находящимся на искусственном вскармливании, может потребоваться дополнительная добавка пребиотиков, имитирующих естественное изобилие HMOs в грудном молоке, для достижения преимуществ пробиотиков.

Примечательно, что L. rhamnosus, по-видимому, извлекает пользу из грудного вскармливания, даже несмотря на то, что он не может использовать HMOs. Наблюдаемое преимущество грудного вскармливания, вероятно, отражает вторичный эффект увеличения обилия бифидобактерий, что делает условия в кишечнике более благоприятными для L. rhamnosus. Бифидобактерии могли генерировать соединения из HMOs, которые поддерживают рост L. rhamnosus, такие как фукоза [33]. Это говорит о том, что пробиотические продукты, содержащие синергетическую смесь бактерий, могут быть более полезными, чем продукты с одним штаммом.

Наиболее очевидным эффектом кесарева сечения и применения антибиотиков было относительное снижение количества бифидобактерий, которое было исправлено добавлением пробиотиков. Поскольку бифидобактерии, как правило, являются наиболее распространенной группой бактерий в этом возрасте, они вносят значительный вклад в общую метаболическую способность микроорганизмов. Таким образом, добавка исправила или уменьшила большинство связанных с кесаревым сечением изменений в функции микробиоты. У младенцев, рожденных кесаревым сечением, в контрольной группе была микробиота с пониженной способностью к деградации углеводов, что важно, включая деградацию НМОs. Вместо того, чтобы деградировать сложные НМОs, микробиота, связанная с кесаревым сечением, по-видимому, была сосредоточена на утилизации лактозы. Большое количество неперевариваемых олигосахаридов в грудном молоке способствует ферментации у младенца и, следовательно, производству питательных веществ для бактерий. Поскольку способ рождения влияет на состав кишечных микробов и их функциональную способность, вполне вероятно, что типы и количество продуктов бактериальной ферментации различаются у младенцев, рожденных естественным путем, и младенцев, родившихся после кесарева сечения. Таким образом, результаты показывают, что кесарево сечение может влиять на состав питательных веществ, которые младенец получает с грудным молоком, возможно, уменьшая количество и изменяя состав SCFAs, доступных для хозяина. Кроме того, несколько путей синтеза витаминов были снижены у младенцев, родившихся после кесарева сечения, и скорректированы добавкой. Фолат, в частности, важен для здорового развития плода и младенца [34] и вырабатывается некоторыми штаммами бифидобактерий, в том числе штаммами B. breve [35]. Было показано, что добавление штаммов бифидобактерий, продуцирующих фолат, и галактоолигосахаридов, или грудного молока, которое увеличивает количество бифидобактерий, увеличивает уровень фолиевой кислоты в сыворотке крови у крыс [36, 37]. Таким образом, бифидобактерии могут вносить значительное количество фолиевой кислоты, доступной младенцу, находящемуся на грудном вскармливании.

Низкое содержание Bacteroides, которое повсеместно встречается у младенцев, рожденных после кесарева сечения [7, 9, 38–43], не было полностью исправлено лечением пробиотиками. В настоящее время нет известного метода восстановления популяции Bacteroides у младенцев, рожденных после кесарева сечения. Было показано, что взятие мазка из влагалища матери не позволяет восстановить как Bacteroides, так и Bifidobacterium [40], поскольку эти таксоны обычно не встречаются во влагалище [44]. Кроме того, вагинальный мазок сопряжен со значительным риском для здоровья [45].

Несмотря на низкую численность Bacteroides spp. у младенцев, рожденных после кесарева сечения, лечение пробиотиками было успешным в снижении частоты аллергических заболеваний в этой группе [24], что позволяет предположить, что восстановление микробиоты, достигнутое с помощью добавки, было достаточным, чтобы вызвать пользу для здоровья. Это может быть связано с нормализацией баланса Clostridium-Bifidobacterium, поскольку высокая численность Clostridium spp. а низкая численность бифидобактерий в младенчестве связана с повышенным риском развития аллергических заболеваний [46, 47]. Кроме того, как B. breve Bb99, так и L. rhamnosus GG являются иммуномодулирующими бактериями с противовоспалительным действием [48, 49]. L. rhamnosus GG, как было показано, вызывает повышенную продукцию INF-γ у младенцев с аллергией на коровье молоко [50] и уменьшает симптомы атопического дерматита у IgE-сенсибилизированных младенцев [51]. Оба вида обладают способностью связываться со слизью кишечника [52]. Было показано, что бифидобактерии, выделенные из фекалий здоровых младенцев, в том числе B. breve, обладают большей способностью связывать слизь, чем бифидобактерии, выделенные от детей с аллергией, в основном B. adolescentis [52]. Адгезия к кишечной слизи делает более вероятным прямое взаимодействие с клетками-хозяевами и может быть важным фактором раннего образования иммунной системы, а также обеспечения устойчивости к колонизации и долговременной колонизации слизистой оболочки.

Ранее мы показали, что прием L. rhamnosus GG в течение 7 месяцев у детей дошкольного возраста предотвратил многие изменения микробиоты, связанные с пенициллином / амоксициллином, но не смог предотвратить связанную с макролидами потерю бифидобактерий [53]. Вместе с настоящими результатами это указывает на то, что оптимальная защита от разрушения микробиоты, связанного с антибиотиками, может быть достигнута с помощью смеси штаммов Bifidobacterium и Lactobacillus. Действительно, исследования на взрослых показали, что добавление Lactobacillus-Bifidobacterium во время и после эрадикационной терапии H. pylori (амоксициллин-кларитромицин-лансопрацол) и во время лечения амоксициллином помогло облегчить связанное с антибиотиками нарушение микробиоты [54-56] и уменьшить общее количество желудочно-кишечных симптомов [57]. Было показано, что смесь пребиотиков, содержащая 2,25 г фруктоолигосахаридов и инулина, увеличивает количество бифидобактерий и лактобактерий у детей 1-2 лет, получавших амоксициллин [58].

Оптимальная продолжительность приема пробиотиков для предотвращения нарушения микробиоты не установлена. Поскольку дисбаланс микробиоты у младенцев, рожденных после кесарева сечения, был восстановлен путем ежедневного приема пробиотиков к возрасту 3 месяцев, вполне возможно, что это достаточная продолжительность лечения. Предыдущие исследования с участием субъектов, получавших антибиотики, получали ежедневные добавки с пробиотиками / пребиотиками в течение 3 недель во время и после курса антибиотиков с хорошими результатами [54–58]. Однако может быть полезно постоянно давать младенцам смесь пробиотиков в критическое время созревания микробиоты и иммунной системы.

Выводы

Лечение антибиотиками в раннем возрасте и кесарево сечение влияют на значительную часть населения мира и связаны с глобальными эпидемическими проблемами здоровья, такими как избыточный вес у детей и иммунологические заболевания. Следовательно, лечение, позволяющее добиться даже скромных улучшений на уровне отдельных людей, может принести большую пользу для здоровья на уровне населения. Наши результаты показывают, что длительный ежедневный прием добавок B. Breve, L. Rhamnosus и P. freundenreichii subsp. shermanii в сочетании с грудным вскармливанием является безопасным и эффективным методом поддержания микробиоты у новорожденных, рожденных после кесарева сечения и леченных антибиотиками. Поскольку эти штаммы уже представлены на рынке, их использование можно легко внедрить в клиническую практику.

Методы

Дизайн исследования

Мы проанализировали состав кишечной микробиоты с использованием образцов фекалий и секвенирования ампликона гена 16S рРНК у 428 младенцев в возрасте 3 месяцев, включая все высококачественные фекальные образцы когорты. Подмножество образцов было дополнительно проанализировано на предмет полного метагенома и метапротеомного состава. Младенцы участвовали в испытании пробиотиков (идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT00298337), подробности которого были опубликованы ранее [24]. Беременных матерей, младенцы которых имели повышенный риск развития аллергии (по крайней мере, у одного из родителей было диагностировано аллергическое заболевание), набирали в женские консультации и через рекламу в районе Хельсинки в 1999–2000 годах. В общей сложности 1223 матери были рандомизированы в группы по шесть человек на 35 неделе беременности в контрольную группу, получавшую две ежедневные капсулы с микрокристаллической целлюлозой, и группу лечения, получавшую одни и те же капсулы, содержащие смесь клеток пробиотических бактерий (Bifidobacterium breve Bb99 (Bp99 2×10⁸ КОЕ), Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii JS (2×10⁹ КОЕ), Lactobacillus rhamnosus Lc705 (5×10⁹ КОЕ) и Lactobacillus rhamnosus GG (5×10⁹ КОЕ)) один раз в день, до рождения. В течение первых 6 месяцев после рождения младенцы получали те же капсулы, которые открывали и смешивали с сахарным сиропом, в который в экспериментальной группе дополнительно добавляли 0,8 г галактоолигосахаридов (GOS). Побочные эффекты не наблюдались ни в одной из групп. Рандомизация проводилась статистиком, и распределение было скрыто от участников исследования, лиц, обеспечивающих уход, всех врачей-исследователей и медсестер. Ослепление сохранялось до тех пор, пока не была проведена 5-летняя оценка. Образцы фекалий собирали у младенцев в возрасте 3 месяцев и хранили при -40 °C. Для настоящего исследования были получены образцы фекалий 428 младенцев (Таблица 1). Родители предоставили информацию о способе родов, продолжительности грудного вскармливания, использовании смеси для кормления и применении антибиотиков с помощью анкет.

Таблица 1. Характеристики когорты, за исключением шести младенцев с недостаточным количеством считываний секвенирования (<100 считываний)

Обработка образцов

ДНК экстрагировали из образцов фекалий с использованием протокола повторного взбивания шариков [59], а бактериальный состав анализировали с помощью Illumina MiSeq, секвенируя гипервариабельную область V3-V4 гена 16S рРНК. Подготовка библиотеки в основном выполнялась в соответствии с протоколом Illumina, за исключением того, что амплификацию гена 16S рРНК и штрих-кодирование выполняли в одной реакции. Реакция ПЦР включала 1 нг / мкл матрицы, 1X Phusion® Master Mix (ThermoFisher, каталожный номер: F-531 L), 0,25 мкМ локус-специфичных праймеров V3-V4 и 0,375 мкМ двухиндексных праймеров TruSeq. ПЦР проводилась при следующих настройках: 98 °C в течение 30 с, 27 циклов при 98 °C в течение 10 с, 62 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 15 с и, наконец, 10 мин при 72 °C, где после образцы хранили при 4 °C. ПЦР-очистку проводили с использованием гранул AMPure XP (Beckman Coulter, Копенгаген, Дания), а подтверждение правильного размера ампликона (примерно 640 пар оснований) выполняли на чипе Bioanalyzer DNA 1000 (Agilent Technology, Санта-Клара, США). Калифорния, США). Произвольно объединенные библиотеки секвенировали с помощью Illumina MiSeq или HiSeq 2500 в режиме Rapid Run.

Мы дополнительно проанализировали метагеномы небольшой подгруппы младенцев, в том числе шести контрольных младенцев, рожденных вагинально, двух контрольных младенцев, рожденных с помощью кесарева сечения, одного вагинально рожденного и трех младенцев, рожденных с помощью кесарева сечения, в группе лечения. Все они находились на полном грудном вскармливании и не получали лечения антибиотиками. Для метагеномного анализа выбранные образцы ДНК были очищены с помощью набора DNA Clean & Concentrator TM-5 (ZYMO Research, Онтарио, Канада) и элюированы в буфере с низким содержанием TE, после чего библиотеки были подготовлены с использованием набора ДНК Nextera и секвенированы в HiSeq Rapid SE200-run с использованием 50% проточной ячейки.

Отобранные образцы фекалий (n = 48) были подвергнуты метапротеомному анализу путем обработки аликвоты (125 мг) свежеоттаявших образцов фекалий и извлечения белков путем взбивания шариков, как описано ранее [60]. Анализ белка и последующая пептидная идентификация бактериальных белков были выполнены, как описано ранее [61]. Белки подвергали денатурирующему SDS-полиакриламидному гель-электрофорезу для удаления примесей, и белки с ожидаемым размером субъединицы 5-500 кД извлекали из геля, алкилировали и переваривали трипсином, как описано ранее. Наконец, переваривание белка было проанализировано методом LC-MS/MS на системе ВЭЖХ с нанопотоком (Easy-NLCII, Thermo Fisher Scientific), подключенной к масс-спектрометру LTQ Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия), оснащенному источником ионизации наноэлектроспрея. Эта и последующая пептидная идентификация бактерий были выполнены по существу так, как описано ранее [61].

Статистический анализ

Считывания ампликона 16S рРНК были проанализированы с помощью R-пакета mare [62]. Среднее число считываний, полученных на выборку, составило 46 934 и варьировалось от 105 до 151 840. Образцы с < 100 считываниями (N = 6) были исключены из анализа, поскольку они, по-видимому, имели недостаточный охват, основанный на предполагаемом богатстве. Хотя было проведено парное секвенирование, мы использовали только прямые чтения, усеченные до 150 оснований, как мы наблюдали, используя искусственные сообщества известного состава, которые при более длительном чтении дают ненадежные результаты [62]. Потенциальные ошибки последовательности были устранены путем отбрасывания уникальных считываний, которые происходили < 100 раз в общем наборе данных. Таксономическая аннотация была выполнена с использованием USEARCH [63] путем сопоставления считываний с справочной базой данных рРНК SILVA 16S версии 115 [64], ограниченной таксонами, связанными с кишечником. Метагеномные последовательности были качественно отфильтрованы с помощью USEARCH, а затем проанализированы с использованием HUMAnN2 и Metaphlan2 [65].

Статистический анализ проводился на языке R с помощью пакета mare [62], инструментов из пакетов vegan [66], MASS [67] и nlme [68]. Основываясь на таксономических данных, мы спрогнозировали способность микробиоты к углеводному обмену, используя базу данных CAZy [25]. Связь между общим составом микробиоты и фоновыми переменными оценивалась с использованием анализа основных координат и многомерного пермутационного дисперсионного анализа. Для оценки влияния способа родов младенцы были разделены на четыре группы в зависимости от режима лечения и способа родов, используя контрольную группу, рожденную естественным путем, в качестве контрольной группы, и модели были скорректированы с учетом использования антибиотиков и типа кормления. При оценке эффекта от использования антибиотиков младенцы были разделены на четыре группы в зависимости от лечения и использования антибиотиков, используя контрольную группу, не получавшую антибиотики, в качестве контрольной группы, и модели были скорректированы для режима рождения и типа кормления. Влияние лечения, воздействия антибиотиков, кесарева сечения и типа вскармливания (полное или частичное грудное вскармливание или вскармливание исключительно смесью) на численность бактериальных таксонов анализировалось с использованием отрицательных биномиальных моделей с количеством считываний на образец в качестве компенсации. Если подобранная модель не соответствовала допущениям модели (в первую очередь гетероскедастичности остатков), наблюдаемые проблемы исправлялись с использованием обобщенных моделей наименьших квадратов. По этой причине статистический тест не является одинаковым для всех таксонов, поскольку распределение данных варьируется между таксонами. Только роды, наблюдаемые в> 10% образцов, анализировались индивидуально.

Мы включили набор отрицательных контрольных образцов, состоящих только из реагентов для ПЦР, и секвенировали их вместе с реальными образцами. В целом, количество считываний для отрицательных контролей было очень небольшим (медиана 260 считываний) по сравнению с реальными образцами (медиана 46 674 считывания). Это указывает на то, что загрязняющие вещества, вероятно, внесли всего несколько сотен считываний на образец, что не сильно повлияет на общий наблюдаемый состав. Самыми многочисленными таксонами в отрицательном контроле были Pseudomonas и Rhodococcus, которые составляли очень небольшую численность в реальных образцах, составляя соответственно 0,2% и 1,2% от общего числа считываний в среднем. Кроме того, мы ранее публиковали данные по образцам положительного контроля (фиктивные сообщества), подтверждающие методы секвенирования и биоинформатики [69]. 

Дополнительные файлы

Дополнительный файл 1: ^{(154K, xlsx)}

Результаты моделирования. (XLSX 153 кб)

Дополнительный файл 2: ^{(2.3M, docx)}

Рисунок S1. Значительные различия между группами, определяемыми способом рождения и дополнительным лечением, по прогнозируемому содержанию углеводно-активных ферментов. Контрольная группа, рожденная естественным путем, представляет собой контрольную группу, с которой сравниваются другие группы (красный = контрольная группа, рожденная кесаревым сечением, темно-синий = группа, рожденая кесаревым сечением + добавка, голубой = группа, рожденная естественным путем + добавка). Незначимые (p> 0,05) различия установлены на 0.

Рисунок S2. Сравнение наблюдаемых различий в относительном обилии родов бактерий в контрольной группе с кесаревым сечением, пробиотической группе с кесаревым сечением и пробиотической группе с естественными родами с контрольной группой с естественными родами. Столбики (сплошные = данные 16S рРНК; пунктирные = данные метапротеома) указывают величину разницы (изменение в логарифмическом порядке), а звездочки указывают уровень значимости: ***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05).

Дополнительная информация:

• Добавление смеси бифидобактерий ускоряет созревание микробиома и уменьшает воспаление кишечника у крайне недоношенных детей
• Перинатальное пробиотическое вмешательство предотвратило аллергические заболевания в подгруппе родоразрешенных кесаревым сечением при 13‐летнем наблюдении (про смесь бифидо-, лакто- и пропионовокислых бактерий)
• Индийский эксперимент с P. freudenreichii
• Пробиотики спасают жизни недоношенных детей (бифидобактерии)
• Пробиотики защищают недоношенных детей от НЭК и сепсиса (бифидобактерии)
• НЭК и сепсис у недоношенных новорожденных и кишечный микробиом
• Кишечный дисбиоз у детей в ОРИТ способствует задержке роста
• Дисбактериоз, недоношенность ребенка и пробиотики
• Задержка роста детей и кишечный микробиом
• Пребывание в реанимации приводит к потере полезной микрофлоры
• Пробиотики эффективны в лечении ротавирусной диареи у детей
• Снижение риска гепатокарциномы с помощью лакто- и пропионовокислых бактерий
• Молочные пропионовокислые бактерии предотвращают остеопороз
• Пропионовокислые бактерии защищают от микотоксинов
• Молочные пропионовокислые бактерии в профилактике и терапии рака
• Бифидобактерии могут быть эффективными в предотвращении колоректального рака
• Применение пропионовокислых бактерий в косметологии и эстетической медицине
• Эффективность пропионовокислых бактерий в лечении колита
• Пропионибактерии в лечении (смягчении) мукозита
• Пропионибактерии P. freudenreichii как косметическое средство против жирной кожи

Литература

Будьте здоровы!