Микробиологический синтез витамина В12

СИНТЕЗ ВИТАМИНА В12 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ PROPIONIBACTERIUM

---

Из всех витаминов, методом микробиологического синтеза производят в основном витамин В12 и его коферментную форму. Продуцентами в этом процессе служат пропионовокислые бактерии. Для получения кормовых концентратов, содержащих витамин В12, на отходах бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) применяют комплекс метанообразующих бактерий.

---

Физиология прокариот (бактерий) - центральное направление микробиологии, формирующее целостное представление о жизнедеятельности организма. Изучение физиолого-биохимических свойств практически значимых микроорганизмов актуально в плане решения общечеловеческой задачи - улучшения качества жизни. Пропионовокислые бактерии (ПКБ) имеют разнообразное практическое применение. Достаточно напомнить, что Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii - основная и незаменимая культура, используемая в мировом производстве «твёрдых» сыров, а в России - и в производстве витамина B12, однако области применения ПКБ этим не ограничены. Поэтому биология ПКБ находится под постоянным «прицелом» специалистов разных профилей. Регулярно проводится международный тематический симпозиум "Propionibacteria". В различных исследованиях значительное внимание уделено роли кобальта и кобаламина (истинного витамина В12) в биосинтезе корриноидов - соединений группы витамина В12. Также сегодня весьма актуально и изучение значения ионов кобальта и корриноидов для жизнедеятельности самих пропионовокислых бактерий...

Молекулярная структура кобаламинов (витамина В12)

Витамин B12 - первое органометаллическое соединение, выделенное из биологической системы. Из неполимерных органических соединений имеет наиболее сложное строение, изображенное на рисунке. Молекула состоит из двух почти планарных циклических структур и линейного участка. Металл Со⁺³ связан с макроциклом, сильно напоминающим порфириновое ядро гема. Это тетрапиррольная структура, но имеющая ту особенность, что вместо метановых мостиков, связывающих 4 пиррольных кольца, кольца А и D непосредственно связаны. Вторая кольцевая структура - азотистое основание - 5,6-диметилбензимидазол (5,6 ДМБ}. 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой системой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ Na-гликозидной связью.Структура витамина В₁₂ не только очень сложная, но содержит некоторые необычные части: 1) корриновая структура ранее не была известна в органической химии (до открытия витамина В₁₂ в 1948 г. независимо Риксом и Смитом); 2) Na-гликозидная связь встречается в природе очень редко и обнаружена лишь в нескольких соединениях, содержащих рибозо-3-фосфат; 3) 5,6 ДМБ тоже принадлежит к уникальным соединениям и встречается в природе только в составе кобаламинов.Атом кобальта имеет 6 координационных связей; 4 из них заняты пиррольными кольцами. Одна - N-3-5,6 ДМБ и последняя - верхним лигандом (у), природа которого может варьировать. В коммерческом витамине В12 (цианкобаламине) лиганд-CN-группа (артефакт процесса выделения). In vivo чаще всего встречаются дезоксиаденозильная группа (Co-B₁₂-I), метильная группа (метилкобаламии, СН₃-B₁₂-CoB-II) или оксогруппа (оксокобаламин). Кроме этих соединений, известных как кобаламины, есть другие корриноидные соединения с иным нуклеотид-аным основанием. Нижний лиганд (х) -5,6 ДМБ может быть заменен на аденин {псевдовитамин В₁₂), на гуанин (фактор С), 2-метиладенин (фактор А) и др. Они могут проявлять активность для некоторых микроорганизмов, но неактивны для людей. Из всех витамин В₁₂-подобных соединений только Со-В₁₂-I и Со-В₁₂-II (СН_з-В₁₂) активны на клеточном уровне и как кофакторы вовлекаются в катализ двух типов реакций. Аденозил B₁₂ используется в реакциях, в которых имеет место перестройка углерод-углеродных связей. Метил В₁₂ вовлекается в реакциях переноса метильных групп, например в синтезе метионина из гомоцистеина (Воробьева, 1982).

Продуценты витамина B12.

В природе витамин В₁₂ и родственные корриноидные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В₁₂ в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В₁₂ представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0—8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii M.- 82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. В семействе Propionibacteriaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витаминами В12 в клетках. Это, прежде всего, Eubacterium limosum (Batyribacterium retteerii). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин В₁₂ в значительных количествах синтезирует Nocardia rugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В₁₂. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. purpureae, M. echinospora, M. halophitica, M. fusca, M. chalceae.

Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечено ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена. Корриноиды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. У Clostridium tetanomorphum и Cl. Sticklandii аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образуют витамин В₁₂ ацетогенные клостридии Cl. thermoaceticum, Cl. formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО₂. Известны активные продуценты витамина B₁₂ у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans MB-2436 - мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Корриноиды синтезируют Rhodopseudomonas, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphericus , Rh. Capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Chromatium vinosum и ряд других видов. Наряду с витамином В₁₂ они образуют бескобальтовые корриноиды, роль которых для продуцентов не установлена. Значительные количества витамина В₁₂ образует цианобактерия Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus. Продуценты витамина B12 культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья.

Получение и применение витамина В12

Мировая продукция витамина В₁₂ составляет 9 - 11 тыс. кг в год; из них 6,5 тыс кг используют на медицинские цели, а остальное - для животноводства. Производство витамина В₁₂ основано главным образом на культивировании пропионовокислых бактерий (Великобритании, Венгрии), мезофильных и термофильных меганогенных бактерий (Венгрия), а также актиномицетов и родственных форм (Италия).

В СНГ в качестве продуцента витамина В₁₂ используют пропионовокислые бактерии P. shermanii. Для получения витамина B₁₂ бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, который непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч. в среду вносят предшественник - 5,6-ДМБ (5,6-диметилбензимидазол). Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В₁₂ (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин B₁₂ сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 - 5,0 при 85 - 90°С в течение 60 мин. с добавлением в качестве стабилизатора 0,25 % NaNO₂.

Водный раствор витамина В12 охлаждают, доводят рН до 6,8-7,0 50%-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Al₂(SO₄)₃* 18Н₂О и безводный FeCl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр - пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с Аl₂О₃, с окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают 24 - 48 ч. при 3 - 4°С. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Для предотвращения разложения В₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом.

Промышленность выпускает различные формы лечебных препаратов кобаламинов: ампулы со стерильным раствором CN – B₁₂, приготовленного на 0,9 % растворе NaCl, таблетки CN - В^₁₂ и в смеси с фолиевой кислотой, таблетки, (муковита), содержащие CN - B^₁₂ и мукопротеид. Лечебные препараты в ампулах: камполон, антианемин и гепавит содержат водный экстракт печени крупного рогатого скота. Перспективны исследования по мутагенезу пропионовокислых бактерий как один из способов повышения продуктивности штамма, а также проверки и внедрения в производственные условия других продуцентов, растущих на дешевом непищевом сырье.

---

Подборка информации по технологиям получения витамина В12 из Propionibacterium

Общая технология получения витамина В12 из пропионовокислых бактерий по сути везде одна и та же: наращивание микробной массы, концентрирование клеток, выделение целевого продукта (здесь → экстракция эндометаболита), его очистка и кристаллизация. Однако практические подходы к культивированию ПКБ, очистке витамина и т.п. могут отличаться. Приведем еще несколько примеров из литературы:

1) Описание получения витамина В12 из книги М.Е. Бекера "Введение в биотехнологию" - 1974 г. (перевод 1978 г)

Прим.: Для синтеза молекулы витамина В12 в питательной среде должен быть кобальт, а также 5,6-диметилбензимидазол, которые некоторые микроорганизмы синтезируют сами.

Для получения медицинского препарата витамина В12 широко используют P. freudenreichii или P. shermanii, их выращивают по методу глубинной ферментации, на среде, содержащей 1% гидролизата казеина, 1% пептона, 1,25% лактата натрия, 0,3% дрожжевого экстракта, соли кобальта и 5,6-диметилбензимидазол. В анаэробных условиях ферментация культуры Propionibacterium длится 72 часа при температуре 28-30 °C.

За это время в культуральной жидкости накапливается 3000 – 10000 мкг/л витамина В12 (см. рис.).

Рис.1. Образование биомассы культуры Propionibacterium shermanii: X –биомасса (г/л); P – витамин В12 (мг/л), t – продолжительность ферментации (ч)

Биосинтез витамина В12 может идти и при аэробных условиях, используя актиномицеты, например Actinomyces olivaceus. В этом случае среду готовят из кукурузного экстракта или барды спиртовой промышленности, rидроля, крахмала, глюкозы, сульфата аммония и солей кобальта. Образование активной формы витамина и в этом случае стимулируют добавки 5,6-диметилбензимидазола.

Для получения кристаллов витамина В12 культуральную жидкость центрифугируют и выделяют содержащую витамин клеточную массу. Затем ее гидролизуют и очищают полученный раствор витамина. Очистку витамина В12 из водных растворов можно провести, обрабатывая раствор:

1. бензиловым спиртом, добавляя к экстракту хлороформ и экстрагируя витамин водой;
2. гидроокисью цинка;
3. смесью крезола и тетрахлоруглерода (1 : 1);
4. хроматографически, пропуская через колонку с Аl₂O₃ и элюируя витамин 50% смесью вода-ацетон.

Очищенный раствор витамина кристаллизуют. Получают темно-фиолетовые кристаллы витамина В12 с 75-76%-ной степенью чистоты. Выход витамина составляет 67-70%.

Себестоимость витамина, полученного в процессе стерильной ферментации, сравнительно высока, поэтому для нужд животноводства его получают по более простому методу метанового брожения, используя в качестве сырья отходы пищевой промышленности.

2) Описание получения витамина В12 из курса лекций по технологии микробного синтеза (Минск : БГТУ, 2014)

Витамин В₁₂ для медицинских целей можно получать культивированием бактерий Propionibacterium shermanii периодическим методом при температуре 28…30°С в анаэробных условиях с соблюдением правил асептики на питательной среде, содержащей глюкозу (40 г/л), кукурузный экстракт (40 г/л), сульфат аммония (2 г/л) и хлорид кобальта (0,005 г/л); рН среды 6,8–7,0. Ферментация протекает в две фазы. В первой фазе продолжительностью 65–70 ч бактерии интенсивно размножаются с накоплением пропионовой и уксусной кислот, подлежащих нейтрализации, и предшественника витамина В₁₂ – фактора В (без нижнего лиганда). На долю фактора В приходится более 80% от всех синтезированных корриноидов (остальное – цианкобаламин (8–10%), псевдовитамин В₁₂ и фактор А).

Вторая фаза ферментации начинается с момента внесения в среду 5,6-ДМБ (5,6-диметилбензимидазол) в количестве 10–20 г/м³, в результате чего происходит трансформация неактивных аналогов в истинный витамин В₁₂. Продолжительность второй фазы 24 ч. К концу процесса культуральная жидкость содержит около 30 мг/л витамина В₁₂, накопленного в клетках бактерий.

Биомассу отделяют сепарацией и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5–5,0, при температуре 85…90°С в течение часа. После отделения остатка биомассы раствор охлаждают, доводят рН до 6,8–7,0 и осаждают белки коагуляцией в присутствии Al₂(SO₄)₃ или FeCl₃. Осадок отделяют фильтрованием, а раствор витамина очищают на ионообменной смоле СГ-1, с которой витамин В₁₂ элюируют водным раствором аммиака. Элюат упаривают и дополнительно очищают на колонке с окисью алюминия (очистка кобаламинов от аналогов). Элюируют витамин В₁₂ водным ацетоном и кристаллизуют из раствора при температуре 3…4°С в течение 24–48 ч. Кристаллы промывают ацетоном, затем диэтиловым эфиром и сушат под вакуумом.

3) Описание получения витамина В12 из учебно-методических пособий профильных ВУЗов

В настоящее время для получения витамина В₁₂ используют следующие микроорганизмы P. freudenreichii ATCC 6207, P. shermanii ATCC 13673, P. shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1 стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирования и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезируют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную мелассу (10 - 100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10 - 100 мг/л), источники азота. В среду добавляют кукурузный экстракт (30 - 70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии культивируют при 30°С, поддерживая рН на уровне 6,5-7,0 путем введения (NH₄)OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением N₂ и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м³/ч) и перемешивание. Возможны некоторые вариации в культивировании. Витамин В₁₂ сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:

1. выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;
2. выделение неочищенного продукта (80% чистоты), который можно использовать в животноводстве;
3. дальнейшую очистку до уровня 91-98% (для медицинских целей).

Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80°-120° в течение 10-30 мин при рН 6,1-8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутствии NaNO₂ или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, Аl₂О₃, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом, или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом. При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0 - 8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii М-82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода - 216 мг/л.

Дополнительную информацию о 2-стадийном процессе получение витамина В12 на основе пропионовокислых бактерий, способных к самостоятельному синтезу аденозилкобаламина 5,6 ДМБ (коэнзима В12), где в качетсве источника азота применялся (NH4)2SO4 (сульфат аммония) см. по ссылке→

Технология получения витамина В12

Витамин В12 получают путем микробиологического синтеза из Propionobacterium, а также Pseudomonas и смешанных структурных бактерий. Основной метод включает использование Propionobacterium. Процесс ведут в реакторе объемом 1 м³ при коэффициенте заполнения 0,65-0,7. Технология получения В12 включает две стадии:

1) перемешивание в реакторе в течение 80-88 ч в анаэробных условиях до полной утилизации сахара, после чего полученную массу центрифугируют;

2) процесс обработки суспензии во втором аппарате, уже при доступе воздуха; расход воздуха составляет 2м³/ч (рис. 6.10). Для питательной среды используют глюкозу, до 10% солей железа, марганца, магния и кобальта (кон­центрация соли колеблется от 10 до 100 мг/л), сульфат аммония. 

Выход кристаллического витамина В12 составляет 40 мг/л.

---

Стратегии биопроцессов для производства витамина B12 методом микробной ферментации и их применение на рынке

Прим. ред.: Как известно, цианокобаламин получают в промышленных масштабах путем бактериальной ферментации. В результате ферментации различных микроорганизмов образуется смесь метилкобаламина, гидроксокобаламина и аденозилкобаламина. Эти соединения превращаются в цианокобаламин при добавлении цианида калия в присутствии нитрита натрия и нагревании. Поскольку многочисленные виды Propionibacterium не вырабатывают экзотоксинов и эндотоксинов и получили статусы GRAS и QPS, они являются предпочтительными бактериальными продуцентами витамина B12.

---

Аннотация

Витамин B12 - широко используемое соединение в кормовой и пищевой промышленности, здравоохранении и медицине, которое может быть получено только путем ферментации из-за сложности его химического синтеза. По этой причине поиск лучших штаммов-продуцентов и оптимизация биопроцессов были в центре внимания промышленных производителей в течение последних нескольких десятилетий. В данном обзоре мы приводим исторический обзор исследований витамина B12 и основные биосинтетические характеристики двух семейств микроорганизмов, обычно используемых для его промышленного производства: нескольких штаммов Propionibacterium freudenreichii и штаммов, относящихся к Pseudomonas denitrificans. Далее приводится полный обзор современного состояния промышленного производства витамина B12, а также основных достижений и проблем, связанных с его совершенствованием, с особым акцентом на оптимизацию биопроцесса, направленную не только на увеличение производства, но и на его устойчивость. Кроме того, приводится полный список наиболее важных и значимых патентов для современных промышленных штаммов. Наконец, обсуждаются потенциальные возможности применения витамина B12 на различных рынках.

1. Исторический обзор

Витамин B12, также известный как кобаламин, является водорастворимой молекулой, необходимой для метаболизма многих организмов. Он имеет сложную структуру и сложный биосинтез, включающий более 30 этапов биотрансформации [1]. Этот биосинтетический путь присутствует только в некоторых бактериях и археях (млекопитающие, в т.ч. и человек, не способны синтезировать витамин B12).

Исследования витамина B12 начались в 1920-х годах в связи с заболеванием, впервые описанным в 1824 году, - пернициозной анемией. Основными симптомами этого заболевания были усталость, потеря веса, головные боли, а в тяжелых случаях - слабоумие, потеря памяти, мышечная слабость и периферическая нейропатия, которые без лечения могут привести к летальному исходу. В 1926 году Минот и Мерфи (Minot and Murphy) продемонстрировали, что пациенты с пернициозной анемией могут успешно излечиться от этого заболевания с помощью специальной диеты с большим количеством слегка прожаренного мяса печени и мышц [2]. Они предположили, что лечение было успешным благодаря неизвестному "внешнему фактору", присутствующему в печени животных. За это открытие они были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1934 году, хотя прошло более двух десятилетий, прежде чем так называемый "внешний фактор" был идентифицирован и выделен. Это произошло в 1948 году, когда две исследовательские группы из фармацевтических компаний (Folkers at Merck, Sharp & Dohme, and Smith at Glaxo) почти одновременно выделили из печени животных соединение кобальта, способное самостоятельно излечивать пернициозную анемию [3,4]. Год спустя это же соединение удалось выделить и из других источников, таких как молоко, говядина и несколько бактериальных культур. Это красное кристаллическое октаэдрическое соединение кобальта было названо витамином B12. Интересно, что спустя годы было обнаружено, что это соединение на самом деле является одной из многочисленных изоформ семейства кобаламинов (Cbl) - цианокобаламином (CNCbl), искусственной физиологически неактивной формой кобаламина, полученной в ходе промышленного процесса извлечения и выделения из печени. Кроме того, CNCbl был первой изоформой кобаламина, структура которой была раскрыта в 1955 году Дороти Мэри Кро́уфут-Хо́джкин [5].

В 1957 году той же группой была определена структура аденозилкобаламина (AdoCbl), одной из двух активных форм кобаламина [5]. Эти открытия привели к тому, что в 1960 году Ходжкин была удостоена Нобелевской премии по химии. Два года спустя была открыта еще одна физиологически активная изоформа витамина B12 - метилкобаламин (MetCbl). Было обнаружено, что и AdoCbl, и MetCbl выступают в качестве кофакторов в ряде ферментов, и в последующие годы было выделено и описано множество MetCbl- и AdoCbl-зависимых ферментов. Некоторые из них, такие как метионин-синтаза из Escherichia coli и L-метилмалонил-КоА-мутаза из Propionibacterium shermanii, были кристаллизованы [6,7], как и большинство молекул, отвечающих за транспорт витамина B12 у млекопитающих [8,9,10,11,12,13,14,15].

В 1973 году Вудворд (Woodward) и его коллеги описали полный химический синтез витамина B12 после длительного исследования, которое продолжалось более десяти лет [16]. Процесс был сложным, состоял из более чем 60 стадий, включая реакции защиты и депротекции, и давал очень низкий выход - менее 1% [16,17].

2. Структура производных кобаламина и их функции в качестве кофакторов ферментов

Витамин B12 - это общее название семейства соединений (кобаламинов или Cbl), имеющих одну и ту же общую структуру: тетрапиррольное корриновое кольцо с центральным атомом кобальта, связанным с четырьмя атомами азота. Этот каркас похож на другие простетические группы, такие как гем в гемоглобине или цитохром P450. Такая структура позволяет использовать окислительно-восстановительное состояние центрального атома металла, кобальта, что позволяет молекуле выполнять различные функции.

Как показано на рисунке 1, корриновое кольцо образовано четырьмя пиррольными единицами (C₄H₅N), соединенными с противоположных сторон метиленовой связью C-CH₃, связью C-H с одной стороны и двумя пиррольными единицами, соединенными напрямую, без метинового мостика между субъединицами A и D, присутствующего в других известных порфиринах, таких как гемоглобин. Эта структура отличается от структуры других подобных молекул количеством и типом боковых цепей, степенью окисления и центральным атомом металла.

Рисунок 1. Схематическое изображение структуры, общей для всех изоформ кобаламина. Также показаны основные группы, которые обычно выступают в качестве верхнего лиганда. 5,6-DMBI: 5,6-диметилбензимидазол.

Помимо четырех атомов N пиррольных единиц, центральный ион Co связан с двумя другими лигандами. Нижний лиганд представляет собой основание 5,6-диметилбензимидазола (DMBI), связанное с центральным ионом Co через атом N7 в α-осевой конформации. DMBI также связан с одной из боковых цепей центральной корриновой структуры: его фосфатная группа присоединяется к аминопропанольной группе, которая связана с боковой цепью пропионовой кислоты пиррольного блока D корринового кольца.

Наконец, шестой лиганд связан с Co в β-осевом положении. Природа этой химической группы может быть различной, она выполняет различные физиологические и каталитические функции. Например, 5-деоксиаденозильная группа в этом положении образует аденозилкобаламин (AdoCbl), а метильная группа - изоформу метилкобаламина (MetCbl). Фактически, связь C-Co в AdoCbl была первой связью такого типа, описанной в биологической молекуле [18]. Хотя именно эти две изоформы проявляют физиологическую активность в качестве кофакторов у человека, существуют и другие формы, такие как гидроксокобаламин (OHCbl) или цианокобаламин (CNCbl), а также менее распространенные верхние лиганды, такие как нитритокобаламин (NitCbl), сульфитокобаламин (SulCbl) или глутатионилкобаламин (GlutCbl) [19].

С одной стороны, MetCbl является кофактором нескольких метилтрансфераз, таких как метионин-синтаза у человека, важный клеточный фермент, функционирующий в двух основных метаболических путях: тетрагидрофолат-зависимый одноуглеродный цикл и конечный этап превращения метионина из гомоцистеина. С другой стороны, AdoCbl используется в качестве кофактора несколькими ферментами, в основном мутазами, хотя у млекопитающих обнаружен только один AdoCbl-зависимый фермент: L-метилмалонил-КоА-мутаза (MMCM), критический фермент для катаболизма пропионата и деградации нечетных цепей жирных кислот, нескольких аминокислот (валина, изолейцина, метионина, треонина) и холестерина.

Как уже говорилось ранее, AdoCbl и MetCbl являются активными изоформами кобаламина, однако известно, что они также чувствительны к свету [20,21]. По этой причине наиболее распространенной коммерческой формой витамина B12 является CNCbl, который более стабилен и легко преобразуется в организме в активную коферментную форму [22].

3. Биосинтез витамина B12: аэробный и анаэробный пути

Открытие структуры и биологических функций различных соединений витамина В12 в 1970-х годах привлекло внимание многих исследователей к путям биосинтеза организмов, продуцирующих Cbl. Структурная сложность, как было установлено позже, была обусловлена большим и запутанным биосинтезом, в котором участвуют более тридцати генов и множество ферментативных стадий для синтеза молекулы “de novo”. Считается, что этот путь является исключительным для некоторых бактерий и архей, поскольку нет генетических свидетельств того, что какой-либо эукариотический организм способен продуцировать какую-либо изоформу Cbl [1,23].

Хотя некоторые промежуточные продукты были обнаружены и выделены ранее [24], полный путь биосинтеза был описан у Pseudomonas denitrificans только в 1990-х годах [25]. Гены, участвующие в синтезе Cbl, получили приставку cob и букву, обозначающую каждое положение гена в опероне. В последующие годы ферменты cob и промежуточные продукты кобаламина из P. denitrificans были охарактеризованы и выделены французской компанией Rhône-Poulenc Santé, ныне Sanofi [26].

Позже гены, участвующие в биосинтезе Cbl, были охарактеризованы и в других организмах, таких как Bacillus megaterium, Salmonella enterica и ранее изученная Propionibacterium freudenreichii. С самого начала было ясно, что путь, найденный в этих организмах, похож на тот, что обнаружен у P. denitrificans, но генетически отличается от него. Ключевые отличия заключались в отсутствии монооксигеназы и другой кобальтохелатазы. Учитывая это, были установлены два различных пути биосинтеза Cbl: (I) аэробный или поздний путь введения кобальта, осуществляемый P. denitrificans [27] и, как выяснилось позже, другими микроорганизмами, такими как Ensifer casida и Sinorhizobium meliloti; и (II) анаэробный или ранний путь введения кобальта, осуществляемый в основном P. freudenreichii, B. megaterium и S. enterica [28].

Независимо от пути биосинтеза, синтез тетрапирролов начинается с синтеза 5-аминолаулиновой кислоты (ALA). После этого превращение ALA в тетрапиррольную макроциклическую структуру происходит в результате трех различных ферментативных реакций. Сначала ALA-дегидратаза (EC 4.2.1.24), Zn²⁺ и Mg²⁺-зависимый фермент, катализирует реакцию конденсации между двумя молекулами ALA с образованием порфобилиногена (PBG) [29]. Затем PBG-деаминаза (EC 4.3.1.8) полимеризует четыре молекулы PBG в линейный тетрапиррол. Наконец, синтаза уропорфириногена III (EC 4.2.1.75) способна инвертировать последнюю пиррольную единицу и соединить ее с первой пиррольной единицей линейного тетрапиррола, образуя уропорфириноген III, несимметричный гексагидропорфириновый изомер [30]. Эта молекула является последним промежуточным звеном, общим с другими простетическими группами, такими как группы гема и хлорофилла [31].

Превращение уропорфириногена III в прекоррин-2, первую молекулу на рисунке 2, катализируется метилтрансферазой уропорфириногена III (EC 2.1.1.107), для которой в качестве донора метила требуется S-аденозил-L-метион (SAM). Более конкретно, фермент метилирует С-2 уропорфириногена III, образуя прекоррин I, и после фототрофной таутомеризации тот же фермент способен метилировать С-7, получая прекоррин-2, который является последним общим промежуточным продуктом для кофермента сирогема, Р450 и витамина В12 [31,32].

Рисунок 2. Краткое описание анаэробного и аэробного биосинтеза аденозилкобаламина. Гены, кодирующие белки аэробного и анаэробного путей, показаны синим и красным цветом, соответственно, за исключением белка α, кодирующий ген которого неизвестен.

Основные различия между аэробным и анаэробным путями заключаются в сокращении кольца и хелатировании кобальта (см. рис. 2). С одной стороны, для сокращения кольца в аэробном процессе требуется молекула кислорода плюс монооксигеназа (CobG) для образования прекоррина-3B, промежуточного продукта гидроксилированного γ-лактона, который подвергается скрытой пинаколовой перегруппировке во время сокращения кольца, вытесняя метилированную позицию С20. Затем кольцо полностью сокращается, и в процессе высвобождается молекула уксусной кислоты [28]. С другой стороны, сокращение кольца происходит на более поздней стадии анаэробного пути, когда кобальт уже введен в молекулу. Этот этап катализируется ферментом, кодируемым геном cbiH, при этом молекулярный кислород не требуется. После этого происходит SAM-зависимое метилирование C17, способствующее экструзии уже метилированной позиции C20 и формированию δ-лактонного кольца [28].

Хелатирование кобальта также сильно отличается в обоих путях. При аэробном пути происходит "позднее" присоединение атома кобальта после полного сжатия кольца. Это присоединение катализируется АТФ-зависимым мультиэнзимным комплексом (cobNST) в присутствии магния [28,33]. В анаэробном пути этот этап происходит в более ранней точке маршрута, когда хелатаза кобальта, кодируемая генами cbiX или cbiK, катализирует вставку кобальта, когда кольцо все еще находится в нерасщепленном состоянии [28].

Кроме того, независимо от пути биосинтеза корринового кольца, DMBI производится отдельно для последующего присоединения в α-осевой конформации. Синтез низших лигандов был описан недавно и также представляет собой два четко различающихся пути (аэробный и анаэробный), в зависимости от потребности в кислороде.

С одной стороны, аэробный биосинтез DMBI катализируется 5,6-диметилбензимидазол-синтазой BluB (EC 1.13.11.79), которая осуществляет фрагментацию и сокращение связанного флавин-мононуклеотидного кофактора и расщепление рибитилового хвоста с образованием DMBI и D-эритрозо-4-фосфата в присутствии молекулярного кислорода. Позже фосфорибозилтрансфераза CobU/T (EC 2.4.2.21) вводит DMBI через реакцию нуклеофильного замещения [34]. Этот путь был впервые описан для S. meliloti [35], а затем обнаружен у большинства Cbl-продуцирующих бактерий [36], включая двух наиболее важных промышленных продуцентов - P. freudenreichii [37] и P. denitrificans [38]. Этот факт подчеркивает неспособность P. freudenreichii полностью продуцировать Cbl анаэробным путем без какого-либо внешнего добавления DMBI.

С другой стороны, анаэробный биосинтез DMBI катализируется генными продуктами оперона bzaA-bzaB-cobT-bzaC-bzaD-bzaE, которые способствуют образованию DMBI с 5-гидроксибензимидазолом, 5-метоксибензимидазолом и 5-метокси-6-метилбензимидазолом в качестве промежуточных продуктов. Этот путь был описан у облигатных анаэробных бактерий Eubacterium limosum [39] и Acetobacterium woodii [34].

4. Микробное производство витамина B12: оптимизация биопроцесса для получения цианокобаламина

Спрос на кобаламин со стороны пищевой промышленности, производства напитков, диетических продуктов и нутрицевтиков резко возрос в последние годы в связи с повышением осведомленности населения о здоровье, а также ростом популярности альтернативных диет, таких как веганская и вегетарианская диеты. По этой причине за последние годы было предпринято множество усилий по оптимизации штаммов и процессов для производства цианокобаламина [1,40].

Помимо уже упомянутых форм кобаламина, AdoCbl, MetCbl и CNCbl, существует множество других кобамидов с различными нижнеаксиальными лигандами, которые выступают в качестве ключевых кофакторов для корриноид-зависимых ферментов, важных, например, для микробиоты кишечника [41,42]. Несмотря на их важность, в данном обзоре рассматривается только цианокобаламин - форма, которая может усваиваться и использоваться человеком и которая в настоящее время производится промышленно.

Исторически сложилось так, что для производства кобаламина в промышленных масштабах использовались штаммы с высокой природной продуктивностью, в основном различные штаммы P. freudenreichii и P. denitrificans, а также родственные штаммы, такие как Pseudomonas nitroreducens и E. casida [1,40].

В течение многих лет общей стратегией улучшения этих штаммов было использование методов случайного мутагенеза для повышения продуктивности витамина В12 или устойчивости к токсичным промежуточным продуктам, присутствующим в среде [43]. Тем не менее, сверхэкспрессия генов, участвующих в биосинтезе кобаламина [44], гетерологичная экспрессия чужеродных генов [45] и подавление некоторых генов [46] также привели к появлению более качественных штаммов-продуцентов. Кроме того, стоит отметить появление новых продуктивных штаммов с многообещающими результатами, таких как B. megaterium [47] и Acetobacter pasteurianus [48], а также гетерологичную экспрессию биосинтетического пути в других известных клеточных платформах, таких как E. coli, что подробно рассмотрено в исследовании Fang et al. за 2017 год [40]. Недавно Балабанова и соавт. подробно рассмотрели генетическую и биосинтетическую регуляцию, а также генетические инструменты, которые использовались для улучшения производства кобаламина на различных клеточных фабриках [36].

Напротив, существует множество примеров прогресса в микробном производстве витамина B12 путем оптимизации биопроцесса. В таблице 1 приведены наиболее значимые инновации, реализованные на уровне биопроцессов для увеличения производства Cbl, а также новые стратегии производства Cbl на новых платформах или средах. Исследования, направленные на увеличение производства путем генной инженерии известных штаммов, не представлены, поскольку целью данного раздела является предоставление обновленной информации об основных инновациях в области биопроцессов для биотехнологического производства кобаламина. Приведена краткая информация об условиях культивирования, характеристиках сред, объемах производства и продуктивности.

Таблица 1. Краткое описание зарегистрированных производств с использованием промышленных штаммов, продуцирующих кобаламин.

Микро-организм/штамм	Основные компоненты среды	Емкость для среды	Инновации	Объемное производ-ство	Объемная продуктив-ность (мг/л/ч)	Ref
B. megaterium  DSM 319	Террифициальная бульонная среда	Колба для встряхивания объемом 250 мл	Добавление прекурсоров и контроль pO2	0.21 мг/л/ c	0.006 мг/л/ч c	[47]
Lactobacillus reuteri ZJ03	Соевое молоко	Колба для встряхивания на 250 мл	Добавление различных источников углерода	0.204 мг/л/	0.003 мг/л/ч	[49]
P. freudenreichii subsp. shermanii NRRL-B-4327, 3523 и NRRL-B-3524	Бульон с лактатом натрия	Колба для встряхивания объемом 250 мл	Добавление аналога витамина B12	31 мг/л/	0.51 мг/л/	[50]
P. freudenreichii  CICC 10019	Глюкоза, CSL a	Резервуар-биореактор с мешалкой объемом 7 л	Биореактор с расширенным слоем (EBAB) с гидролизатами крахмала сельскохозяйственных культур	47.6 мг/л/	0.18 мг/л/ч	[51]
P. freudenreichii  CICC 10019	Глюкоза, CSL	Биореактор с мешалкой объемом 7 л	Биореактор EBAB	43.4 мг/л/	0.27 мг/л/ч	[52]
P. freudenreichii  CICC 10019	Глюкоза, CSL	Биореактор с мешалкой объемом 1,5 л	Биореактор EBAB и добавление DMBI	58.8 мг/л/	0.59 мг/л/ч	[53]
P. freudenreichii  CICC 10019	Глюкоза/ глицерин, CSL	Биореактор с мешалкой объемом 5 л	Биореактор EBAB, глицерин в качестве источника углерода и гидролизат стеблей сельскохозяйственных культур в качестве источника азота	43 мг/л/	0.36 мг/л/ч	[54]
P. freudenreichii  DF13	Пермеат молочной сыворотки с добавками	Биореактор с мешалкой объемом 1 л	Совместное культивирование с Lactobacillus plantarum SM39 для одновременного производства фолатов и Cbl	0.75 мг/л/	0.004 мг/л/ч	[55]
P. freudenreichii  DSM 20271//Lactobacillus brevis ATCC 14869	Тесто из пшеничных отрубей	n.d. b	Совместная ферментация в тесте из пшеничных отрубей для производства витамина B12 in situ	332 нг/г c	n.d. b	[56]
P. freudenreichii  IFO 12424//Ralstonia eutropha H16 (ATCC17699)	Полипептон, казеин, дрожжевой экстракт	Биореактор с резервуаром для пере-мешивания объемом 5 л	Система рециркуляции клеток и совместная культура с Ralstonia eutropha для уменьшения ингибирования пропионовой кислотой	8 мг/л/ c	0.14 мг/л/ч c	[57]
P. freudenreichii  PTCC 1674.	Триптон, дрожжевой экстракт, различные источники углерода	100 см3	Отработанное подсолнечное масло для жарки в качестве источника углерода для производства витамина B12	2.74 мг/л/	0.02 мг/л/ч	[58]
P. freudenreichii subsp. shermanii  ATCC 13673	Глюкоза, дрожжевой экстракт	2 л биореактор с мешалкой	Оптимизация объема закваски, контроля рН и концентрации субстрата	0.087 мг/л/	0.002 мг/л/ч	[59]
P. freudenreichii subsp. shermanii  CICC 10019	Глюкоза, CSL	Ферментер на 100 л	Добавление DMBI именно со стратегией контроля Ado-Cbl	39.15 мг/л/	0.32 мг/л/ч	[60]
P. freudenreichii subsp. shermanii	Глицерин, триптон, казеин, DMBI	Колба для встряхивания на 200 мл	Оптимизация среды с помощью экспериментальной схемы с использованием сырого глицерина в качестве основного источника углерода	4.01 мг/л/	0.024 мг/л/ч	[61]
P. freudenreichii subsp. shermanii	Среды на основе сыворотки	пробирки 20 мл	Добавление DMBI, никотинамида и рибофлавина	5.3 мг/л/	0.03 мг/л/ч	[62]
P. freudenreichii subsp. shermanii	Среды, похожие на пищевые (зерновые матрицы)	n.d.b	Добавление прекурсоров в различные зерноподобные матрицы	1.5 мг/кг	0.009 мг/кг/ч	[63]
P. freudenreichii subsp. shermanii  2067	Пропионовая среда на основе сыра/жидкая среда на основе сыворотки	Колба для встряхивания на 50 мл	Производство в пищевых условиях без добавления DMBI	0.124 мг/л/ c	0.0013 мг/л/ч	[64]
P. freudenreichii  CICC10019	Глюкоза, дрожжевой экстракт, CSL	Колбы на 100 мл	Оптимизация среды с помощью статистического анализа	8.32 мг/л/	0.068 мг/л/ч	[65]
P. freudenreichii  CICC10019	Глюкоза, CSL	Ферментер объемом 7 л	Мембранная сепарация с сопряженной периодической ферментацией	21.6 мг/л/	0.16 мг/л/ч	[66]
P. denitrificans	Мальтоза, пептон, бетаин	Колба для встряхивания на 250 мл	Добавление ротенона в качестве ингибитора дыхания для увеличения производства	54.7 мг/л/	0.57 мг/л/ч	[67]
P. denitrificans	Свекольная патока, сахароза, бетаин	Ферментер объемом 120 м3	Глюкозо-бетаиновое питание, стратегия контроля рН	214.13 мг/л/ c	1.27 мг/л/ч c	[68]
P. denitrificans	Глюкоза, CSL, бетаин	Ферментер 120 м3	Стратегия пошагового управления скоростью поглощения кислорода	188 мг/л/	1.12 мг/л/ч	[69]
P. denitrificans	Глюкоза, CSL, бетаин	Ферментер 50 л	Влияние удельной скорости потребления кислорода на морфологию клеток и производство	213.1 мг/л/	1.88 мг/л/ч	[70]
P. denitrificans	Мальтоза, пептон, бетаин	Колба для встряхивания 250 мл	Добавка бетаина	58.61 мг/л/	0.48 мг/л/ч	[71]
P. denitrificans	Мальтозный сироп, CSL, бетаин	120 м3 ферментер	Мальтозный сироп и CSL в качестве основных субстратов	198.27 мг/л/	1.10 мг/л/ч	[72]
P. denitrificans	Глюкоза, CSL, бетаин	120 м3 ферментер	Пошаговый контроль pO2	198.80 мг/л/	1.18 мг/л/ч	[73]

Указываются основные микроорганизмы, штаммы, соединения среды, масштабность, а также краткая информация об основных инновациях и объемных характеристиках производствах. Объем производства представлен в мг/л. Объемная продуктивность была рассчитана на основе данных из оригинальных публикаций. ^a CSL: кукурузный крутой щелок; ^b n.d.: не определено; ^c Значения были пересчитаны в мг/л или мг/л/ч на основе данных из оригинальной публикации.

---

В целом, можно отметить резкие различия в производстве кобаламина разными микроорганизмами-продуцентами. В этом смысле объем производства и продуктивность, полученные с помощью P. denitrificans, явно превосходят аналогичные показатели других продуцентов, в то время как продукция видом P. freudenreichii сильно варьирует между штаммами и условиями культивирования. В случае с последним наиболее эффективными представляются стратегии, основанные на снижении ингибирующего эффекта накапливающейся пропионовой кислоты.

4.1. Микробное производство в Pseudomonas denitrificans

Paracoccus denitrificans (паракоккус денитрификанс) - грамотрицательная бактерия, которая использует аэробный путь биосинтеза для производства витамина B12. Несмотря на то, что паракоккус не имеет общепризнанного безопасного статуса (GRAS), в настоящее время он является основным производителем витамина B12, используемым промышленными предприятиями, такими как Sanofi в Европе [74] или Huarong Pharmacy Corporation в Китае.

С одной стороны, штамм компании Sanofi был изначально был создан с помощью комбинации методов случайного мутагенеза и молекулярной биологии, и, хотя официальной информации о его объемном производстве нет, принимая во внимание другие аэробные штаммы, заманчиво предположить, что он может производить около 200-300 мг/л [72].  Оптимизированный штамм был получен из природного высокопродуктивного штамма, известного как MB-580, впервые описанного и запатентованного в 1962 году (US3018225A). В течение нескольких лет французская компания Rhône-Poulenc амплифицировала несколько генов cob, участвующих в биосинтезе витамина В12, пока не были созданы определенные высокопродуктивные штаммы - SBL27 и, в конечном счете, SC510 [26]. Компания Sanofi, бывшая Rhône-Poulenc, в настоящее время является основным европейским производителем витамина В12.

Однако доминирующие мировые производители витамина B12 на рынке находятся в Китае: North China Pharmaceutical Company, Henan Luyuan Pharmaceutical Company, Hebei Yuxing Bio-Engineering Company и китайская CSPC Huarong Pharmaceutical Company, общий объем производства которых в 2020 году составит около 31,41 тонны, а стоимость - 339,8 миллиона долларов США [75]. Происхождение штаммов, используемых в их промышленных производствах, точно не известно, но предполагается, что это аэробный штамм, что следует из различных публикаций исследовательских групп, связанных с Huarong Pharmaceutical Company [69,73,76], а последние патенты по оптимизации биопроцессов с P. denitrificans, представленные в Китае, утверждают объемное производство до 281 мг/л (см. таблицу 2).

Помимо генетических модификаций, повышение продуктивности витамина B12 в P. denitrificans также было достигнуто за счет оптимизации культуральной (питательной) среды и изменения условий биопроцессинга (биообработки). Например, было протестировано влияние микроэлементов в среде, pH, контроля растворенного кислорода и добавления нескольких добавок. В этом смысле добавление Zn²⁺, как сообщается, оказывает значительное положительное влияние на синтез ALA и PBG, двух основных предшественников кобаламина, а добавление Co²⁺ и DMBI, основания, которое включается в нуклеотидную петлю, положительно влияет на производство [77]. Оптимизация начальных количеств этих трех соединений с помощью экспериментальной схемы привела к увеличению производства кобаламина на 13 % [77].

Состав среды влияет на стабильность рН культур и оказывает значительное влияние на производство витаминов. Чтобы лучше контролировать рН, была разработана стратегия питания с глюкозой в качестве источника углерода и бетаином в качестве метилового донора, которая оказалась полезной для производства витаминов при использовании культур в биореакторе объемом 120 м³ [69,73,76]. Более того, хотя хорошо известно, что бетаин действует как донор метила для биосинтеза витамина B12 [78] и усиливает образование нескольких ключевых промежуточных продуктов, таких как ALA, глутамат, глицин и метионин [71], высокие концентрации бетаина могут также ингибировать рост клеток [71,76]. Поэтому в дальнейшем была разработана правильная стратегия подачи бетаина, чтобы сбалансировать негативное влияние на рост клеток и положительное влияние на производство кобаламина, и впоследствии она была успешно реализована в промышленных масштабах [76].

Скорость переноса кислорода (OTR) также была одним из основных предметов оптимизации биопроцесса для P. denitrificans. Более высокие значения OTR на начальных стадиях культивирования способствуют росту клеток, в то время как более низкие OTR на более поздних стадиях оказались критичными для повышения продуктивности [69]. Более поздние исследования показали, что увеличение продукции, наблюдаемое в условиях пониженной оксигенации, может быть связано с изменениями в морфологии клеток, стимулирующими переход от фазы роста клеток к состоянию элонгации, которое обеспечивает более высокую продукцию витамина B12 [70]. Принимая это во внимание, было разработано несколько многоступенчатых стратегий контроля растворенного кислорода, в которых аэрация и перемешивание постепенно снижались до тех пор, пока значения растворенного кислорода не опускались ниже 2%, что позволило повысить производство примерно на 17% [69,73]. Кроме того, добавление ингибиторов дыхательной цепи, таких как ротенон, также может увеличить производство витаминов, несмотря на пагубное воздействие на рост клеток [67].

Наконец, различные источники углерода и азота, такие как глюкоза, мальтозный сироп, свекловичная патока и кукурузный крутой щелок, были протестированы в качестве более дешевой альтернативы более дорогим рафинированным сахарозе и глюкозе. Некоторые из этих соединений могут негативно влиять на стабильность рН и, следовательно, на конечную продукцию витаминов [68]. Тем не менее, сочетание мальтозного сиропа, кукурузного крутого щелока и бетаина было представлено как успешная и более дешевая альтернатива традиционным средам [72].

4.2. Микробное производство В12 в Propionibacterium freudenreichii

Штаммы P. freudenreichii представляют собой грамположительные палочковидные бактерии, названные так из-за их способности синтезировать большое количество пропионовой кислоты по пути Вуда-Веркмана. В отличие от аэробных продуцентов витамина B12, P. freudenreichii обладает преимуществом статуса GRAS, предоставленного FDA, и статуса квалифицированной презумпции безопасности (QPS), предоставленного EFSA.

Некоторые подходы генной инженерии были опробованы на P. freudenreichii для получения более высоких количеств витамина B12. Например, сообщалось, что сверхэкспрессия некоторых основных генов, участвующих в синтезе кобаламина [44], и подход с перетасовкой генома [79] улучшили производство кобаламина. Однако основные промышленные штаммы обычно получали путем случайного мутагенеза с использованием различных мутагенных агентов, таких как ультрафиолетовый свет или химические соединения, для получения лучших продуцентов кобаламина. У P. freudenreichii эти высокопродуктивные штаммы обычно отличаются повышенной толерантностью и устойчивостью к пропионовой кислоте [43].

P. freudenreichii - факультативно-анаэробные штаммы, которые следуют анаэробному биосинтетическому маршруту для производства кобаламина. Несмотря на то, что они дают высокие урожаи кобаламина только в условиях очень низкого содержания кислорода, кислород необходим для синтеза DMBI и его присоединения к корриновому кольцу [80]. По этой причине с культурой обычно работают в два этапа: первый этап, на котором клетки культивируются в полностью анаэробных условиях, и второй этап, обычно после 72-96 ч культивирования [59,62,80], на котором с помощью перемешивания обеспечивается мягкая аэрация для создания микроаэрации, необходимой для синтеза DMBI и производства кобаламина [74].

Статус GRAS этих продуцентов витамина B12 позволил расширить сферу их применения на рынке за счет прямого использования в производстве пищевых продуктов. В этом смысле обогащение продуктов питания P. freudenreichii in situ было успешно протестировано на пищевых средах, таких как среда, имитирующей среду «пропионового» сыра или жидкая среда на основе молочной сыворотки [62,64], зерновые матрицы [63] и при обогащении темпе in situ [81]. Хотя конечная плотность клеток и заявленные уровни производства низки по сравнению с другими, традиционными средами, в контексте обогащения продуктов питания это позволяет увеличить содержание кобаламина, используя нетрадиционные источники, и достичь рекомендуемых ежедневных уровней потребления витамина B12, используя лишь небольшое количество ферментированных продуктов [64].

Как уже упоминалось, эти бактерии способны производить большое количество пропионовой кислоты, которая в конечном итоге становится токсичной и ограничивает рост клеток [52]. Поэтому было опробовано несколько стратегий оптимизации биопроцесса для снижения накопления пропионовой кислоты. В частности, методы удаления продуктов in situ (ISPR) показали многообещающие результаты при одновременном производстве пропионовой кислоты и витамина B12. Среди методов ISPR - использование адсорбционных биореакторов с расширенным слоем (EBAB) с использованием смол с высокой биосовместимостью, таких как ZGA330, которые, как сообщается, обеспечивают объемное производство витамина B12 на уровне от 40 мг/л до 60 мг/л [52].

В EBAB адсорбция происходит при расширении среды колонки (на расширенном носителе – ред.), что позволяет культуре проходить через хроматографическую колонку без засорения, а пропионовая кислота задерживается в смоле [54]. Различные условия культивирования [54], источники углерода и азота [51] и добавление добавок к среде, таких как DMBI [53], были протестированы для одновременного улучшения производства пропионовой кислоты и витамина B12. В системе EBAB комбинация глюкозы и глицерина [54] и гидросилаты стеблей кукурузы [51] оказались эффективными источниками углерода, при этом объемное производство CNCbl составило 43,2 мг/л и 47,6 мг/л, соответственно.

Другим интересным подходом к снижению концентрации пропионовой кислоты является совместное брожение P. freudenreichii с другими микроорганизмами, способными метаболизировать пропионовую кислоту. Например, совместное культивирование P. freudenreichii и Ralstonia eutropha показало увеличение выработки кобаламина с 6,73 мг/л почти до 19 мг/л [57]. Кроме того, совместная ферментация успешно применяется не только для снижения содержания пропионовой кислоты, но и для одновременного производства более чем одного продукта или для обогащения других клеточных культур. Одновременное получение фолиевой кислоты и витамина В12 было получено при совместном культивировании P. freudenreichii и Lactobacillus plantarum (в настоящее время называется Lactiplantibacillus plantarum [82]) [55], а недавно была запатентована совместная ферментация Basidiomycota и штамма P. freudenreichii для одновременного получения витамина D и В12 [83]. Примером обогащения пищевых продуктов может служить производство витамина В12 in situ в хлебном тесте на основе молочной сыворотки с одновременным культивированием P. freudenreichii и Lactobacillus brevis (в настоящее время называемые Levilactobacillus brevis [82]) для обеспечения микробиологической безопасности и стабильности [56].

Добавление предшественников кобаламина - еще одна распространенная стратегия повышения производительности. Добавление обычных прекурсоров и необходимых соединений, таких как ALA и Co²⁺, часто описывается как благоприятное для производства витаминов [1]. Хотя все штаммы P. freudenreichii способны самостоятельно синтезировать DMBI, уровень биосинтеза этого основания невысок. Более того, образование DMBI невозможно в строго анаэробных условиях, поскольку для его синтеза необходим кислород [37]. Если доступность DMBI ограничена, активная форма витамина B12 не образуется, и клетки начинают накапливать неполные формы, такие как кобинамид или псевдовитамин B12. Таким образом, добавление DMBI или даже предшественников DMBI, таких как рибофлавин или никотиамид, постоянно сообщается как положительный фактор в производстве кобаламина [1,40,53,60,62,64]. Кроме того, другие группы обнаружили, что добавление аналогов витамина B12 может уменьшить ингибирование обратной связи и увеличить выработку кобаламина [50].

Наконец, культуры P. freudenreichii также интересны в промышленных условиях благодаря их способности расти в широком диапазоне сложных источников углерода и азота и даже в отходах и отработанных средах, таких как меласса [84], сырой глицерин [61], отработанное подсолнечное масло для жарки [58], томатные выжимки [85], жидкий кислый белковый остаток сои [86] и отработанные среды овощных соков [87].

5. Стратегии переработки и постмодификации витамина B12

Получение витамина B12 - хорошо описанный процесс, который, насколько известно авторам, остается неизменным на протяжении последних десятилетий в промышленных масштабах (классическая схема биопроцесса приведена на рисунке 3). Вкратце, культуральный бульон подвергается нескольким этапам разделения и очистки (включая процессы экстракции, фильтрации и адсорбции), которые влияют на общую производительность и осуществимость процесса. Классическая последующая обработка начинается с концентрирования биомассы для значительного уменьшения ее объема, которое обычно выполняется с помощью центрифугирования. Тем не менее, в зависимости от биопроцесса, Cbl может находиться и во внеклеточном состоянии, поэтому очистка может начинаться с цельного бульона.

Рисунок 3. Классический биопроцесс получения высокочистого цианокобаламина. Основной поток CNCbl выделен красным цветом. Промежуточные емкости для хранения опущены для упрощения рисунка. P1 - P11 представляют собой процессы 1 - 11, соответственно. Биопроцесс представлен с использованием программы SuperPro Designer® V9 Academic Site Edition, Intelligen, Inc. (Scotch Plains, NJ, USA).

В любом случае все виды корриноидов экстрагируются путем нагревания при 80-120 °C и рН 6,5-8,5 в течение 10-30 мин. Цианирование может быть проведено в процессе экстракции или после первоначальной фильтрации и адсорбции [74,88]. В обоих случаях различные корриноиды превращаются в CNCbl при добавлении цианида калия или тиоцианата. Этот процесс обычно проводится в присутствии нитрита натрия и тепла [80].

В дальнейшем раствор CNCbl осветляют с помощью одного или нескольких процессов фильтрации (микрофильтрации и/или нанофильтрации) и адсорбции (смола XAD). Если полученный Cbl идет на корм животным, раствор витамина часто обрабатывают хлоридом цинка и осаждают органическими растворителями, например ацетоном, для получения конечного продукта [89]. Если требуется большая чистота, например, для использования в фармацевтике, для получения чистого конечного продукта часто требуются дополнительные стадии адсорбции с использованием различных смол (например, IRA, оксид алюминия). На рисунке 3 представлен классический биопроцесс для получения высокочистого CNCbl.

После очистки витамин B12 может подвергаться различным постмодификациям для использования в качестве пищевой добавки или перорального препарата с целью повышения его биодоступности. Защита этих соединений может быть особенно интересна в случае нефункционирующего внутреннего фактора, который приводит к очень низкой биодоступности Cbl [90,91]. В связи с этим было разработано несколько методов защиты пероральных добавок от специфических условий, возникающих в желудочно-кишечном тракте [92]. Среди них микрокапсулирование, которое уже широко используется в фармацевтической и косметической промышленности [93], позволило повысить стабильность витамина B12 с помощью пищевых эмульсий W1/O/W2 [94,95], липосом [96] или различных пищевых инкапсулирующих агентов, таких как хитозан, арабиновая камедь, альгинат натрия, каррагинан, мальтодекстрин, модифицированный крахмал, цианобактериальный внеклеточный полимер, ксантан и пектин [97,98]. Кроме того, Фидалео и соавторы недавно рассмотрели использование наноносителей как перспективную нанотехнологию, которая может позволить улучшить терапию витамином B12, снизить побочные эффекты и общие затраты, а также улучшить качество жизни пациентов [99].

6. Патенты и уровень техники

Исследования в области производства кобаламина активно патентовались с самого начала, были опубликованы тысячи патентов, хотя большинство из них уже не действуют. Из-за большого количества публикаций и того факта, что в настоящее время большинство производственных и промышленных достижений осуществляется в Китае, представить полный список всех действующих и используемых в настоящее время патентов сложно и не входит в рамки данного обзора. Вместо этого в таблице 2 представлен исторический обзор некоторых из наиболее важных и актуальных патентов для современных промышленных процессов. Мы указываем состояние каждого патента - просроченный, заброшенный или действующий - в дополнение к основным заявленным инновациям и, при наличии, данным об объемном производстве.

В 1962 году одним из первых патентов, относящихся к данной теме, после открытия внешнего фактора стал US3018225A [100], где было описано открытие природного штамма с высокой продуктивностью (P. denitrificans MB580). Этот штамм был широко изучен, и многие высокопродуктивные штаммы, такие как SC510, были получены с помощью методов генной инженерии, как описано в US20060019352A1 [101]. Фактически, исследователи, связанные с компанией Rhône-Poulenc, использовали MB580 и полученные из него штаммы для изучения генов, лежащих в основе аэробного биосинтеза Cbl, и представили полный аэробный биосинтетический путь в 1990 году [26]. В настоящее время точные аэробные штаммы, используемые для промышленного производства кобаламина, неизвестны, но считается, что они тесно связаны с SC510. Более поздние патенты, связанные с аэробными штаммами, охватывают все стадии разработки биопроцесса: (I) скрининг и идентификацию новых штаммов-продуцентов (CN111254173 A [102]), (II) оптимизацию среды и биопроцесса (CN108949866 A [103], CN110205350 A [104], CN109837320 A [105]), а также (III) последующую переработку (CN111808158 A [106]).

С другой стороны, большинство самых ранних патентов, связанных с анаэробами и P. freudenreichii, были посвящены оптимизации штаммов для производства CNCbl. В этом смысле одним из наиболее значимых ранних патентов является US4544633A [43], где описана генерация пропионово-устойчивого штамма-продуцента путем случайного мутагенеза. Помимо улучшения штаммов, более поздние патенты часто фокусировались на оптимизации биопроцессов и использовании биореакторов с расширенным слоем для одновременного производства CNCbl и других соединений, представляющих интерес, таких как пропионовая кислота (US6492141B1 [107]). Кроме того, запатентована возможность использования штаммов P. freudenreichii, продуцирующих Cbl, в качестве пробиотиков (US7427397B2 [108]). Интересно, что последние патенты, связанные с анаэробными штаммами, посвящены стратегиям совместного культивирования (US9938554 [109], US20200149084A1 [83]) или совместного производства (CN206828509U [110], IN201827044769 A [111]). В последнем патенте, IN201827044769 A [111], заявлена объемная продукция 76,13 мг/л, что является максимальной продукцией, зарегистрированной для штамма P. freudenreichii.

Наконец, существует ряд патентов на альтернативные штаммы-продуценты, такие как B. megaterium (US2576932A [112]), несколько штаммов Lactobacillus (WO2011154820A2 [113]), S. meliloti (CN104342390 A [114], CN110804598 A [115]) и даже E. coli (WO2019109975A1 [116]). Уровень продуктивности большинства этих микроорганизмов довольно низок по сравнению с традиционными производителями, и патенты часто направлены на идентификацию штаммов или их усовершенствование путем генной инженерии или гетерологичной экспрессии основных генов, участвующих в биосинтезе Cbl. Однако исключением является штамм S. meliloti (CGMCC 9638), у которого уровень производства витамина B12 находится в диапазоне 50-115 мг/л [115].

Таблица 2. Основные патенты, связанные с производством витамина В12.

Номер патентной заявки (ссылка)	Название	Микро-организм/ штамм	Инновация	Объемное произ-водство	год
Род Propionibacterium
US4544633A [43](Expired)	Способ получения витамина В12 методом ферментации и микроорганизм, продуцирующий витамин В12.	P. freudenreichii  (IFO 12424, IFO 12391, IFO 12426)	Создание штаммов, устойчивых к пропионовой кислоте (P. freudenreichii FERM-86 и FERM-87), для усиленного производства CNCbl	15 мг/л	1983
US6492141B1 [107] (Expired)	Процесс производства витамина B12	P. freudenreichii  CBS 929.97	Эффект O2 в производстве во время анаэробной фазы и стратегия "заполни и зачерпни" для увеличения производства	19 мг/л	1999
US6187761B1 [117] (Expired)	Производство и применение композиций, содержащих высокие концентрации активности витамина B12.	P. freudenreichii  subsp.  shermanii и  P. denitrificans	Метод получения витамина B12 и изготовление высоко-концентрированных композиций	10 мг/л	1999
US7427397B2 [108] (Expired)	Пробиотик  Propionibacterium	Propionibacterium jensenii 702	Propionibacterium jensenii как пробиотик	0.0012 мг/л	2004
EP2376644B1 [118] (Active)	Процесс приготовления ферментационного бульона	Lactobacillus plantarum DSM 22,118 и P. freudenreichii  DSM 22120	Оптимизация ферментационной среды и совместное культивирование для производства фолата и витамина B12	1.07 мг/л	2009
CN206828509U [110] (Active)	Устройство для получения пропионовой кислоты и совместного производства витамина В12 методом полунепрерывной ферментации.	P. freudenreichii	Одновременное производство пропионовой кислоты и витамина B12 в полунепрерывной ферментации с отделением пропионовой кислоты	20.12 мг/л	2017
US9938554 [109] (Active)	Совместное культивирование пропионибактерий и дрожжей.	P. freudenreichii  (ATCC 6207) и клетки дрожжей (DSM 28271)	Совместное культивирование Propionibacterium и пропионово-устойчивых дрожжей для снижения химической кислородной нагрузки (COD) отработанных сред	16 мг/л	2018
US20200149084A1 [83] (Active)	Метод последовательного совместного культивирования для производства пищевого продукта, богатого витаминами и белками.	Basidiomycota и P. freudenreichii	Совместное культивирование штаммов рода Basidiomycota и штаммов, продуцирующих витамин B12, для обогащения продуктов питания in situ	0.0014 мг/л 1	2020
IN201827044769 A [111] (Active)	Непрерывный процесс совместного производства витамина B12 и органических кислот.	P. freudenreichii  (ATCC 13673)	Совместное производство витамина B12 и органических кислот в непрерывной ферментации с использованием одного биореактора	76.13 мг/л	2020
WO21041759 A1 [119] (Active)	Модифицированные пропионибактерии и способы применения	P. freudenreichii  (P. UF 1)	Получение штамма, продуцирующего избыток витамина B12, путем введения мутации, снижающей активность рибосвитча cbiMcbl	n.d. 2	2021
Paracoccus denitrificans
US3018225A [100] (Expired)	Производство витамина B12	P. denitrificans  MB-580	Процесс производства витамина B12 с использованием высокопродуктивного штамма (P. denitrificans MB-580)	2.4 мг/л 1	1962
US20060019352A1 [101] (Abandoned)	Методы увеличения продукции кобаламинов с использованием экспрессии гена cob	P. denitrificans	Сверхэкспрессия нескольких генов, участвующих в биосинтезе Cob; получение нескольких штаммов-производителей, таких как SC-510	65 мг/л	1990
US6156545A [120] (Expired)	Метод биосинтеза, позволяющий получать кобаламины.	P. denitrificans  G2650	Усиленное производство Cob за счет гетерологичной сверхэкспрессии предшественников, таких как DMBI и O-фосфо-L-треонин	7.9 мг/л	1996
CN101538599A [121] (Active)	Способ повышения выхода денитрифицированного витамина В12 псевдомонад.	P. denitrificans J741	Повышение производительности Cob путем оптимизации добавления бетаина	177.49 мг/л	2008
CN102399845A [122] (Active)	Процесс управления процессом ферментации витамина B12 на основе концентрации CO2 в отходящих газах	P. denitrificans  MB-580	Усиленное производство витамина B12 благодаря стратегии управления углекислым газом во время ферментации	164.6 мг/л	2010
CN101748177 A [123] (Active)	Оптимизированный метод получения витамина B12 посредством ферментации P. denitrificans и синтетической среды	P. denitrificans	Разработка и оптимизация сред и условий биопроцесса для улучшения производства витамина B12	77 мг/л	2010
CN102021214 A [124] (Active)	Процесс контроля ферментационного производства витамина B12 на основе скорости потребления кислорода	P. denitrificans	Оптимизация производства витамина B12 с помощью стратегии контроля кислорода	171,4 мг/л	2011
CN102453740 A [125] (Active)	Культуральная среда для получения витамина B12 путем ферментации P. denitrificans и способ ее ферментации	P. denitrificans	Использование искусственной мелассы и оптимизация биопроцесса для более стабильного выхода ферментации	198 мг/л	2012
CN108949866 A [103] (Active)	Многоступенчатая система регулирования скорости вращения для улучшения ферментации P. denitrificans для производства витамина B12.	P. denitrificans	Выработка витамина В12 улучшена за счет оптимизации питательных сред и скорости перемешивания в биопроцессе	246 мг/л 1	2018
CN108913739 A [126] (Active)	Способ получения витамина В12 с использованием P. denitrificans, основанный на контроле значения pH	P. denitrificans	Улучшенная выработка витамина В12 за счет оптимизации биопроцесса с помощью контроля значения рН	248 мг/л	2018
CN110205350 A [104] (Active)	Способ повышения выхода витамина В12, основанный на регулировании показателя аммиачного азота.	P. denitrificans	Способ улучшения производства Cbl путем добавления дрожжевого экстракта, контролируемого по индексу содержания аммиачного азота	167 мг/л 1	2019
CN109837320 A [105] (Active)	Способ стимулирования P. denitrificans для выработки витамина B12	P. denitrificans	Оптимизация сред и условий культивирования для улучшения производства витамина B12	198 мг/л	2019
CN111808158 A [106] (Active)	Метод получения неочищенного продукта витамина B12	P. denitrificans	Усовершенствование процесса выделения AdoCbl	n.d. 2	2020
CN111254173 A [102] (Active)	Метод скрининга и скрининговая культуральная среда для бактериальных штаммов для высокого выхода витамина B12, полученного путем ферментации с P. denitrificans	Несколько высоко-продуктивных штаммов P. denitrificans	Скрининг штаммов P. denitrificans, продуцирующих большое количество витамина B12, и скрининг культурной среды для получения большого количества витамина B12	281 мг/л 1	2020
Другие микроорганизмы
US2650896A [127] (Expired)	Цианид-ионы в производстве витамина B12	Streptomyces griseus	Влияние цианид-ионов на производство B12	Биологи-ческая проба	1953
US2576932A [112] (expired)	Процесс ферментации для производства витамина B12.	B. megaterium  B-938	Получение витамина B12 с помощью B. megaterium на питательной среде с сахарозой	0.45 мг/л	1983
US20050227332A1 [128] (Expired)	Способ получения витамина В12 из метановых бактерий, метаболизирующих водород	Мезофильная метановая бактерия, полученная из сброженного ила	Культуру акклиматизируют в среде H2-CO и выращивают в биореакторе с иммобилизованным слоем.	25.2 мг/л	2005
US20060105432A1 [129] (Abandoned)	Способ получения витамина В12	B. megaterium  DSMZ509	Генетически модифицированный штамм B. megaterium	0.008 мг/л 1	2006
WO2011154820A2 [113] (Application granted)	Штаммы пробиотических бактерий, продуцирующие витамин B12	Lactobacillus reuteri (DSM 17938, DSM 16143,ATCC 55730)	Обогащение продуктов питания in situ для увеличения производства витамина B12 с помощью штаммов Lactobacillus reuteri	0.018 мг/л 1	2011
CN104342390 A [114] (Active)	Штамм Sinorhizobium meliloti, состав и применение штамма Sinorhizobium meliloti.	S. meliloti  (CGMCC 9638)	Штамм S. melitolli, способный производить витамин B12, и оптимизация биопроцесса для производства витамина B12	Не менее 50 мг/л	2015
WO2019109975A1 [116] (Active)	Рекомбинантный штамм Escherichia coli для синтеза витамина B12 de novo, способ его получения и его применение.	E. coli	Рекомбинантная кишечная палочка для синтеза витамина B12 de novo	89 мкг/г сухих клеток	2019
CN110804598 A [115] (Active)	Мутант и мутантный ген прокоррин-2C(20)-метилтрансферазы и его применение для получения витамина B12.	Sinorhizobium  (CGMCC 9638)	Получение штамма-перепроизводителя витамина B12 путем сверхэкспрессии гена прекоррин- 2C(20)-метил-трансферазы	115 мг/л	2020

¹ Значения были пересчитаны в мг/л с использованием данных, имеющихся в оригинальной публикации; ² n.d.: не определено.

---

7. Области применения витамина B12 и состояние рынка

Наиболее важным рынком для продуктов, содержащих B12, является кормовая и пищевая промышленность, где его эффективность и безопасность были всесторонне проверены [130], хотя он также широко используется в производстве добавок и фармацевтической промышленности.

В кормовой и пищевой промышленности CNCbl обычно добавляют в корма для птицы, свиней и телят в дозировке от 10 до 30 мг/т почти во всех странах Европы и США [74]. Он также используется в качестве добавки в некоторых пищевых продуктах, например, в зерновых, где его органолептические свойства и химические характеристики, такие как отсутствие запаха, отсутствие вкуса и растворимость в воде, являются преимуществом для обогащения некоторых продуктов. Однако его ярко-красный цвет может стать проблемой для добавления в другие продукты питания, например, в белый хлеб [88].

Что касается использования витамина B12 в индустрии добавок, то в последние годы он становится все более актуальным, особенно с ростом популярности вегетарианской и веганской диеты [131]. CNCbl является наиболее используемой формой в основном из-за его стабильности, цены, доказанной безопасности [22] и схожей эффективности по сравнению с другими формами [22,131]. Несмотря на сообщения о сушеных водорослях, содержащих значительное количество B12 [132], Cbl практически отсутствует в овощах [131], и основными диетическими источниками являются продукты, полученные из животных. Хотя B12 присутствует в молочных продуктах и яйцах (продуктах, подходящих для вегетарианской диеты), его количество довольно мало по сравнению с другими вариантами (примерно 0,4 мкг/100 г в молоке и 1,3 мкг/100 г в яйцах против 9,4 мкг/100 г в некоторых видах мяса, 8,9 мкг/100 г в рыбе и 52,4 мкг/100 г в моллюсках [132]). Этот факт, а также предполагаемая биодоступность только 50% всех Cbl, получаемых из пищевых источников [41], и потери, которые могут происходить при обработке продуктов (приготовление пищи, воздействие света, пастеризация и т.д.) [131], делают достижение рекомендуемой суточной нормы потребления в 2,4 мкг сложной задачей для тех, кто придерживается чисто вегетарианской диеты без добавок витамина B12 [131].

Дефицит витамина B12 также распространен в странах с низким или средним уровнем дохода, где в основном используется растительная диета и низкое потребление мяса [133]. Однако даже в странах с высоким уровнем дохода есть несколько групп населения, подверженных высокому риску дефицита B12. Особенно это касается пожилых людей: по данным NIH, в США и Великобритании от дефицита B12 страдают около 20 % людей старше 60 лет [134]. В случае пожилых людей дефицит в основном обусловлен снижением потребления и высокой распространенностью мальабсорбции, связанной с пищей, вызванной возрастной атрофией желудка и снижением уровня «внутреннего фактора» [41,135].

К группам повышенного риска также относятся беременные и кормящие женщины, дети и пациенты с аутоиммунными заболеваниями, вызывающими желудочные осложнения, такие как атрофический гастрит или снижение секреции желудочной кислоты [132]. Во всех этих случаях рекомендуется увеличить суточное потребление B12, в основном за счет добавок.

Хотя большинство добавок основано на CNCbl, в редких случаях изменений клеточного трафика и обработки белков, вызванных редкими генетическими заболеваниями [136], может потребоваться добавка других форм, таких как MetCbl или OHCbl. Кроме того, добавки CNCbl могут быть непригодны для курильщиков [137,138].

Наконец, следует также отметить, что часто предпочтительнее добавлять B12 отдельно, а не в составе мультивитаминных таблеток, поскольку присутствие витамина C и меди может привести к его разрушению и образованию неактивных побочных продуктов Cbl [131].

Помимо прямого приема, B12 также широко используется для обогащения различных пищевых продуктов. В этом случае CNCbl снова является предпочтительной формой из-за своей большей стабильности при обработке и приготовлении пищи [132]. Продукты, обогащенные B12, широко распространены в США и других странах, где, например, обогащенные B12 крупы и молоко обеспечивают значительную часть общей суточной потребности в Cbl [132]. Рассматривались и другие альтернативы, такие как обогащение муки [139]. В этом смысле некоторые из подходов к обогащению in situ, представленные в данном обзоре [56,63], могут стать интересными и ценными альтернативами в будущем.

Витамин B12 также широко используется в фармакологии, где, помимо CNCbl, производятся и распространяются и другие формы, такие как OHCbl, AdoCbl и MetCbl, благодаря их более высокой усвояемости и более устойчивому уровню в сыворотке крови [74]. Фармакологический B12 представлен в различных формах, таких как назальные спреи, пероральные и сублингвальные препараты и даже прямые инъекции для лечения пернициозной анемии, дефицита B12, отравления цианидами и снижения уровня гомоцистеина. Есть также несколько заявлений о его положительном эффекте у пациентов с болезнью Альцгеймера и в качестве стимулятора иммунной системы, хотя для их подтверждения необходимы дополнительные доказательства [74,140].

Учитывая все эти варианты использования и рынков сбыта, неудивительно, что общий объем производства и рынка витамина B12 в мире неуклонно растет, хотя точные данные о стоимости мирового рынка трудно получить из-за нехватки достоверной информации. Тем не менее, можно с уверенностью предположить, что за последние десятилетия общий объем производства значительно вырос. В 1989 году общий объем производства составлял около 3 тонн в год [74], а к 2005 году он уже вырос до 10 тонн и имел рыночную стоимость около 77 миллионов евро [88]. Как уже упоминалось, в 2020 году производство в Китае достигнет 31,41 тонны с рыночной стоимостью 339,48 млн долларов США [76], а по некоторым прогнозам, к 2027 году рынок витамина B12 достигнет общей стоимости 410 млн долларов США [141]. Постепенное увеличение численности пожилого населения, распространение альтернативных веганских и вегетарианских диет и дефицит продуктов животного происхождения являются факторами, объясняющими столь резкий рост рынка, а также причинами, по которым ожидается, что рынок B12 продолжит расти в будущем.

8. Заключительные замечания

Из опубликованных данных ясно, что промышленное производство витамина B12 с использованием штаммов Propionibacterium freudenreichii сопряжено с рядом проблем и недостатков, которые необходимо преодолеть, чтобы этот метод мог конкурировать с методами, использующими аэробные штаммы. Из всех рассмотренных примеров (табл. 1 и табл. 2) наибольшее объемное производство анаэробного штамма составило 76 мг/л (IN201827044769 A [111]), что явно уступает 250-280 мг/л, о которых сообщалось в различных исследованиях для аэробных штаммов (CN108949866 A [103], CN108913739 A [126], CN111254173 A [102]).

Однако необходимо учитывать особенности рынков, на которые ориентирован витамин B12, например, диетические добавки или обогащенные продукты питания и напитки. Многие конечные потребители витамина B12, помимо пациентов, страдающих пернициозной анемией или другими заболеваниями, являются веганами или вегетарианцами, а также людьми с высоким уровнем здоровья и экологической сознательности. В этом случае статус GRAS Propionibacterium freudenreichii и тот факт, что многие штаммы-производители являются микроорганизмами без ГМО, являются ценными активами, повышающими их рыночную привлекательность. Например, стратегии обогащения in situ могут стать экономически выгодным применением культур Propionibacterium freudenreichii в будущем. Эта возможность подкрепляется перспективными пробиотическими свойствами, описанными для некоторых штаммов Propionibacterium freudenreichii: модуляция микробиоты, иммуномодуляция и производство нескольких нутрицевтических соединений, таких как трегалоза, 1,4-дигидрокси-2-нафтойная кислота и короткоцепочечные жирные кислоты [142].

Кроме того, способность бактерии Propionibacterium freudenreichii синтезировать различные продукты, помимо витамина B12 (в основном пропионовую кислоту и небольшое количество трегалозы), также может повысить ее промышленную привлекательность. В настоящее время большая часть мирового производства пропионовой кислоты получается из сырой нефти в результате нефтехимических процессов, и было проведено множество исследований, направленных на поиск альтернативного процесса производства на биологической основе, который позволил бы маркировать этот продукт как "натуральный консервант" [143]. Таким образом, возможность создания биофабрики Propionibacterium freudenreichii с одновременным производством и извлечением как пропионовой кислоты, так и витамина B12, повысит промышленную и коммерческую целесообразность.

Помимо штаммов Pseudomonas denitrificans и Propionibacterium freudenreichii, широко изучались и другие возможные продуценты, такие как Sinorhizobium meliloti, различные штаммы Lactobacillus и даже E. coli (путем гетерологичной экспрессии биосинтетического пути). Пока что их продукция не является конкурентоспособной, что делает их неподходящей альтернативой для промышленного производства CNCbl. Тем не менее, будущие штаммы и стратегии могут обеспечить более совершенные процессы производства, что повысит их промышленную жизнеспособность, хотя их коммерческий успех может быть затруднен нормативными ограничениями и приемлемостью для потребителей.

Наконец, следует отметить, что в своем нынешнем состоянии производство CNCbl все еще неоптимально, и для дальнейшего развития его потенциала в качестве экономически эффективного и ценного промышленного биопроцесса необходимо преодолеть множество трудностей. Основное препятствие заключается в том, что даже у аэробных штаммов с высокой продуктивностью, таких как Pseudomonas denitrificans, объемные уровни производства часто составляют около 200-300 мг/л - гораздо меньше, чем при аналогичных процессах ферментации, например, для получения витамина B2. Кроме того, циклы ферментации являются длительными и дорогостоящими, в основном из-за необходимости использования дорогостоящих компонентов среды, таких как высокие концентрации комплексных источников азота и добавок, например, бетаина. Подача достаточного количества кобальта в бульон также может быть проблематичной с точки зрения затрат и экологии [144].

Для повышения экономической целесообразности и экологической устойчивости биотехнологического производства витамина В12 необходимо предпринять дальнейшие усилия в области биообработки, последующего производства и оптимизации состава питательных сред (с использованием более дешевых или переработанных компонентов). Однако главной проблемой по-прежнему остается низкая продуктивность имеющихся штаммов-продуцентов, обусловленная в основном жесткой генетической регуляцией производства Cbl: ингибированием оперонов cysG и cbi кобаламиновым рибосвитчем, а также другими процессами даунрегуляции [40,74,144]. Преодоление этого ограничения может потребовать генной инженерии, что может быть плохо воспринято конечными потребителями, в основном веганами и вегетарианцами, которые очень обеспокоены выбором своего рациона и использованием ГМО-организмов.

---

Дополнительно:

Примечание редактора: Технологии получения цианокобаламина совершенствуются до сих пор. Например, в 2023 г. была описана новая жизнеспособная стратегия для разработки будущих и устойчивых стратегий производства цианокобаламина (CNCbl) с использованием штаммов P. freudenreichii дикого типа без необходимости использования более сложных установок, таких как многофазные непрерывные биопроцессы или адсорбционные биореакторы с расширенным слоем для устранения пропионовой кислоты. Подробнее информация изложена в статье "Разработка стратегии одностадийного непрерывного технологического процесса для производства витамина B12 с помощью Propionibacterium freudenreichii" | См.: Álvaro Calvillo, et al. Developing a single-stage continuous process strategy for vitamin B12 production with Propionibacterium freudenreichii / Microb Cell Fact22, 26 (2023).

• Влияние солей кобальта на синтез витамина B12 пропионибактериями
• Влияние ультразвуковой обработки на синтез В12 пропионибактериями
• Биосинтез витаминов пропионибактериями + витамин В12→
• Биосинтез витамина B12 бактериями из рода Propionibacterium →
• Получение биомассы пропионибактерий и витамина В12 на отработанных средах
• Характеристика витамина В12 и основные продуценты при его получении (PDF)

Литература

1. Martens, H.; Barg, M.; Warren, D.; Jah, J.-H. Microbial Production of Vitamin B₁₂. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, 58, 275–285. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
2. Minot, G.R.; Murphy, W.P. Treatment of Pernicious Anemia by a Special Diet. J. Am. Med. Assoc. 1926, 87, 1666. [Google Scholar] [CrossRef]
3. Rickes, E.L.; Brink, N.G.; Koniuszy, F.R.; Wood, T.R.; Folkers, K. Crystalline Vitamin B₁₂. Science 1948, 107, 396–397. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
4. Smith, L. Purification of Anti-Pernicious Anemia Factors from Liver. Nature 1948, 161, 638–639. [Google Scholar] [CrossRef]
5. Hodgkin, D.C.; Kamper, J.; Lindsey, J.; Mackay, M.; Pickworth, J.; Robertson, J.H.; Shoemaker, C.B.; White, J.G. The Structure of Vitamin B₁₂. I. An Outline of the Crystallographic Investigation of Vitamin B₁₂. Proc. R. Soc. London Ser. A. Math. Phys. Sci. 1957, 242, 228–263. [Google Scholar] [CrossRef]
6. Dixon, M.M.; Huang, S.; Matthews, R.G.; Ludwig, M. The Structure of the C-Terminal Domain of Methionine Synthase: Presenting S-Adenosylmethionine for Reductive Methylation of B₁₂. Structure 1996, 4, 1263–1275. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
7. Mancia, F.; Keep, N.H.; Nakagawa, A.; Leadlay, P.F.; McSweeney, S.; Rasmussen, B.; Bösecke, P.; Diat, O.; Evans, P.R. How Coenzyme B₁₂ Radicals Are Generated: The Crystal Structure of Methylmalonyl-Coenzyme A Mutase at 2 Å Resolution. Structure 1996, 4, 339–350. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
8. Wuerges, J.; Garau, G.; Geremia, S.; Fedosov, S.N.; Petersen, T.E.; Randaccio, L. Structural Basis for Mammalian Vitamin B₁₂ Transport by Transcobalmin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 4386–4391. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
9. Mathews, F.S.; Gordon, M.M.; Chen, Z.; Rajashankar, K.R.; Ealick, S.E.; Alpers, D.H.; Sukumar, N. Crystal Structure of Human Intrinsic Factor: Cobalamin Complex at 2.6-Å Resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104, 17311–17316. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
10. Alam, A.; Woo, J.S.; Schmitz, J.; Prinz, B.; Root, K.; Chen, F.; Bloch, J.S.; Zenobi, R.; Locher, K.P. Structural Basis of Transcobalamin Recognition by Human CD320 Receptor. Nat. Commun. 2016, 7, 12100. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
11. Furger, E.; Frei, D.C.; Schibli, R.; Fischer, E.; Prota, A.E. Structural Basis for Universal Corrinoid Recognition by the Cobalamin Transport Protein Haptocorrin. J. Biol. Chem. 2013, 288, 25466–25476. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
12. Koutmos, M.; Gherasim, C.; Smith, J.L.; Banerjee, R. Structural Basis of Multifunctionality in a Vitamin B₁₂- Processing Enzyme. J. Biol. Chem. 2011, 286, 29780–29787. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
13. Yamada, K.; Gherasim, C.; Banerjee, R.; Koutmos, M. Structure of Human B₁₂ Trafficking Protein CblD Reveals Molecular Mimicry and Identifies a New Subfamily of Nitro-FMN Reductases. J. Biol. Chem. 2015, 290, 29155–29166. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
14. Xu, D.; Feng, Z.; Hou, W.T.; Jiang, Y.L.; Wang, L.; Sun, L.; Zhou, C.Z.; Chen, Y. Cryo-EM Structure of Human Lysosomal Cobalamin Exporter ABCD4. Cell Res. 2019, 29, 1039–1041. [Google Scholar] [CrossRef]
15. Schubert, H.L.; Hill, C.P. Structure of ATP-Bound Human ATP:Cobalamin Adenosyltransferase. Biochemistry 2006, 45, 15188–15196. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
16. Woodward, R. The Total Synthesis of Vitamin B₁₂. Pure Appl. Chem. 1973, 33, 145–177. [Google Scholar] [CrossRef]
17. Eschenmoser, A.; Wintner, C.E. Natural Product Synthesis and Vitamin B₁₂. Science 1977, 196, 1410–1420. [Google Scholar] [CrossRef]
18. Fink, R.G. Coenzyme B₁₂-Based Chemical Precedent for Co-C Bond Homolysis and Other Key Elementary Steps; Krautler, B., Arigoni, D., Golding, B.T., Eds.; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 1998. [Google Scholar]
19. Hannibal, L.; Axhemi, A.; Glushchenko, A.V.; Moreira, E.S.; Brasch, N.E.; Jacobsen, D.W. Accurate Assessment and Identification of Naturally Occurring Cellular Cobalamins Luciana. Clin. Chem. Lab. Med. 2008, 46, 1739–1746. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
20. Juzeniene, A.; Nizauskaite, Z. Photodegradation of Cobalamins in Aqueous Solutions and in Human Blood. J. Photochem. Photobiol. B Biol. 2013, 122, 7–14. [Google Scholar] [CrossRef]
21. Hogenkamp, H.P.C.; Vergamini, P.J.; Matwiyoff, N.A. The Effect of Temperature and Light on the Carbon43 Nuclear Magnetic Resonance Spectra of Alkylcorrinoids, Selectively Enriched with Carbon-13. J. Chem. SOC. (A) 1975, 23, 2628–2633. [Google Scholar] [CrossRef]
22. Obeid, R.; Fedosov, S.N.; Nexo, E. Cobalamin Coenzyme Forms Are Not Likely to Be Superior to Cyano- and Hydroxyl-Cobalamin in Prevention or Treatment of Cobalamin Deficiency. Mol. Nutr. Food Res. 2015, 59, 1364–1372. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
23. Roth, J.R.; Lawrence, J.G.; Bobik, T.A. Cobalamin (Coenzyme B₁₂): Synthesis and Biological Significance. Annu. Rev. Microbiol. 1996, 50, 137–181. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
24. Leeper, F.J. The Biosynthesis of Porphyrins, Chlorophylls, and Vitamin B₁₂. Nat. Prod. Rep. 1989, 6, 171–203. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
25. Thibaut, D.; Blanche, F.; Cameron, B.; Crouzet, J.; Debussche, L.; Remy, E.; Vuilhorgne, M. Vitamin B₁₂ Biosynthesis in Pseudomonas denitrificans. In Vitamin B₁₂, and B₁₂-Proteins; Kräutler, B., Arigoni, D., Golding, B.T., Eds.; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 1998; pp. 63–79. [Google Scholar]
26. Crouzet, J.; Cauchois, L.; Blanche, F.; Debussche, L.; Thibaut, D.; Rouyez, M.C.; Rigault, S.; Mayaux, J.F.; Cameron, B. Nucleotide Sequence of a Pseudomonas Dentrificans 5.4-Kilobase DNA Fragment Containing Five Cob Genes and Identification of Structural Genes Encoding S-Adenosyl-L-Methionine: Uroporphyrinogen III Methyltransferase and Cobyrinic Acid a,c-Diamide Synthase. J. Bacteriol. 1990, 172, 5968–5979. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
27. Stamford, N.P.J.; Duggan, S.; Li, Y.; Alanine, A.I.D.; Crouzet, J.; Battersby, A.R. Biosynthesis of Vitamin B₁₂: The Multi-Enzyme Synthesis of Precorrin-4 and Factor IV. Chem. Biol. 1997, 4, 445–451. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
28. Moore, S.J.; Warren, M.J. The Anaerobic Biosynthesis of Vitamin B₁₂. Biochem. Soc. Trans. 2012, 40, 581–586. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
29. Jaffe, E.K. The Porphobilinogen Synthase Family of Metalloenzymes. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2000, 56, 115–128. [Google Scholar] [CrossRef]
30. Jordan, P.M. The Biosynthesis of 5-Aminolaevulinic Acid and Its Transformation into Uroporphyrinogen III. In New Comprehensive Biochemistry; Krebs, J., Michalak, M., Eds.; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 1991; Volume 19, pp. 1–66. [Google Scholar]
31. Raux, E.; Schubert, H.L.; Warren, M.J. Biosynthesis of Cobalamin (Vitamin B₁₂): A Bacterial Conundrum. Cell. Mol. Life Sci. 2000, 57, 1880–1893. [Google Scholar] [CrossRef]
32. Warren, M.J.; Raux, E.; Schubert, H.L.; Escalante-Semerena, J.C. The Biosynthesis of Adenosylcobalamin (Vitamin B₁₂). Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 390–412. [Google Scholar] [CrossRef]
33. Debussche, L.; Couder, M.; Thibaut, D.; Cameron, B.; Crouzet, J.; Blanche, F. Assay, Purification, and Characterization of Cobaltochelatase, a Unique Complex Enzyme Catalyzing Cobalt Insertion in Hydrogenobyrinic Acid a,c- Diamide during Coenzyme B₁₂ Biosynthesis in Pseudomonas denitrificans. J. Bacteriol. 1992, 174, 7445–7451. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
34. Mathur, Y.; Sreyas, S.; Datar, P.M.; Sathian, M.B.; Hazra, A.B. CobT and BzaC Catalyze the Regiospecific Activation and Methylation of the 5-Hydroxybenzimidazole Lower Ligand in Anaerobic Cobamide Biosynthesis. J. Biol. Chem. 2020, 295, 10522–10534. [Google Scholar] [CrossRef]
35. Campbell, G.R.O.; Taga, M.E.; Mistry, K.; Lloret, J.; Anderson, P.J.; Roth, J.R.; Walker, G.C. Sinorhizobium Meliloti BluB Is Necessary for Production of 5,6-Dimethylbenzimidazole, the Lower Ligand of B₁₂. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 4634–4639. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
36. Balabanova, L.; Averianova, L.; Marchenok, M.; Son, O.; Tekutyeva, L. Microbial and Genetic Resources for Cobalamin (Vitamin B₁₂) Biosynthesis: From Ecosystems to Industrial Biotechnology. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 4522. [Google Scholar] [CrossRef]
37. Deptula, P.; Kylli, P.; Chamlagain, B.; Holm, L.; Kostiainen, R.; Piironen, V.; Savijoki, K.; Varmanen, P. BluB/CobT₂ Fusion Enzyme Activity Reveals Mechanisms Responsible for Production of Active Form of Vitamin B₁₂ by Propionibacterium freudenreichii. Microb. Cell Factories 2015, 14, 186. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
38. Nguyen-Vo, T.P.; Ainala, S.K.; Kim, J.R.; Park, S. Analysis, Characterization of Coenzyme B₁₂ Biosynthetic Gene Clusters and Improvement of B₁₂ Biosynthesis in Pseudomonas denitrificans ATCC 13867. FEMS Microbiol. Lett. 2018, 365, fny211. [Google Scholar] [CrossRef]
39. Hazra, A.B.; Han, A.W.; Mehta, A.P.; Mok, K.C.; Osadchiy, V.; Begley, T.P.; Taga, M.E. Anaerobic Biosynthesis of the Lower Ligand of Vitamin B₁₂. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 10792–10797. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
40. Fang, H.; Kang, J.; Zhang, D. Microbial Production of Vitamin B₁₂: A Review and Future Perspectives. Microb. Cell Fact. 2017, 16, 15. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
41. Sobczyńska-Malefora, A.; Delvin, E.; McCaddon, A.; Ahmadi, K.R.; Harrington, D.J. Vitamin B₁₂ Status in Health and Disease: A Critical Review. Diagnosis of Deficiency and Insufficiency–Clinical and Laboratory Pitfalls. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2021, 58, 399–429. [Google Scholar] [CrossRef]
42. Hardlei, T.F.; Obeid, R.; Herrmann, W.; Nexo, E. Cobalamin Analogues in Humans: A Study on Maternal and Cord Blood. PLoS ONE 2013, 8, e61194. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
43. Kojima, I. Process for Producing Vitamin B12 by the Fermentation Technique, and Vitamin B12-Producing Microorganism. U.S. Patent 4,544,633, 1 October 1985. [Google Scholar]
44. Piao, Y.; Yamashita, M.; Kawaraichi, N.; Asegawa, R.; Ono, H.; Murooka, Y. Production of Vitamin B₁₂ in Genetically Engineered Propionibacterium freudenreichii. J. Biosci. Bioeng. 2004, 98, 167–173. [Google Scholar] [CrossRef]
45. Piao, Y.; Kiatpapan, P.; Yamashita, M.; Murooka, Y. Effects of Expression of HemA and HemB Genes on Production of Porphyrin in Propionibacterium freudenreichii. Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70, 7561–7566. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
46. Biedendieck, R.; Malten, M.; Barg, H.; Bunk, B.; Martens, J.H.; Deery, E.; Leech, H.; Warren, M.J.; Jahn, D. Metabolic Engineering of Cobalamin (Vitamin B₁₂) Production in Bacillus Megaterium. Microb. Biotechnol. 2010, 3, 24–37. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
47. Mohammed, Y.; Lee, B.; Kang, Z.; Du, G. Development of a Two-Step Cultivation Strategy for the Production of Vitamin B₁₂ by Bacillus Megaterium. Microb. Cell Factories 2014, 13, 102. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
48. Bernhardt, C.; Zhu, X.; Schütz, D.; Fischer, M.; Bisping, B. Cobalamin Is Produced by Acetobacter Pasteurianus DSM 3509. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019, 103, 3875–3885. [Google Scholar] [CrossRef]
49. Gu, Q.; Zhang, C.; Song, D.; Li, P.; Zhu, X. Enhancing Vitamin B₁₂ Content in Soy-Yogurt by Lactobacillus Reuteri. Int. J. Food Microbiol. 2015, 206, 56–59. [Google Scholar] [CrossRef]
50. Thirupathaiah, Y.; Rani, C.S.; Reddy, M.S.; Venkateswar Rao, L. Effect of Chemical and Microbial Vitamin B₁₂ Analogues on Production of Vitamin B₁₂. World J. Microbiol. Biotechnol. 2012, 28, 2267–2271. [Google Scholar] [CrossRef]
51. Wang, P.; Shen, C.; Li, L.; Guo, J.; Cong, Q.; Lu, J. Simultaneous Production of Propionic Acid and Vitamin B₁₂ from Corn Stalk Hydrolysates by Propionibacterium freudenreichii in an Expanded Bed Adsorption Bioreactor. Prep. Biochem. Biotechnol. 2020, 50, 763–767. [Google Scholar] [CrossRef]
52. Wang, P.; Wang, Y.; Liu, Y.; Shi, H.; Su, Z. Novel in Situ Product Removal Technique for Simultaneous Production of Propionic Acid and Vitamin B₁₂ by Expanded Bed Adsorption Bioreactor. Bioresour. Technol. 2012, 104, 652–659. [Google Scholar] [CrossRef]
53. Wang, P.; Zhang, Z.; Jiao, Y.; Liu, S.; Wang, Y. Improved Propionic Acid and 5,6-Dimethylbenzimidazole Control Strategy for Vitamin B₁₂ Fermentation by Propionibacterium freudenreichii. J. Biotechnol. 2015, 193, 123–129. [Google Scholar] [CrossRef]
54. Wang, P.; Jiao, Y.; Liu, S. Novel Fermentation Process Strengthening Strategy for Production of Propionic Acid and Vitamin B₁₂ by Propionibacterium freudenreichii. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2014, 41, 1811–1815. [Google Scholar] [CrossRef]
55. Hugenschmidt, S.; Schwenninger, S.M.; Lacroix, C. Concurrent High Production of Natural Folate and Vitamin B₁₂ Using a Co-Culture Process with Lactobacillus Plantarum SM39 and Propionibacterium freudenreichii DF13. Process Biochem. 2011, 46, 1063–1070. [Google Scholar] [CrossRef]
56. Xie, C.; Coda, R.; Chamlagain, B.; Varmanen, P.; Piironen, V.; Katina, K. Co-Fermentation of Propionibacterium freudenreichiiand Lactobacillus Brevisin Wheat Bran for in Situproduction of Vitamin B₁₂. Front. Microbiol. 2019, 10, 1541. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
57. Miyano, K.I.; Ye, K.; Shimizu, K. Improvement of Vitamin B₁₂ Fermentation by Reducing the Inhibitory Metabolites by Cell Recycle System and a Mixed Culture. Biochem. Eng. J. 2000, 6, 207–214. [Google Scholar] [CrossRef]
58. Hajfarajollah, H.; Mokhtarani, B.; Mortaheb, H.; Afaghi, A. Vitamin B₁₂ Biosynthesis over Waste Frying Sunflower Oil as a Cost Effective and Renewable Substrate. J. Food Sci. Technol. 2015, 52, 3273–3282. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
59. Pillai, V.V.; Prakash, G.; Lali, A.M. Growth Engineering of Propionibacterium freudenreichii Shermanii for Organic Acids and Other Value-Added Products Formation. Prep. Biochem. Biotechnol. 2018, 48, 6–12. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
60. Wang, P.; Wang, Y.; Su, Z. Improvement of Adenosylcobalamin Production by Metabolic Control Strategy in Propionibacterium freudenreichii. Appl. Biochem. Biotechnol. 2012, 167, 62–72. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
61. Kośmider, A.; Białas, W.; Kubiak, P.; Drozdzyńska, A.; Czaczyk, K. Vitamin B₁₂ Production from Crude Glycerol by Propionibacterium freudenreichii ssp. Shermanii: Optimization of Medium Composition through Statistical Experimental Designs. Bioresour. Technol. 2012, 105, 128–133. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
62. Chamlagain, B.; Deptula, P.; Edelmann, M.; Kariluoto, S.; Grattepanche, F.; Lacroix, C.; Varmanen, P.; Piironen, V. Effect of the Lower Ligand Precursors on Vitamin B₁₂ Production by Food-Grade Propionibacteria. LWT-Food Sci. Technol. 2016, 72, 117–124. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
63. Chamlagain, B.; Sugito, T.A.; Deptula, P.; Edelmann, M.; Kariluoto, S.; Varmanen, P.; Piironen, V. In Situ Production of Active Vitamin B₁₂ in Cereal Matrices Using Propionibacterium freudenreichii. Food Sci. Nutr. 2018, 6, 67–76. [Google Scholar] [CrossRef]
64. Deptula, P.; Chamlagain, B.; Edelmann, M.; Sangsuwan, P.; Nyman, T.A.; Savijoki, K.; Piironen, V.; Varmanen, P. Food-like Growth Conditions Support Production of Active Vitamin B₁₂ by Propionibacterium freudenreichii 2067 without DMBI, the Lower Ligand Base, or Cobalt Supplementation. Front. Microbiol. 2017, 8, 368. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
65. Liu, J.; Liu, Y.; Wu, J.; Fang, H.; Jin, Z.; Zhang, D. Metabolic Profiling Analysis of the Vitamin B₁₂ Producer Propionibacterium freudenreichii. Microbiologyopen 2021, 10, e1199. [Google Scholar] [CrossRef]
66. Zhang, Y.; Li, X.; Wang, Z.; Wang, Y.; Ma, Y.; Su, Z. Metabolic Flux Analysis of Simultaneous Production of Vitamin B₁₂ and Propionic Acid in a Coupled Fermentation Process by Propionibacterium freudenreichii. Appl. Biochem. Biotechnol. 2021, 193, 3045–3061. [Google Scholar] [CrossRef]
67. Cheng, X.; Chen, W.; Peng, W.; Li, K. Improved Vitamin B₁₂ Fermentation Process by Adding Rotenone to Regulate the Metabolism of Pseudomonas denitrificans. Appl. Biochem. Biotechnol. 2014, 173, 673–681. [Google Scholar] [CrossRef]
68. Li, K.T.; Liu, D.H.; Li, Y.L.; Chu, J.; Wang, Y.H.; Zhuang, Y.P.; Zhang, S.L. An Effective and Simplified PH-Stat Control Strategy for the Industrial Fermentation of Vitamin B₁₂ by Pseudomonas denitrificans. Bioprocess Biosyst. Eng. 2008, 31, 605–610. [Google Scholar] [CrossRef]
69. Wang, Z.; Wang, H.; Li, Y.; Chu, J.; Huang, M.; Zhuang, Y.; Zhang, S. Improved Vitamin B₁₂ Production by Step-Wise Reduction of Oxygen Uptake Rate under Dissolved Oxygen Limiting Level during Fermentation Process. Bioresour. Technol. 2010, 101, 2845–2852. [Google Scholar] [CrossRef]
70. Wang, Z.; Shi, H.; Wang, P. The Online Morphology Control and Dynamic Studies on Improving Vitamin B₁₂ Production by Pseudomonas denitrificans with Online Capacitance and Specific Oxygen Consumption Rate. Appl. Biochem. Biotechnol. 2016, 179, 1115–1127. [Google Scholar] [CrossRef]
71. Xia, W.; Wei, P.; Kun, C. Interactive Performances of Betaine on the Metabolic Processes of Pseudomonas denitrificans. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2014, 42, 273–278. [Google Scholar] [CrossRef]
72. Xia, W.; Chen, W. Industrial Vitamin B₁₂ Production by Pseudomonas denitrificans Using Maltose Syrup and Corn Steep Liquor as the Cost-Effective Fermentation Substrates. Bioprocess Biosyst. Eng. 2015, 38, 1065–1073. [Google Scholar] [CrossRef]
73. Li, K.T.; Zhou, J.; Cheng, X.; Wei, S.J. Study on the Dissolved Oxygen Control Strategy in Large-Scale Vitamin B₁₂ Fermentation by Pseudomonas denitrificans. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2012, 87, 1648–1653. [Google Scholar] [CrossRef]
74. Vandamme, E.J.; Revuelta, J.L. (Eds.) Industrial Biotechnology of Vitamins, Biopigments, and Antioxidants; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 2016; ISBN 9783527681754. [Google Scholar]
75. CEIC. China Production: Year to Date: Vitamin E. Available online: https://www.ceicdata.com/en/china/pharmaceuticalproduction-ytd-antiparasitics-vitamins-and-minerals/cn-production-ytd-vitamin-e (accessed on 21 June 2022).
76. Li, K.T.; Liu, D.H.; Li, Y.L.; Chu, J.; Wang, Y.H.; Zhuang, Y.P.; Zhang, S.L. Improved Large-Scale Production of Vitamin B₁₂ by Pseudomonas denitrificans with Betaine Feeding. Bioresour. Technol. 2008, 99, 8516–8520. [Google Scholar] [CrossRef]
77. Li, K.T.; Liu, D.H.; Li, Y.L.; Chu, J.; Wang, Y.H.; Zhuang, Y.P.; Zhang, S.L. Influence of Zn²⁺, Co²⁺ and Dimethylbenzimidazole on Vitamin B₁₂ Biosynthesis by Pseudomonas denitrificans. World J. Microbiol. Biotechnol. 2008, 24, 2525–2530. [Google Scholar] [CrossRef]
78. Kusel, J.; Fa, Y.; Demain, A. Betaine Stimulation of Vitamin B₁₂ Biosynthesis in Pseudomonas denitrificans May Be Mediated by an Increase in Activity of δ-Aminolaevulinic Acid Synthase. J. Gen. Microbiol. 1984, 130, 835–841. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
79. Zhang, Y.; Liu, J.Z.; Huang, J.S.; Mao, Z.W. Genome Shuffling of Propionibacterium shermanii for Improving Vitamin B₁₂ Production and Comparative Proteome Analysis. J. Biotechnol. 2010, 148, 139–143. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
80. Gray, M.J.; Escalante-Semerena, J.C. Single-Enzyme Conversion of FMNH2 to 5,6-Dimethylbenzimidazole, the Lower Ligand of B₁₂. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104, 2921–2926. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
81. Signorini, C.; Carpen, A.; Coletto, L.; Borgonovo, G.; Galanti, E.; Capraro, J.; Magni, C.; Abate, A.; Johnson, S.K.; Duranti, M.; et al. Enhanced Vitamin B₁₂ Production in an Innovative Lupin Tempeh Is Due to Synergic Effects of Rhizopus and Propionibacterium in Cofermentation. Int. J. Food Sci. Nutr. 2018, 69, 451–457. [Google Scholar] [CrossRef]
82. Zheng, J.; Wittouck, S.; Salvetti, E.; Franz, C.M.A.P.; Harris, H.M.B.; Mattarelli, P.; O’toole, P.W.; Pot, B.; Vandamme, P.; Walter, J.; et al. A Taxonomic Note on the Genus Lactobacillus: Description of 23 Novel Genera, Emended Description of the Genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and Union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020, 70, 2782–2858. [Google Scholar] [CrossRef]
83. Frettloeh Martin Sequential Co-Culturing Method for Producing a Vitamin- and Protein-Rich Food Product. U.S. Patent 2020-0149084 A1, 14 May 2020.
84. Quesada-Chanto, A.; Afschar, A.S.; Wagner, F. Microbial Production of Propionic Acid and Vitamin B₁₂ Using Molasses or Sugar. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994, 41, 378–383. [Google Scholar] [CrossRef]
85. Haddadin, M.S.Y.; Abu-Reesh, I.M.; Haddadin, F.A.S.; Robinson, R.K. Utilisation of Tomato Pomace as a Substrate for the Production of Vitamin B₁₂—A Preliminary Appraisal. Bioresour. Technol. 2001, 78, 225–230. [Google Scholar] [CrossRef]
86. Assis, D.A.D.; Matte, C.; Aschidamini, B.; Rodrigues, E.; Záchia Ayub, M.A. Biosynthesis of Vitamin B₁₂ by Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii ATCC 13673 Using Liquid Acid Protein Residue of Soybean as Culture Medium. Biotechnol. Prog. 2020, 36, e3011. [Google Scholar] [CrossRef]
87. Gardner, N.; Champagne, C.P. Production of Propionibacterium Shermanii Biomass and Vitamin B₁₂ on Spent Media. J. Appl. Microbiol. 2005, 99, 1236–1245. [Google Scholar] [CrossRef]
88. Moine, G.; Hohmann, H.-P.; Kurth, R.; Paust, J.; Hähnlein, W.; Pauling, H.; Weimann, B.-J.; Kaesler, B. Vitamins, 6. B Vitamins. In Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry; Wiley-VCH GmbH & Co. KGaA: Weinheim, Germany, 2011. [Google Scholar]
89. Survase, S.A.; Bajaj, I.B.; Singhal, R.S. Biotechnological Production of Vitamins. Food Technol. Biotechnol. 2006, 44, 381–396. [Google Scholar]
90. Nielsen, M.J.; Rasmussen, M.R.; Andersen, C.B.F.; Nexø, E.; Moestrup, S.K. Vitamin B₁₂ Transport from Food to the Body’s Cells—A Sophisticated, Multistep Pathway. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2012, 9, 345–354. [Google Scholar] [CrossRef]
91. Berlin, H.; Berlin, R.; Brante, G. Oral Treatment of Pernicious Anemia with High Doses of Vitamin B₁₂ without Intrinsic Factor. Acta Med. Scand. 1968, 184, 247–258. [Google Scholar] [CrossRef]
92. Gamboa, J.M.; Leong, K.W. In vitro and in vivo Models for the Study of Oral Delivery of Nanoparticles. Adv. Drug Deliv. Rev. 2013, 65, 800–810. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
93. Dhakal, S.P.; He, J. Microencapsulation of Vitamins in Food Applications to Prevent Losses in Processing and Storage: A Review. Food Res. Int. 2020, 137, 109326. [Google Scholar] [CrossRef]
94. Matos, M.; Gutiérrez, G.; Iglesias, O.; Coca, J.; Pazos, C. Enhancing Encapsulation Efficiency of Food-Grade Double Emulsions Containing Resveratrol or Vitamin B₁₂ by Membrane Emulsification. J. Food Eng. 2015, 166, 212–220. [Google Scholar] [CrossRef]
95. Ramalho, M.J.; Loureiro, J.A.; Pereira, M.C. Poly (Lactic-Co-Glycolic Acid) Nanoparticles for the Encapsulation and Gastrointestinal Release of Vitamin B₉ and Vitamin B₁₂. ACS Appl. Nano Mater. 2021, 4, 6881–6892. [Google Scholar] [CrossRef]
96. Bochicchio, S.; Barba, A.A.; Grassi, G.; Lamberti, G. Vitamin Delivery: Carriers Based on Nanoliposomes Produced via Ultrasonic Irradiation. LWT-Food Sci. Technol. 2016, 69, 9–16. [Google Scholar] [CrossRef]
97. Estevinho, B.N.; Mota, R.; Leite, J.P.; Tamagnini, P.; Gales, L.; Rocha, F. Application of a Cyanobacterial Extracellular Polymeric Substance in the Microencapsulation of Vitamin B₁₂. Powder Technol. 2019, 343, 644–651. [Google Scholar] [CrossRef]
98. Carlan, I.C.; Estevinho, B.N.; Rocha, F. Study of Microencapsulation and Controlled Release of Modified Chitosan Microparticles Containing Vitamin B₁₂. Powder Technol. 2017, 318, 162–169. [Google Scholar] [CrossRef]
99. Fidaleo, M.; Tacconi, S.; Sbarigia, C.; Passeri, D.; Rossi, M.; Tata, A.M.; Dini, L. Current Nanocarrier Strategies Improve Vitamin B₁₂ Pharmacokinetics, Ameliorate Patients’ Lives, and Reduce Costs. Nanomaterials 2021, 11, 743. [Google Scholar] [CrossRef]
100. Long, R.A. Production of Vitamin B12. U.S. Patent 3,018,225, 23 January 1962. [Google Scholar]
101. Crouzet, J.; Debussche, L.; Schil, S.L.; Thibaut, D. Methods of Increasing the Production of Cobalamins Using Cob Gene Expression. U.S. Patent 2006/0019352 A1, 26 January 2006. [Google Scholar]
102. Zhendong, L.; Qing, C.; Weikai, X.; Hua, L.; Lulu, Y. Screening Method and Screening Culture Medium for Bacterial Strain for High Yield of Vitamin B12 Produced through Fermentation Production with Pseudomonas denitrificans. CN Patent 111254173 A, 9 June 2020. [Google Scholar]
103. Yonggan, H.; Yanmao, L.; Hui, L.; Xin, W. Multi-Stage Rotating Speed Regulating Policy for Improving Pseudomonas denitrificans Fermentation for Production of Vitamin B12. CN Patent 108949866 A, 7 December 2018. [Google Scholar]
104. Wang, J.; Wang, J.; Hanzhong, L.; Yanxia, C.; Mu, Q.; Yingran, L.; Xueran, L.; Jingkun, Z.; Hong, W.; Yuan, Y. Method for Improving Yield of Vitamin B12 Based of Regulation of Ammonia Nitrogen Index. CN Patent 110205350 A, 6 September 2019. [Google Scholar]
105. Ruiyan, L.; Jiexi, M.; Wei, L.; Caixia, Z.; Fengyu, K. Method for Promoting Pseudomonas denitrificans to Generate Vitamin B12. CN Patent 109837320 A, 4 June 2019. [Google Scholar]
106. Pengdong, H.; Lizhong, P.; Hongwei, G.; Yi, S.; Qiong, M. Preparation Method of Vitamin B12 Crude Product. CN Patent 111808158 A, 23 October 2020. [Google Scholar]
107. Hunik, J.H. Process for the Production of Vitamin B12. U.S. Patent 6,492,141 B1, 10 December 2002. [Google Scholar]
108. Michelle, I.; Adams, C. Probiotic Propionibacterium. U.S. Patent 7.427,397 B2, 23 September 2008. [Google Scholar]
109. Gregor, K.; Stefan, F.; Mirjan, S.; Hrvoje, P. Co-Cultivation of Propionibacterium and Yeast. U.S. Patent 9,938,554, 10 April 2018. [Google Scholar]
110. Zhiguo, W.Z.; Guoxia, X.; Liquan, W.; Yunshan, W.S. Device for Producing Propionic Acid and Co-Producing Vitamin B12 by Semi-Continuous Fermentation 2017. CN Patent 206828509 U, 2 January 2018. [Google Scholar]
111. Mallinath, L.A.; Pillai, V. Continuous Process for Co-Production of Vitamin B12 and Organic Acids. IN Patent 201827044769, 2 October 2020. [Google Scholar]
112. Garibaldi, J.A.; Kosuke, I.; Lewis, J.C.; Mcginnis, J. Fermentation Process for Production of Vitamin B₁₂. U.S. Patent 2576,932, 4 December 1994. [Google Scholar]
113. Mogna, G.; Paolo Strozzi, G.; Mogna, L. Vitamin B12 Producing Lactobacillus Reuteri Strains 201. International Patent 2011/154820 A2, 15 December 2011. [Google Scholar]
114. Dawei, Z.; Miaomiao, X.; Sha, L.; Wenjuan, Z.; Ping, Z.; Huan, F. Sinorhizobium Meliloti Strain and Composition and Application of Sinorhizobium Meliloti Strain. CN Patent 104342390 A, 11 February 2015. [Google Scholar]
115. Dawei, Z.; Huina, D. Procorrin-2C(20)-Methyltransferase Mutant and Mutant Gene and Application Thereof in Preparing Vitamin B12 2020. CN Patent 110804598 A, 18 February 2020. [Google Scholar]
116. Zhang, D.; Fang, H. Recombinant Strain of Escherichia Coli for de Novo Synthesis of Vitamin B12, Construction Method Therefor and Application Thereof. International Patent 2019/109975A1, 13 June 2019. [Google Scholar]
117. Bijl, H.L. Production and Use of Compositions Comprising High Concentrations of Vitamin B12 Activity. U.S. Patent 6,187,761 B1, 13 February 2001. [Google Scholar]
118. Hugenschmidt, S.; Miescher Schwenninger, S.; Lacroix, C. Process for the Preparation of a Fermentation Broth. EU Patent 2 376 644 B1, 23 April 2014. [Google Scholar]
119. Mansour, M. Modified Propionibacterium and Methods of Use. International Patent 2021/041759, 4 March 2021. [Google Scholar]
120. Remy, E.; Examiner, P.; Achutamurthy, P. Biosynthesis Method Enabling the Preparation of Cobalamins. U.S. Patent 6,156,545, 5 December 2000. [Google Scholar]
121. Zhang, S.; Zhao, Q.; Li, K.; Liu, D.; Hongzhuang, Y.; Wang, Z.; Li, Y. Method for Improving Yield of Denitrified Pseudomonas Vitamin B12. CN Patent 101538599 A, 23 September 2009. [Google Scholar]
122. Zhang, S.; Chen, X.; Li, Y.; Zhenguo, W.; Xie, L.; Cao, Y.; Tang, L.; Wang, Z.; Zhuang, Y. Vitamin B12 Fermentation Production Control Process Based on CO₂ Concentration in Tail Gas. CN Patent 102399845 A, 13 September 2010. [Google Scholar]
123. Zhang, S.; Zhang, Y.; Wang, Z.; Wang, H.; Zhuang, Y.; Chu, J.; Siliang, Z.; Yiming, Z.; Yinping, Z.; Huiyuan, W.; et al. Optimized Method for Producing Vitamin B12 through Pseudomonas denitrificans Fermentation and Synthetic Medium. CN Patent 101748177 A, 9 December 2008. [Google Scholar]
124. Wang, H.; Chu, J.; Wang, Z.; Zhuang, Y.; Zhang, S.; Zejian, W.; Huiyan, W.; Yingping, Z.; Siliang, Z.; Ju, C. Oxygen Consumption Rate-Based Vitamin B12 Fermentation Production Control Process. CN Patent 102021214 A, 22 September 2009. [Google Scholar]
125. Ren, Y.; Leng, X.; Wang, Y.; Qi, N.; Dong, Y.; Xiaohong, L.; Nai, Q.; Yong, R.; Youshan, W.; Yuan, D. Culture Medium for Producing Vitamin B12 by Fermenting Pseudomonas denitrificans and Fermentation Method Thereof. CN Patent 102453740 A, 16 May 2012. [Google Scholar]
126. Ju, Y.; Yang, H.; Yanmao, L.; Guangyong, Z. Method for Producing Vitamin B12 by Using Pseudomonas denitrificans Based on PH Value Control. CN Patent 108913739 A, 30 November 2018. [Google Scholar]
127. Mcdaniel, L.E.; Harold, B. Cyanide Ion in Production of Vitamin B12. U.S. Patent 2,650,896, 1 September 1953. [Google Scholar]
128. Takaaki, M.; Zhenya, Z. Method for Producing Vitamin B12 from Hydrogen-Metabolizing Methane Bacte-Rium. U.S. Patent 2005/0227332 A1, 13 October 2005. [Google Scholar]
129. Barg, H.; Jahn, D. Method for the Production of Vitamin B12. U.S. Patent 2006/0105432 A1, 18 May 2006. [Google Scholar]
130. Rychen, G.; Aquilina, G.; Azimonti, G.; Bampidis, V.; Bastos, M.D.L.; Bories, G.; Chesson, A.; Cocconcelli, P.S.; Flachowsky, G.; Gropp, J.; et al. Safety and Efficacy of Vitamin B₁₂ (in the Form of Cyanocobalamin) Produced by Ensifer spp. as a Feed Additive for All Animal Species Based on a Dossier Submitted by VITAC EEIG. EFSA J. 2018, 16, e05336. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
131. Rizzo, G.; Laganà, A.S.; Rapisarda, A.M.C.; la Ferrera, G.M.G.; Buscema, M.; Rossetti, P.; Nigro, A.; Muscia, V.; Valenti, G.; Sapia, F.; et al. Vitamin B₁₂ among Vegetarians: Status, Assessment and Supplementation. Nutrients 2016, 8, 767. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
132. Watanabe, F.; Yabuta, Y.; Tanioka, Y.; Bito, T. Biologically Active Vitamin B₁₂ Compounds in Foods for Preventing Deficiency among Vegetarians and Elderly Subjects. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 6769–6775. [Google Scholar] [CrossRef]
133. Titcomb, T.J.; Tanumihardjo, S.A. Global Concerns with B Vitamin Statuses: Biofortification, Fortification, Hidden Hunger, Interactions, and Toxicity. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2019, 18, 1968–1984. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
134. Oh, S.; Cave, G.; Lu, C. Vitamin B₁₂ (Cobalamin) and Micronutrient Fortification in Food Crops Using Nanoparticle Technology. Front. Plant Sci. 2021, 12, 1451. [Google Scholar] [CrossRef]
135. Pawlak, R.; Rusher, D.R. A Review of 89 Published Case Studies of Vitamin B₁₂ Deficiency. J. Hum. Nutr. Food Sci. 2013, 1, 1008. [Google Scholar]
136. Watkins, D.; Rosenblatt, D.S. Inborn Errors of Cobalamin Absorption and Metabolism. Am. J. Med. Genet. Part C Semin. Med. Genet. 2011, 157, 33–44. [Google Scholar] [CrossRef]
137. Shepherd, G.; Velez, L.I. Role of Hydroxocobalamin in Acute Cyanide Poisoning. Ann. Pharmacother. 2008, 42, 661–669. [Google Scholar] [CrossRef]
138. Linnell, J.C.; Smith, A.D.; Smith, C.L.; Wilson, M.J.; Matthews, D.M. Effects of Smoking on Metabolism and Excretion of Vitamin B₁₂. BMJ 1968, 2, 215–216. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
139. Allen, L.; Rosenberg, I.; Oakley, G.; Omenn, S. Considering the Case for Vitamin B₁₂ Fortification of Flour. Food Nutr. Bull. 2010, 31 (Suppl. S1), S36–S46. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
140. Hamel, J. A Review of Acute Cyanide Poisoning with a Treatment Update. Crit. Care Nurse 2011, 31, 72–82. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
141. Reports and Data Vitamin B12 (Cobalamin) Market to Reach USD 409.7 Million By 2027. Available online: https://www.globenewswire.com/news-release/2020/08/26/2084313/0/en/Vitamin-B12-Cobalamin-Market-To-Reach-USD-409-7-Million-By-2027-Reports-and-Data.html (accessed on 22 April 2022).
142. Rabah, H.; Rosa do Carmo, F.L.; Jan, G. Dairy Propionibacteria: Versatile Probiotics. Microorganisms 2017, 5, 24. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
143. Zhou, X.; Li, Y. (Eds.) Atlas of Oral Microbiology: From Healthy Microflora to Disease; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2015. [Google Scholar]
144. Acevedo-Rocha, C.G.; Gronenberg, L.S.; Mack, M.; Commichau, F.M.; Genee, H.J. Microbial Cell Factories for the Sustainable Manufacturing of B Vitamins. Curr. Opin. Biotechnol. 2019, 56, 18–29. [Google Scholar] [CrossRef].

     ---

Будьте здоровы!