Микроэкологические исследования человека по методу газовой хроматографии масс-спектрометрии микробных маркеров

Метод масс-спектрометрии микробных маркеров в клинической практике

Микроэкологические исследования человека по методу хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров

Далее по тексту: ХМС, ГХ-МС, МСММ - обозначение одного метода масс-спектрометрии микробных маркеров

1. Общая информация о методе МСММ
2. Преимущества метода МСММ
3. Характеристика микробиологического анализа
4. О методе исследования микрофлоры по Осипову Г.А.
5. Перспективность газовой хроматографии масс-спектрометрии
6. Масс-спектрометрия микробных маркеров в клинической практике
7. Введение
8. Материал и методы исследования
9. Результаты и их анализ
10. Микробная этиология заболеваний кожи
11. Синдром раздраженного кишечника
12. Инфекции урогенитального тракта
13. Инфекционный простатит
14. Заключение
15. Информация о практике проведения МСММ
16. Литература

См. дополнительно:

Идентификация микроорганизмов с применением газовой хромато-масс-спектрометрии

Общая информация о методе

Применение газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ХМС) используется для определения в биологических пробах человека компонентов клеточных стенок микроорганизмов, так называемых микробных маркеров из числа высших жирных кислот. У каждого микроорганизма есть "свои", т.е. характерные только ему маркеры, при обнаружении которых делаются заключения о присутствии тех, или иных микробов с их количественной оценкой. Это используется для определения инфекционных агентов воспалений и оценки дисбиозов различных локализаций.

Метод был разработан в России группой ученых под руководством доктора биологических наук, профессора микробиологии Осипова Георгия Андреевича. С 1991 года метод используется в медицине, экологии и биотехнологии, в основном, при научных исследованиях. Научная обоснованность метода заключена в четырнадцати кандидатских, докторских диссертациях и десятках публикаций в научной периодике, в том числе в иностранных реферируемых журналах. Она обусловлена получением беспрецедентно большого объема информации о действующих в воспалительных процессах и при дисбиозах бактериях, особенно из числа анаэробов, некультивируемых в клинических лабораториях аэробов, а также актинобактерий, дрожжей, микроскопических грибов и вирусов. 

Сегодня метод ХМС прекрасно зарекомендовал себя в среде специалистов гинекологов, репродуктологов, урологов, гастроэнтерологов, как альтернатива, так и при совместном применении с традиционными методами обследования.

Основные преимущества  методики Хромато-масс-спектрометрии (ХМС) микробных маркеров:

1. Газовая хроматография масс-спектрометрия является высокочувствительным и достоверным методом обследования;
2. Одним анализом количественно оцениваются более 50 доминантных родов и видов микроорганизмов - потенциальных участников воспалительных процессов.
3. В отличие от широко применяемых методов диагностики - культуральных, иммуно-серологических, молекулярно-биологических, ХМС указывает на целый спектр микробов, которые традиционно не учитывается, в результате чего пациент остается недообследованным со всеми вытекающими последствиями.
4. Уникальной особенностью исследований методом ХМС является способность выявлять возбудителей заболеваний, находящихся в "спящем" состоянии, когда микроколонии окутаны защитной полисахаридной капсулой. 
5. Методика универсальна. Применяется для исследования микробиоценозов любых органов и локализаций.

Характеристика микробиологического анализа

Метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010) является надежным количественным экспресс-методом диагностики дисбактериозов и определения возбудителей инфекции. Принципиальное отличие метода в количественном определении маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов) непосредственно в клиническом материале, что придает ему качественно новое свойство – возможность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров.

Основные характеристики метода:

• Без культивирования непосредственно в клиническом материале;
• Одновременное определение 57 микроорганизмов в одной пробе;
• Полное время анализа составляет 2 часа;
• Универсальность в отношении разных групп микроорганизмов: бактерии, грибы, вирусы;     
• Чувствительность 10³-10⁴ клеток в пробе;
• Селективность –  до вида;
• Использование любого биоматериала.

Метод МСММ дает возможность быстро получить расширенную информацию об анаэробах и трудно культивируемых аэробах, а также актинобактериях, вирусах, дрожжах и микроскопических грибах из одной пробы обеспечивает полное понимание микробной этиологии заболевания.

Метод МСММ лишен недостатков классических методов диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике:

В отличие от бактериологических исследований

• экспрессный, результаты не «отстают» от реальной картины развития инфекционного процесса;
• есть возможность оценить роль некультивируемых микроорганизмов в инфекционно-воспалительном процессе.

В отличие от иммуно-серологических испытаний

• прямой;
• отсутствуют ошибочные определения, связанные с индивидуальными вариациями иммунного ответа.

В отличие от молекулярно-биологических методов

• количественная оценка.

Метод прошел многолетнюю апробацию и эффективно используется во многих медицинских учреждениях. Вот  только немногие из них:

• МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Москва
• Институт медико-биологических проблем РАН, Москва
• Лечебно-реабилитационный центр Росздрава, Москва
• Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова  МЧС России, С-Петербург
• Лаборатория коллективного пользования СФУ, Красноярск
• ЦНИЛ Красноярского государственного медицинского института, Красноярск
• Байкальский институт природопользования СО РАН, Улан-Удэ
• Международный аналитический центр ИОХ РАН, Москва
• Городская клиническая больница № 2, Владивосток
• НИИ скорой помощи имени Н.В. Склифосовского, Москва
• Лаборатория микробной хроматографии, Санкт-Петербург
• Нижневартовский ПНД, Нижневартовск
• НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва
• Челябинский государственный университет, Челябинск
• Институт аналитической токсикологии, Москва
• Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону

О МЕТОДЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОФЛОРЫ ПО ОСИПОВУ Г.А.

На рисунке: слева - Газовый хромато-масс-спектрометр Маэстро-αМС; справа - разработчик метода хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров, доктор биологических наук, профессор микробиологии Осипов Георгий Андреевич

О востребованности метода МСММ

Существующая методология микробиологического обследования пациента в клинических лабораториях по разным причинам сводится к анализу всего лишь десятка родов аэробных микроорганизмов из числа энтеробактерий, аэробных кокков и псевдомонад. Невольно игнорируется большинство клинически значимых микробов из числа аэробных актинобактерий, всех анаэробов и других трудно культивируемых микроорганизмов. Число неучтенных при обследовании каждого больного составляет сотни видов, так, как давно известно, что в организме человека и в окружающей среде присутствует более пятисот видов, способных вызвать инфекционных процесс или воспаление. Пользуясь информационной мощью сети Интернет нетрудно показать, что каждый микроб является потенциально патогенным. На сегодня не вызывает сомнений, что инфекции и воспаления не являются моноэтиологичными, рано или поздно выясняется участие в них группы микроорганизмов, объединенных в генетически и трофически организованные сообщества, называемые биопленками.

Сам организм человека оказывается основным источником микробов, и в первую очередь анаэробов. Анаэробы - доминанты микробиоты человека. Их места обитания – плотные мукопептиды слизистых оболочек кишечника, дыхательных путей, урогенитального тракта и закрытых от прямого доступа кислорода компартментов кожи. Аэробы не характерны для таких мест обитания микроорганизмов. Современные научные представления о микроэкологии человека, говорят о том, что аэробы вторичны в количественном (и функциональном плане тоже) в нормальной и патофизиологии его органов. Источники инфекции, кроме особо опасных сосредоточены преимущественно внутри человека, а не в  окружающей среде. Доля анаэробов существенно превалирует над аэробами и это пора учесть в практике рутинных анализов лабораторий клинической микробиологии.

В такой ситуации аэробы, являющиеся основным объектом работы клинических лабораторий, представляются лишь как биологические маркеры основной инфекции, вызванной анаэробами.

Таким образом, существующая практика клинических бактериологических исследований имеет малую информативность и сомнительную пользу для лечения заболеваний микробной этиологии. Выход из сложившейся ситуации виден либо в расширении и углублении процедуры обследований культурально-биохимическим методом с обязательным включением в постоянную практику анаэробов и актинобактерий с усовершенствованием техники отбора проб, либо во внедрение новых технологий микробиологического анализа, лишенных недостатков, связанных с необходимостью получения биомассы живых микроорганизмов в искусственных условиях.

Газовая хроматография – масс-спектрометрия

В этом отношении перспективен метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) микробных маркеров. Он разработан в России доктором биологических наук Осиповым Г.А., при участии группы ученых биологов, микробиологов, врачей и с 1991 года используется в медицине, экологии и биотехнологии. В его основе лежит высокоточное определение присутствия молекулярных признаков микроорганизмов из числа их клеточных липидов – высших жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеролов в анализируемой пробе. Определение производится высокочувствительным и селективным методом газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС), позволяющим одновременно измерять более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале - крови, моче, биоптатах, пунктатах и других биологических жидкостях и тканях без предварительного посева на питательные среды или использования тестовых биохимических материалов. Разработан автоматический алгоритм анализа с помощью штатных программ ГХ-МС, позволяющих определить концентрацию более 50 микроорганизмов в материале через три часа после его поступления в лабораторию. 

• Метод подтвержден патентами на изобретения и имеет разрешение на применение в качестве новой  медицинской технологии.

• Его научная обоснованность заключена в четырнадцати кандидатских и докторских диссертациях и десятках публикаций в научной периодике, в том числе в иностранных реферируемых журналах.

Пятнадцатилетний опыт применения метода микробных маркеров в клиниках городов Москвы и Санкт-Петербурга  показал его практическую пользу в диагностике и лечении  простых и сложных патологий. Она обусловлена получением беспрецедентно большого объема информации о действующих в воспалительных процессах и при дисбиозах бактериях, особенно из числа анаэробов и некультивируемых в клинических лабораториях аэробов, а также актинобактерий, дрожжей и микроскопических грибов. Новизна аналитической процедуры, новизна и объем информации обеспечивает полное понимание микробной этиологии заболевания каждого без исключения из тысяч обследованных пациентов, с одной стороны. С другой – требует от врача принципиально новых подходов в лечении больных на основании измененных представлений о микробной экологии человека в норме и патологии.

Метод становится все более востребованным, потому, что он информативный, экспрессный и экономически эффективный. А самое главное – дает ощутимое преимущество в вылечивании хронических заболеваний, преодолении септических состояний и выяснении причин лихорадок неизвестной этиологии, а также существа нарушений общего микроэкологического гомеостаза организма человека.

Метод ХМС как диагностический инструмент:

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ МИКРОБНЫХ МАРКЕРОВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

Применение масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) для изучения микроэкологии человека дает качественно новый вариант микробиологического исследования благодаря возможности одновременного количественного определения более сотни микробных маркеров непосредственно в биологических пробах без предварительного культивирования микроорганизмов и использования биохимических тестовых материалов и генетических праймеров. Получение в реальном времени расширенной информации об анаэробах и трудно культивируемых аэробах, а также актинобактериях, вирусах, дрожжах и микроскопических грибах из одной пробы обеспечивает полное понимание микробной этиологии заболевания. Количественные измерения методом МСММ позволяют изучать динамику изменения микробиоты при лечебных мероприятиях, в том числе – влияние антибиотиков и пробиотиков на пристеночную микробиоту кишечника.

Введение

С современных позиций, нормальную микробиоту человека рассматривают как совокупность микробных сообществ локусов, характеризующихся определенным составом и колонизирующих кожу и слизистые оболочки. Нормальная микробиота – тот первичный неспецифический барьер, лишь после прорыва которого инициируется включение всех последующих неспецифических и специфических факторов защиты макроорганизма. На рубеже ХХI века сформировалось представление о микрофлоре организма человека как о еще одном органе, покрывающим в виде чулка кишечную стенку, слизистые оболочки и кожу человека. Оставаясь невидимым, этот «орган» весит около двух килограммов и насчитывает порядка 10¹⁴ клеток (сто биллионов) клеток микроорганизмов. Это число в десять раз превышает число собственных клеток человека. Микробиота выступает как чуткий индикатор физиологического состояния организма человека в зависимости от воздействия на него различных факторов.

На сегодня нет точного описания архитектуры микробного сообщества пристеночного слоя кишечника. Но известны данные, согласно которым микроорганизмы, в количестве 10¹¹ клеток/см³ [9] распределены в пристеночном слое муцина [3, 20], прочного геля, состоящего из пептидогликана, продуцируемого бокаловидными клетками эпителия кишечной слизистой оболочки. Он близок по химической природе полисахаридной защитной капсуле, которой окружают себя многие микробы. Такая среда выглядит пригодной для существования микроорганизмов в тонких слоях муциновой слизи в виде равномерно распределенных клеток на достаточно близком расстоянии (порядка размера микробной клетки) друг от друга. Такое расположение должно обеспечивать контакт с диффундирующим в муцин химусом и клетками между собой для быстрого обмена продуктами метаболизма. Специальные исследования показали, что в биопленке по иному, в сравнении с чистыми культурами бактерий, происходят их многочисленные физиологические процессы, в том числе продукция метаболитов и биологически активных веществ. Сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид – кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Последнее получило специальное определение как социальное поведение (quorum sensing) микроорганизмов. Реакция микроорганизмов на изменение условий окружающей среды в биопленке существенно отличается от реакции каждого отдельного вида в монокультуре. Такая организация обеспечивает ее физиологическую и функциональную стабильность и, следовательно, является залогом конкурентного выживания в экологической нише. В организме человека специфическое преимущество такой организации заключается в обеспечении гомеостаза органов, функциональность которых зависит от населяющих их микробов.

Не лишено смысла рассматривать микробное соообщество любых слизистых оболочек в определенной мере подобной кишечнику организованной биопленке. Поводом к тому является стабильность состава каждого из этих микробиоценозов: гомеостаз микробных маркеров имеет место не только в крови [1, 15], но и в вагинальном содержимом женщин и эякуляте мужчин [4].

Микроэкологический статус человека, точнее, поддержание его гомеостаза, является необходимым условием стабильного функционирования всех его органов и систем.

Соответственно, одним из первых мероприятий по обеспечению качества и продолжительности жизни, а тем более в лечении любых заболеваний, особенно клинических отделениях реабилитации и интенсивной терапии, должен быть контроль и восстановление микробиоценоза, если он оказался нарушенным. В этом можно найти сходство во мнениях в современных публикациях [5, 8, 12, 27]. Микробиота человека сконцентрирована в основном в кишечнике. Сведения о природе микробиоценоза кишечника, накопленные к настоящему времени, выглядят достаточными для понимания его функционирования, как физиологически активного органа человека. Однако для их реализации в управлении этим органом при патологиях, причинно-следственным образом связанных с дисбиозом, недостает количественного метода определения  изменений в составе достаточно широкого круга ключевых микроорганизмов и их мониторинга в процессе коррекции. Причем желательно анализировать состав пристеночной кишечной микробиоты, а не микробиоты фекалий, как это принято повсеместно. Именно в мукозном слое, облегающем слизистую оболочку кишечника, происходит усвоение пищевого химуса, поступающего из желудка, синтез микроорганизмами большого числа биологически активных веществ: ферментов,  витаминов, иммуностимуляторов, но также и токсичных для человека веществ. Предполагается, что отсутствие баланса в их продукции связано с патологическими проявлениями самого разного характера: кишечными расстройствами, кожными заболеваниями, половой дисфункцией и сердечной недостаточностью.

Материал и методы исследования

Контроль микроэкологического статуса человека сейчас уже является проблемой практического здравоохранения. Следует признать, что классические бактериологические методы затруднительно использовать для ее эффективного решения. Контролировать состав пристеночной микробиоты кишечника и других органов оказалось возможным с помощью метода газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) по содержащимся в их клеточной стенке длинноцепочечным жирным кислотам и жирным альдегидам фосфолипидов. Известно, что состав жирных кислот микроорганизмов видоспецифичен и используется для их идентификации в чистой культуре [18]. Кроме того, у многих микробов имеются индивидуальные маркеры специфичные для таксонов разного уровня (семейства, рода или вида), по которым их можно определять количественно в объектах окружающей среды и клинических пробах [9]. Существо анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот из образца, подлежащего исследованию (например, биоптата кишечной стенки или крови), их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. На основании этих измерений расшифрован состав микробиоты пристеночного мукозного слоя этих отделов кишечника, а также фекалий [3]. Данные по фекалиям оказались в полном количественном соответствии с литературными, что послужило основанием для верификации метода ГХ-МС в применении к другим объектам исследования, но сразу по всем микроорганизмам в одном анализе и с большой точностью по сравнению с культуральным и, пожалуй, генетическим (FISH) методами [9].

Одновременное исследование крови тех же пациентов, а также доноров показало соответствие состава минорных ЖК, альдегидов и стеролов в биоптатах тонкой кишки и в крови.

Метод около пятнадцати лет проходил апробацию в медицинских учреждениях Москвы. В 2010 г. Росздравнадзором разрешено его применение в качестве новой медицинской технологии «Оценки микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).

Результаты и их анализ

Обнаруженный в результате систематических исследований гомеостаз микробных маркеров в крови [1, 15] и адекватность его профиля составу кишечной микробиоты здорового человека обеспечил уникальную возможность мониторировать состояние микробиоты кишечника неинвазивным экспрессным методом – по анализу крови.

Микробная этиология заболеваний кожи

Микробная этиология заболеваний кожи и многих внутренних органов уже изучалась в процессе клинической апробации метода МСММ, которые позволили не только получить дополнительные сведения об агентах инфекции, но и получить подтверждение о транслокации микроорганизмов кишечника в очаг воспаления.

Наблюдение за микробиотой тонкого кишечника при таких кожных заболеваниях как себорея, акне и атопический дерматит дает подтверждение о нозологической специфичности дисбактериоза  кишечника. Так у больных себорейным дерматитом при дефиците Lactobacillus и Propionibacterium в кишечнике высока концентрация маркеров клостридий группы C.ramosum и видов Eubacterium (рис. 1). При угревой болезни (акне) наблюдается дефицит Lactobacillus при избыточном росте клостридий группы C.ramosum, Bifidobacterium, вирусов Herpes и других микроорганизмов. При атопическом дерматите в кишечнике регулярно обнаруживается дефицит Bifidobacterium.

Примечание редактора:  Из практики применения пробиотиков ООО "Пропионикс" было обнаружено, что пероральное применение концентратов ПКБ P. freudenreichii показало их высокую излечивающую способность в случае себореи, что согласуется с данными, полученными путем МСММ. Учитывая бифидогенные свойства пропионовокислых бактерий, их использование при атопическом дерматите и других патологиях с дефицитом бифидобактерий (как и использование бифидобактерий вместе с ПКБ, что вызывает синергизм) можно считать весьма целесообразным, учитывая иммуномодулирующие и антимутагенные свойства указанных штаммов, а также выявленное антибиотическое (бактерицидное и бактериостатическое) действие в отношении патогенных  и условно-патогенных микроорганизмов.

Рис.1. Диаграмма масс-спектрометрии микробных маркеров в крови у больных себорейным дерматитом

Метод масс-спектрометрии микробных маркеров, благодаря своей экспрессности и информативности, позволил получить экспериментальные данные, подтверждающие связь ряда заболеваний с изменением микроэкологического статуса организма. Эти данные согласуются с известными данными о связи микробиоты кишечника с кожными заболеваниями [14]. Более того, они позволяют узнать существо изменений микробиоты, причем, именно тонкого кишечника, а не фекалий, как это делалось в предыдущих исследованиях. Для практического врача это означает возможность усовершенствования тактики лечения больных за счет выбора этиотропных антибиотиков для подавления избыточного роста (инфекции) части микробиоты и стимулирования размножения дефицитной группы микробов.

Синдром раздраженного кишечника

При синдроме раздраженного кишечника (СРК) наблюдается тотальный дефицит кишечной микробиоты до семикратного снижения общей численности микроорганизмов преимущественно за счет уменьшения численности Lactobacillus, Bifidobacterium и Propinibacterium freudenreichii при избыточном росте Eubacterium и Streptococcus [3]. Кроме того, растет численность анаэробов Bacteroides fragilis, Porphyromonas, Propinobacterium acnes, при периодическом избытке Enterobacteriacae, клос-тридий группы C. ramosum и Eggertellalenta, а также Campylobacter mucosalis, Enterococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Streptococcus. До лечения у пациента обнаружен избыток C. ramosum, Streptococcus, Nocardia и Actinomyces viscosus при существенном недостатке основных микроорганизмов нормальной микробиоты кишечника – Lactobacillus, Bifidobacterium, Eubacterium и Propionibacterium (Рис. 2).

Рис.2. Диаграмма масс-спектрометрии микробных маркеров в крови при коррекции дисбиоза жидкими пробиотиками

После лечения с применением некоторых известных жидких пробиотиков микроэкологический статус в основном нормализовался, за исключением того, что Lactobacillus и Propionibacterium freudenreichii не достигли нормы, а численность Eubacterium перешла в избыток. При восстановлении нарушенного микроэкологического статуса оказалось полезным применение иммуномодуляторов (гепон, имуномакс), висмутовых препаратов типа де-нола а также метронидазола, который, как оказалось, кроме подавления внедренных в слизистую оболочку бактероидов стимулирует рост всех микроорганизмов нормальной микробиоты кишечника.

Примечание редактора: В данном примере жидкие пробиотики – биопрепараты с активизированными чистыми культурами бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, включая пробиотики с органическими формами микроэлементов (Se и I), а также биоконцентраты с холестеринметаболизирующей активностью не применялись. Между тем, использование молочных P. freudenreichii по данным последних исследовний позволяет произвести тонкую модификацию кишечной микробиоты за счет ростовых бифидогеных стимуляторов (bifidogenic growth stimulator (BGS)) таким образом, что в итоге восстанавливается содержание не только самих пропионовокислых бактерий и бифидобактрий, но и лактобацилл, в т.ч. нормализуется баланс КЦЖК (пропионат, бутират, ацетат), а также самонаведение лимфоцитов (снижение Ил-1 β, ИЛ-6 и ФНО-α и увеличение Ил-10), что указывает на противовспалительный эффект.

Практика применения инновационных биоконцентратов ООО "Пропионикс" с учетом данных масс-спектрометрии микробных маркеров (в совокупности с показателями анализа на сахар и холестерин (атерогенный класс  ЛПНП и ЛПОНП), эссенциальные микроэлементы (йод, селен, железо), а также ряд витаминов (например, B12)), в настоящее время дает хорошие результаты, в т.ч. по анализам при планировании беременности и подготовке перед ЭКО, включая анализы женщин с проблемами беременности (например, при привычном невынашивании беременности) или неудачами ЭКО.

Дополнительно см.: Пробиотики. Беременность и постнатальный период

Инфекции урогенитального тракта

Многочисленные анализы инфекции и дисбиозов методом МСММ при вагинитах выявили ряд типичных случаев:

• Гонококковый вагинит. В вагинальном секрете и соскобах присутствуют маркеры Neisseria и сопутствующей в таких случаях анаэробной микрофлоры (Peptostreptococcus, Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Selenomonas). В то же время занижено  содержание Lactobacillus, Bifidobacterium, некоторых Clostridium, Ruminicoccus, Actinomyces, части Eubacterium и других микроорганизмов нормофлоры – вагинальный дисбактериоз.
• Синергизм актинобактерий и кокков. Превалируют аэробные актиномицеты (Streptomyces, Nocardia и др.) со Streptococcus, Bifidobacterium и Ruminicoccus. В числе кокков – Rhodococcus equi, который рассматривают как внутриклеточный условный патоген (аналог гонококка, но менее вирулентный – обычно встречается у мужчин при простатите). Превышают норму некоторые другие бактерии, среди которых заслуживают внимания два вида клостридий.
• Энтеробактерии. Эндотоксинемия. Ведущими микроорганизмами являются грамотрицательные микроорганизмы, преимущественно сем. Enterobacteriaceae, которые создают высокие концентрации эндотоксина в локусе и в крови.
• Микоз, без участия кандиды. Существенно превышают норму маркеры микроскопических грибов, продуцирующих кампестерол и ситостерол, а также Staphylococcus aureus и Clostridium propionicum и Clostridium perfringens. Ниже нормы количество многих бактерий, в том числе Lactobacillus и Bifidobacterium (дисбактериоз).
• Ведущая микрофлора представлена бактериями Clostridium perfringens и микроскопическими грибами Candida albicans при наличии Streptococcus (Streptococcus oralis) и грамотрицательных микроорганизмов родов Klebsiella, а также анаэробов Eubacterium.
• У женщин с проблемами беременности или неудачами ЭКО методом МСММ выявляется существенное превышение нормы «скрытыми» (от рутинных методов) компонентами нормальной микробиоты: Clostridium perfringens, Helicobacter pylory, Streptomyces, Eubacterium. При наличии такого рода токсигеннных микроорганизмов в детородном органе как по отдельности, а тем более при одновременном присутствии, вряд ли будет возможным развитие оплодотворенной яйцеклетки в полноценный плод и нормальное протекание беременности [6].

Полученные данные подтверждают современное  представление об инфекциях урогенитального тракта как о полимикробном воспалении. Более того, данные  показывают, что ни один из контролируемых таксонов микроорганизмов не сохраняет свою концентрацию в пределах нормы при воспалениях. Здесь понятие таксон может иметь ранг семейства или рода как правило. На самом деле видовое разнообразие микробиоценоза урогетитального тракта в несколько раз шире, в сравнении с результатами рутинных клинических обследований. Следует отметить, что оно напоминает кишечную микробиоту своим качественным составом, в том числе анаэробами.

Подобно микробиоте кишечника микробное сообщество слизистых половых органов женщин гомеостатично и играет положительную роль в обменных процессах и защите от внешних патогенов. В то же время оно проявляет и враждебные по отношению к хозяину функции, если состав микробиоты нарушен и токсинообразование, характерное для большинства представителей нормальной микробиоты, становится клинически значимым и может угрожать здоровью женщины. Более того, оно может угрожать и главной физиологической функции женских половых органов – репродуктивной [6].

По данным из научной литературы, воспалительные процессы внутренних половых органов составляют 62,5 % в структуре гинекологической заболеваемости, причем, у 9,5% женщин диагностируютгнойные воспалительные заболевания маточных труби яичников.

Отмечается, что инфекционные заболевания редко вызываются одним возбудителем. Смешанные инфекции составляют примерно 20–30 % в структуре инфекционных заболеваний матки и придатков, т.е. почти у каждой третьей пациентки выявляется инфекционный процесс, вызванный несколькими возбудителями. Подавляющее большинство воспалительных заболеваний органов малого таза обусловлено собственной условно-патогенной микробиотой, ведущая роль в развитии которых принадлежит  наиболее вирулентным анаэробам, энтеробактериям и коккам. Исследованы 21 инфицированный биоптат от 10 пациенток перенесших операции по разным поводам [8]. Из 54 таксонов микроорганизмов, контролируемых в процессе анализа, 32 показывают избыточный рост (инфекцию). Инфицирование каждого исследованного материала включает несколько (до двенадцати) таксонов микроорганизмов. Это подтверждает тезис о смешанном характере инфекции половых органов женщин. Полученные данные подтверждают также сформировавшееся представление о доминировании анаэробов. Их доля составляет 70–90 % по нашим измерениям и соответствует оценке других авторов.

Выявляемые в клинических лабораториях при рутинных анализах микроорганизмы в рейтинговом положении оказываются во втором ранге смешанной инфекции верхних половых органов. Максимального уровня в этой группе достигает Enterococcus – 10⁸  клеток/мл. Тогда как перечисленные выше доминирующие анаэробы занимают порядки 10⁸–10¹¹. Грамотрицательные микроорганизмы Moraxella/Acinetobacter, P. aeruginosa, Haemophylus/Burkholderia, Prevotella, B. fragilis, H. pylori обнаруживаются в исследованных пробах в количестве 10⁵–10⁷ клеток/мл. Представители сем. Enterobacteriaceae присутствуют, но не выходят за пределы уровня колонизации вагины в норме.

Результаты этого анализа перспективны для выявления и консервативного лечения подобного рода заболеваний на ранних стадиях, а также уточнения механизма возникновения патологических изменений матки и придатков, приводящих к необходимости оперативного вмешательства.

При инфекционном простатите в разных исследованиях выявлены представители семейства Enterobacteriaceae, бактерии рода Pseudomonas, энтерококки (Enterococcus faecalis, E.faecium и другие), Staphylococcus aureus, Chlamydia trachomatis, Corynebacterium, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Streptococcus, and Escherichia, Flavobacterium spp., Pseudomonas testosteroni. Исследование ДНК секрета и биоптатов простаты свидетельствует о наличии в них микроорганизмов, отличающихся от микробиоты кожи и прямой кишки, и, следовательно, не обнаруживаемых традиционными методами. Действительно, генетическим методом удалось определить в семени наличие 15 видов необычных анаэробов родов Peptostreptococcus, Prevotella, Corynebacterium, Rubrivirax, Actinobacillus, Veilonella и Eubacterium, а также трех аэробов: Streptococcus salivarius, S.pneumoniae и Burkholderia picketii [25, 26]. В секрете простаты обнаружено большое количество недектируемых в обычной клинической практике коринеформных бактерий, причем в сложном сообществе с Staphylococcus, Peptostreptococcus, Streptococcus и Escherichia, состав которого различен у разных пациентов. Кроме того, обнаружены микробные ассоциации и у здоровых мужчин, однако иные, чем у больных и в меньшей концентрации.

Заключение

Приведенные примеры в целом показывают, что диагностика возбудителей инфекционных процессов по данным масс-спектрометрии биологических жидкостей является экспресным, чувствительным и универсальным методом индикации, одинаково эффективным как для аэробных, так и для анаэробных микроорганизмов. При этом следует отметить, что инфекции в подавляющем большинстве случаев полимикробны, в них доминируют анаэробы, в воспалениях существенную роль в провоспалительных и противовоспалительных актах играет собственная автохтонная микробиота организма человека.

Метод МСММ может быть использован для определения любого микроба, имеющего в составе структурных клеточных компонетов вещество-маркер, отличное от химических веществ фоновой биологической жидкости. Наблюдения и литературные данные свидетельствуют о достаточном количестве клеточных компонентов, специфичных сугубо для возбудителя, по которым его можно идентифицировать, используя индивидуальные или коллективные маркеры [26].

Чувствительность метода составляет 10⁴–10⁵ клеток в пробе в зависимости от содержания маркера в клетке. В настоящее время для проведения анализа требуется не более 3 ч на 1 образец, или 7 часов на серию из 5 проб. Экспрессность и универсальность анализа при возможности точного определения численности микроорганизмов позволили за короткий срок пополнить сведения о микробной этиологии многих заболеваний сердечно-сосудистой системы [24], органов дыхания и пищеварительной системы, кожи [10, 11], урогенитального тракта, послеоперационных и травматических инфекций. Полученные для каждого больного данные по составу микроорганизмов, участников инфекционного процесса при оценке общего микроэкологического статуса, позволяют врачу получить качественно новую обширную информацию для принятия адекватной антимикробной и общей терапии.

Информация о практике проведения МСММ

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Кровь (из пальца или из вены), мокрота, гнойный экссудат, вагинальный секрет, эякулят, мазки моча, себум, соскобы, биоптаты тканей (соединительная ткань, эпителий).

АНАЛИЗ МИКРОБИОМА

Результаты исследования микробных маркеров в крови методом газовой хроматографии масс-спектрометрии (анализ микробиоты тонкой кишки)

ВРАЧАМ НА ЗАМЕТКУ

Применение масс-спектрометрии микробных маркеров в клинической практике

Источники:

Г.А. Осипов, Г.Г. Родионов. Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им А.Н. Бакулева РАМН, Москва; Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова МЧС России, Санкт-Петербург. Микроэкология человека в норме и патологии по данным масс-спектрометрии микробных маркеров. // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2013. № 2 – С.43-53

Сайт Института Аналитической токсикологии - cсылка→ (вопросы по анализам)

Клиенты ИАТ – частные и государственные медицинские учреждения.

Литература:

1. Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином // Вестник РАМН. – 1999. – T. 16. – № 7. – C. 25–31.
2. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. – М.: Наука, 2003. – 348 с.
3. Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культурально-биохимическим и хромато-масс-спектрометрическим методами. / Г.А. Осипов, А.И. Парфенов, Н.В. Верховцева [и др.] // Эксп. Клин. Гастроэнтерология. – 2003. – Т. 4. – С. 59–67.
4. Крымцева Т.А. Физиологическая роль изменения жирнокислотного состава урогенитальных жидкостей организма человека при дисбиозах: автореф. дис. канд. биол. наук. – Москва. 2003. – 35 с.
5. Микроэкологический статус кандидатов на пересадку печени / О.И. Андрейцева, В.В. Киселев, Н.Б. Бойко [и др.]. // Трансплантология. – 2010. – № 1. – С. 37–46.
6. Минорные жирные кислоты биологических жидкостей урогенитальных органов и их значимость в диагностике воспалительных процессов. / Т.А. Крымцева, Г.А. Осипов, Н.Б. Бойко [и др.]. // Журн. микроб. эпидем. иммун. – 2003. – № 2. – С. 92–101.
7. Николаев Ю.Н., Плакунов В.К. Биопленка – «город микробов» или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. 2007. – Т. 76. – № 2. – С. 149–163.
8. Осипов Г.А, Федосова Н.Ф., Лядов К.В. Количественный in situ микробиологический анализ по липидным маркерам в биологических жидкостях с использованием метода газовой хроматографии – масс спектрометрии. // Здравоохранение и медицинские технологии. – 2007. – № 5. – С. 20–23
9. Осипов Г.А. Хромато-масс-спектрометрический анализ микроорганизмов и и сообществ в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах. / Химический анализ в медицинской диагностике. – М.: Наука, 2010. – С. 293–368.
10. Спектрометрическое исследование состава микроорганизмов кишечника у больных себорейным дерматитом. / И.В. Полеско, Ю.С. Бутов, Г.А. Осипов, В.В. Малиновская. // Рос. журн. кож. и вен. бол. – 2006. – № 3. – С. 23–27.
11. Состав кожного сала, микроэкология кожи и кишечника у больных себорейным дерматитом и акне (исследование методом газовой хроматографии масс-спектрометрии). / И.В. Полеско, Ю.С. Бутов, Г.А. Осипов [и др.]. //Рос. журн. кож. и вен. бол. – 2007. – № 2. – С. 43–50.
12. Федосова Н.Ф., Лядов К.В., Осипов Г.А. Новые подходы к анализу инфекционных послеоперационных и посттравматических осложнений. / Инфекции в хирургии. – 2010. – Т. 8. – № 2. – С. 56–62.
13. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. В 3-х томах. / Микрофлора человека и животных и ее функции. – М.: Грант, 1998. – Т. 1. – С. 14–17.
14. Abnormal fecal microflora and malabsorption phenomena in atopic eczema patients. / G. Ionescu, R. Kiehl, L. Ona, R. Schuler. // J Adv Med. – 1990. – Vol. 3. – P. 71–89.
15. Beloborodova N.V., Osipov G.A. // Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship.// Microbial Ecology in Health and Disease. – 2000. - Vol. 12. – P. 12–21.
16. Davey M.E. and O’Tоol G.A. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. – 2000. – Vol. 64, N 4. – P. 847–867.
17. Donlan R.M.and J. William Costerton. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. // Clinical Microbiology Reviews. – 2002. – Vol. 15, N 2. – P. 167–193.
18. Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acid profiles for rapid, accurate identification of plant pathogenic bacteria. / D.E. Stead, J.E. Sellwood, J. Wilson, J.J. Viney. // Appl. Bacteriol. – 1992. – Vol. 72. – P. 315–321.
19. Guideline for prevention of surgical site infection. / A. J. Mangram, T. C. Horan, M. L. Pearson [et al.] // Jarvis. Am. J. Infect. Control. – 1999. – Vol. 27. – P. 97–134.
20. Macfarlane, S., Hopkins M.J., Macfarlane G.T. Bacterial grows and metabolism on surfaces in the large intestine. // Microbial Ecology in Health and Disease. – 2006. – Vol. 2. – P. 64–72.
21. Nicholson J.K. Global systems biology, personalized medicine and molecular epidemiology. // Mol Syst Biol. – 2006. – Vol. 2. – P. 52.
22. Nicholson J.K., Holmes E., Wilson I.D. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care. // Nat Rev Microbiol. – 2005. – Vol. 3. – P. 431–438.
23. Nicholson J.K., Wilson I.D. Understanding global systems biology: Metabonomics and the continuum of metabolism. // Nat Rev Drug Discov. – 2003. – Vol. 2. – P. 668–676.
24. Osipov G.A., Turova E.S. Studying species composition of microbial communities with the use of gas chromatography-mass spectrometry. Microbial community of kaolin. // FEMS Microbiol.Rev. – 1997. – Vol. 20. – P. 437–446.
25. Prokariotic DNA sequences in patients with chronic idiopathic prostatitis. / J.N. Krieger, D.E. Riley, M.C. Roberts, R.E. Berger. // J.Clin. Microbiol. – 1996. – Vol. 34, N 12. – P. 3120–3128.
26. Polymerase chain reaction-based detection of bacteria in semen. / K. Jarvi, J.-M. Lacroux, A. Jain, I. Dumitru [et al.]. // Fertil.Steril. – 1996. – Vol. 66, N 3. – P. 463–467.
27. The gut microbiota as a target for improved surgical outcome and improved patient care. / J. Kinross, A.C. von Roon, N. Penney [et al.]. // Curr Pharm Des. – 2009. – Vol. 15, N 13 – P. 1537–1545.

См. также:

• Анализ крови и спектральный анализ волос на микроэлементы и витамины
• Метагеномный анализ микробиоты

Идентификация микроорганизмов с применением газовой хромато-масс-спектрометрии

Аннотация

В обзоре изложена основная информация, имеющаяся в литературе, об использовании метода газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС). Обсуждены вопросы, затрагивающие значимость этого метода для идентификации микроорганизмов. Отмечена перспективность создания отечественного программного обеспечения и баз данных масс-спектров микроорганизмов.

Существует множество методов идентифика­ции микроорганизмов (МО): фенотипические, гено­типические, хемотаксономические методы, прямое белковое профилирование и др. [1]. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки и применяется в зависимости от цели эксперимента.

Одним из современных методов, используе­мых для дифференциации и идентификации МО, является метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС). Он основан на сочетании двух ана­литических методов: капиллярной газовой хромато­графии и масс-спектрометрии. Принцип метода — качественное и количественное определение мар­керных веществ МО (жирных кислот (ЖК), альде­гидов, спиртов, стеринов и др.) непосредственно в исследуемом материале.

Количественное газохроматографическое оп­ределение индивидуальных ЖК в биологических объектах является одним из наиболее востребован­ных методов аналитической и клинической биохи­мии: оно широко используется при оценке пищевой ценности продуктов питания, для таксономическо­го и судебно-медицинского установления приро­ды биологических образцов, в качестве источника информативных биомедицинских критериев в ди­агностике заболеваний разной этиологии, в науч­но-исследовательских, бактериологических и вете­ринарных лабораториях [2]. Одной из перспектив применения газовой хроматографии в биомедицин­ских исследованиях является концепция метаболи­ческих профилей — систем интегральной оценки метаболизма как для макроорганизмов (метаболи­ческие профили биосред: мочи, крови, слюны, вы­дыхаемого воздуха), так и для МО. Метаболические профили так же индивидуальны, как и отпечатки пальцев [3].

Наличие специфических веществ (маркеров) в исследуемых образцах открывает возможность для направленного поиска и идентификации МО в со­обществах с использованием метода ГХ/МС. Так, с определения маркера были начаты работы группы американских исследователей под руководством D.C. White [4], впоследствии изучивших структуру микробных сообществ [5] различных групп МО по известным маркерам без количественных определе­ний видового состава сообщества. Установлено, что нечетные, разветвленные и циклопропановые ЖК, а также жирные альдегиды встречаются преимуще­ственно у грамположительных бактерий, а высшие жирные β-оксикислоты присущи только грамотрицательным МО. К настоящему времени состав ЖК большинства МО III и IV групп патогенности изу­чен [6][7][8][9][10][11][12][13], показана его воспроизводимость, дока­заны родо- и видоспецифичность ЖК [14].

Разработанный Г.А. Осиповым алгоритм [14] позволил не только рассчитать качественный и ко­личественный состав микробного сообщества, в том числе МО III-IV групп патогенности, в биото­пах человека, но и следить за изменением его со­става, отслеживая изменения метаболизма МО ме­тодом ГХ/МС.

Идентификация МО путем получения профиля ЖК включает в себя несколько последовательных этапов:

• рост и накопление бактерий в определенных условиях;
• омыление клеточных липидов;
• метилирование ЖК;
• экстракцию и очистку метиловых эфиров ЖК;
• разделение метиловых эфиров ЖК газовой хроматографией;
• идентифицирование и количественное опре­деление пиков.

Полученные профили можно сравнить с серией библиотек профилей и списком бактерий с наиболее похожими профилями, представленными вместе с расчетом относительного сходства. За рубежом продаются подобные системы, например система микробиологической идентификации «Sherlock» («MIDI Inc. Delaware», США), запущенная в 1991 г. для быстрой идентификации более 1500 видов МО путем анализа ЖК и альдегидов [15]. Программное обеспечение позволяет автоматизировать газовую хроматографию. Метод хорошо себя зарекомендо­вал; результаты, полученные путем ГХ/МС-анализа, были аналогичными данным, полученным с ис­пользованием молекулярно-биологических методов исследования.

Необходимо отметить, что значимость си­стемы микробиологической идентификации зави­сит от вида исследуемого МО. Наибольшая слож­ность возникает при проведении внутривидовой межштаммовой дифференциации. Высокая степень вариабельности ЖК-состава либо высокая гомоло­гия спектров ЖК изолятов одного вида не всегда позволяют провести внутривидовую дифференциа­цию [16][17]. Поэтому в настоящее время для иден­тификации МО, помимо ЖК, в качестве биомарке­ров используют сахара, аминокислоты, нуклеозиды, органические кислоты и некоторые вторичные метаболиты. Также следует учитывать тот факт, что на фенотипическую экспрессию ЖК в клеточных стенках бактерий или клеточных мембранах влияет целый ряд факторов, включая состав среды, тем­пературу культивирования и фазу роста. В связи с этим требуется строгая стандартизация протокола исследования.

В России на основе ГХ/МС также была раз­работана и внедрена в практику комплексная авто­матизированная хемотаксономическая система для обнаружения патогенных бактерий, возбудителей острых кишечных инфекций в продуктах питания по профилю ЖК [18]. Подобно работе с использова­нием системы микробиологической идентификации «Sherlock», не исключен этап выделения чистых культур с помощью селективных питательных сред. Авторами была создана отечественная база данных по ЖК для более чем 200 микробов, принадлежа­щих к 12 родам (Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Citrobacter, Campylobacter, Escheri­chia, Listeria, Yersinia, Staphylococcus, Francisella). В настоящее время метод ГХ/МС с анализом спектра ЖК успешно используется для описания и характе­ристики патогенных бактерий III-IV групп [14].

В то же время сведений о применении данно­го подхода для идентификации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний мало. В част­ности, в отношении возбудителя холеры в доступ­ной литературе обнаружена работа американских авторов [19], в которой была предпринята попытка провести межвидовую дифференциацию предста­вителей семейства Vibrionaceae по наличию или отсутствию гидрокси-, разветвленных, циклопропановых и ненасыщенных ЖК. В эксперимент были взяты 16 представителей семейства, которые в про­цессе анализа были разделены на 12 групп. Низкая специфичность метода могла быть обусловлена не­достаточно полной на тот момент базой данных мо­лекулярных маркеров МО. В настоящее время такая база данных включает информацию по ЖК, спиртам, стеролам и другим биологически активным соедине­ниям МО (более 200 позиций), что является доста­точным для определения таксономической принад­лежности МО на уровне рода, а иногда и вида.

Т.Е. Кузьменко с соавт. [20] исследовали со­став ЖК свободных липидов у 3 штаммов Vibrio cholerae O1: 1 штамма El Tor и 2 штаммов клас­сического биовара. Следует отметить, что немно­гочисленные работы по попытке изучения состава ЖК у холерных вибрионов проводились на разном оборудовании с применением различных методи­ческих приемов выделения и идентификации без стандартизации условий культивирования МО, что не позволяло адекватно интерпретировать получен­ные результаты.

В 1996 г. группой исследователей была про­ведена идентификация двух клинических изолятов F. tularensis от пациентов с пневмонией. При срав­нении спектров ЖК с применением базы данных MIDI была подтверждена их видовая принадлеж­ность и обнаружены межштаммовые различия. В данном исследовании показано, что дискриминиру­ющая способность метода ГХ/МС аналогична мето­ду полногеномного секвенирования [21].

T.J.J. Inglis и соавт. [22] показали возмож­ность дифференциации близкородственных штам­мов — Burkholderia pseudomallei и Burkholderia thailandensis. В результате проведенного исследова­ния показано, что в состав клеток штамма B. pseu­domallei, вызывающего мелиоидоз, входит 2-гидрокситетрадекановая кислота. Данная кислота от­сутствует в составе клеток непатогенного штамма B. thailandensis.

Разрешающая способность метода ГХ/МС для дифференциации представителей рода Yersinia по­казана в работе A. Leclercq и соавт. [16]. Анализ со­отношения ЖК (12:0/16:0 и 14:0/16:0) позволил раз­делить род Yersinia на 3 кластера: непатогенные иерсинии; патогенные изоляты Yersinia enterocolitica; Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia pestis. При ана­лизе 29 штаммов Y. pestis были выявлены основные ЖК: 12:0, 14:0, 3-OH-14:0, 16:0, 16:1ω9-цис, 17:0- цис и 18:11ω9-транс. Авторы отметили, что состав ЖК штаммов Y. pestis был достаточно однороден и не зависел от биотипа, риботипа и эпидемиологиче­ских характеристик.

В 2000 г. группа исследователей применила метод ГХ/МС для сравнения ЖК-спектров споро­вых и вегетативных клеток аэробных бацилл, об­разующих эндоспоры (роды Bacillus, Paenibacillus и Brevibacillus). В ходе исследования была проде­монстрирована высокая воспроизводимость метода ГХ/МС. Показано, что как в споровых, так и в ве­гетативных формах преобладают разветвленные на­сыщенные ЖК. При этом содержание насыщенных ЖК в споровых формах значительно выше, чем в вегетативных. По мнению авторов, анализ спектра ЖК может быть дополнительным инструментом при проведении хемотаксономического анализа аэ­робных бацилл [23]. Метод ГХ/МС был успешно ис­пользован для исследования неизвестных порошков на предмет наличия спор сибирской язвы [24].

Кроме исследования ЖК-состава мембран, метод ГХ/МС широко используется для характе­ристики липополисахарида (ЛПС). Установлено, что, имея общую структуру ЛПС, липид А у раз­ных представителей грамотрицательных бактерий отличается по головным заместителям, количеству и составу ЖК. В зависимости от вида МО состав липида А может варьировать от 4 ЖК (Francisella tularensis, Helicobacter pylori, Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T), образуя тетраацилированные формы липида А, до 7 ЖК — гептаацилированные варианты липида А (Erwinia carotovora и Acinetobacter radioresistens S13). Большинство гексаацилированных молекул липида А имеют асимметричное распределение ЖК между глюкозаминами дисахарида липида А. Симметричное (2 + 2) распределение ЖК обнаружено в липиде А из Coxiella burnetii и некоторых гексаацилированных (3 + 3) структурах. В составе эндотоксинов из морских бактерий Pseudoalteromonas haloplanktis TAC 125 и Alteromonas addita KMM 3600T идентифицированы пентаацилированные структуры липида А [25][26][27].

N. Phillips с соавт. [28] провели исследова­ние модификаций липида А ЛПС возбудителя ту­ляремии. В работе были использованы 2 штамма: F. tularensis LVS (ATCC 29684) с ранее изученным жирнокислотным профилем липида А и F. tularensis 1547-57 (тип B). При использовании метода ГХ/МС показано, что штамм F. tularensis 1547-57 (тип B) имеет схожий с F. tularensis LVS ЖК-состав липида А, но дополнительно содержит в составе длинноце­почечные ЖК (С₂₀₀, С₂₂₀, С₂₄₀). В ходе дальнейшего исследования липида А было показано присутствие в нем галактозамина. По мнению авторов, данная модификация липида А может влиять на устойчи­вость бактерии к действию антимикробных пепти­дов. Применение метода ГХ/МС позволило выявить молекулярные маркеры природного и вакцинного штаммов туляремийного микроба.

В диагностических целях используется мультиионный метод ГХ/МС-анализа in situ, созданный отечественными исследователями, который позво­ляет проводить идентификацию возбудителя непо­средственно в биологическом материале (мокрота, гнойный экссудат, биоптаты тканей и др.), минуя стадию выделения чистой культуры. Данный метод предусматривает проведение идентификации по 150 микробным маркерам одновременно, что дела­ет анализ на основе ГХ/МС экспрессным методом диагностики [29].

Метод ГХ/МС может быть использован для реконструкции видового состава и структуры эко­логических сообществ МО [3], позволяя опреде­лять состав микробного сообщества не только ка­чественно, но и количественно [30], включая пато­генные МО в биотопах человека, а также следить за изменением состава микробиоценоза и отслеживать изменения метаболизма его участников [14][31][32]. Показана возможность применения газохромато­графического анализа для определения наличия в пробах клинического материала возбудителей анаэробных инфекций [3]. При таком инфекцион­ном процессе в пробах гноя, дренажной жидкости открытой раны накапливаются летучие ЖК С3-С6 (в том числе изомерные), тогда как при инфекции аэробного происхождения — уксусная кислота и нелетучие кислоты [3].

Изучение профиля ЖК позволяет получать данные о микробном сообществе некультивируемых МО при бактериологическом анализе.

Методы ГХ/МС могут быть успешно исполь­зованы в изучении адаптационных свойств МО. Спектр ЖК является фенотипической характери­стикой бактериальной клетки. Вариации его состава позволяют судить об изменениях условий культиви­рования МО. В настоящее время наиболее изучен регуляторный механизм адаптации бактерий к тем­пературному режиму окружающей среды [33][34].

Клеточные мембраны бактерий представля­ют собой сложные гетерогенные системы, физи­ко-химические свойства которых зависят от коли­чественного и качественного состава липидных компонентов. Наглядным примером могут служить изменения вязкости мембран, ассоциированных со спектром ЖК, у бактерий рода Yersinia. Установле­но, что повышение вязкости мембраны при сниже­нии температуры культивирования обусловлено из­менением физических свойств мембранных липи­дов, связанным со способностью МО модулировать спектр ЖК, входящих в состав фосфолипидов [33].

F. Chen и соавт. [35] изучили пути метаболизма двух штаммов возбудителя туляремии: F. tularensis subsp. holarctica (патогенный для человека) и F. tularensis subsp. novicida (непатогенный для чело­века). При изучении ГХ/МС-методом профиля изо­топологов аминокислот, полисахаридного деривата глюкозы, фруктозы, аминосахаров, ЖК, 3-гидроксибутирата, лактата, сукцината и малата показано, что штаммы в различной степени используют дан­ные субстраты. По мнению авторов исследования, различия в использовании субстратов могут быть связаны с вирулентностью штаммов и их персистенцией в организме хозяина и переносчика.

Одним из ключевых моментов при проведении ГХ/МС является анализ полученных данных. Под­ход основан на анализе времени выхода вещества и наличия нескольких значимых ионов. Данный метод анализа является наиболее точным и дает наилучшие результаты, однако сильно зависит от используемого оборудования — одно и то же вещество будет иметь разное время удержания при при­менении разных колонок. Это делает практически невозможным использование данных, полученных другими авторами, и требует создания баз данных именно на «своем» оборудовании. Помимо этого практически все базы данных содержат масс-спек­тры отдельных веществ, а не целых МО. Одной из возможных проблем использования зарубежного программного обеспечения и баз данных является зависимость от хаотичной санкционной политики зарубежных стран, что может привести к блокиро­ванию работы дорогостоящего импортного обору­дования. Все это делает актуальными работы по созданию отечественного программного обеспе­чения, баз данных масс-спектров веществ и базы профилей МО для их идентификации с помощью ГХ/МС.

Выводы

Таким образом, ГХ/МС-метод характеризуют:

• высокая чувствительность (1×10³–1×10⁴ кле­ток в пробе) и достоверность, возможность использования в клинической диагностике;
• способность выявлять возбудителей инфек­ций, находящихся в «спящем» состоянии (микроколонии окутаны защитной полисаха­ридной капсулой);
• универсальность методики в отношении раз­ных групп МО: бактерий, грибов, вирусов;
• экспрессность — полное время анализа со­ставляет 2 ч;
• селективность — возможность идентифика­ции МО до вида;
• использование любого биоматериала.

Метод лишен недостатков классических ме­тодов идентификации и дифференциации. Так, в отличие от бактериологических исследований ГХ/МС — экспрессный метод: отсутствуют стадии повторных пересевов и биохимических тестов, ко­торые особенно сложны, трудоемки и длительны. Нет необходимости в получении чистой культуры; возможна идентификация некультивируемых форм МО. В отличие от иммуносерологических исследо­ваний ГХ/МС — прямой метод: отсутствуют оши­бочные определения, связанные с индивидуальны­ми вариациями иммунного ответа; он также более чувствительный. В отличие от молекулярно-биоло­гических методов дается адекватная количествен­ная оценка; метод менее дорогой, для его реализа­ции используются доступные любым лабораториям химические реактивы и методики пробоподготовки.

Литература

Будьте здоровы!