Сычужное свёртывание белков молока

СЫЧУЖНЫЙ ФЕРМЕНТ И МЕХАНИЗМ СВЁРТЫВАНИЯ МОЛОКА

Сычужная коагуляция казеина с образованием казеиновой сети

На рис.: Сычужная коагуляция казеина с образованием казеиновой сети

СОДЕРЖАНИЕ

1. Коагуляция казеина и сычужная свёртываемость молока

Коагуляцию белков можно вызвать различными способами, но любой из них должен сопровождаться снижением отрицательного зарядаоб этом см. в другом разделе

Молоко является сложной полидисперсной системой. В виде истинного раствора в молоке (молочной сыворотке) находится большинство неорганических компонентов, лактоза, водорастворимые витамины, небелковые азотистые соединения и другие минорные низкомолекулярные соединения. Размеры молекул растворенных соединений не превышают 1,5 нм. В виде коллоидного раствора в молоке находятся казеины, сывороточные белки, большая часть фосфатов кальция. Размеры коллоидных частиц молока: сывороточных белков - 15-50 нм, казеина - 30-300 нм, фосфатов кальция - 10-20 нм. Для коллоидных систем характерна неустойчивость, обусловленная большой удельной поверхностью дисперсной фазы и, соответственно, большим запасом свободной энергии системы. При переходе системы в более устойчивое состояние частицы дисперсной фазы укрупняются. Молочный жир содержится в молоке в виде эмульсии; средний размер жировых шариков в коровьем молоке равен 2,0-2,5 мкм, минимальный - 0,1 мкм (100 нм), максимальный - 10 и более мкм. Жировая эмульсия в молоке неустойчива, чему способствует разная плотность дисперсной фазы и дисперсной среды, благодаря которой происходит самопроизвольное отстаивание молочного жира.

Суть сыроделия состоит в концентрировании белков и жира молока и биотрансформации основных его компонентов в соединения, обусловливающие специфические органолептические показатели продукта. Таким образом, необходимой стадией производства любого сыра является дестабилизация коллоидной фазы молока и отделение ее от части дисперсной среды, т.е. расслоение системы.

Коллоидные растворы могут находиться в состоянии золя или геля. В состоянии золя коллоидные частицы, обычно называемые мицеллами, не связаны друг с другом и находятся в свободном броуновском движении. После дестабилизации коллоидные частицы начинают связываться друг с другом - образуются их агрегаты. Процесс агрегации коллоидных частиц называют коагуляцией (от лат. coagulum - сгусток). С учетом изложенного, а также данных из раздела о казеиновых мицеллах, можно дать определение коагуляции:

Коагуляция белков молока — это соединение белков молока (казеинов) в более крупные агрегаты, которое происходит в результате дестабилизации коллоидных частиц (казеиновых мицелл) в изоэлектрической точке, когда у последних снижается количество поверхностных зарядов и снижается потенциал отталкивания, и гидратная оболочка ослабевает.

Коагуляция бывает скрытой и истинной.

  • При скрытой коагуляции мицеллы связываются друг с другом не всей поверхностью, а только на некоторых ее участках, образуя пространственную мелкоячеистую структуру, которая называется гелем. При дестабилизации всех или большинства частиц дисперсной фазы гель охватывает весь объем дисперсной среды (исходного молока). Скрытую коагуляцию называют гелеобразованием (или просто коагуляцией, свертыванием).
  • Истинная коагуляция заключается в полном слиянии коллоидных частиц и выпадении дисперсной фазы в осадок или всплывании. Истинная коагуляция в дальнейшем будет называться осаждением.

Коллоидная система свежего молока является золем. Концентрирование компонентов молока в сыроделии начинается с коагуляции молока энзиматическим, кислотным, кислотно-энзиматическим методами или осаждения белков термокислотным методом (в т.ч. термокальциевым - из обезжиренного молока). Проще говоря, при выработке молочных продуктов коагуляцию казеина осуществляют с помощью кислот (кислотная коагуляция), сычужного фермента (сычужная коагуляция) и так далее, по аналогии. Как было уже показано, гидрофильные свойства казеина влияют на способность кислотного и кислотно-сычужного сгус­тка удерживать и выделять влагу - от гидрофильных свойств казеина и продуктов его распада зависят водосвязывающая и влагоудерживающая способность сырной массы при созревании сыров, консистенция готового продукта.

  • Сущность кислотной коагуляции сводится  к нейтрализации отрицательных зарядов казеина положительно заряженными ионами водорода кислоты. В промышленности кислотную коагуляцию применяют при выработке кисломолочных продуктов, пищевого и технического казеина, копреципитатов. Для осаждения казеина применяют в основном молочную кислоту, образующуюся в результате молочнокислого брожения молочного сахара.  При получении казеина и копреципитатов  используют соляную кислоту.
  • Сущность сычужной коагуляции  заключается в отщеплении от κ-казина отрицательно заряженных гликомакропротеидов. Сычужную коагуляцию казеина применяют при производстве сыров, творога и казеина. При производстве творога и сыра также применяют совместное осаждение казеина сычужным ферментом и молочной кислотой.
  • Действие раствора хлорида кальция при кальциевой коагуляции связано со снижением отрицательного заряда казеина под влиянием положительно заряженных ионов кальция. Кальциевую кагуляцию применяют для осаждения молочных белков из обезжиренного молока. Коагуляцию хлоридом кальция обычно проводят при высокой температуре (90–95оС), поэтому она называется термокальциевой коагуляцией. Повышенная температура вызывает денатурацию сывороточных белков, которые коагулируют вместе с казеином.

Под сычужной свертываемостью молока понимают способность его белков коагулировать под действием внесенного сычужного фермента с образованием относительно плотного сгустка. Продолжительность сы­чужной свертываемости заготовляемого молока колеблется в широких пределах. Так, при стандартных условиях проведения сычужной пробы продолжительность свертывания может составлять 10 - 35 мин. Иногда молоко очень медленно свертывается под действием сычужного фермента или вовсе не свертывается. Такое молоко называют сычужно-вялым. Способность молока к сычужной свертываемости определяется, в пер­вую очередь, содержанием в нем казеина и солей кальция  - чем оно больше, тем выше скорость свертывания молока и плот­ность образующихся белковых сгустков, и наоборот. Использование сычуж­но-вялого молока при выработке сыра и творога приводит к образованию непрочного сгустка, имеющего низкие структурно-механические и синеретические свойства.

Стадии гелеобразования

Проверка на чистый разрыв

Сычужное свертывание молока проходит 2 стадии:

I. ферментатив­ную
II. коагуляционную

На первой стадии под действием сычужного фер­мента происходит разрыв чувствительной к нему пептидной связи в полипептидной цепи к-казеина. В результате этого к-казеин распадается на нераство­римый (чувствительный к ионам кальция) пара-к-казеин и растворимый гликомакропептид. Гликомакропептиды к-казеина имеют высокий отрицательный заряд и обладают сильными гидрофильными свойствами. При их отщеплении от к-казеина снижается электрический заряд на поверхности казеино­вых мицелл (↓ силы электростатического отталкивания), частично теряется гидратная оболочка, в результате чего снижа­ется устойчивость казеиновых мицелл и они коагулируют, т. е. наступает вторая стадия - коагуляция.

Рис.: Схема процесса сычужного свертывания молока (по Пайенсу). а – коагуляция мицелл под действием сил гидрофобного взаимодействия; б – коагуляция мицелл за счет кальциевых мостиков; 1 – нативные казеиновые мицеллы; 2 – параказеиновые мицеллы
Схема образования пространственной структуры в процессе свертывания молока
На рис.: Схема образования пространственной структуры в процессе свертывания молока: а — начало образования структурной сетки; б — пространственная структура сгустка; 1 — частицы белка; 2— петли структуры, заполненные дисперсион­ной средой

   казеиновая сетка и гель

На рис. Слева - Начало процесса гелеобразования (агрегировнные мицеллы образуют цепочки). Справа - Изображение криосканирующей электронной микроскопии микроструктуры геля (казеиновой сетки), полученного с помощью рекомбинантного химозина. Линии указывают на жировые шарики / Линейки шкалы имеют длину 200 нм (слева) и 20 мкм (справа).

Коагуляция белков наступает после рас­щепления 80-90% к-казеина, находящегося на поверхности мицелл. Дестабилизированные казеиновые час­тицы сначала образуют агрегаты и цепочки. При достижении «критичес­ких» размеров цепочки соединяются между собой продольными и попе­речными связями и образуют сплошную пространственную сетку, в ячейках которой заключена дисперсионная среда, в т.ч. жировые шарики (см. рис. выше).

Сущность кислотной и сычужно-кислотной коагуляции казеина

Подробнее о сущности коагуляции казеина

Сущность кислотной коагуляции сводится к следующему → Образующаяся (или вне­сенная) молочная кислота снижает отрицательный заряд казеиновых мицелл, в результа­те этого достигается равенство положительных и отрицательных зарядов в изоэлектрической точке казеина (рН 4,6 - 4,7). При кислотной коагуляции помимо снижения отрицательного заря­да казеина нарушается структура казеинаткальцийфосфатного комплекса (отщепляется фосфат кальция и структурообразующий кальций). Так как кальций и фосфат кальция являются важными структурными элемента­ми комплекса, то их переход в раствор дополнительно дестабилизирует казеиновые мицеллы.

При выработке творога кислотно-сычужным способом на казеин со­вместно действуют молочная кислота и внесенный сычужный фермент. Под действием сычужного фермента казеин превращается в параказеин, имею­щий изоэлектрическую точку в менее кис­лой среде (смещение pH 4,6  5,2). Активность сычужного фермента зависит от кис­лотности, температуры молока и содержания в нем ионов кальция (Ca2+). Фер­мент проявляет свою активность при рН 5,2-6,3, оптимальное значе­ние рН для сычужного фермента 6,2. Оптимальная температура его дей­ствия 39-42°С. В изоэлектрической точке казеиновые или параказеиновые частицы при столк­новении агрегируют, образуя цепочки или нити, а затем пространственную сетку, в ячейки или петли которой захватывается дисперсионная среда с жировыми шари­ками и другими составными частями мо­лока. Происходит гелеобразование. При производстве кисломолочных продуктов и сыра процесс гелеобразования можно условно разделить на четыре ста­дии: стадия скрытой коагуляции (индук­ционный период), стадия массовой коагу­ляции, стадия структурообразования (уп­лотнения сгустка) и стадия синерезиса.

Образующийся сгусток (гель) обладает определенными механическими свойствами: вязкостью, пластичностью, упругостью и прочностью. Эти свойства связаны со структурой системы, поэтому их называют структурно-механическими или реологическими. Структурно-механические свойства сгустков определяются характе­ром связей, возникающих между белковыми частицами при формирова­нии структуры. Связи могут быть обратимыми и необратимыми, и последними характеризуется сычужная коагуляция → Необратимые связи не обладают свой­ством восстанавливаться после механического воздействия на сгусток. С ними связано явление синерезиса.

Синерезис - уплотнение, стягивание сгустка с укорачиванием нитей казеина и вытеснением заключенной меж­ду ними жидкости. Скорость синерезиса определяется влагоудерживающей способностью казеина и зависит от концентрации в сырье сухих веществ, состава бактериальных заквасок, режимов тепловой обработки и гомогенизации, способа свертывания молока и других факторов.


2. Гелеобразование под микроскопом

На рисунке ниже представлена серия электронно-микроскопических фотографий процесса агрегирования мицелл казеина в фазе флокуляции процесса гелеобразования. Приведенная серия снимков, полученных с интервалом в две минуты, наглядно иллюстрирует кинетику процесса образования первичных кластеров из мицелл при гелеобразовании.

1. Кинетика образования кластеров из мицелл казеина в фазе флокуляции при ферментативном гелеобразовании (ПЭМ)

Рис.1. Кинетика образования кластеров из мицелл казеина в фазе флокуляции при ферментативном гелеобразовании (ПЭМ)

Ниже представлены изображения структуры геля, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), на которых хорошо видно, что структура геля состоит преимущественно из кластеров (хлопьев), образованных мицеллами (рисунок 2).

Структура молочного геля, СЭМ

Рис.2. Структура молочного геля, СЭМ

Кроме того, здесь же видно, что структура геля пронизана хорошо сформированными крупными каналами диаметром около 5 мкм, по которым, в основном, и проходит движение сыворотки. Исследования структуры геля, проведенные методом – сверхбыстрого замораживания-скалывания для просвечивающей электронной микроскопии, показали аналогичные результаты (рисунок 3).

Структура белкового каркаса молочного геля (ПЭМ)

Рис. 3. Структура белкового каркаса молочного геля (ПЭМ)

Если изображение, полученное сканирующей электронной микроскопией, имеет большую глубину резкости и позволяет дать квазитрехмерную оценку структуры, то просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) дает изображение случайного поперечного скола стенок пространственной структуры, образованной кластерами мицелл. Здесь, также как и на рисунке 2, каналы имеют характерные размеры около 5 мкм.

Можно констатировать, что существует, как минимум, два уровня структурирования молочного геля: локальное структурирование в кластерах мицелл и глобальное структурирование системы из готовых кластеров. Наиболее вероятно, что окончательная структура геля формируется на стадии коагуляции из уже готовых кластеров мицелл.

Кластер из мицелл казеина на заключительном этапе фазы флокуляции при гелеобразовании (ПЭМ)

Рис. 4. Кластер из мицелл казеина на заключительном этапе фазы флокуляции (ПЭМ)

Наблюдаемая структура кластеров мицелл казеина является рыхлой, содержит существенную стохастическую составляющую и не может быть удовлетворительно описана в рамках линейной геометрии. Поэтому для дальнейшего анализа структур кластеров мицелл целесообразно использовать аппарат фрактальной геометрии, позволяющий эффективно анализировать структуры подобного вида.


3. Механизм сычужного свертывания белков молока

УПРОЩЕННО

(Если видео не отображается, то см. по ссылке)

Итак, свертывание белков молока сычужным ферментом является одним из наиболее важных процессов при выработке сыра. От скорости получения и структурно-механических свойств сычужного сгустка зависят структура, консистенция, рисунок и другие показатели сыра. Сычужное сверты­вание белков молока (сычужная коагуляция казеина) носит необратимый характер и включает две стадии — ферментативную и коагуляционную. Механизм обоих стадий окончательно не установлен. Существует несколь­ко теорий, объясняющих химизм взаимодействия сычужного фермента с казеинат-кальций-фосфатным комплексом и последующей коагуляции параказеина — фосфоамидазная, гидролитическая и др. Основной компонент белка молока, который участвует в формировании сгустка называется казеин.

Кратко о том, как действует химозин (в GIF):

казеиновые

а) Казеиновые мицеллы находятся во взвешенном состоянии (отталкиваются друг от друга) благодаря отрицательно-заряженным С-концевым участкам к-казеинов (гликомакропептидам), которые образуют т.н. стабилизирующий "волосковый слой"

Коагуляция -

б) Казеиновые мицеллы, значительно потеряв отрицательно-заряженный "волосковый слой", сближаются и "слипаются" между собой, образуя белковые агрегаты формирующую казеиновую сеть (в молоке образуется сгусток).

Несмотря на общность структуры, химозин отличается от пепсинов исключительно высокой специфичностью по отношению к единственной связи (Phe105-Met106) в молекуле κ-казеина молока. В то же время, уровень протеолитической активности химозина по отношению к любым другим пептидным связям казеинов и сывороточных белков молока намного ниже. Основные белки молока - α-, β- и κ-казеины – относятся к кальций-связывающим протеинам и являются для организма новорожденного источником Ca2+, аминокислот и пептидов, обладающих, в том числе, антимикробной активностью. В молоке казеины образуют гетерогенные мицеллы, внутренняя структура которых стабилизирована кальций-фосфатными комплексами, гидрофобными и ионными взаимодействиями. На поверхности мицелл экспонированы анионные С-терминальные участки к-казеинов, которые образуют стабилизирующий "волосковый слой". Благодаря отрицательно заряженному "волосковому слою", в нативном молоке казеиновые мицеллы образуют стабильную дисперсию (находятся во взвешенном состоянии, отталкиваясь друг от друга - ред.). Химозин с высокой избирательностью и скоростью гидролизует связь Phe105-Met106, что приводит к утрате "волоскового слоя", дестабилизации, сближению и агрегации мицелл. В результате молоко коагулирует.

На рисунке ниже представлена мицелла казеина.

мицелла казеина

Рис. 5: Мицелла казеина.

Ниже представлена одна из основных теорий химизма в работе сычужного фермента:

Аминокислотная цепь, образующая κ-казеин, состоит из 169 аминокислот. В этой цепи связь между аминокислотными остатками в положениях 105 (фенилаланин) и 106 (метионин) легко доступна для многих протеолитических ферментов (в частности, химозина). Химозин атакует эту связь и расщепляет полипептидную цепь (см. механизм действия химозина).

1-й продукт гидролиза (пара-κ-казеин). При действии сычужного фермента на связь Фен105–Мет106 κ-казеин гидролизуется до гидрофобного пара-κ-казеина, содержащего аминокислотные остатки с 1 по 105, свойства которого практически не отличаются от свойств αs- и β-казеинов (прим. ред. - казеин — это комплекс 4-х фракций: αs1, αs2, β, к).

2-й продукт гидролиза  (гликомакропептид). При гидролизе от к-казеина отщепляется также гликомакропептид. Этот образующийся концевой аминосодержащий фрагмент содержит аминокислоты между 106-м и 169-м положениями, среди которых преобладают полярные аминокислоты, а также углевод, придающий этой последовательности гидрофильные свойства. Эта часть молекулы κ-казеина выделяется в сыворотку при изготовлении сыра. Данный продукт гидролиза конкретно содержит в большом количестве серин, треонин, глутаминовую кислоту, а также связанные с треонином углеводные фрагменты, в том числе сиаловую кислоту. Именно из-за наличия углеводов этот продукт часто называют гликомакропептидом. При рН свежего молока он имеет достаточно высокий отрицательный заряд, и в целом именно этот фрагмент κ-казеина определяет гидрофильные свойства последнего.

Стадии действия сычужного фермента. Образование сгустка обусловлено внезапным удалением гидрофильных макропептидов и наступающей при этом неравновесностью внутримолекулярных сил. Это приводит к развитию и усилению связи между гидрофобными участками цепи за счет кальциевых связей, образующихся, когда молекулы воды, содержащиеся в мицеллах, начинают покидать структуру. Данный процесс обычно описывают как стадию коагуляции с синерезисом. Расщепление связи Фен105–Мет106 в молекуле κ-казеина часто называют первичной стадией действия сычужного фермента, а стадию коагуляции и синерезиса – второй стадией процесса. Имеется также третья стадия этого процесса, при которой сычужный фермент воздействует на компоненты казеина более обычным путем. Это происходит при созревании сыра.


Упрощенное описание этапов сычужной коагуляции казеина:

мицелла казеинаКазеины в молоке присутствуют в основном в мицеллярной форме. Мицеллы казеина представляют собой сферические, пористые, гидратированные частицы диаметром от 50 до 600 нм. Мицеллы состоят из субмицелл – сферических частиц размером 10–20 нм и молекул казеината кальция (т.е. комплекса органического кальция с казеином). Субмицеллы соединены друг с другом с помощью коллоидного фосфата и гидрофобных, водородных и др. связей. Главными силами, способствующими формированию и стабилизации субмицелл казеина, являются гидрофобные взаимодействия. Важную роль играют кальциевые мостики между фосфосериновыми группами субъединиц казеина. На современном этапе учеными разных стран представлено несколько моделей казеиновых мицелл. При этом все авторы считают, что казеиновые мицеллы состоят из плотно упакованных субмицелл, построенных по типу ядро – оболочка.

Казеин присутствует в различных формах в мицелле, в основном в виде альфа-, бета- и каппа-казеина (к-казеина). Внешняя поверхность мицеллы состоит из к-казеинов, которые имеют гидрофильный отрицательно заряженный конец (гликомакропептид), торчащий из мицеллы наружу. Отрицательный заряд отталкивает другие мицеллы, и благодаря этому механизму все мицеллы равномерно распределены по всему молоку.

1) Почти все белки в молоке представлены в виде белковых агрегатов, называемых мицеллами (см. рис. выше). Эти мицеллы имеют отрицательный заряд внешней поверхности и в молоке они равномерно распределены. Напротив, жировые шарики (жировые глобулы) в молоке не имеют электрического заряда, и, поскольку они нейтральны, они не будут отталкиваться или притягиваться к др. веществам. Однако липиды легче воды, поэтому они поднимаются на поверхность и образуют слой крема. 
2) Мицеллы остаются взвешенными в молоке из-за электрического заряда, отталкивающего их друг от друга. Мицелла состоит из различных белков. Ядро состоит из гидрофобных белков (альфа- и бета-казеинов), в то время как тип белка, который составляет поверхность, имеет как гидрофобную, так и гидрофильную поверхность. Этот белок называется к-казеин (к-казеин), и его гидрофильный (водолюбивый) конец направлен наружу, а гидрофобный водоотталкивающий конец направлен внутрь. Обращенные наружу концы к-казеинов выглядят так, как будто к их поверхности прилипли реснички, и именно здесь находится отрицательный заряд.
2 глобула
3) Когда мы делаем сыр, мы добавляем сычужный фермент (химозин). Ферменты помогают расщеплять вещества, действуя как катализаторы, но остаются стабильными в процессе. Сычужный фермент действует, разрезая концы каппа-казеинов, которые составляют внешнюю поверхность мицеллы и удерживают отрицательный заряд. Сычужный фермент не изменяется в этом процессе, он действует только как «ножницы». Отщепленные отрицательно заряженные концы (гликомакропептиды) остаются подвешенными в растворе, т.к. они все еще отталкиваются друг от друга. Однако мицеллы, потеряв значительную часть своего отрицательного заряда, могут уже свободно перемещаться и находиться в непосредственной близости друг от друга.
химозин (начало работы)
4) Теперь мицеллы могут объединяться в кластеры (белковые агрегаты) и связываться с помощью свободных молекул кальция и магния. Это происходит потому, что свободные кальций и магний имеют положительный заряд, который притягивает их к слегка отрицательно заряженным мицеллам, "склеивая" их вместе. Этот процесс формирует гораздо более плотную структуру белка по сравнению со свертыванием, которое происходит при подкислении молока. Эти связи настолько прочны, что молоко превращается в пудингообразное вещество – творожный сгусток.
образование кальций - магниевых связей
5) Сначала мицеллы случайным образом соединяются в длинные цепочки, но через пару часов после добавления сычужного фермента многие из них подходят так близко друг к другу, что сливаются в более крупные мицеллы, в результате чего образуется творожный сгусток (гель). При этом начинается фаза синерезиса, т.е. самопроизвольное уменьшения объёма геля, сопровождаемое отделением жидкой дисперсионной среды, в результате уплотнения пространственной структурной сетки, образованной частицами дисперсной фазы.
процесс коагуляции (начало)
6) По мере продвижения процесса и слияния все большего количества мицелл образуется более компактная структура, так как пространство между мицеллами сужается. Это сужение выдавливает воду и более мелкие частицы из структуры белка, и таким образом отделяется сыворотка. Большинство жировых шариков (глобул) и молочнокислых бактерий слишком велики, чтобы пройти через казеиновую сетку и поэтому остаются в сгустке. При приготовлении сыра выделение сыворотки усиливается за счет нарезки и дробления сгустка, подкисления молока, атакже нагревания.
процесс коагуляции (усиление )

О сычужной коагуляции с точки зрения физико-химических процессов см. отдельно

4. СЫЧУЖНЫЕ ФЕРМЕНТЫ И КОАГУЛЯНТЫ

sychuzhnyj_ferment.jpg
красно-синяя связь Phe105-Met106 κ-казеина
Рис. 6. справа: Молекулярная модель поверхности к-казеина → красно-синим показана пептидная связь Фенилаланин(105)-Метионин(106)

4.1. Специфичность молокосвертывающего фермента

Свертывание молока - важнейший этап в производстве сыра, и выбор конкретного фермента, способствующего свертыванию, имеет основополагающее значение для выхода сыра, его текстуры и вкуса. Сычужное (энзиматическое) свертывание молока состоит из двух фаз – первичной, энзиматической и вторичной, неэнзиматической (коагуляционной). Энзиматическая фаза (гидролиз к-казеина) протекает под действием молокосвертывающих ферментов, коагуляционная фаза (агрегация мицелл) идет без участия молокосвертывающих ферментов, но в присутствии ионов Са2+.

Широко используемым ферментом, способствующим свертыванию молока, является химозин (EC 3.4.23.4) - аспарагиновая протеаза, которая может гидролизовать специфическую пептидную связь (Phe105-Met106), присутствующую в κ-казеине (см. рис.9.). Эта аспарагиновая протеаза считается наиболее эффективной для сыроделия. С-концевая область κ-казеина обычно гидрофильна и имеет отрицательный заряд при естественном рН молока (рН 6,7). Этот заряд покрывает мицеллы казеина, образуя слой, который обеспечивает стабильность мицелл за счет стерических препятствий и электростатического отталкивания. Гидролиз начинает первую фазу сычужного свертывания (энзиматическую или ферментативную). 

Ядро мицеллы казеина образовано субмицеллами α- и β-казеинов, связанных между собой гидрофобными взаимодействиями, и нерастворимым фосфатом кальция, который представляет собой сшивающий агент. Во время производства сыра снижение рН молока с помощью закваски приводит к солюбилизации части фосфата кальция, который выделяется в виде Ca2+. Последние непосредственно влияют на вторую фазу сычужной коагуляции, еще больше снижая коллоидную стабильность мицелл казеина и приводя к агрегации мицелл при формировании сгустка.

Рассматривая те или иные молокосвёртывающие ферментные препараты (МФП), мы всегда имеем в виду потенциальную возможность их практического использования. Поэтому для характеристики МФП различного генеза используют следующие биохимические параметры: 1) Молокосвертывающая активность (МА), 2) Общая протеолитическая активность (ПА), 3) Специфичность (определяемая как МА/ПА), 4) Термостабильность (ТС), 5) Зависимость МА от рН субстрата, 6) Зависимость МА и ПА от концентрации ионов кальция в субстрате.

Чтобы предсказать образование сгустка, вкусовые качества и текстуру конечного продукта, следует оценить качество молокосвёртывающего фермента по соотношению MA / ПA, характеризующему его специфичность

Молокосвертывающая активность (МА) – это специфичный протеолиз связи Phe105-Met106 в молекуле κ-казеина. Гидролиз этой связи приводит к дестабилизации казеиновых мицелл, в результате чего происходит образование молочного сгустка. Как правило при исследовании МА химозинов в качестве субстрата используют коровье молоко (удельная МА выражается в УЕ/мг или в % от МА эталона - 100%-го телячьего химозина). 

Общая протеолитическая активность (ПА), в отличие от МА, направлена на любые пептидные связи белков молока, за исключением связи Phe105-Met106 κ-казеина. Иными словами, MA относится к специфичности гидролиза фермента свертывания в сторону κ-казеина, тогда как ПA относится к гидролизу белков, присутствующих в сгустке (в основном состоящих из αs1-, αs2-, β- и κ-казеина), что может привести к образованию послевкусия (горечи) в долгосрочной перспективе (общая ПА выражается в тех же единицах, что и МА).

Специфичность МФП или соотношение MA / ПA, подобное телячьему химозину (которое считается эталонным), соответствует высококачественному коагулянту, отражающему высокий выход сгустка и низкий уровень дефектов сыра. Упрощенно можно сказать, что чем выше специфичность, тем универсальнее препарат (т.е. может подходить не только для производства свежих сыров, но и для сыров с длительным периодом созревания).

4.2. ЧТО ТАКОЕ СЫЧУЖНЫЙ ФЕРМЕНТ?

Традиционный (телячий) сычужный фермент представляет собой смесь ферментов, вырабатываемых в желудках жвачных млекопитающих. Химозин, его ключевой компонент, представляет собой фермент протеазу (EC 3.4.23.4), который свертывает казеин в молоке. Часто сычужным ферментом называют именно химозин - ред. В дополнение к химозину, сычужный фермент, получаемый из желудка жвачных (напр., телят) содержит также немного пепсинапротеолитического фермента класса гидролаз (EC 3.4.23.1) В продаже сычужный фермент продается в виде смеси химозина и пепсина (например, в соотношении 96% химозина и 4% пепсина).

Рис.7. Рентгеновский анализ структуры химозина теленка

Реннин (химозин) — фермент из класса гидролаз, который у жвачных животных вырабатывается железами сычуга, отсюда одно из его — сычужный фермент. Сычуг (лат. abomasum) - это последний, 4-й отдел сложного четырехкамерного желудка жвачных животных, так называемый железистый желудок. В сычуге телят, питающихся молоком, вырабатывается реннин (химозин) — пищеварительный сычужный фермент, расщепляющий пептиды. Выделенный из сычугов молодых телят и ягнят, этот фермент используется при изготовлении сыра.

С древних времен человечество использовало экстракты сычуга (четвертого «настоящего» желудка) молодых телят, а иногда и ягнят и козлят в производстве сыра. Сычуг содержит молокосвертывающие ферменты, которые предназначены для быстрого свертывания молока в желудке молодого потомства и тем самым замедляют скорость поступления молока в тонкую кишку. Таким образом, питательные вещества, казеин и жир (последний захваченный казеиновой сетью, которая образуется в результате сычужной коагуляции) молока задерживаются в сычуге до тех пор, пока не будет выделено достаточное количество панкреатического сока для достижения оптимальной усвояемост.

С другой стороны, легко всасываемая вода, лактоза (углеводы) и минеральные вещества молока почти сразу попадают в тонкий кишечник. Хотя происхождение производства сыра точно неизвестно, примерно в 8000 г. до н.э. было обнаружено, что добавление экстракта сычуга только что забитых телят к молоку быстро свертывало молоко и образовывало твердый гель. Это открытие могло быть связано с обнаружением кусочков молочных сгустков (творога) в сычуге молодых телят при их забое.

Расположение сычуга и других отделов пищеварительной системы жвачных животных

Рис. 8: Расположение сычуга и других отделов пищеварительной системы жвачных животных (см. также видео о работе желудка жвачных).

До девятнадцатого века все сыры производились на фермах с использованием свежих экстрактов высушенного сычуга для свертывания молока. Однако в 1850-х годах были созданы небольшие кооперативные молочные заводы, которым требовалось большее количество сычужного фермента (по определению, экстракта сычуга жвачных животных). От названия сычужного фермента произошло слово rennin (реннин) для обозначения молокосвертывающего фермента, который сегодня называется химозином (EC 3.4.23.4) в рекомендуемой международной номенклатуре ферментов. На самом деле тривиальное название химозин использовал еще в 1840 году французский фармацевт Жан Батист Дешам (Jean Baptiste Deschamps).

Молекулярно-каталитические свойства химозина и других молокосвертывающих ферментов

Механизм действия химозина. Химозин расщепляет пептидную связь κ-казеина между Phe105–Met106

Рис. 9: Механизм действия химозина (гидролиз). Химозин расщепляет пептидную связь κ-казеина между Phe105–Met106. Гидрофобная часть показана желтым, а гидрофильная - розовым.

Химозин (EC 3.4.23.4) и другие молокосвертывающие ферменты относятся к группе аспарагиновых (кислых) протеиназ, для которых характерно высокое содержание дикарбоновых и оксиаминокислот и низкое содержание основных аминокислот. Молекулярная масса различных молокосвертывающих ферментов составляет от 30 000 до 40 000 Да. Химозин теленка имеет молекулярную массу 35 600 Да, исходя из его первичной структуры (323 аминокислотных остатка). Химозины разных видов перекрестно реагируют иммунохимически и обнаруживают 75–80% идентичность аминокислотной последовательности N-конца с химозином теленка, который, в свою очередь, имеет примерно 50% идентичность последовательности с пепсинами.

Третичная структура аспарагиновых протеиназ демонстрирует высокую гомологию. Структура содержит расширенную щель, которая содержит сайт связывания, который может вместить по меньшей мере семь аминокислотных остатков субстрата (к-казеина). Внутри расщелины боковые цепи Asp32 и Asp215 отходят от N- и C-концевых доменов и образуют активный центр химозина.

Изоэлектрическая точка и протеолитический оптимум рН всех аспарагиновых протеиназ являются кислыми, хотя ферменты, свертывающие молоко, обладают высокой активностью при почти нейтральном рН (6,5). Общий протеолитический рН-оптимум химозина равен 3,8, но он обладает высокой удельной молокосвертывающей активностью при рН свежего молока, т.е. при pH 6,7. По сравнению с пепсином, который имеет свой общий протеолитический оптимум рН около 2, молокосвертывающая активность 1 мг химозина соответствует активности около 5 мг пепсина при рН 6,7. Существует три генетических варианта химозина, A, B и C, где вариант B является доминирующим (аллельная частота rv50%), а вариант C наиболее редким (rv10%) в экстрактах желудка крупного рогатого скота (КРС). Только один аминокислотный остаток отличает вариант А химозина от варианта В, тогда как информации о первичной аминокислотной последовательности новейшего обнаруженного варианта С химозина до сих пор нет. Согласно последнему отчету, химозин А с аспарагиновой кислотой в положении 244 имеет примерно на 50% более высокую удельную молокосвертывающую активность, чем химозин В, в котором глицин находится в положении 244. Несмотря на разницу в специфической активности по свертыванию молока между вариантами А и В, считается, что оба они обладают одинаковыми свойствами для приготовления сыра.

Каталитический механизм молокосвертывающих ферментов заключается в гидролизе связи Phe105–Met106 к-казеина на поверхности мицеллы казеина. Гидролиз к-казеина дестабилизирует мицеллы казеина, которые коагулируют в присутствии Са2+. Химозин имеет сильное сродство к этому участку к-казеина и обладает самой высокой удельной молокосвертывающей активностью из аспарагиновых протеиназ.

Другие аспарагиновые протеиназы свертывания молока, то есть пепсин, протеиназа Rhizomucor miehei (EC 3.4.23.6), протеиназа Rhizomucor pusillus (EC 3.4.23.6) и протеиназа Cryphonectria (ранее Endothia) parasitica (EC 3.4.23.6), имеют удельную молокосвертывающую активность (МА) ниже, чем у химозина. Следует также помнить, что условия молокосвертывания, такие как рН, содержание кальция и температура, сильно влияют на молокосвертывающую активность; молокосвертывающая активность пепсина особенно сильно зависит от рН. Было показано, что химозины овец и коз обладают более высокой специфичностью к овечьему и козьему молоку, соответственно, чем к коровьему молоку. Противоположное, конечно, имеет место в случае с говяжьим химозином.


Дополнение от редактора

ПОЛУЧЕНИЕ СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА В ФЕРМЕРСКИХ ХОЗЯЙСТВАХ

zheludok_zhvachnyh_zhivotnyh1

Рис. 10: Строение желудка жвачных животных

Ниже описывается вариант получения сычужного фермента

Как известно, сычужный фермент получают из сычугов молочных телят и ягнят, т.е. в возрасте 2...4 нед. У убитых животных удаляют сычуг, и его содержимое не промывают, чтобы не вымывать фермент. Затем перевязывают один конец шпагатом, а через другой, через трубочку, вдувают воздух и завязывают второй конец. Сычуг подвешивают в сухом помещении для просушивания. Высушенные сычуги складывают пачками по несколько штук, заворачивают в ткань или бумагу и хранят в подвешенном состоянии в сухом помещении (в настоящее время животные сычужные ферменты получают в основном из замороженных сычугов - ред.).

Чтобы высушить вяленый сычуг, надуйте его насосом и оставьте сушиться на воздухе. Схема отделения сычуга от желудка теленка

Рис. 11: Схема отделения сычуга от желудка теленка (а), его надувание (после удаления содержимого) (б), сушка сычугов (в)

Сычуги используют через 3...4 мес для приготовления фермента. Чтобы приготовить раствор фермента, концы сычугов отрезают. Затем широкий конец одного сычуга прикладывают к узкому концу другого. Это позволяет выровнять крепость закваски. Пакет сычугов нарезают на мелкие кусочки в виде домашней лапши. Измельченный сычуг настаивают на рассоле и на кислой сыворотке. Для приготовления кислой сыворотки берут сыворотку из-под сыра и оставляют на 36...48 ч для скисания при комнатной температуре. По достижении кислотности 70...80°Т сыворотку пастеризуют и тщательно фильтруют для удаления свернувшегося белка. Для получения рассола 5% соли добавляют в чистую воду, кипятят и охлаждают до 30...32 °С. В металлической посуде настаивать нельзя.

Измельченный сычуг заливают рассолом из расчета 10 г сычуга на 250 мл рассола и выдерживают примерно 5 ч при 30...32 °С. После набухания сычугов рассол фильтруют через марлю. Фильтрат выливают обратно в сосуд с сычугами, туда же наливают кислую сыворотку из расчета 1 л на 10 г сычуга и выдерживают при 36...38 °С в течение 2.. .3 сут. Сычужный фермент в основном переходит в раствор. Если кусочки всплывают — раствор плохой, не всплывают — хороший.

В дополнение к химозину жвачные животные выделяют еще и пепсин - другой фермент, свертывающий молоко (об этом будет сказано ниже). Пепсин можно также изготовить из желудков здоровых свиней независимо от возраста → желудок отрезают от пищевода и кишечника, вскрывают по малой кривизне, промывают изнутри водой температурой 30...35 °С. Снимают слизистую оболочку, измельчают на мясорубке и настаивают на подкисленной, чистой, кипяченой воде, охлажденной до 36...38 °С. На 1 л воды добавляют 15 мл соляной кислоты. Условия настаивания такие же, как у сычужного фермента. На каждые 300 г измельченной массы слизистой оболочки берут 1 л подкисленной воды. Настой пепсина сливают, фильтруют, разливают в стеклянные бутылки и хранят в прохладном и темном помещении.

Определения потребности в сычужном ферменте

На сыродельных заводах для определения потребности в сычужном ферменте пользуются прибором, представляющим собой эмалированную кружку емкостью 1 л. На внутренней стенке нанесены деления, в дне кружки — отверстие, через которое молоко, занимающее объем от верхнего, нулевого, до нижнего, пятого, деления, вытекает приблизительно за 4 минуты (см. рис. ниже).

кружка для определения количества сычужного фермента или пепсина при свертывании молока

Рис. 12: кружка для определения количества сычужного фермента или пепсина при свертывании молока: 1 - ниппель; 2 - резиновая пробка

Перед началом работы одну ложечку сычужного фермента (2,5 г) после перемешивания с равным количеством соли растворяют в 95 мл воды. Прибор заполняют подготовленным для свертывания молоком и устанавливают на край ванны так, чтобы вытекающее из отверстия молоко попадало в ванну. Когда уровень молока в приборе будет на нулевом делении, в молоко вносят 10 мл подготовленного сычужного раствора и быстро перемешивают шпателем (для приготовления раствора берут 2,5 г сычужного фермента (порошок) и смешивают с 2,5 г поваренной соли, затем добавляют 95 мл воды температурой 35 °С). В момент образования сгустка вытекание молока из прибора прекращается. Отмечают деление шкалы, на котором остановился уровень молока. Это деление показывает, какое количество сычужного фермента (г) необходимо для свертывания 100 кг молока за 30 минут. Расчет производят по формуле:

А = М*Н / В,

где А — количество ложечек сычужного порошка, необходимое для свертывания молока в течение 30 минут; М — количество молока в ванне (ц); Н — показания прибора; В — вес одной ложечки сычужного порошка (г).

Под крепостью сычужного фермента понимают время в секундах, в течение которого свертывается 100 мл молока под действием 10 мл раствора сычужного фермента.

Для определения крепости берут 100 мл молока; помешивая, быстро вносят 10 мл раствора фермента, останавливают движение молока, отмечают время по секундомеру и наблюдают за образованием сгустка. Сгусток готов, если он сползает со стенки наклонного ковша и не оставляет следов белка. Свертываемость молока — это его способность переходить из жидкого состояния (золя) в гель.


4.3. Сычужный фермент - соотношение химозин / пепсин

Как обсуждалось выше, сычужный фермент производился в основном из сычуга молодых телят, то есть телячьего сычужного фермента, вплоть до конца двадцатого века. Причина секреции специфического фермента, свертывающего молоко, химозина, в желудке новорожденных жвачных животных заключается в том, что они получают свои иммуноглобулины из молозива, то есть молока, выделяемого в течение первых 2-3 дней лактации. Химозин обладает достаточной протеолитической активностью для свертывания молока, но его общая протеолитическая активность слишком слаба, чтобы сильно повредить иммуноглобулины. Напротив, у других видов млекопитающих иммуноглобулины передаются через кровь от матери к плоду внутриутробно.

СЫЧУЖНЫЙ ФЕРМЕНТ

В дополнение к химозину жвачные животные также выделяют ферменты, свертывающие молоко, пепсин (ЕС 3.4.23.1) и гастриксин (ЕС 3.4.23.3); последний является второстепенной протеиназой у жвачных животных и не будет обсуждаться далее. Пепсин обладает, в дополнение к своей активности по свертыванию молока, сильной общей протеолитической активностью в кислых условиях сычуга / желудка. И химозин, и пепсин продуцируются и секретируются главными клетками слизистой оболочки, а в некоторой степени и клетками фундальной области слизистой оболочки сычуга (от слова fundus – дно – округлая, часто заполненная газом часть желудка, расположенная выше и левее кардииред.). Собственно гранулы аппарата Гольджи клеток содержат оба фермента. Они продуцируются в виде неактивных зимогенов (т.е. прохимозина и пепсиногена) и активируются до химозина и пепсина при низком рН благодаря присутствию соляной кислоты (HCl), секретируемой париетальными клетками фундальных желез. Эти железы защищены от протеолитической деградации муцинами, секретируемыми эпителиальными клетками слизистой оболочки сычуга.

телячий химозинСоотношение химозина и пепсина в слизистой оболочке сычуга зависит от режима кормления и возраста жвачных. С рождения и даже с 10-й по 20-ю неделю беременности химозин является доминирующей протеиназой в сычуге телят. Пока теленок находится на подсосном или молочном вскармливании, доля химозина, определенная по молокосвертывающей активности при рН 6,5, составляет около 90% (таблица 1). Доля химозина остается на высоком уровне (75%) даже у 6-месячного теленка на пастбищном вскармливании, если ему дают молоко (пососать вымя). Однако, если теленка отлучают от вымени и кормят немолочными концентратами, доля химозина снижается примерно до 30% в возрасте 6 месяцев. Затем доля химозина с возрастом снижается, и у взрослого крупного рогатого скота обнаруживаются только следы химозина. Таким образом, можно сделать вывод, что кормление молоком и доля химозина тесно связаны.

Таблица 1. Влияние режима кормления и возраста на долю (%) химозина или пепсина (определяемого по активности свертывания молока при рН 6,5) в экстрактах из говяжьего сычуга.

Кормление
Возраст
(месяцев)
Химозин
(%)
Пепсин
(%)
Теленок на молочном подсосе
<3
90
10
Теленок на пастбищном вскармливании и молоке
6
75
25
Теленок на концентрированном вскармливании
6
30
70
Корова, откармливаемая концентратом и сеном
>24
Следы
100

В настоящее время животные сычужные ферменты получают в основном из замороженных сычугов (ранее использовали только сушеные сычуги), которые измельчают в специальных мельницах и экстрагируют их молокосвертывающие зимогены в солевом растворе NaCl 3-10 г на 100 г. Зимогены активируют до химозина и пепсина путем снижения рН примерно до 2 в течение 1 ч, а затем доводят до примерно рН 5,5 перед фильтрованием и концентрированием экстракта. Экстракт дополнительно фильтруют для удаления бактерий, а затем повышают концентрацию NaCl примерно до 20 г на 100 г. Поскольку пропорции химозина и пепсина в экстракте сычуга зависят от возраста и режима кормления животных, от которых получают сычуг, различные партии сычужного фермента смешивают, чтобы получить желаемую пропорцию химозина и пепсина. Наконец, сычужный фермент разбавляют до определенной концентрации (общей молокосвертывающей активности), которая варьируется в зависимости от страны. Сычужные ферменты обычно распространяются в виде жидкостей, но могут быть и в виде порошка. Следует отметить, что получение сычужных ферментов из крупного рогатого скота старшего возраста, то есть сычужного фермента взрослого крупного рогатого скота (КРС), вызывает большие трудности на стадиях фильтрации из-за высокой концентрации муцинов в экстракте. Производители сычужных ферментов решают эту проблему по-разному.

Экстракты из овечьего и козьего сычуга также используются в качестве сычужных ферментов, но в гораздо меньшей степени, чем сычуг крупного рогатого скота. Ожидается, что доля химозина и пепсина в этих сычужных ферментах будет зависеть также от возраста и режима кормления животных, от которых получают сычуг.

4.4. Сычужный фермент (химозин) - это прежде всего аспарагиновая протеиназа

Материал со ссылками

Пептидазы (протеазы, протеиназы) представляют собой большую и важную группу ферментов, многие из которых нашли применение в технологических процессах, связанных с продуктами питания, напитками, кормами, лекарствами, моющими средствами, производством химикатов, обработкой кожи, бумаги и текстиля. Активными ферментами, свертывающими молоко, во всех препаратах, которые успешно используются в производстве сыра, являются аспарагиновые протеиназы (EC 3.4.23), которые названы так потому, что остатки аспарагиновой кислоты (Asp) являются лигандами активированной молекулы воды в своих активных центрах, которые опосредуют нуклеофильные атаки на расщепляющиеся пептидные связи [119].

Гидролиз белка путем нуклеофильной атаки воды
Рис. 13. Гидролиз белка путем нуклеофильной атаки воды

Химозин расщепляет однопептидную связь Phe105-Met106 κ-казеина Рис. 14. Химозин расщепляет однопептидную связь Phe105-Met106 κ-казеина, а H2O действует как нуклеофил.

Прим. ред.: Аминокислотные остатки (Asp34 и Asp216) в молекуле химозина образуют координационную связь с молекулой воды (H2O), которая, действуя как нуклеофил, атакует карбонильный углеродный атом гидролизуемой пептидной связи → В целом, молекула химозина существует в виде двух доменов, разделенных расщеплением активного сайта, в котором расположены указанные аспартильные остатки, боковые цепи которых ориентированы в сторону расщепления. Активная щель может вмещать ≈7 остатков последовательности κ-казеина. В подавляющем большинстве известных аспарагиновых пептидаз два остатка Asp действуют вместе, связывая и активируя каталитические молекулы воды, но в некоторых остатки других аминокислот заменяют второй остаток Asp. Одной примечательной характеристикой аспарагиновых пептидаз является то, что все эти ферменты, описанные до сих пор, являются эндопептидазами. Эндопептидазы расщепляют пептидные связи во внутренних частях своих полипептидных цепей, вдали от N- и С-конца.

Пептидазы различаются по функциональной группе (каталитический тип) в их активном центре (обозначают лат. буквами): (A) для аспартата (аспарагиновые протеазы), (C) для цистеина (цистеиновые протеазы), (G) для глутаминовая кислота (глутаминовые протеиназы), (M) для металла (металлопротеиназы), (P) для смешанного типа (смешанные пептидазы), (S) для серина (сериновые протеазы), (T) для треонина (треониновые протеазы), (N) для аспарагиновой пептидлиазы, и (U) для пока еще неклассифицированных пептидаз неизвестного каталитического типа. Основываясь на статистически значимом сходстве в их первичных структурах, пептидазы классифицируются на семейства (приблизительно 268), которые идентифицируются буквой, представляющей их каталитический тип. Кроме того, некоторые семейства могут содержать подсемейства. Некоторые семейства делятся на подсемейства на основании свидетельств древней дивергенции внутри семейства (например, S1A, S1B). Затем семьи группируются примерно в 62 клана в соответствии со сходством их трехмерных структур. Некоторые кланы делятся на подкланы на основании свидетельств древних разногласий внутри клана. Название клана состоит из двух букв. Первая буква представляет тип катализатора, а вторая буква присваивается последовательно по мере идентификации каждого клана. Этот метод классификации используется в базе данных MEROPS [120] для пептидаз и белков, которые их ингибируют [121,122].

В дополнение к этой классификации, в зависимости от функциональной группы в активном пептидазном сайте, пептидазы дополнительно классифицируют по специфичности определенных аминокислот («специфичность последовательности»), образующих чувствительные пептидные связи. Например, аспарагиновые эндопептидазы из семейства пепсинов гидролизуют пептидные связи с большими гидрофобными аминокислотами в P1 или P1' (касательно P1 и P1' см.: Общая модель ферментативного расщепления) [121, 123, 124].

Аспарагиновые пептидазы относят к кланам AA, AC, AD, AE и AF [121]. Они представляют собой группу пептидаз семейства пепсинов (А1) с одинаковым каталитическим механизмом и обычно функционируют в кислых растворах, поэтому их называют кислыми пептидазами. Аспарагиновые пептидазы имеют долгую историю и обнаруживаются у животных, грибов, растений, простейших, бактерий и вирусов. Особенность действия в специфических кислых средах ограничивает их функции в живых организмах и они менее многочисленны, чем другие группы пептидаз, но в силу своей большой физиологической и коммерческой значимости этот класс пептидаз уникален [125]. Большинство аспарагиновых протеаз проявляют максимальную активность при низких значениях рН (рН от 3 до 4) и имеют изоэлектрические точки в диапазоне рН от 3,0 до 4,5. Их молекулярные массы составляют от 30 до 45 кДа [126].

Согласно классификации в банках данных MEROPS, химозин (EC 3.4.23.4) относится к клану АА, семейству (пепсин) А1, подсемейству А1А пептидаз в составе третьего класса гидролаз.

Дешам (Deschamps) впервые выделил этот фермент в 1840 г. и предложил название химозин (греч. chyme, «желудочный сок») [126]. В 1890 г. Леа и Дикинсон (Lea and Dickinson) [129] предложили название ренин (rennin) (производное от сычужного фермента (rennet)), но из-за путаницы с родственным протеолитическим ферментом, ренином, из почек, в 1970 г. Фолтман (Foltman) предложил вернуться к первому названию, химозин, который был принят Международным союзом биохимии и молекулярной биологии (IUBMB) [130]. В 1872 году Олоф Хаммарстен (Olof Hammarsten) показал, что сычужный фермент (химозин) синтезируется и сохраняется в неактивной форме и активируется при контакте с желудочной кислотой; это было первое подробное исследование воздействия сычужного фермента на казеин [131].

Согласно банкам данных MEROPS, пепсин А является членом клана АА, семейства (пепсин) А1, подсемейства А1А пептидаз в составе третьего класса гидролаз [127,132]. Пепсин А (EC 3.4.23.1), известный просто как «пепсин» (pepsin), был открыт и признан в 18 веке первым ферментом, запускающим переваривание пищевых белков в желудке. Пепсин был первоначально назван Шванном (Schwann) в 1825 году. Пепсин является преобладающей желудочной пептидазой в желудочном дне (in the fundus) взрослых млекопитающих [121,131,132,131,132] и исключительно стабилен и активен в кислых условиях. Это эндопептидаза, характеризующаяся более низкой удельной активностью, высокой общей протеолитической активностью и высокой зависимостью от рН. Пепсин B (EC 3.4.23.2) представляет собой минорную протеиназу, обнаруженную в желудках свиней [1].

Аспарагиновые пептидазы растений являются членами кланов AA и AD. В клане АА они распределены по семействам А1, А3, А11 и А12. Большинство растительных аспарагиновых пептидаз вместе с пепсиноподобными ферментами относятся к семейству А1 [133].

химозин и пепсин

Рис. 15.: Модель молекулярной поверхности химозина и пепсина

Сычужный фермент (смесь химозина и пепсина) вырабатывается в четвертом отделе желудка (сычуге) сосущих жвачных животных (телят, ягнят, козлят/коз и др.). Химозин представляет собой неонатальную пептидазу, которая имеет постнатальное поглощение иммуноглобулинов [1] и может быть обнаружена у плодов уже с шестого месяца беременности, с наибольшим увеличением между девятым месяцем и третьим или четвертым днем ​​​​после родов [134]. Причиной секреции химозина в желудке новорожденных жвачных животных является свертывание молока для повышения питательной ценности при задержке в кишечнике, что позволяет молодняку ​​утилизировать больше питательных веществ. Обе пептидазы (химозин и пепсин) секретируются в неактивной форме в виде зимогенов (прохимозина и пепсиногена) в канал, непосредственно связанный с просветом желудка, и активируются низким рН в сычуге до химозина и пепсина путем удаление N-концевого про-сегмента. Просегмент отвечает за стабильность неактивных форм зимогенов и предотвращает связывание субстрата с активным центром. Химозин представляет собой полипептид, состоящий из 323 аминокислот, с молекулярной массой 35,6 кДа [119, 135].

Обычно химозин обладает низкой протеолитической активностью, но высокой молокосвертывающей активностью. Химозин телят обладает узкой субстратной специфичностью и расщепляет специфическую однопептидную связь Phe105-Met106 κ-казеина, превращая его в нерастворимую форму творога с кальциевым пара-κ-казеином (указана связь между аминокислотными остатками в положениях 105 (фенилаланин) и 106 (метионин) – ред.) [136].

Согласно Harboe et al. [1], было обнаружено, что химозин обладает высокой активностью в отношении молока своего вида. Химозин телят встречается в трех аллельных формах: A, B и C. Наиболее распространен химозин B. Основное различие между вариантами A и B заключается в том, что вариант A имеет аспарагиновую кислоту (Asp) в положении 244, а вариант B имеет глицин (Gly) в том же положении. Вариант А обладает на 50% большей протеолитической активностью, чем форма В [126]. Вариант С генетически отличается и является продуктом другого аллеля [137]. Благодаря использованию в сырной промышленности химозин теленка хорошо изучен и охарактеризован на ферментативном и молекулярном уровнях [133].

5. Типы сычужных ферментов и другие коагулянты в производстве сыра

животные для ферментов молокосвертывающих

Отдельно по теме см. по ссылке:

Протеолитические ферменты, применяемые в сыроделии

Важнейшим ферментным препаратом в производстве сыра является сычужный фермент. Это смесь химозина и пепсина, которая отвечает за свертывание молока, а также за протеолитические процессы во время созревания сыра. Традиционно сычужный фермент получали путем экстрагирования желудочного сока млекопитающих-сосунков (телят, ягнят или козлят) для получения сычужного фермента животного происхождения. До 19 века сыр производился непосредственно на фермах, и производители использовали домашние экстракты из высушенного сычуга для свертывания молока. Начиная с 1850-х годов были созданы кооперативные молочные заводы, что увеличило потребность в производстве большего количества сычужного фермента [126]. Промышленное производство телячьего сычужного фермента (химозина) восходит к 1874 году в Дании, когда Кристиан Хансен наладил технологию извлечения химозина из сычуга телят для производства сыра. Сычужный фермент был первым промышленно производимым ферментным препаратом, продаваемым со стандартизированной активностью фермента.

дрожжи, плесени, бактерии и химозин

Рис. 16: Микробные продуценты молокосвертывающих ферментов

Рост производства сыра во всем мире в 20-м веке привел к нехватке сычужного фермента, поскольку примерно в 1950-х и 1960-х годах спрос начал превышать доступное предложение [138]. Эта проблема была решена с введением новых типов молокосвертывающих агентов, таких как животные сычужные ферменты (например, бычий пепсин) [139], микробиальные сычужные ферменты (Rhizomucor miehei, Rhizomucor pussillus, Parasitica coagulans) [140], ферментативно-продуцируемый химозин. (FPC), полученный из Kluyveromyces marxianus var. lactis и Escherichia coli K-12 [141] или агенты растительного происхождения (Calotropis procera, Cynara cardunculus) [142, 143].

Химозин теленка является одним из наиболее часто изучаемых ферментов животных, и он был одним из первых ферментов млекопитающих, который был успешно клонирован в 19 веке [144, 145]. Из-за своей коммерческой важности ген химозина является наиболее часто используемым, он был клонирован и экспрессирован на более высоком уровне в различных микробных хозяевах, таких как: (1) бактерии Escherichia coli (Pfizer) [145, 146, 147], (2) плесень Aspergillus niger (C. Hansen) [1] и (3) дрожжи Kluyveromyces marxianus var. lactis (Gist-brocades) [1,148]. Химозин крупного рогатого скота также успешно клонируется в других микробных хозяевах, таких как A. nidulans [149] и Pichia pastoris [150, 151, 152, 153]. Существует значительный объем научной литературы о производстве и биохимических свойствах рекомбинантного химозина других видов млекопитающих: (1) верблюда [133,154,155,156,157], (2) ягненка/овцы [158], (3) козленка/козы [155,159,160,161], (4) буйвола [155,162,163], (5) яка [164,165] и (6) альпака [166].

Согласно Jacob et al. [167], из всех коагулянтов или заменителей сычужного фермента рекомбинантный химозин Bos Taurus на сегодняшний день является наиболее известным генно-инженерным свертывающим ферментом. Недостатком FPC (ферментативно-продуцируемого химозина) является его производство путем ферментации с использованием генетически модифицированных организмов, что может быть причиной, по которой потребители предпочитают разные продукты. Микробные сычужные ферменты, с другой стороны, не являются продуктами ГМО; их легко производить в неограниченных количествах, и их характеристики могут быть улучшены с помощью инструментов биотехнологии [168]. Поскольку они не производятся из тканей животных (например, теленка, ягненка, козленка), нет возможности передачи губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE) или скрепи [167]. Микробные коагулянты, однако, проявляют более высокую протеолитическую активность по сравнению с сычужным ферментом или FPC, что может привести к снижению выхода сыра во время производства и развитию горечи в процессе созревания [167,168]. Растительные или овощные коагулянты редко используются для коммерческого производства [133]. Бен Амира и др. [169] утверждают, что использование растительных коагулянтов очень ограничено для крупномасштабного производства из-за их негативного влияния на выход сыра и развитие горечи. Бен Амира и др. [169] утверждают, что использование растительных коагулянтов очень ограничено для крупномасштабного производства из-за их негативного влияния на выход сыра и развитие горечи. Гарсия и др. [170] сообщили, что содержание сухого вещества, твердость, клейкость и жевательность показали значительные различия в сырах, приготовленных с использованием растительных коагулянтов и телячьего сычужного фермента, причем более высокие значения были получены в сырах, приготовленных с использованием растительных коагулянтов. Мануэльян и др. [171] в своем исследовании моцареллы, приготовленной из буйволиного молока, сообщили о более медленной коагуляции после добавления растительных коагулянтов, чем при использовании сычужного фермента. Они пришли к выводу, что более длительное время свертывания можно преодолеть, добавив больше коагулянта, но необходимы дальнейшие исследования для оценки сенсорных свойств и текстурных характеристик продукта. Пептидазы, экстрагированные из цветков Cynara cardunculus, использовались для изготовления овечьих сыров кустарного производства в Португалии и Испании, особенно сыра Серра-да-Эштрела [143].

Оригинальный препарат сычужного фермента, обычно называемый животным сычужным ферментом, представляет собой экстракт из сычуга жвачных животных. В соответствии с этим определением для ферментных препаратов из желудков жвачных животных принято название «сычужный фермент», а другие молокосвертывающие ферменты следует называть «коагулянтами».

Сычужные ферменты и коагулянты в основном классифицируются в зависимости от их источника: (1) сычужный фермент животного происхождения и коагулянты, (2) микробные коагулянты, (3) химозин, образующийся при ферментации, и (4) растительные коагулянты. Химозин, продуцируемый генетически модифицированным организмом, например, Aspergillus niger и Kluyveromyces lactis, называется ферментативно-продуцируемым химозином (FPC) [1,133,172]. Согласно литературному обзору, известными ферментативно-продуцируемыми химозинами (FPC) млекопитающих являются рекомбинантный говяжий химозин [155], овечий прохимозин [158], козий прохимозин [159, 173, 174], химозин водяного буйвола [162] и верблюжий химозин [154].

Сычужный фермент, получаемый из желудочного сока молокососущих телят (ягнят, козлят), производят в жидком, твердом и пастообразном виде. Сычужные ферменты в виде паст традиционно используются в странах Средиземноморья на кустарном уровне и содержат различные количества липолитической активности с химозином и пепсином [119,175,176].  Сычуг ягнят и козлят используется в Греции для производства сыра Фета и Кефалотири из овечьего и козьего молока [175].

Из-за высокого содержания химозина сычужный фермент телят считается идеальным ферментным продуктом для сыроварения [1]. В сычуге и экстрактах из его тканей соотношение химозина и пепсина варьирует. Соотношение между этими двумя ферментами зависит от возраста и режима кормления животного, как показано в таблице 3 [126,177]. Наиболее желательное соотношение химозина и пепсина при приготовлении сыра в обычном сычужном ферменте телят составляет 80:20 [119, 126, 177]. Как правило, экстракты молочных животных содержат больше химозина, а экстракты взрослых животных — пепсина. В мировом производстве сычужного фермента животных забивают в разном возрасте, а в экстрактах используется разная смесь ферментов.

Таблица 2. (вариант табл. 1) - Соотношение химозина и пепсина в слизистой оболочке сычуга крупного рогатого скота в зависимости от возраста и режима кормления.

Стадия разведения
Возраст (месяцы)
Кормление
Химозин
(вес. %)
Пепсин
(вес. %)
Ref
Теленок сосунок
<3
Молоко
80–90
10–20
[126,177]
Теленок, вскормленный молоком
3–6
Молочное и пастбищное вскармливание
70–75
25–30
Теленок на концентрированном вскармливании
6
Зерновые и сено
12
88
Телка
12–24
Зерновые и сено
2
98
Корова
>24
Зерновые и сено
следы
100

Хотя химозин теленка является промышленным золотым стандартом для производства сыра, химозин из других источников животного происхождения (например, ягненка, козленка, буйвола и верблюда) также изучался в качестве альтернативы [119, 133]. Существует несколько продуктов из баранины/овчины и козлят/коз, но они лучше всего подходят для свертывания молока своего вида [1,178]. Наиболее часто используемой альтернативой сычужному ферменту телят является сычужный фермент взрослого крупного рогатого скота. Наиболее распространенными коммерчески доступными рекомбинантными химозинами являются Chy-max, получаемые путем ферментации в E.coli K-12; Chymogen и ChymoStar, продуцируемые Aspergillus niger var awamori; и Maxiren, полученный из Kluyveromyces marxianus var lactis. Протеиназа из R. miehei была клонирована и экспрессирована в Aspergillus oryzae компанией Novo Nordisk A/S (Дания) [1].

По материалам: Fabijan Oštarić, et al. Challenging Sustainable and Innovative Technologies in Cheese Production: A Review Processes 2022, 10(3), 529


6. ЕДИНИЦЫ И СТАНДАРТЫ АКТИВНОСТИ МОЛОКОСВЁРТЫВАЮЩИХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

analiz_sychuzhnyh_fermentov_i_zamenitelej_sychuzhnyh_fermentov.png

Rennet

6.1. Единица Сокслета

Характеристика сычужных ферментов примерно с 1870 г., когда они были впервые произведены в промышленных масштабах, до 1950-х гг. основывалась на силе (общей молокосвертывающей активности), поскольку составы сычужных ферментов были весьма схожи, то есть в сычужном ферменте теленка преобладал химозин. Силу сычужных ферментов выражали в единицах Сокслета (Soxhlet unit), которые первоначально определяли как объем сыропригодного молока, которое может быть свернуто одной единицей объема (1 мл или 1 г) сычужного фермента за 40 мин (2 400 с) при 35°С. Этот результат выражается в соотношении (например, 1:5000, т.е. 1 мл сычужного фермента свертывает 5000 мл молока). Однако из-за различий в свертывающей способности сырого молока это определение не является удовлетворительным.

6.2. Единица Берриджа

Усовершенствование анализа свертываемости молока было опубликовано английским ученым Н.Дж. Берриджем (NJ Berridge) в 1952 году, который предложил использовать стандартизированное сухое молоко, разведенное в 0,01 моль л-1 CaCl2, в качестве субстрата в тестах активности. Единица Берриджа, или сычужная единица (RU), определяется как активность, которая способна свертывать 10 мл стандартизированного молока (рН 6.3) за 100 с при 30°С. До 1990-х годов единицы Сокслета и Берриджа в значительной степени использовались почти для всех национальных определений силы сычужного фермента и тестов на свертываемость молока. Однако различия в составе сычужных ферментов и заменителей сычужного фермента, присутствующих сегодня на рынке, делают старые определения слишком неопределенными и неточными.

6.3. Международные стандарты

В сычужных ферментах может преобладать либо химозин (сычужный фермент теленка), либо пепсин (бычий сычужный фермент), и в них могут быть различные пропорции химозина и пепсина между этими крайними значениями. Поскольку свертывающая активность пепсина при снижении рН возрастает гораздо больше, чем активность химозина, тест на свертываемость молока необходимо проводить при определенном рН, близком к рН сыропригодного молока (6.5). В противном случае активность пепсина будет завышена, как в случае использования субстрата Берриджа, содержащего 0,01 моль л-1 CaCl2, имеющего рН около 6,3 и очень высокое содержание кальция.

Кроме того, грибковые (микробиальные) заменители сычужного фермента содержат ферменты, свертывающие молоко, различного происхождения, и их характеристики в отношении активности свертывания молока различаются по сравнению с обычными сычужными ферментами (как телячьими, так и взрослого КРС) и между собой.

Стало очевидным, что существует потребность в международных стандартных методах определения состава и силы действия сычужных ферментов и заменителей сычужного фермента. В IDF над этим работала группа экспертов, и в настоящее время опубликовано четыре международных стандарта. Один предназначен для определения состава сычужного фермента КРС, а три других определяют силу сычужного фермента КРС, микробиальных коагулянтов и овечьего/козьего сычужного фермента соответственно.

6.3.1. Состав сычужного фермента

Состав сычужного фермента КРС (т.е. фермента крупного рогатого скота: телят и взрослых особей) можно определить с помощью стандарта IDF 110:2010a (см. также ISO 15163:2012 | IDF 110:2012), который выражает результаты в процентах активности химозина и пепсина или в миллиграммах активного химозина и пепсина на литр. Предпочтительно использовать процентное выражение активности из-за лучшей повторяемости и воспроизводимости анализа. Принцип метода заключается в том, что химозин и пепсин хроматографически разделяют на две фракции на анионообменной колонке. Затем определяют молокосвертывающую активность фракций химозина и пепсина относительно одного из двух международных эталонных порошков сычужного фермента (см. ниже) на стандартизированном молочном субстрате (содержащем 0,05 г на 100 мл CaCl2) при рН 6,5 и температуре 32°С. Процент молокосвертывающей активности химозина и пепсина рассчитывают по результатам тестов активности. Однако общую молокосвертывающую активность не следует рассчитывать путем сложения активности обеих фракций из-за некоторых потерь ферментов на колонке и трудности точного определения количества сычужного фермента, введенного в колонку.

Происхождение микробных коагулянтов или любой примеси в составе сычужного фермента КРС (телячьего и взрослого), т.е. наличие микробных коагулянтов или свиного пепсина, можно определить иммунологическим методом, описанным в приложении А к выше указанному стандарту. Если обнаруживается, что сычужный фермент КРС содержит ферменты, не способствующие свертыванию молока, результаты определения содержания химозина и пепсина в сычужном ферменте ненадежны, поскольку на состав фракций могли повлиять другие коагулянты.

6.3.2. Молокосвёртывающая активность сычужных ферментов

Общая свертывающая активность сычужных ферментов КРС (телят и взрослых особей) может быть проанализирована методом, описанным в стандарте (ISO 11815:2007 | IDF 157:2007). Принцип способа заключается в том, что активность сычужного фермента, способствующую свертыванию молока, определяют относительно активности двух эталонных порошков сычужного фермента международного стандарта, то есть одного сычужного фермента теленка (активность химозина ≥98%) и одного сычужного фермента взрослого КРС (активность пепсина ≥98%) (см. ниже).

Ассоциация производителей пищевых ферментов животного происхождения (AMAFE), назначенная IDF, произвела большие партии контрольных стандартных порошков как телячьих, так и из сычуга взрослых особей. Молокосвертывающая активность этих партий была отрегулирована так, чтобы она была точно такой же на стандартизированном молочном субстрате (0,05 г на 100 мл CaCl2) при pH 6,5 и 32 0C: она установлена на уровне 1000 международных единиц свертывания молока на грамм (IMCU g-1) → Эталонные порошки можно приобрести непосредственно в AMAFE по адресу, указанному в стандарте IDF 157:2007. Когда в будущем запасы исходных больших партий эталонных порошков будут исчерпаны, будет указана общая активность новых партий по свертыванию молока относительно старых партий.

Таким образом, общую молокосвертывающую активность образца сычужного фермента измеряют относительно обоих эталонных порошков при рН 6,5 и 32°С на стандартизированном молочном субстрате (0,05 г на 100 мл CaCl2). Полученные результаты интерполируются по отношению к составу образца сычужного фермента. Например, если состав сычужного фермента содержит 75% химозина и 25% пепсиновой активности, следует суммировать 75% относительной активности по свертыванию молока по сравнению с эталонным сычужным ферментом для телят и 25% относительной активности по свертыванию молока по сравнению с эталонным сычужным ферментом для взрослого КРС. Результаты приведены в международных единицах свертывания молока на миллилитр или на грамм (IMCU ml-1 или IMCU g-1).

Примечание: Общая свертывающая активность рекомбинантного химозина (FPC) измеряется только по отношению к эталонному сычужному ферменту для телят, поскольку FPC содержат 100% химозина.

Для измерения общей молокосвертывающей активности овечьего и козьего сычужных ферментов, включая сычужную пасту, подходит Стандарт IDF 199:2006. Принцип и эталонные стандартные порошки такие же, как и для говяжьего сычужного фермента (IDF 157:2007).

6.3.3. Стандарт для молокосвертывающей активности микробных коагулянтов

Существует также Международный стандарт IDF (176:2010b) для общей активности свертывания молока наиболее широко используемых микробных коагулянтов (коагулянт Miehei, коагулянт Pusillus и коагулянт Parasitica). Принцип этого метода тот же, что и для сычужных ферментов КРС (IDF 157:2007), но используется стандартный эталонный порошок протеиназы R. miehei. Общая свертывающая активность контрольного порошка микробной протеиназы определяется в соответствии с международным эталонным порошком сычужного фермента для телят, то есть устанавливается на фиксированное значение относительно контрольного порошка сычужного фермента для телят. Микробиологический эталонный порошок можно получить у производителя, указанного в стандарте IDF 176:2010b.

Источник: Использовались данные из статьи Anders Andrén. Cheese: rennets and coagulants. Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition) - 2011, Pages 574-578

Дополнительная информация

Разделы по теме сыроделия:

Литература:

  1. Harboe, M.K.; Broe, M.L.; Qvist, K.B. The Production, Action and Application of Rennet and Coagulants. In Technology of Cheesemaking, 2nd ed.; Law, B.A., Tamime, A.Y., Eds.; John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ, USA, 2010; pp. 98–129. [Google Scholar]
  2. Fox, P.F.; Guinee, T.P.; Cogan, T.M.; McSweeney, P.L.H. Fundamentals of Cheese Science, 3rd ed.; Springer US: Boston, MA, USA, 2017. [Google Scholar] [CrossRef]
  3. Cipolat-Gotet, C.; Cecchinato, A.; Drake, M.A.; Marangon, A.; Martin, B.; Bittante, G. From cow to cheese: Novel phenotypes related to the sensory profile of model cheeses from individual cows. J. Dairy Sci. 2018, 101, 5865-5877. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
  4. Bergamaschi, M.; Cecchinato, A.; Biasioli, F.; Gasperi, F.; Martin, B.; Bittante, G. From cow to cheese: Genetic parameters of the flavour fingerprint of cheese investigated by direct-injection mass spectrometry (PTR-ToF-MS). Genet. Sel. Evol. 2016, 48, 1-14. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  5. Behera, S.S.; Ray, R.C.; Zdolec, N. Lactobacillus plantarum with Functional Properties: An Approach to Increase Safety and Shelf-Life of Fermented Foods. Biomed Res. Int. 2018, 2018, 9361614. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
  6. Vinceković, M.; Jurić, S.; Đermić, E.; Topolovec-Pintarić, S. Kinetics and Mechanisms of Chemical and Biological Agents Release from Biopolymeric Microcapsules. J. Agric. Food Chem. 2017, 65, 9608-9617. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  7. Jurić, S.; Đermić, E.; Topolovec-Pintarić, S.; Bedek, M.; Vinceković, M. Physicochemical properties and release characteristics of calcium alginate microspheres loaded with Trichoderma viride spores. J. Integr. Agric. 2019, 18, 2534-2548. [Google Scholar] [CrossRef]
  8. Jurić, S.; Jurić, M.; Jambrak, A.R.; Vinceković, M. Tailoring alginate/chitosan microparticles loaded with chemical and biological agents for agricultural application and production of value-added foods. Appl. Sci. 2021, 11, 4061. [Google Scholar] [CrossRef]
  9. Jurić, S.; Šegota, S.; Vinceković, M. Influence of surface morphology and structure of alginate microparticles on the bioactive agents release behavior. Carbohydr. Polym. 2019, 218, 234-242. [Google Scholar] [CrossRef]
  10. Priyashantha, H.; Lundh, Å. Graduate Student Literature Review: Current understanding of the influence of on-farm factors on bovine raw milk and its suitability for cheesemaking. J. Dairy Sci. 2021, 104, 12173-12183. [Google Scholar] [CrossRef]
  11. Gowen, J.W. Genetics of Breeding Better Dairy Stock. J. Dairy Sci. 1926, 9, 153-170. [Google Scholar] [CrossRef]
  12. Falconer, D.S. Introduction to Quantitative Genetics, 4th ed.; Prentice Hall: Harlow, UK, 1996. [Google Scholar]
  13. Fisher, R.A. The correlation between relatives on the supposition of Mendelian inheritance. Trans. R. Soc. Edin-Burgh 1918, 52, 399-433. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  14. Bulmer, M.G. The Effect of Selection on Genetic Variability. Am. Nat. 1971, 105, 201-211. [Google Scholar] [CrossRef]
  15. Bulmer, M.G. The Mathematical Theory of Quantitative Genetics; Oxford University Press: Oxford, UK, 1980. [Google Scholar]
  16. Miglior, F.; Fleming, A.; Malchiodi, F.; Brito, L.F.; Martin, P.; Baes, C.F. A 100-Year Review: Identification and genetic selection of economically important traits in dairy cattle. J. Dairy Sci. 2017, 100, 10251–10271. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  17. Shook, G.E. Selection for Disease Resistance. J. Dairy Sci. 1989, 72, 1349–1362. [Google Scholar] [CrossRef]
  18. Ikonen, T.; Ahlfors, K.; Kempe, R.; Ojala, M.; Ruottinen, O. Genetic Parameters for the Milk Coagulation Properties and Prevalence of Noncoagulating Milk in Finnish Dairy Cows. J. Dairy Sci. 1999, 82, 205–214. [Google Scholar] [CrossRef]
  19. Cassandro, M.; Comin, A.; Ojala, M.; Dal Zotto, R.; De Marchi, M.; Gallo, L.; Carnier, P.; Bittante, G. Genetic Parameters of Milk Coagulation Properties and Their Relationships with Milk Yield and Quality Traits in Italian Holstein Cows. J. Dairy Sci. 2008, 91, 371–376. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  20. Cecchinato, A.; Penasa, M.; De Marchi, M.; Cipolat-Gotet, C.; Bazzoli, I.; Cologna, N.; Bittante, G. Methods for the assessment of milk coagulation properties: A genetic analysis. J. Dairy Sci. 2011, 89, 705. [Google Scholar]
  21. Penasa, M.; Cassandro, M.; Pretto, D.; De Marchi, M.; Comin, A.; Chessa, S.; Dal Zotto, R.; Bittante, G. Short communication: Influence of composite casein genotypes on additive genetic variation of milk production traits and coagulation properties in Holstein-Friesian cows. J. Dairy Sci. 2010, 93, 3346–3349. [Google Scholar] [CrossRef]
  22. Edwards, R.A.; King, J.W.B.; Yousef, I.M. A note on the genetic variation in the fatty acid composition of cow milk. Anim. Sci. 1973, 16, 307–310. [Google Scholar] [CrossRef]
  23. Karijord, Ø.; Standal, N.; Syrstad, O. Sources of variation in composition of milk fat. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie 1982, 99, 81–93. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  24. Lindström, U.B.; Antila, V.; Syväjärvi, J. A Note on Some Genetic and Non-Genetic Factors Affecting Clotting Time of Ayrshire Milk. Acta Agric. Scand. 1984, 34, 349–355. [Google Scholar] [CrossRef]
  25. Hayes, J.F.; Ng-Kwai-Hang, K.F.; Moxley, J.E. Heritability of Milk Casein and Genetic and Phenotypic Correlations with Production Traits. J. Dairy Sci. 1984, 67, 841–846. [Google Scholar] [CrossRef]
  26. van Hulzen, K.J.E.; Sprong, R.C.; van der Meer, R.; van Arendonk, J.A.M. Genetic and nongenetic variation in concentration of selenium, calcium, potassium, zinc, magnesium, and phosphorus in milk of Dutch Holstein-Friesian cows. J. Dairy Sci. 2009, 92, 5754–5759. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  27. Bittante, G.; Penasa, M.; Cecchinato, A. Invited review: Genetics and modeling of milk coagulation properties. J. Dairy Sci. 2012, 95, 6843–6870. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  28. Bonfatti, V.; Cecchinato, A.; Gallo, L.; Blasco, A.; Carnier, P. Genetic analysis of detailed milk protein composition and coagulation properties in Simmental cattle. J. Dairy Sci. 2011, 94, 5183–5193. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  29. Etzion, Y.; Linker, R.; Cogan, U.; Shmulevich, I. Determination of Protein Concentration in Raw Milk by Mid-Infrared Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance Spectroscopy. J. Dairy Sci. 2004, 87, 2779–2788. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  30. Soyeurt, H.; Dardenne, P.; Dehareng, F.; Lognay, G.; Veselko, D.; Marlier, M.; Bertozzi, C.; Mayeres, P.; Gengler, N. Estimating Fatty Acid Content in Cow Milk Using Mid-Infrared Spectrometry. J. Dairy Sci. 2006, 89, 3690–3695. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  31. Dal Zotto, R.; De Marchi, M.; Cecchinato, A.; Penasa, M.; Cassandro, M.; Carnier, P.; Gallo, L.; Bittante, G. Reproducibility and repeatability of measures of milk coagulation properties and predictive ability of mid-infrared reflectance spectroscopy. J. Dairy Sci. 2008, 91, 4103–4112. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  32. De Marchi, M.; Fagan, C.C.; O’Donnell, C.P.; Cecchinato, A.; Dal Zotto, R.; Cassandro, M.; Penasa, M.; Bittante, G. Prediction of coagulation properties, titratable acidity, and pH of bovine milk using mid-infrared spectroscopy. J. Dairy Sci. 2009, 92, 423–432. [Google Scholar] [CrossRef]
  33. Cecchinato, A.; De Marchi, M.; Gallo, L.; Bittante, G.; Carnier, P. Mid-infrared spectroscopy predictions as indicator traits in breeding programs for enhanced coagulation properties of milk. J. Dairy Sci. 2009, 92, 5304–5313. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  34. Soyeurt, H.; Bruwier, D.; Romnee, J.M.; Gengler, N.; Bertozzi, C.; Veselko, D.; Dardenne, P.; Bovenhuis, H.; Verstege, A.J. M Potential estimation of major mineral contents in cow milk using mid-infrared spectrometry. J. Dairy Sci. 2009, 92, 2444–2454. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  35. De Marchi, M.; Bonfatti, V.; Cecchinato, A.; Di Martino, G.; Carnier, P. Prediction of protein composition of individual cow milk using mid-infrared spectroscopy. Ital. J. Anim. Sci. 2009, 8, 399–401. [Google Scholar] [CrossRef]
  36. Rutten, M.J.M.; Bovenhuis, H.; Heck, J.M.L.; van Arendonk, J.A.M. Predicting bovine milk protein composition based on Fourier transform infrared spectra. J. Dairy Sci. 2011, 94, 5683–5690. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  37. Bittante, G.; Cecchinato, A. Genetic analysis of the Fourier-transform infrared spectra of bovine milk with emphasis on individual wavelengths related to specific chemical bonds. J. Dairy Sci. 2013, 96, 5991–6006. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  38. De Marchi, M.; Toffanin, V.; Cassandro, M.; Penasa, M. Invited review: Mid-infrared spectroscopy as phenotyping tool for milk traits. J. Dairy Sci. 2014, 97, 1171–1186. [Google Scholar] [CrossRef]
  39. Hill, W.G. Applications of Population Genetics to Animal Breeding, from Wright, Fisher and Lush to Genomic Prediction. Genetics 2014, 196, 1–16. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  40. Gianola, D.; Rosa, G.J.M. One Hundred Years of Statistical Developments in Animal Breeding. Annu. Rev. Anim. Biosci. 2015, 3, 19–56. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  41. Smith, C. Improvement of metric traits through specific genetic loci. Anim. Sci. 1967, 9, 349–358. [Google Scholar] [CrossRef]
  42. Brum, E.W.; Rausch, W.H.; Hines, H.C.; Ludwick, T.M. Association Between Milk and Blood Polymorphism Types and Lactation Traits of Holstein Cattle. J. Dairy Sci. 1968, 51, 1031–1038. [Google Scholar] [CrossRef]
  43. Soller, M.; Genizi, A. The Efficiency of Experimental Designs for the Detection of Linkage between a Marker Locus and a Locus Affecting a Quantitative Trait in Segregating Populations. Biometrics 1978, 34, 47. [Google Scholar] [CrossRef]
  44. Rothschild, M.; Jacobson, C.; Vaske, D.; Tuggle, C.; Wang, L.; Short, T.; Eckardt, G.; Sasaki, S.; Vincent, A.; McLaren, D.; et al. The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 201–205. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  45. Aschaffenburg, R.; Drewry, J. Occurrence of Different Beta-Lactoglobulins in Cow’s Milk. Nature 1955, 176, 218–219. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  46. Aschaffenburg, R. Inherited Casein Variants in Cow’s Milk. Nature 1961, 192, 431–432. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  47. Martin, P.; Ollivier-Bousquet, M.; Grosclaude, F. Genetic polymorphism of caseins: A tool to investigate casein micelle organization. Int. Dairy J. 1999, 9, 163–171. [Google Scholar] [CrossRef]
  48. Amigo, L.; Recio, I.; Ramos, M. Genetic polymorphism of ovine milk proteins: Its influence on technological properties of milk—A review. Int. Dairy J. 2000, 10, 135–149. [Google Scholar] [CrossRef]
  49. Caroli, A.M.; Chessa, S.; Erhardt, G.J. Invited review: Milk protein polymorphisms in cattle: Effect on animal breeding and human nutrition. J. Dairy Sci. 2009, 92, 5335–5352. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  50. Selvaggi, M.; Laudadio, V.; Dario, C.; Tufarelli, V. Investigating the genetic polymorphism of sheep milk proteins: A useful tool for dairy production. J. Sci. Food Agric. 2014, 94, 3090–3099. [Google Scholar] [CrossRef]
  51. Bovenhuis, H.; Verstege, A.J.M. Improved method for phenotyping milk protein variants by isoelectric focusing using PhastSystem. Neth. Milk Dairy J. 1989, 43, 447–451. [Google Scholar]
  52. Bovenhuis, H.; Van Arendonk, J.A.M.; Korver, S. Associations Between Milk Protein Polymorphisms and Milk Production Traits. J. Dairy Sci. 1992, 75, 2549–2559. [Google Scholar] [CrossRef]
  53. Jakob, E.; Puhan, Z. Technological properties of milk as influenced by genetic polymorphism of milk proteins—A review. Int. Dairy J. 1992, 2, 157–178. [Google Scholar] [CrossRef]
  54. Ng-Kwai-Hang, K.F.; Hayes, J.F.; Moxley, J.E.; Monardes, H.G. Variation in Milk Protein Concentrations Associated with Genetic Polymorphism and Environmental Factors. J. Dairy Sci. 1987, 70, 563–570. [Google Scholar] [CrossRef]
  55. Ng-Kwai-Hang, K.F.; Kim, S. Different amounts of β-lactoglobulin A and B in milk from heterozygous AB cows. Int. Dairy J. 1996, 6, 689–695. [Google Scholar] [CrossRef]
  56. Barillet, F.; Arranz, J.-J.; Carta, A. Mapping quantitative trait loci for milk production and genetic polymorphisms of milk proteins in dairy sheep. Genet. Sel. Evol. 2005, 37, S109. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  57. Cecchinato, A.; Chessa, S.; Ribeca, C.; Cipolat-Gotet, C.; Bobbo, T.; Casellas, J.; Bittante, G. Genetic variation and effects of candidate-gene polymorphisms on coagulation properties, curd firmness modeling and acidity in milk from Brown Swiss cows. Animal 2015, 9, 1104–1112. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  58. Ramos, A.M.; Matos, C.A.P.; Russo-Almeida, P.A.; Bettencourt, C.M.V.; Matos, J.; Martins, A.; Pinheiro, C.; Rangel-Figueiredo, T. Candidate genes for milk production traits in Portuguese dairy sheep. Small Rumin. Res. 2009, 82, 117–121. [Google Scholar] [CrossRef]
  59. Corral, J.M.; Padilla, J.A.; Izquierdo, M. Associations between milk protein genetic polymorphisms and milk production traits in Merino sheep breed. Livest. Sci. 2010, 129, 73–79. [Google Scholar] [CrossRef]
  60. Giambra, I.J.; Brandt, H.; Erhardt, G. Milk protein variants are highly associated with milk performance traits in East Friesian Dairy and Lacaune sheep. Small Rumin. Res. 2014, 121, 382–394. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  61. Noce, A.; Pazzola, M.; Dettori, M.L.; Amills, M.; Castelló, A.; Cecchinato, A.; Bittante, G.; Vacca, G.M. Variations at regulatory regions of the milk protein genes are associated with milk traits and coagulation properties in the Sarda sheep. Anim. Genet. 2016, 47, 717–726. [Google Scholar] [CrossRef]
  62. Clark, S.; Sherbon, J.W. Genetic variants of alphas1-CN in goat milk: Breed distribution and associations with milk composition and coagulation properties. Small Rumin. Res. 2000, 38, 135–143. [Google Scholar] [CrossRef]
  63. Hayes, H.; Petit, E.; Bouniol, C.; Popescu, P. Localization of the α-S2-casein gene (CASAS2) to the homoeologous cattle, sheep, and goat chromosomes 4 by in situ hybridization. Cytogenet. Genome Res. 1993, 64, 281–285. [Google Scholar] [CrossRef]
  64. Meier, S.; Korkuć, P.; Arends, D.; Brockmann, G.A. DNA Sequence Variants and Protein Haplotypes of Casein Genes in German Black Pied Cattle (DSN). Front. Genet. 2019, 10, 1129. [Google Scholar] [CrossRef]
  65. Echard, G.; Broad, T.E.; Hill, D.; Pearce, P. Present status of the ovine gene map (Ovis aries); comparison with the bovine map (Bos taurus). Mamm. Genome 1994, 5, 324–332. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  66. Ikonen, T.; Bovenhuis, H.; Ojala, M.; Ruottinen, O.; Georges, M. Associations Between Casein Haplotypes and First Lactation Milk Production Traits in Finnish Ayrshire Cows. J. Dairy Sci. 2001, 84, 507–514. [Google Scholar] [CrossRef]
  67. Boettcher, P.J.; Caroli, A.; Stella, A.; Chessa, S.; Budelli, E.; Canavesi, F.; Ghiroldi, S.; Pagnacco, G. Effects of Casein Haplotypes on Milk Production Traits in Italian Holstein and Brown Swiss Cattle. J. Dairy Sci. 2004, 87, 4311–4317. [Google Scholar] [CrossRef]
  68. Hayes, B.; Hagesæther, N.; Ådnøy, T.; Pellerud, G.; Berg, P.R.; Lien, S. Effects on Production Traits of Haplotypes Among Casein Genes in Norwegian Goats and Evidence for a Site of Preferential Recombination. Genetics 2006, 174, 455–464. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  69. Pizarro Inostroza, M.G.; Navas González, F.J.; Landi, V.; León Jurado, J.M.; Delgado Bermejo, J.V.; Álvarez, J.F.; Martínez Martínez, M.D.A. Bayesian Analysis of the Association between Casein Complex Haplotype Variants and Milk Yield, Composition, and Curve Shape Parameters in Murciano-Granadina Goats. Animals 2020, 10, 1845. [Google Scholar] [CrossRef]
  70. Buchberger, J.; Dovč, P. Lactoprotein Genetic Variants in Cattle and Cheese Making Ability. Food Technol. Biotechnol. 2000, 38, 91–98. [Google Scholar]
  71. Martin, P.; Szymanowska, M.; Zwierzchowski, L.; Leroux, C. The impact of genetic polymorphisms on the protein composition of ruminant milks. Reprod. Nutr. Dev. 2002, 42, 433–459. [Google Scholar] [CrossRef]
  72. Ogorevc, J.; Kunej, T.; Razpet, A.; Dovc, P. Database of cattle candidate genes and genetic markers for milk production and mastitis. Anim. Genet. 2009, 40, 832–851. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  73. Cohen-Zinder, M.; Seroussi, E.; Larkin, D.M.; Loor, J.J.; Everts-van der Wind, A.; Lee, J.H.; Drackley, J.K.; Band, M.R.; Hernandez, A.G.; Shani, M.; et al. Identification of a missense mutation in the bovine ABCG2 gene with a major effect on the QTL on chromosome 6 affecting milk yield and composition in Holstein cattle. Genome Res. 2005, 15, 936–944. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  74. Ron, M.; Cohen-Zinder, M.; Peter, C.; Weller, J.I.; Erhardt, G. Short Communication: A Polymorphism in ABCG2 in Bos indicus and Bos taurus Cattle Breeds. J. Dairy Sci. 2006, 89, 4921–4923. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  75. Grisart, B.; Coppieters, W.; Farnir, F.; Karim, L.; Ford, C.; Berzi, P.; Cambisano, N.; Mni, M.; Reid, S.; Simon, P.; et al. Positional Candidate Cloning of a QTL in Dairy Cattle: Identification of a Missense Mutation in the Bovine DGAT1 Gene with Major Effect on Milk Yield and Composition. Genome Res. 2002, 12, 222–231. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  76. Spelman, R.J.; Ford, C.A.; McElhinney, P.; Gregory, G.C.; Snell, R.G. Characterization of the DGAT1 Gene in the New Zealand Dairy Population. J. Dairy Sci. 2002, 85, 3514–3517. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  77. Banos, G.; Woolliams, J.A.; Woodward, B.W.; Forbes, A.B.; Coffey, M.P. Impact of Single Nucleotide Polymorphisms in Leptin, Leptin Receptor, Growth Hormone Receptor, and Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT1) Gene Loci on Milk Production, Feed, and Body Energy Traits of UK Dairy Cows. J. Dairy Sci. 2008, 91, 3190–3200. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  78. Glantz, M.; Lindmark Månsson, H.; Stålhammar, H.; Paulsson, M. Effect of polymorphisms in the leptin, leptin receptor, and acyl-coenzyme A:diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1) genes and genetic polymorphism of milk proteins on cheese characteristics. J. Dairy Sci. 2011, 94, 3295–3304. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  79. Liefers, S.C.; Veerkamp, R.F.; te Pas, M.F.W.; Delavaud, C.; Chilliard, Y.; Platje, M.; Lende, T. Leptin promoter mutations affect leptin levels and performance traits in dairy cows1. Anim. Genet. 2005, 36, 111–118. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  80. Weikard, R.; Kühn, C.; Goldammer, T.; Freyer, G.; Schwerin, M. The bovine PPARGC1A gene: Molecular characterization and association of an SNP with variation of milk fat synthesis. Physiol. Genomics 2005, 21, 1–13. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  81. Khatib, H.; Zaitoun, I.; Wiebelhaus-Finger, J.; Chang, Y.M.; Rosa, G.J.M. The Association of Bovine PPARGC1A and OPN Genes with Milk Composition in Two Independent Holstein Cattle Populations. J. Dairy Sci. 2007, 90, 2966–2970. [Google Scholar] [CrossRef]
  82. Bole-Feysot, C.; Goffin, V.; Edery, M.; Binart, N.; Kelly, P.A. Prolactin (PRL) and Its Receptor: Actions, Signal Transduction Pathways and Phenotypes Observed in PRL Receptor Knockout Mice. Endocr. Rev. 1998, 19, 225–268. [Google Scholar] [CrossRef]
  83. Brym, P.; Kamiński, S.; Wójcik, E. Nucleotide sequence polymorphism within exon 4 of the bovine prolactin gene and its associations with milk performance traits. J. Appl. Genet. 2005, 46, 179–185. [Google Scholar]
  84. He, F.; Sun, D.; Yu, Y.; Wang, Y.; Zhang, Y. Association between SNPs within prolactin gene and milk performance traits in Holstein Dairy Cattle. Asian-Australasian J. Anim. Sci. 2006, 19, 1384–1389. [Google Scholar] [CrossRef]
  85. Khatib, H.; Monson, R.L.; Schutzkus, V.; Kohl, D.M.; Rosa, G.J.M.; Rutledge, J.J. Mutations in the STAT5A Gene Are Associated with Embryonic Survival and Milk Composition in Cattle. J. Dairy Sci. 2008, 91, 784–793. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  86. Mullen, M.P.; Berry, D.P.; Howard, D.J.; Diskin, M.G.; Lynch, C.O.; Giblin, L.; Kenny, D.A.; Magee, D.A.; Meade, K.G.; Waters, S.M. Single Nucleotide Polymorphisms in the Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1) Gene are Associated with Performance in Holstein-Friesian Dairy Cattle. Front. Genet. 2011, 2, 3. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  87. Ibeagha-Awemu, E.M.; Kgwatalala, P.; Zhao, X. A critical analysis of production-associated DNA polymorphisms in the genes of cattle, goat, sheep, and pig. Mamm. Genome 2008, 19, 591–617. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  88. Strucken, E.M.; Laurenson, Y.C.S.M.; Brockmann, G.A. Go with the flow-biology and genetics of the lactation cycle. Front. Genet. 2015, 6, 118. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  89. Frazer, K.A.; Murray, S.S.; Schork, N.J.; Topol, E.J. Human genetic variation and its contribution to complex traits. Nat. Rev. Genet. 2009, 10, 241–251. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  90. Mackay, T.F.C.; Stone, E.A.; Ayroles, J.F. The genetics of quantitative traits: Challenges and prospects. Nat. Rev. Genet. 2009, 10, 565–577. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  91. Goddard, M.E.; Hayes, B.J. Mapping genes for complex traits in domestic animals and their use in breeding programmes. Nat. Rev. Genet. 2009, 10, 381–391. [Google Scholar] [CrossRef]
  92. Flint, J.; Mackay, T.F.C. Genetic architecture of quantitative traits in mice, flies, and humans. Genome Res. 2009, 19, 723–733. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  93. Yang, J.; Benyamin, B.; McEvoy, B.P.; Gordon, S.; Henders, A.K.; Nyholt, D.R.; Madden, P.A.; Heath, A.C.; Martin, N.G.; Montgomery, G.W.; et al. Common SNPs explain a large proportion of the heritability for human height. Nat. Genet. 2010, 42, 565–569. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  94. Visscher, P.M.; Brown, M.A.; McCarthy, M.I.; Yang, J. Five Years of GWAS Discovery. Am. J. Hum. Genet. 2012, 90, 7–24. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  95. Kemper, K.E.; Goddard, M.E. Understanding and predicting complex traits: Knowledge from cattle. Hum. Mol. Genet. 2012, 21, R45–R51. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  96. Cole, J.B.; VanRaden, P.M.; O’Connell, J.R.; Van Tassell, C.P.; Sonstegard, T.S.; Schnabel, R.D.; Taylor, J.F.; Wiggans, G.R. Distribution and location of genetic effects for dairy traits. J. Dairy Sci. 2009, 92, 2931–2946. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  97. Curik, I.; Druml, T.; Seltenhammer, M.; Sundström, E.; Pielberg, G.R.; Andersson, L.; Sölkner, J. Complex Inheritance of Melanoma and Pigmentation of Coat and Skin in Grey Horses. PLoS Genet. 2013, 9, e1003248. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  98. Meuwissen, T.H.E.; Hayes, B.J.; Goddard, M.E. Prediction of Total Genetic Value Using Genome-Wide Dense Marker Maps. Genetics 2001, 157, 1819–1829. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  99. Mai, M.D.; Sahana, G.; Christiansen, F.B.; Guldbrandtsen, B. A genome-wide association study for milk production traits in Danish Jersey cattle using a 50K single nucleotide polymorphism chip. J. Anim. Sci. 2010, 88, 3522–3528. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  100. Schopen, G.C.B.; Visker, M.H.P.W.; Koks, P.D.; Mullaart, E.; van Arendonk, J.A.M.; Bovenhuis, H. Whole-genome association study for milk protein composition in dairy cattle. J. Dairy Sci. 2011, 94, 3148–3158. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  101. Mucha, S.; Mrode, R.; Coffey, M.; Kizilaslan, M.; Desire, S.; Conington, J. Genome-wide association study of conformation and milk yield in mixed-breed dairy goats. J. Dairy Sci. 2018, 101, 2213–2225. [Google Scholar] [CrossRef]
  102. Jiang, J.; Ma, L.; Prakapenka, D.; VanRaden, P.M.; Cole, J.B.; Da, Y. A Large-Scale Genome-Wide Association Study in U.S. Holstein Cattle. Front. Genet. 2019, 10, 412. [Google Scholar] [CrossRef]
  103. Marina, H.; Gutiérrez-Gil, B.; Esteban-Blanco, C.; Suárez-Vega, A.; Pelayo, R.; Arranz, J.J. Analysis of whole genome resequencing datasets from a worldwide sample of sheep breeds to identify potential causal mutations influencing milk composition traits. Animals 2020, 10, 1542. [Google Scholar] [CrossRef]
  104. Scholtens, M.; Jiang, A.; Smith, A.; Littlejohn, M.; Lehnert, K.; Snell, R.; Lopez-Villalobos, N.; Garrick, D.; Blair, H. Genome-wide association studies of lactation yields of milk, fat, protein and somatic cell score in New Zealand dairy goats. J. Anim. Sci. Biotechnol. 2020, 11, 55. [Google Scholar] [CrossRef]
  105. Pryce, J.E.; Bolormaa, S.; Chamberlain, A.J.; Bowman, P.J.; Savin, K.; Goddard, M.E.; Hayes, B.J. A validated genome-wide association study in 2 dairy cattle breeds for milk production and fertility traits using variable length haplotypes. J. Dairy Sci. 2010, 93, 3331–3345. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  106. Dadousis, C.; Biffani, S.; Cipolat-Gotet, C.; Nicolazzi, E.L.; Rosa, G.J.M.; Gianola, D.; Rossoni, A.; Santus, E.; Bittante, G.; Cecchinato, A. Genome-wide association of coagulation properties, curd firmness modeling, protein percentage, and acidity in milk from Brown Swiss cows. J. Dairy Sci. 2016, 99, 3654–3666. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  107. Marina, H.; Pelayo, R.; Suárez-Vega, A.; Gutiérrez-Gil, B.; Esteban-Blanco, C.; Arranz, J.J. Genome-wide association studies (GWAS) and post-GWAS analyses for technological traits in Assaf and Churra dairy breeds. J. Dairy Sci. 2021, 104, 11850–11866. [Google Scholar] [CrossRef]
  108. Hayes, B.J.; Bowman, P.J.; Chamberlain, A.J.; Goddard, M.E. Invited review: Genomic selection in dairy cattle: Progress and challenges. J. Dairy Sci. 2009, 92, 433–443. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  109. Hickey, J.M.; Chiurugwi, T.; Mackay, I.; Powell, W. Genomic prediction unifies animal and plant breeding programs to form platforms for biological discovery. Nat. Genet. 2017, 49, 1297–1303. [Google Scholar] [CrossRef]
  110. Wiggans, G.R.; Cole, J.B.; Hubbard, S.M.; Sonstegard, T.S. Genomic Selection in Dairy Cattle: The USDA Experience. Annu. Rev. Anim. Biosci. 2017, 5, 309–327. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed][Green Version]
  111. Cole, J.B.; VanRaden, P.M. Symposium review: Possibilities in an age of genomics: The future of selection indices. J. Dairy Sci. 2018, 101, 3686–3701. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  112. Van Eenennaam, A.L.; Weigel, K.A.; Young, A.E.; Cleveland, M.A.; Dekkers, J.C.M. Applied Animal Genomics: Results from the Field. Annu. Rev. Anim. Biosci. 2014, 2, 105–139. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  113. Koltes, J.E.; Cole, J.B.; Clemmens, R.; Dilger, R.N.; Kramer, L.M.; Lunney, J.K.; McCue, M.E.; McKay, S.D.; Mateescu, R.G.; Murdoch, B.M.; et al. A Vision for Development and Utilization of High-Throughput Phenotyping and Big Data Analytics in Livestock. Front. Genet. 2019, 10, 1197. [Google Scholar] [CrossRef]
  114. Mota, L.F.M.; Pegolo, S.; Baba, T.; Peñagaricano, F.; Morota, G.; Bittante, G.; Cecchinato, A. Evaluating the performance of machine learning methods and variable selection methods for predicting difficult-to-measure traits in Holstein dairy cattle using milk infrared spectral data. J. Dairy Sci. 2021, 104, 8107–8121. [Google Scholar] [CrossRef]
  115. Georges, M.; Charlier, C.; Hayes, B. Harnessing genomic information for livestock improvement. Nat. Rev. Genet. 2019, 20, 135–156. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  116. Rexroad, C.; Vallet, J.; Matukumalli, L.K.; Reecy, J.; Bickhart, D.; Blackburn, H.; Boggess, M.; Cheng, H.; Clutter, A.; Cockett, N.; et al. Genome to Phenome: Improving Animal Health, Production, and Well-Being—A New USDA Blueprint for Animal Genome Research. Front. Genet. 2019, 10, 2018–2027. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  117. Brito, L.F.; Bedere, N.; Douhard, F.; Oliveira, H.R.; Arnal, M.; Peñagaricano, F.; Schinckel, A.P.; Baes, C.F.; Miglior, F. Review: Genetic selection of high-yielding dairy cattle toward sustainable farming systems in a rapidly changing world. Animal 2021, 15, 100292. [Google Scholar] [CrossRef]
  118. Moran, D.; Blair, K.J. Review: Sustainable livestock systems: Anticipating demand-side challenges. Animal 2021, 15, 100288. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  119. Yegin, S.; Dekker, P. Progress in the field of aspartic proteinases in cheese manufacturing: Structures, functions, catalytic mechanism, inhibition, and engineering. Dairy Sci. Technol. 2013, 93, 565–594. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  120. MEROPS Database. Available online: https://www.ebi.ac.uk/merops/ (accessed on 13 January 2022).
  121. Rawlings, N.D.; Barrett, A.J. Peptidases. In eLS; Wiley: Hoboken, NJ, USA, 2014. [Google Scholar] [CrossRef]
  122. Rawlings, N.D.; Barrett, A.J.; Thomas, P.D.; Huang, X.; Bateman, A.; Finn, R.D. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Res. 2018, 46, D624–D632. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  123. Schechter, I.; Berger, A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967, 27, 157–162. [Google Scholar] [CrossRef]
  124. Schechter, I. Mapping of the Active Site of Proteases in the 1960s and Rational Design of Inhibitors/Drugs in the 1990s. Curr. Protein Pept. Sci. 2005, 6, 501–512. [Google Scholar] [CrossRef]
  125. Tang, J. Aspartic Proteases: Structure, Function, and Inhibition. In Aspartic Acid Proteases as Therapeutic Targets; Wiley: Hoboken, NJ, USA, 2011; Volume 45, pp. 23–41. [Google Scholar] [CrossRef]
  126. Andrén, A. Cheese: Rennets and Coagulants. In Encyclopedia of Dairy Sciences, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, USA, 2011; pp. 574–578. [Google Scholar] [CrossRef]
  127. Barrett, A.J.; Rawlings, N.D.; Salvesen, G.; Fred Woessner, J. Introduction. In Handbook of Proteolytic Enzymes; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2013; pp. li–liv. [Google Scholar] [CrossRef]
  128. Bela Szecsi, P.; Harboe, M. Chymosin. In Handbook of Proteolytic Enzymes; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2013; pp. 37–42. [Google Scholar] [CrossRef]
  129. Lea, A.S.; Dickinson, W.L. Notes on the mode of action of Rennin and Fibrin-ferment. J. Physiol. 1890, 11, 307–311. [Google Scholar] [CrossRef]
  130. Foltmann, B.; Szecsi, P.B. Chymosin. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 2nd ed.; Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woessner, J.F., Eds.; Academic Press: London, UK, 2004; pp. 29–32. [Google Scholar] [CrossRef]
  131. Szecsi, P.B. The aspartic proteases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1992, 52, 5–22. [Google Scholar] [CrossRef]
  132. Tang, J. Chapter 3—Pepsin A. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 3rd ed.; Rawlings, N.D., Salvesen, G., Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2013; pp. 27–35. [Google Scholar] [CrossRef]
  133. Uniacke-Lowe, T.; Fox, P.F. Chapter 4—Chymosin, Pepsins and Other Aspartyl Proteinases: Structures, Functions, Catalytic Mechanism and Milk-Clotting Properties. In Cheese, 4th ed.; McSweeney, P.L.H., Fox, P.F., Cotter, P.D., Everett, D.W., Eds.; Academic Press: San Diego, CA, USA, 2017; pp. 69–113. [Google Scholar] [CrossRef]
  134. Pang, S.H. Rennin Content of Abomasa from Bovine Fetuses. 1969. All Graduate Theses and Dissertations, 5269. Available online: https://digitalcommons.usu.edu/etd/5269 (accessed on 20 January 2022).
  135. Davies, D.R. The Structure and Function of the Aspartic Proteinases. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1990, 19, 189–215. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  136. Visser, S.; van Rooijen, P.J.; Schattenkerk, C.; Kerling, K.E.T. Peptide substrates for chymosin (Rennin). Kinetic studies with peptides of different chain lenght including parts of the sequence 101–112 of bovine κ-casein. Biochim. Biophys. Acta Enzymol. 1976, 438, 265–272. [Google Scholar] [CrossRef]
  137. Rampilli, M.; Larsen, R.; Harboe, M. Natural heterogeneity of chymosin and pepsin in extracts of bovine stomachs. Int. Dairy J. 2005, 15, 1130–1137. [Google Scholar] [CrossRef]
  138. Jaros, D.; Rohm, H. Rennets: Applied Aspects, 4th ed.; Elsevier Ltd.: Amsterdam, The Netherlands, 2017. [Google Scholar] [CrossRef]
  139. Kumar, A.; Grover, S.; Sharma, J.; Batish, V.K. Chymosin and other milk coagulants: Sources and biotechnological interventions. Crit. Rev. Biotechnol. 2010, 30, 243–258. [Google Scholar] [CrossRef]
  140. Andren, A. Rennets and coagulants. In Encyclopedia of Dairy Sciences, 1st ed.; Roginski, H., Fuquay, W.J., Fox, P.F., Eds.; Academic Press: London, UK, 2003; pp. 283–286. [Google Scholar]
  141. Teuber, M. Production of chymosin (EC 3.4.23.4) by microorganisms and its use for cheesemaking. Bull. Int. Dairy Fed. 1990, 251, 3–15. [Google Scholar]
  142. Aworh, O.C.; Muller, H.G. Cheese-making properties of vegetable rennet from sodom apple (Calotropis procera). Food Chem. 1987, 26, 71–79. [Google Scholar] [CrossRef]
  143. Sousa, M.J.; Malcata, F.X. Advances in the role of a plant coagulant (Cynara cardunculus) in vitro and during ripening of cheeses from several milk species. Lait 2002, 82, 151–170. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  144. Uchiyama, H.; Uozumi, T.; Beppu, T.; Arima, K. Purification of Prorennin mRNA and Its Translation in Vitro. Agric. Biol. Chem. 1980, 44, 1373–1381. [Google Scholar] [CrossRef]
  145. Foltmann, B. General and Molecular Aspects of Rennets. In Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology; Springer US: Boston, MA, USA, 1993; pp. 37–68. [Google Scholar] [CrossRef]
  146. Emtage, J.S.; Angal, S.; Doel, M.T.; Harris, T.J.; Jenkins, B.; Lilley, G.; Lowe, P.A. Synthesis of calf prochymosin (prorennin) in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80, 3671–3675. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  147. Kumar, A.; Sharma, J.; Mohanty, A.K.; Grover, S.; Batish, V.K. Purification and characterization of milk clotting enzyme from goat (Capra hircus). Comp. Biochem. Physiol. Part B Biochem. Mol. Biol. 2006, 145, 108–113. [Google Scholar] [CrossRef]
  148. Starovoitova, V.V.; Velichko, T.I.; Baratova, L.A.; Filippova, I.Y.; Lavrenova, G.I. A comparative study of functional properties of calf chymosin and its recombinant forms. Biochemistry 2006, 71, 320–324. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  149. Cullen, D.; Gray, G.L.; Wilson, L.J.; Hayenga, K.J.; Lamsa, M.H.; Rey, M.W.; Norton, S.; Berka, R.M. Controlled Expression and Secretion of Bovine Chymosin in Aspergillus Nidulans. Nat. Biotechnol. 1987, 5, 369–376. [Google Scholar] [CrossRef]
  150. Noseda, D.G.; Recúpero, M.N.; Blasco, M.; Ortiz, G.E.; Galvagno, M.A. Cloning, expression and optimized production in a bioreactor of bovine chymosin B in Pichia (Komagataella) pastoris under AOX1 promoter. Protein Expr. Purif. 2013, 92, 235–244. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  151. Noseda, D.G.; Recúpero, M.; Blasco, M.; Bozzo, J.; Galvagno, M.Á. Production in stirred-tank bioreactor of recombinant bovine chymosin B by a high-level expression transformant clone of Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 2016, 123, 112–121. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  152. Espinoza-Molina, J.A.; Acosta-Muñiz, C.H.; Sepulveda, D.R.; Zamudio-Flores, P.B.; Rios-Velasco, C. Codon Optimization of the “Bos Taurus Chymosin” Gene for the Production of Recombinant Chymosin in Pichia pastoris. Mol. Biotechnol. 2016, 58, 657–664. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  153. Belenkaya, S.V.; Balabova, D.V.; Belov, A.N.; Koval, A.D.; Shcherbakov, D.N.; Elchaninov, V.V. Basic Biochemical Properties of Recombinant Chymosins (Review). Appl. Biochem. Microbiol. 2020, 56, 363–372. [Google Scholar] [CrossRef]
  154. Kappeler, S.R.; van den Brink, H.J.M.; Rahbek-Nielsen, H.; Farah, Z.; Puhan, Z.; Hansen, E.B.; Johansen, E. Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 342, 647–654. [Google Scholar] [CrossRef]
  155. Vallejo, J.A.; Ageitos, J.M.; Poza, M.; Villa, T.G. Short communication: A comparative analysis of recombinant chymosins. J. Dairy Sci. 2012, 95, 609–613. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  156. Langholm, J.J.; Mølgaard, A.; Navarro Poulsen, J.C.; Harboe, M.K.; Simonsen, J.B.; Lorentzen, A.M.; Hjernø, K.; van den Brink, J.M.; Qvist, K.B.; Larsen, S. Camel and bovine chymosin: The relationship between their structures and cheese-making properties. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2013, 69, 901–913. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  157. Wang, N.; Wang, K.Y.; Li, G.; Guo, W.; Liu, D. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 2015, 111, 75–81. [Google Scholar] [CrossRef]
  158. Rogelj, I.; Perko, B.; Francky, A.; Penca, V.; Pungerčar, J. Recombinant Lamb Chymosin as an Alternative Coagulating Enzyme in Cheese Production. J. Dairy Sci. 2001, 84, 1020–1026. [Google Scholar] [CrossRef]
  159. Vega-Hernández, M.C.; Gómez-Coello, A.; Villar, J.; Claverie-Martıín, F. Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin. J. Biotechnol. 2004, 114, 69–79. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  160. Tyagi, A.; Kumar, A.; Yadav, A.K.; Chandola Saklani, A.; Grover, S.; Batish, V.K. Functional expression of recombinant goat chymosin in Pichia pastoris bioreactor cultures: A commercially viable alternate. LWT Food Sci. Technol. 2016, 69, 217–224. [Google Scholar] [CrossRef]
  161. Liu, W.G.; Wang, Y.P.; Zhang, Z.J.; Wang, M.; Lv, Q.X.; Liu, H.W.; Meng, L.C.; Lu, M. Generation and characterization of caprine chymosin in corn seed. Protein Expr. Purif. 2017, 135, 78–82. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  162. Vallejo, J.A.; Ageitos, J.M.; Poza, M.; Villa, T.G. Cloning and Expression of Buffalo Active Chymosin in Pichia pastoris. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 10606–10610. [Google Scholar] [CrossRef]
  163. Tyagi, A.; Kumar, A.; Mohanty, A.K.; Kaushik, J.K.; Grover, S.; Batish, V.K. Expression of buffalo chymosin in Pichia pastoris for application in mozzarella cheese. LWT 2017, 84, 733–739. [Google Scholar] [CrossRef]
  164. Luo, F.; Jiang, W.H.; Yang, Y.X.; Li, J.; Jiang, M.F. Cloning and Expression of Yak Active Chymosin in Pichia pastoris. Asian-Australas. J. Anim. Sci. 2016, 29, 1363–1370. [Google Scholar] [CrossRef]
  165. Ersöz, F.; İnan, M. Large-scale production of yak (Bos grunniens) chymosin A in Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 2019, 154, 126–133. [Google Scholar] [CrossRef]
  166. Belenkaya, S.V.; Rudometov, A.P.; Shcherbakov, D.N.; Balabova, D.V.; Kriger, A.V.; Belov, A.N.; Koval, A.D.; Elchaninov, V.V. Biochemical Properties of Recombinant Chymosin in Alpaca (Vicugna pacos L.). Appl. Biochem. Microbiol. 2018, 54, 569–576. [Google Scholar] [CrossRef]
  167. Jacob, M.; Jaros, D.; Rohm, H. Recent advances in milk clotting enzymes. Int. J. Dairy Technol. 2011, 64, 14–33. [Google Scholar] [CrossRef]
  168. Moschopoulou, E. Microbial milk coagulants. In Microbrobial Enzyme Technology in Food Applications, 1st ed.; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2017; pp. 199–213. [Google Scholar] [CrossRef]
  169. Ben Amira, A.; Besbes, S.; Attia, H.; Blecker, C. Milk-clotting properties of plant rennets and their enzymatic, rheological, and sensory role in cheese making: A review. Int. J. Food Prop. 2017, 20, S76–S93. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  170. García, V.; Rovira, S.; Teruel, R.; Boutoial, K.; Rodriguez, R.; Roa, I.; López, M.B. Effect of vegetable coagulant, microbial coagulant and calf rennet on physicochemical, proteolysis, sensory and texture profiles of fresh goats cheese. Dairy Sci. Technol. 2012, 92, 691–707. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  171. Manuelian, C.L.; Boselli, C.; Vigolo, V.; Giangolini, G.; De Marchi, M. Effects of animal versus vegetal rennet on milk coagulation traits in Mediterranean buffalo bulk milk. J. Dairy Sci. 2020, 103, 4958–4964. [Google Scholar] [CrossRef]
  172. Andren, A. Milk-clotting activity of various rennets and coagulants: Background and information regarding IDF standards. Int. Dairy Fed. 1998, 332, 9–14. [Google Scholar]
  173. Kumar, A.; Sharma, J.; Grover, S.; Kumar Mohanty, A.; Kumar Batish, V. Molecular Cloning and Expression of Goat (Capra hircus) Prochymosin in E.coli. Food Biotechnol. 2007, 21, 57–69. [Google Scholar] [CrossRef]
  174. Yang, B.; Wang, X.; Luo, J.; Tang, G.; Li, W.; Zhang, L. Cloning and sequence analyses of preprochymosin cDNA of Xinong Saanen Goat. Anim. Husb. Vet. Med. 2007, 4, 2–7. [Google Scholar]
  175. Anifantakis, E.; Green, M.L. Preparation and properties of rennets from lamb’s and kid’s abomasa. J. Dairy Res. 1980, 47, 221–230. [Google Scholar] [CrossRef]
  176. Moschopoulou, E. Characteristics of rennet and other enzymes from small ruminants used in cheese production. Small Rumin. Res. 2011, 101, 188–195. [Google Scholar] [CrossRef]
  177. Andren, A.; Bjorck, L.; Claesson, O. Imunohistochemical Studies on the Development of Prochymosin- and Pepsinogen-Containing Cells in Bovine Abomasal Mucosa. J. Physiol. 1982, 327, 247–254. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  178. Foltmann, B. Chymosin: A short review on foetal and neonatal gastric proteases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1992, 210, 65–79. [Google Scholar] [CrossRef]
  179. Ward, O.P. Proteases. In Comprehensive Biotechnology, 3rd ed.; Moo-Young, M., Ed.; Elsevier: Amsterdam, Netherlands, 2019; pp. 604–615. [Google Scholar] [CrossRef]
  180. Foltmann, B. Studies on Rennin II. On the Crystallisation, Stability and Proteolytic Activity of Rennin. Acta Chem. Scand. 1959, 13, 1927–1935. [Google Scholar] [CrossRef][Green Version]
  181. Andrén, A. Milk-Clotting Enzymes. In Agents of Change: Enzymes in Milk and Dairy Products; Kelly, A.L., Larsen, L.B., Eds.; Springer International Publishing: Cham, Switzerland, 2021; pp. 349–362. [Google Scholar] [CrossRef]
  182. Kim, S.M.; Zayas, J.F. Influence of Ultrasound on the Properties of Chymosin and the Ultrastructure of Abomasum During Chymosin Extraction. J. Food Process. Preserv. 1991, 15, 89–100. [Google Scholar] [CrossRef]
  183. Kim, S.M.; Zayas, J.F. Processing Parameters of Chymosin Extraction by Ultrasound. J. Food Sci. 1989, 54, 700–703. [Google Scholar] [CrossRef]
  184. Zhang, F.X.; Wang, B.N. Optimization of processing parameters for the ultrasonic extraction of goat kid rennet. Int. J. Dairy Technol. 2007, 60, 286–291. [Google Scholar] [CrossRef]
  185. Tabayehnejad, N.; Castillo, M.; Payne, F.A. Comparison of total milk-clotting activity measurement precision using the Berridge clotting time method and a proposed optical method. J. Food Eng. 2012, 108, 549–556. [Google Scholar] [CrossRef]
  186. Berridge, N.J. Some observations on the determination of the activity of rennet. Analyst 1952, 77, 57–62. [Google Scholar] [CrossRef]
  187. Standard 157:2007; Milk: Determination of Total Milk-Clotting Activity of Bovine Rennets. International Dairy Federation: Geneva, Switzerland; Brussels, Belgium, 2007.
  188. Standard 176:2002; Milk and Milk Products: Microbial Coagulants: Determination of Total Milk-Clotting Activity. International Dairy Federation: Geneva, Switzerland; Brussels, Belgium, 2002.
  189. Standard 199:2006; Milk and Milk Products: Ovine and Caprine Rennets: Determination of Total Milk-Clotting Activity. International Dairy Federation: Geneva, Switzerland; Brussels, Belgium, 2006.
  190. Standard 110:2012; Milk and Milk Products—Calf Rennet and Adult Bovine Rennet—Determination by Chromatography of Chymosin and Bovine Pepsin Contents. International Dairy Federation: Geneva, Switzerland; Brussels, Belgium, 2012
Этот сайт использует файлы cookie и метаданные. Продолжая просматривать его, вы соглашаетесь на использование нами файлов cookie и метаданных в соответствии с Политикой конфиденциальности.
Продолжить