Главная \ Домашнее сыроделие (сыроварение) \ Молокосвертывающие ферментные препараты (МФП) в сыроделии

Реннин (химозин) и другие коагулянты в сыроделии

Животные реннины, рекомбинантный химозин и другие коагулянты в сыроделии

высокие технологии в сыроделии - рекомбинантный химозин и другие молокосвертывающие ферментные препараты

ХИМОЗИН (chymosin)

Продолжение (дополнение) раздела о сычужном ферменте


Молокосвертывающий ферментный препарат Химозин жидкий 600 IMCUмлПримечание: Первым этапом в производстве сычужного сыра является процесс сычужного свертывания молока, в ходе которого κаппа-казеинолитические ферменты способствуют осаждению мицелл. Лучшим ферментом для этой цели является химозин из-за его высокой степени специфичности к κаппа-казеину. При этом, рекомбинантный химозин телёнка сегодня является наиболее часто используемым химозином в промышленности (>80%). В частности, ООО "Пропионикс" предлагает для всех сыроделов (как любителей, так и профессионалов) новый ферментационно полученный (рекомбинантный) химозин телёнка, отличающийся наиболее повышенной специфичной активностью к связи Фенилаланин(105) - Метионин(106) в каппа-казеине.

О сычужном свертывании молока см. дополнительно по этой ссылке→.


СОДЕРЖАНИЕ

.
3.1. МФП - Обзор рынка 3.2. Современные ферменты микробного происхождения 3.3. Использование рекомбинантных МФП

Химозин. Общие сведения.

купить химозин для сыра Реннин (химозин) - фермент из класса гидролаз, который вырабатывается в желудочных железах некоторых млекопитающих. У жвачных животных вырабатывается железами сычуга (4-го отдела желудка), отсюда одно из его тривиальных названий — сычужный фермент. Это первый фермент, выделенный химически датским учёным Кристианом Хансеном (дат. Christian Ditlev Ammentorp Hansen) путём экстракции солевым раствором из высушенного желудка телёнка.

Рекомбинантный химозин - это химозин, синтезированный микроорганизмом, несущими в составе экспрессионного вектора ген, кодирующий химозин. На сегодняшний день химозин был получен из следующих микроорганизмов: E. coli, P. mirabilis, B. subtilis, S. cerevisiae, K.  lactis, A. niger, A. awamori, A. oryzae, P. pastoris. Из-за несовершенства микробных и нехватки животных сычужных ферментов производители искали им замену.

С развитием биотехнологий стало возможным получать изолированные гены железистых клеток желудка жвачных животных, отвечающие за продукцию сычужного фермента, и вставлять их в определенные бактерии, плесневые грибы или дрожжевые клетки чтобы они производили химозин во время ферментации. В резльтате были получены так называемые "рекомбинантные химозины", которые имеют и другое название → "ферментационно продуцируемые химозины" (Fermentation Produced Chymosin (FPC)). Рекомбинантные химозины гарантировано свертывают молоко даже при активной кислотности свежего молока (рН 6,6-6,7), а на продолжительность свертывания мало влияют колебания по содержанию белка и ионов кальция в молоке.


Рекомбинантный химозин (FPC) не содержит ГМО: Генетически модифицированные микроорганизмы (бактерии, дрожжи, плесени) погибают после ферментации, и химозин выделяется из ферментационного бульона, так что химозин, образующийся при ферментации, используемый производителями сыров, не содержит никакого ГМ-компонента или ингредиента. Продукты FPC находятся на рынке с 1990 года и сегодня считаются идеальными ферментами для свертывания молока.

Рекомбинантный химозин (FPC) содержит химозин, идентичный химозину животного происхождения, но производится более эффективным способом. FPC содержит только химозин B, достигая высокой степени чистоты по сравнению с животным сычужным ферментом. Cегодня наиболее широко используемый в мире FPC, производится с использованием плесневого грибка Aspergillus niger или молочнокислых дрожжей Kluyveromyces lactis.

Рекомбинантый или Ферментативно произведенный химозин (FPC)

Рис. 1. Теперь для получения чистого химозина не требуется забивать телят - молочников. Изображенный процесс получения рекомбинантного химозина показывает, что на выходе получается чистый фермент, не содержащий ГМО. При этом качество химозина не страдает.

Поскольку препарат FPC идентичен химозину теленка (аналогичная аминокислотная последовательность), его свойства такие же, как и у телячьего химозина. Разница лишь в том, что организм-продуцент может добавить некоторые остатки к молекуле химозина (10% молекул гликозилированы). Однако на практике еще не наблюдалось, чтобы такие модификации существенно снижали технологические свойства FPC по сравнению с животным химозином теленка. Таким образом, FPC может принести производителю сыра несколько преимуществ по сравнению с животным или микробным сычужным ферментом. К таким преимуществам относятся более высокий выход готового продукта, лучшая текстура сыра и меньшая горечь.

Определенным недостатком FPC является возможная реакция потребителей, поскольку некоторые могут считать сыр, произведенный с помощью FPC, генно-инженерным и вероятно вредным. Но как уже было указано выше, FPC - не является ГМО и не содержит ГМО. Ферментационно произведенный химозин является продуктом, получаемым с помощью ГМ-микроорганизмов, аналогично инсулину, который давным-давно производится из ГМ-E.coli (кишечной палочки). После экстракции и очистки FPC ничем не отличается от своего животного аналога (от редактора: это все равно что сравнивать электроэнергию от АЭС или от ветрогенератора → источники имеют разный класс опасности, но потребителю все равно откуда берется электричество).

Химозин как аспарагиновая протеаза (АП)

Протеазы (протеиназы, пептидазы)

Рис. 2. Протеазы показаны в виде ножниц, разрезающих пептидную цепь белка

Протеазы – это ферменты, катализирующие разрыв амидной связи в белках и пептидах. Аспарагиновые протеазы (АП) представляют отдельный класс протеолитических ферментов, чей активный центр содержит два остатка аспарагиновой кислоты, которые катализируют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Химозины – это представители семейства аспарагиновых протеаз, которые участвуют в высокоспецифичном гидролизе к-казеина в желудке млекопитающих на ранних этапах постнатального развития. Химозин также является эндопептидазой, т.е. предпочтительно гидролизуют пептидные связи на внутренних участках полипептидной цепи.

В желудках различных видов млекопитающих обнаруживается пять типов гастральных аспарагиновых протеиназ - пепсин A (EC 3.4.23.1), пепсин B (EC3.4.23.2), пепсин C или гастрикцин (EC 3.4.23.3) пепсин F (не имеет номера EC) и химозин (EC 3.4.23.4). Все они секретируются клетками слизистых оболочек желудков в виде ферментативно-неактивных предшественников – зимогенов. Активация зимогенов и образование активных ферментов происходит в желудочном соке при низких значениях рН.


Для дальнейшего понимания вопроса напомним принцип взаимодействия фермента и субстрата (в нашем случае химозина и к-казеина)

принцип действия ферментов

На рис. выше: а) Фермент расщепляет только определенные молекулы (субстраты) и только при определенных связях. б) Фермент помещается в определенное место в молекулярной цепочке, где он ослабляет связь (иными словами, субстрат, сблизившись с активным центром фермента, образует комплекс); в) Молекула расщепляется.

Для дальнейшего понимания вопроса рекомендуется также освежить знания о структуре белков (первичной, вторичной и т.д. - кратко в пдф)


В третичной структуре два каталитических остатка аспарагиновой кислоты расположены в центре образованной доменами щели на расстоянии водородной связи друг от друга. С N-конца и С-конца от них формируются сайты узнавания субстрата (рисунок 3).

Схема строения сайта связывания аспарагиновых протеаз

Рисунок 3. – Схема строения сайта связывания аспарагиновых протеаз.

Во время протеолиза аминокислотные остатки субстрата занимают положение в сайтах узнавания внутри каталитической щели так, что гидролизируемая связь оказывается в непосредственной близости к каталитическим остаткам АП. Описанный фермент-субстратный комплекс удерживается за счет водородных взаимодействий и диссоциирует после разрыва атакуемой связи → Аминокислотные остатки (Asp34 и Asp216) в молекуле химозина образуют координационную связь с молекулой воды (H2O), которая, действуя как нуклеофил, атакует карбонильный углеродный атом гидролизуемой пептидной связи (принцип действия показан на GIF-изображении ниже, и описан в материале со ссылками).

Каталитический аппарат во всех АП практически одинаков и различия между ферментами обусловлены, главным образом, различиями в специфичности, возникающими в результате структурной эволюции сайтов связывания фермента и боковых радикалов аминокислот в субстрате.

слюнные ферменты - расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу

Для примера: Фермент расщепляет субстрат сахарозу.
В случае химозина, субстратом служит к-казеин, который расщепляется на пара-к-казеин и гликомакропептид (при гидролизе молекула H2O  действует как нуклеофил - ред.).

Специфичность протеазы определяется белок-белковыми взаимодействиями сайта связывания фермента с субстратом. В 1967 году Шехтер и Бергер в работе, посвященной изучению специфичности папаина, предложили представить сайт связывания субстрата в виде субсайтов. При этом аминокислотная последовательность субстрата, участвующая во взаимодействии, выстраивается в линию так, что каждый из его аминокислотных остатков занимает один субсайт связывания (рисунок 4). Обозначения субстрата идет от расщепляемой связи в направлении амино- и карбоксильного конца соответственно (P1 с N-конца и P1' с C-конца), а соответствующие аминокислотные остатки субсайтов были обозначены S1 и S1’ и т.д.

Схема строения сайта связывания протеаз

Рисунок 4. – Схема строения сайта связывания протеаз (аминокислотная последовательность выстроена для удобства в линию).

Химозин расщепляет однопептидную связь Phe105-Met106 κ-казеина

Рис. 5. Гидролиз к-казеина: Атакуя к-казеин, химозин селективно и быстро катализирует гидролиз "ключевой" связи Phe105-Met106 (фенилаланин (105) - метионин (106))

Сычужная коагуляция носит необратимый характер и включает две стадии: ферментативную и коагуляционную (об этом см. отдельно в разделе сычужное свертывание). На первой стадии (рис. 5.) под действием основного компонента сычужного фермента - химозина - происходит разрыв пептидной связи фенилаланина (в положении 105) и метионина (в положении 106) в полипептидных цепях к-казеина казеинаткальцийфосфатного комплекса (ККФК). В результате протеолиза молекулы к-казеина распадаются на гидрофобный пара-к-казеин и гидрофильный гликомакропептид. 

химозин и каппа-казеин

Рисунок 6: Слева - Компьютерное моделирование молекулярной поверхности химозина. Справа - Компьютерное моделирование молекулярной поверхности к-казеина. Красным выделен остаток Phe104, синим - остаток Met105, белым - фракция пара-к-казеина, а желтым – гликомакропептид (ГМП).

Гликомакропептиды имеют высокий отрицательный заряд и обладают сильными гидрофильными свойствами. При их отщеплении частично разрушается гидратная оболочка, силы электростатического отталкивания между частицами уменьшаются и дисперсная система теряет устойчивость. На второй стадии дестабилизированные мицеллы казеина (параказеина) собираются в агрегаты и образуется сгусток, т.е. происходит процесс гелеобразования (об этом процессе упрощенно см. здесь →).

Физиологическая функция химозина

теленок-сосунок и химозин Зимогены химозина и пепсина – прохимозин (ПроХн) и пепсиноген - синтезируется фундальными железами, локализованными в желудке. Пока новорожденный питается молоком, клетки желёз иммунореактивны и по ПроХн и по пепсиногену. После завершения молочного вскармливания или перехода на смешанное вскармливание синтез ПроХн затухает, тогда как экспрессия пепсиногена – сохраняется. В желудочном соке взрослых животных, питающихся грубой пищей, доминируют пепсины А, В и гастрикцин.

Несмотря на общность структуры, химозин (Хн) отличается от пепсинов исключительно высокой специфичностью по отношению к единственной связи (Phe105-Met106) в молекуле κ-казеина молока. В то же время, уровень протеолитической активности Хн по отношению к любым другим пептидным связям казеинов и сывороточных белков молока намного ниже.

Основные белки молока - α-, β- и κ-казеины – относятся к кальций-связывающим протеинам и являются для организма новорожденного источником Ca2+, аминокислот и пептидов, обладающих, в том числе, антимикробной активностью. В молоке казеины образуют гетерогенные мицеллы, внутренняя структура которых стабилизирована кальций-фосфатными комплексами, гидрофобными и ионными взаимодействиями. На поверхности мицелл экспонированы анионные С-терминальные участки к-казеинов, которые образуют стабилизирующий "волосковый слой". Благодаря отрицательно заряженному "волосковому слою", в нативном молоке казеиновые мицеллы образуют стабильную дисперсию. Химозин с высокой избирательностью и скоростью гидролизует связь Phe105-Met106, что приводит к утрате "волоскового слоя", дестабилизации, сближению и агрегации мицелл. В результате молоко коагулирует.

В настоящее время нет однозначного ответа на вопрос о биологической роли формирования молочного сгустка под действием гастральных протеиназ. Предполагается, что образование сгустка замедляет прохождения пищи из просвета желудка до двенадцатиперстной кишки и далее в кишечник, а также обеспечивает деликатную стимуляцию пищеварительного тракта новорожденного. В результате содержащиеся в сгустке, образовавшемся под действием Хн, белки и другие нутриенты дольше задерживаются в желудке, постепенно поступая в кишечник, где полноценно метаболизируются.

Структура химозина. Визуализация
химозин (молекула)
Рис. 7.: Структура химозина (Слева - визуализируется с помощью 3Dmol.js)

Особенности структуры химозина

Химозин, как и другие представители подсемейства А1А, представляет собой одноцепочечный полипептид, который синтезируется в препроформе (в виде более крупной неактивной молекулы). Секретируемый зимогенпрохимозин в среднем имеет длину 350 а.о., в кислой среде он подвергается автокаталитической активации до химозина (молекулярный вес 35,6 кДа). У разных видов животных химозин имеет разное количество изоформ (например, у коровы - з, у верблюда - 2).

Разные изоформы могут отличаться по стабильности, специфичности, оптимумам рН и значениям изоэлектрической точки. В частности, химозин коровы содержит по крайней мере три изоформы – A, B и С. Химозины A и B (рисунок 8) происходят из соответствующих зимогенов и отличаются только одним аминокислотным остатком в положении 244 (Asp - в ХнA, Gly - в ХнB). При исследовании химозина С был сделан вывод, что он является продуктом автокаталитического гидролиза химозина A. Химозин С образуется в процессе удаления трипептида Asp254-Glu255-Phe256 из молекулы химозина А. Относительная активность химозина A, B и C составляет 155, 100 и 25 %, а значения изоэлектрических точек - 4,44; 4,57 и 4,66.

Рисунок 8 – Схема первичной структуры химозинов (структура зимогенов химозина)
(а) структура и (b) варианты A и B (изоформы) белка

Прим. ред.: Псевдохимозин на 15 аминокислотных остатков длиннее химозина → конечный продукт активации прохимозина при низком рН (путем расщепления связи 27-28). Псевдохимозин превращается в химозин, когда его доводят до рН 5,5.

Итак, говяжий химозин является особым представителем группы ферментов аспарагиновой протеазы, синтезируемых в четвертом отделе желудка (сычуге) новорожденных телят. Этот фермент (323 аминокислоты, 35,6 кДа) секретируется клетками слизистой оболочки желудка в виде зимогена, известного как прохимозин (365 аминокислот, 40,8 кДа). В кислых условиях просвета желудка предшественник фермента превращается в активную форму путем автокаталитического расщепления N-концевой последовательности 42 аминокислот.

Вторичная структура говяжьего химозина на 48% состоит из β-тяжей (29 тяжей, 158 остатков) и на 13% - из α-спиралей (9 спиралей, 44 остатка). Белок содержит три дисульфидных мостика (Cys47-Cys52, Cys207-Cys211 и Cys250-Cys283) и цис-пролин (Pro25), который консервативен в мукорпепсине, эндотиапепсине и пепсине свиньи.

Для новичков: β-тяжи (β-strands) — это участки молекулы белка, в которых связи пептидного остова нескольких идущих подряд полипептидов организованы в плоской конформации. На иллюстрациях (см. рис. ниже), β-тяжи белков иногда изображаются в виде плоских "лент со стрелками", чтобы подчеркнуть направление полипептидной цепи.

На сегодняшний день третичная структура химозина экспериментально установлена только для двух видов (рисунок 9) – коровы (Bos taurus) и одногорбого верблюда (Camelus dromedarius). Гомология первичной и третичной структуры химозинов этих видов составляет 95 и 85% соответственно.

Схема третичной структуры химозина коровы (I) и верблюда (II)

Рисунок 9. – Схема третичной структуры химозина коровы (I) и верблюда (II).

Химозины коровы и верблюда, как и других представителей аспарагиновых протеаз (АП), формируют характерную двудоменную структуру, разделенную щелью активного сайта. В ее центре расположены два каталитически активных аспартатных остатка (Asp34 и Asp216), боковые радикалы которых ориентированы внутрь щели. Расстояние между карбоксильным кислородом двух остатков Asp составляет 3,1 Å. Сравнительные рентгеноструктурные исследования показали, что трехмерная структура химозина коровы в целом очень близка к структуре пепсина свиньи и другим ранее полученным кристаллическим структурам АП.

Важной особенностью третичной структуры химозинов является необычное положение остатка Tyr77. Этот остаток, как было сказано ранее, является консервативным для АП и участвует в формировании активного субсайта S1. Однако в третичной структуре химозинов Tyr77 не участвует в формировании S1 субсайта, а напротив взаимодействует с ним и частично S3 субсайтом, тем самым вызывая самоингибирование фермента. → Исследования показали, что химозин существует в растворе в двух формах: активной, с субсайтами, свободными для взаимодействия с субстратом, и в самоингибированной форме с субсайтами S1 и S3, закрытыми остатком Tyr77. При этом установлено, что смещение равновесия в сторону активной формы происходит в результате специфического взаимодействия субсайтов S8-S4 с κ-казеином.

Каппа-казеин как основной субстрат химозина.

Одной из основных характеристик химозина, как протеазы, является его специфическая активность в отношении каппа-казеина молока, которая в некоторой мере определяет его биохимические свойства. В этой связи необходимо подробнее рассказать о κ-казеине и молоке, как среде, в которой протекает реакция гидролиза с участием химозина.

Молоко − сложная биологическая жидкость, содержащая воду, белки, жиры, лактозу, лимонную кислоту и неорганические компоненты, включая фосфат кальция. Белки молока подразделяют на казеины, белки сыворотки и белки, связанные с липидной фазой. Казеины секретируются эпителиальными клетками молочных желез и представляют собой семейство родственных фосфопротеинов, которые образуют мицеллы и содержат связанный кальций . Большая часть белка в молоке представлена казеином (фосфоказеинатом кальция), который в свою очередь подразделяют на четыре фракции: αs1-, αs2-, β- и κ-казеины, различающиеся способностью связывать ионы Ca2+ из-за разницы в содержании фосфатов. Большее количество фосфатов содержат гидрофобные белки - α- и β-казеины, которые легко осаждаются кальцием. В отличие от α- и β-, κ-казеин содержит только один фосфатный остаток и не осаждается кальцием, а гидрофобно реагирует с другими тремя фракциями казеинов. По мере того как казеины секретируются, они самоассоциируются в большие коллоидные агрегаты, называемые мицеллами, в которых α- и β-казеины удерживаются от осаждения за счет их взаимодействия с κ-казеинами в молоке. В молочной железе образование мицелл казеина позволяет концентрировать в жидком молоке белок и фосфат кальция.

Основным натуральным субстратом для химозина является κ-казеин (рисунок 10.). Атакуя к-казеин, химозин селективно и с высокой скоростью катализирует гидролиз "ключевой" связи Phe105-Met106. Кроме того, химомозин также способен гидролизовать некоторые пептидные связи αs1- и β-казеинов, однако протеолиз этих белков происходит гораздо медленнее, чем протеолиз к-казеина.

Исследование κ-казеина с помощью спектроскопического и молекулярного моделирования показывают, что мономерная форма этого белка принимает конформацию с устойчивыми вторичными структурными мотивами, наиболее значимыми из которых являются два набора антипараллельных β-слоев богатые гидрофобными боковыми цепями.

Аминокислотная последовательность κ-казеина коровы

Рисунок 10. – Аминокислотная последовательность κ-казеина коровы. Красным обозначены отрицательно заряженные аминокислотные остатки (а.о.); Синим обозначены положительно заряженные а.о. Подчеркиванием выделена химозин-чувствительная область.

Таблица 1. Обозначение аминокислот (на заметку).

Одно-
буквенное
обозначение
Русское
название
Комментарии
*заряженость бокового радикала для pН (6-7)
A
Аланин
Гидрофобная; Незаряженная
R
Аргинин
Основная; Несёт положительный заряд
N
Аспарагин
Гидрофильная; Незаряженная
D
Аспарагиновая кислота
Кислотная; Несёт отрицательный заряд
V
Валин
Гидрофобная; Незаряженная
H
Гистидин
Основная; Несёт положительный заряд
G
Глицин
Гидрофильная; Незаряженная
Q
Глутамин
Гидрофильная; Незаряженная
E
Глутаминовая кислота
Кислотная; Несёт отрицательный заряд
I
Изолейцин
Гидрофобная; Незаряженная
L
Лейцин
Гидрофобная; Незаряженная
K
Лизин
Основная; Несёт положительный заряд
M
Метионин
Гидрофобная; Незаряженная
P
Пролин
Гидрофобная; Незаряженная
S
Серин
Гидрофильная; Незаряженная
Y
Тирозин
Гидрофильная; Незаряженнная
T
Треонин
Гидрофильная; Незаряженная
W
Триптофан
Гидрофобная; Незаряженная
F
Фенилаланин
Гидрофобная; Незаряженная
V
Цистеин
Гидрофильная; Незаряженная

Химозин гидролизует каппа-казеин с образованием двух продуктов: гликомакропептида (ГМП) - С-концевого фрагмента Met106-Val169 и пара-κ-казеина (ПКК) – N-концевого полипептида Gln1-Phe105. После удаления ГМП (который формирует стабилизирующий "волосковый слой") казеиновые мицеллы сближаются и агрегируют, что приводит к образованию молочного сгустка, который стабилизируется кальциевыми мостиками.

С целью изучения механизма гидролиза κ-казеина коровы химозином проводились кинетические исследования с использованием различных субстратов. Использовался цельный κ-казеин и пептиды различной длины, соответствующие аминокислотной последовательности химозин-чувствительной области κ-казеина (рисунок 11) или пептидных аналогов.

Химозин чувствительная область κ-казеина коровы

Рисунок 11. – Химозин-чувствительная область κ-казеина коровы. Красным обозначены отрицательно заряженные а.о. Синим обозначены положительно заряженные а.о.

Хотя связь Phe105-Met106 является предпочтительной мишенью для химозина, специфичность протеолиза не связана только с последовательностью Phe105-Met106 как таковой. Исследования, проведенные с использованием методов молекулярного моделирования предполагают, что κ-казеин связывается с химозином сетью электростатических взаимодействий.

Биохимические параметры химозина значимые для практического использования

Фактически производство сыра представляет собой процесс дегидратации, в котором жир и казеины молока концентрируются в 6-12 раз, в зависимости от вида конечного продукта. Хотя протоколы для различных видов сыров отличаются в деталях, основные этапы являются общими. В упрощенном виде технологию производство сыра с применением молокосвертывающих ферментов можно разделить на две фазы: выработка продукта и его созревание. Выработка осуществляется в течение нескольких суток и в общем виде включает в себя следующие этапы: (1) подкисление (снижения рН молочной смеси с 6,6-6,7 до 6,4-6,5), (2) коагуляцию (внесение молокосвёртывающего ферментного препарата (МФП) и получение молочного сгустка), (3) обезвоживание (удаление сыворотки), (4) формование, (5) посолка. Степень гидратации конечного продукта регулируется комбинацией технологических операций. Температура, уровень влаги и соли, рН и видовой состав вносимой в сыр микрофлоры, влияют на разнообразные биохимические процессы, которые происходят в нем во время созревания и, следовательно, определяют вкус, аромат и текстуру готового продукта. Таким образом, органолептические свойства и качество готового сыра определяются всеми этапами его выработки, но основой сыроделия является получение молочного сгустка под действием молокосвертывающего фермента.

Активность и специфичность молокосвёртывающих ферментов

Рассматривая те или иные молокосвёртывающие ферментные препараты, мы всегда имеем в виду потенциальную возможность их практического использования. Поэтому для характеристики химозинов различного генеза используют следующие биохимические параметры:

1. Молокосвертывающая активность (МА),
2. Общая протеолитическая активность (ПА),
3. Специфичность (определяемая как МА/ПА),
4. Термостабильность (ТС),
5. Зависимость МА от рН субстрата,
6. Зависимость МА и ПА от концентрации ионов кальция в субстрате.

Молокосвертывающая активность (МА) – это высокоспецифичный протеолиз связи Phe105-Met106 в молекуле κ-казеина. Гидролиз этой связи приводит к дестабилизации казеиновых мицелл, в результате чего происходит образование молочного сгустка – основы для производства сыра. Несмотря на существование пептидных субстратов, имитирующих химозин чувствительную область κ-казеина, исследования активности фермента на молоке имеет как практическое, так и фундаментальное значение. Это объясняется тем фактом, что в физиологических и производственных условиях реакция специфического протеолиза проходит не в водном растворе, а в молоке, где процесс катализа зависит от структуры казеиновых мицелл и их микроокружения (сывороточные белки, жировые глобулы молока, ионы и т.д.).

Как правило при исследовании МА химозинов в качестве субстрата используют коровье молоко. Метод определения активности фермента на молоке коровы – прост, дешев и, самое главное, функционален, поскольку регистрирует продолжительность образования сгустка и, тем самым, имитирует события, происходящие как в желудке новорожденного, так и в сыродельной ванне.

Для примера ниже показаны общая и удельная МА 2-х рекомбинантных химозинов

Препарат
Общая МА, УЕ/мл
Концентрация белка мг/мл
Удельная МА УЕ/мг
Удельная МА, %
pХн-Bos
2752 ± 88
0.033 ± 0.005
83394
100
рХн-Cer-E.c
2330 ± 10
0.044 ± 0.002
52955
64

рХн-Cer-E.coli – препарат рекомбинантного химозина алтайского марала, полученного в системе экспрессии E.coli

рХн-Bos – коммерческий препарат рекомбинантного химозина коровы (Bos taurus) - эталон для сравнения → В настоящее время в производстве сыров официально применяются два рекомбинантных химозина – рХн коровы и одногорбого верблюда, синтезируемые в системах экспрессии A. niger var. awamori или K. lactis


Общая протеолитическая активность (ПА). При описании свойств любого нового химозина важной характеристикой является его общая протеолитическая активность (ПА). В отличие от МА, общая ПА фермента направлена на любые пептидные связи белков молока, за исключением связи Phe105-Met106 κ-казеина. Как говорилось ранее, специфичность химозина не связана только с последовательностью Phe105-Met106 как таковой, но и определяется суммой взаимодействий аминокислотных остатков субстрата и субсайтов узнавания ферментов.

Высокая общая ПА приводит к снижению выхода сыра (за счет потерь продуктов протеолиза, которые удаляются вместе с подсырной сывороткой) и ухудшению его органолептических (за счет образования горьких пептидов) и физико-химических свойств (нарушается текстура, формируется мажущая консистенция). Кроме того, неспецифический гидролиз казеинов молока ведет к ухудшению технологических характеристик подсырной сыворотки, которая используется в качестве сырья для изготовления некоторых продуктов питания (отдельные виды молочных напитков, детские питательные смеси, альбуминные пасты) или добавок в хлебопекарной промышленности. В этой связи, идеальный коагулянт молока для сыроделия – это фермент, сочетающий в себе высокий показатель МА и минимальную общую ПА.

Специфичность молокосвертывающего фермента определяется как соотношение молокосвертывающей и общей протеолитической активности (МА/ПА). Используя критерий специфичности коммерческие коагулянты молока можно расположить в следующей последовательности: рХн коровы > говяжий пепсин > мукорпепсины > эндотиапепсин. Представленный ряд отражает универсальность ферментов (чем выше специфичность, тем универсальнее препарат), а также указывает на возрастающую вероятность развития пороков вкуса и консистенции при использовании коагулянта с высокой общей ПА для выработки сыров с длительными сроками созревания и хранения.

Для примера ниже показаны МА, общая ПА и спецефичность 2-х препаратов химозина

Препарат Удельная МА% Общая ПА % Специфичность, МА/ПА
pХн-Bos 100 100 1.00
рХн-Cer-E.coli 64 114 0.56

Термостабильность (ТС) фермента – диапазон температур, при которой сохраняется его специфическая активность. Для коагулянтов молока этот показатель определяют путем измерения остаточной МА после прогревания при температурах в диапазоне 30-65 °С. Как правило, порогом ТС химозина (IT80) считается температура, при которой фермент сохраняет не менее 80% от исходной молокосвертывающей активности (измеренной при температуре 30-35 ⁰С).

Коагулянты молока с высоким порогом термоинактивации могут проявлять нежелательную ПА на стадиях выработки сыров, связанных с повышением температуры нагревания сгустка, а также при длительном созревании и хранении готовой продукции. Поэтому ТС является важной технологической характеристикой любого МФ, поскольку позволяет регулировать степень протеолиза и сроки созревания сыров путем варьирования температуры обработки молочного сгустка. Иными словами, порог термоинактивации (IT80) МФ влияет на стратегию его применения - так, для сыров с короткими сроками созревания и хранения допускается использование термостабильных коагулянтов молока с высокими IT80. Напротив, для сыров с длительными сроками созревания и хранения необходимо использовать ферменты с низким порогом температурной инактивации. Например, разница в ТС между рекомбинантным химозином козы, полученным в системе дрожжей P. pastoris, и натуральным составляет 10 градусов.

Литературные данные, свидетельствуют о том, что ТС химозинов может отличаться не только в зависимости от видовой принадлежности, но и, в случае рекомбинантных химозинов, от вида продуцента. Например, разница в ТС между рекомбинантным химозином козы, полученным в системе дрожжей P. pastoris, и натуральным составляет 10 градусов.

Зависимость МА от рН субстрата. Важным для ферментативной активности химозина является значение рН молока. На начальном этапе выработки сыра в молоко (имеющее рН≈6,7) вносят молочнокислые бактерии, которые утилизируют лактозу, с образованием молочной кислоты. В результате на этапе добавления химозина (этап 2) рН молока снижается до значения 6,4-6,5. Исходя из этого, одним из требований к технологическим молокосвертывающим ферментам является способность эффективно коагулировать молочный субстрат в слабокислом диапазоне рН.

Даже незначительные колебания значений pH молочной смеси приводят к значительному изменению баланса сил, стабилизирующих мицеллы казеина, что влияет на их биохимические свойства и время свертывания сычужного фермента. Если содержание ионов водорода увеличивается, время свертывания зависит не только от активности химозинов, но также от электростатических и гидрофобных свойств мицелл казеина. Подкисление молока снижает отрицательный заряд казеинов по мере приближения pH к значениям pI этих белков. Уменьшение суммарного отрицательного заряда снижает электростатические силы межмицеллярного отталкивания и одновременно усиливает гидрофобные взаимодействия казеин-казеина, ускоряя образование сгустка. Когда значения pH увеличиваются и отдаляются от pI казеинов, их суммарные отрицательные заряды увеличиваются. В результате усиливаются электростатические силы межмицеллярного отталкивания, что предотвращает близкое сближение мицелл казеина друг с другом. В то же время гидрофобные казеин-казеиновые взаимодействия ослабевают. Совокупный эффект этих физико-химических изменений приводит к замедленному образованию сгустка. По этой причине, повышение pH молочной смеси в диапазоне 6,0–7,0 приводит, как правило, к увеличению продолжительности ферментативного свертывания молока. Поэтому одно из основных требований к технологическим МФ – способность эффективно свертывать молоко в слабокислом диапазоне рН.

Влияние концентрации ионов кальция (CaCl2) на МА и ПА. В большинстве случаев до начала производства сыра молоко подвергается процедуре пастеризации. Как известно, почти весь кальций, присутствующий в молоке, связан с казеинами виде фосфоказеината кальция и только 10% его находится в ионизированной форме. Повышение температуры во время пастеризации приводит к снижению растворимости фосфатов кальция и их необратимой преципитации в форме Сa3(PO4)2. В результате снижения концентрации Ca2+ продолжительность коагуляции молока с использованием химозина увеличивается. Для нивелирования этого процесса, после пастеризации в молоко вносится CaCl2 до конечной концентрации 0,1-0,5 г/л (≈1-5 мМ), что улучшает коагуляционные свойства термообработанного молока. Но при повышении концентрации Са2+ увеличивается не только специфическая (молокосвертывающая) способность фермента, но и его общая протеолитическая активность, крайне нежелательная для выработки сыров. В этой связи одним из требований к молокосвертывающему ферменту для сыроделия является низкая чувствительность к концентрации Ca2+.

Для новых молокосвёртывающих ферментных препаратов чувствительность к содержанию Ca2+, которая эквивалентна или меньше чувствительности эталонных ферментов (например, рекомбинантного химозина коровы), является положительным фактором, поскольку дает возможность варьировать количество вносимого хлорида кальция, не беспокоясь о значительных изменениях MA и ПA.  Таким образом, в сыроделии низкая чувствительность коагулянта молока к нарастанию концентрации хлорида кальция в субстрате является предпочтительной, поскольку снижает риск развития избыточной ПА.

2. Протеолитические ферменты, применяемые в сыроделии

На рис.: Структура химозина, дестабилизирующая мицеллы казеина

Производство твердых, так называемых сычужных, сыров является одним из основных направлений в молочной промышленности, где применяются протеазы различного происхождения: животного, растительного, бактериального и грибного. Наиболее используемой протеазой является химозин (реннин) – аспартаза (EC 3.4.23.4), которая синтезируется в желудке (сычуге) жвачных животных и отвечает за коагуляцию κ-казеина. Следует отметить, что объемы производства и уровень потребления сыра в мире неуклонно растут, что объясняет наличие возрастающего спроса на сычужные ферменты.

Исторический аспект. Сыр как высококалорийный, богатый белком продукт питания  известен человечеству более 8000 лет, и на сегодняшний день существует не менее 1000 различных видов и сортов сыра [1]. Появление в рационе человека такого продукта неслучайно: сыр возник как один из способов сохранения другого ценного продукта питания – молока, так как в виде сыра оно пригодно для употребления длительный период времени. Стандартный процесс изготовления сыра состоит из следующих этапов: нормализация и пастеризация молока, коагуляция растворимых белков молока (свертывание), обработка сгустка, удаление сывороточных масс, формование и прессование, ферментация – а именно продукция молочной кислоты вносимой микробиотой, посолка и созревание. Таким образом, данный процесс представляет собой сочетание основных способов консервирования продуктов питания, издавна известных человеку: концентрирование, ферментация, высаливание и высушивание; благодаря этому удавалось не только сохранить молоко, но и получить более питательный, отличающийся высокой усвояемостью, продукт, состоящий из белка примерно на 25%, молочного жира примерно на 60% и содержащий около 3,5% минеральных веществ, не считая поваренной соли [2]. Иными словами, сыр – это наиболее концентрированный продукт обработки молока, содержащий все исходные компоненты в известных соотношениях в меньших единицах объема.

Впервые протеазы желудка телят, а также их использование как коагулирующего агента при производстве сыра, были описаны в конце XIX в. фармацевтом Х. Хансеном, работавшим над выделением, очисткой и стандартизацией активности  пепсина из телячьих желудков в Копенгагенском университете под руководством профессора Юлиуса Томсена [3]. Ранее традиционным считалось использование непосредственно порошка из измельченных тканей четвертого отдела желудка жвачных животных, а активный компонент, осуществляющий катализ коагуляции молочных белков, выявлен не был. Известны археологические находки, датируемые 6000–7000 лет до н. э., подтверждающие использование желудочных ферментов животных с целью получения сыра. Процесс описывается следующим образом: кислое молоко, получавшееся неспецифическим сбраживанием, т. е. благодаря находившимся в нем микроорганизмам, в том числе, попавшим в молоко с тела человека, животного, окружающей среды (фактически контаминации),  для  сохранения  помещали в сосуды, изготовленные из шкур и желудков животных. Наиболее часто встречались сосуды из желудков домашнего скота, в частности, жвачных животных. Существует предположение о том, что традиция приготовления сыров берет свое начало на Среднем Востоке, где в условиях жаркого субтропического климатамолоко оставалось свежим лишь несколько часов после дойки лактирующего животного. Затем молоко прокисало, и, находясь в покое в емкости из желудка животного, благодаря активности молочнокислых бактерий и ферментам, содержащимся в стенках сосуда, створаживалось: в верхней части сосуда формировался легко разрушаемый слой, образованный коагулированными белками, а в нижней оставались сывороточные массы, часть которых беспрепятственно вытекала, испарялась и впитывалась стенками сосуда. Позднее люди научились вручную концентрировать коагулят, т. е. удалять лишнюю сыворотку, а также начали дополнительно подвергать его высушиванию на солнце. Такой продукт сохранялся гораздо дольше во многом из-за высокой концентрации молочной кислоты – средства антагонизма преобладающих молочнокислых бактерий. Использование же рассолов для последующей обработки продукта позволило дополнительно продлить срок его хранения и повысить вкусовые качества. Производимый сегодня описанным путем сыр имеет название «рассольный незрелый», он особенно популярен в некоторых регионах Среднего Востока [4]. В 1874 г. Х. Хансеном в Копенгагене был открыт первый завод по производству сычужного фермента из желудков телят [5], а созданная им компания под коммерческим названием «CHR.HANSEN» существует по сегодняшний день и располагает рядом дочерних предприятий по всему миру [6].

С развитием генно-инженерных технологий стало возможно применение протеаз, получаемых без непосредственного использования тканей животного происхождения. В начале 1980-х гг. был получен рекомбинантный химозин, синтезированный бактериями Escherichia coli K-12, несущими в составе экспрессионного вектора ген, кодирующий коровий химозин. Он стал первым рекомбинантным ферментом, разрешенным к использованию в пищевой промышленности [7].

Формирование вкуса и аромата сыра. В соответствии со стандартной технологией, качество любого из многочисленных видов сыра определяется сочетанием четырех параметров: качеством исходного сырья (молока), комплексом коагулирующих ферментов, условиями и длительностью выдержки созревающего сыра, видовым и/или штаммовым составом и особенностями метаболизма микроорганизмов заквасочных культур, их характеристиками [4].

Одним из основных белковых компонентов молока является казеин, более 95% молекул которого существует в форме мицелл, состоящих из белка на 94% (сухого вещества) и на 6% из низкомолекулярных соединений, по большей части содержащих ионы кальция, магния, фосфаты, цитраты. Мицеллы, состоящие из 5000 мономеров, имеют сферическую форму, диаметр от 50 до 600 нм (в среднем – 120 нм) и вес около 105 кДа [8]. При повышении рН сверх 9,0 либо при внесении агента, хелатирующего ионы Ca2+, высокой концентрации мочевины или детергентов, мицеллы диссоциируют из-за разрыва водородных и гидрофобных связей. Коагуляция белков молока достигается ферментативным гидролизом κ-казеина, молекулы которого на поверхности белковых мицелл ориентированы своими полярными, отрицательно заряженными С-концами таким образом, что предотвращают агрегацию мицелл, вследствие создаваемого конформационного напряжения и расталкивания одноименных зарядов.

Особенности сортовой  технологии,  температурный  режим и устойчивость (полнота инактивации) фермента-коагулянта имеют важное значение в формировании вкуса и аромата сыра. Так, повышение температур на стадии коагуляции, призванное повысить скорость процесса и снизить количество остаточного белка в сыворотке, т. е. скорректировать недостатки используемого фермента, может привести к тому, что уровень активности выбранного коагулянта быстро снизится до 1–0,5 % от исходного уровня, что негативно скажется на всех характеристиках продукта. Тем не менее такая технологическая схема используется для производства таких сортов сыра, как «Эмменталь», «Пармезан» и ряда швейцарских сортов, но непригодна в случае с «Гаудой» и «Чеддером» или датскими сортами [9].

Экзогенный реннет и подобные ему ферментные комплексы коагуляции определяют структуру формирующегося сыра, его консистенцию и другие физические свойства. Была показана зависимость содержания влаги в сырном сгустке от количества активного химозина в нем (по количеству вносимого ингибитора – пепстатина): количество связанной воды – αw – увеличивается с ростом концентрации активного химозина, так как разрыв пептидной связи приводит к появлению групп NH3+, COO, конкурирующих за молекулы свободной воды из раствора, в котором находится формирующийся сырный сгусток [10]. Содержание влаги в созревающем сыре является крайне важным параметром, влияющим на развитие первичной и формирование вторничной микробиоты, что позволяет регулировать рост численности бактерий, так как все они нуждаются в воде. Например, повышенная влажность ведет к тому, что продукт плохо хранится, быстро портится и становится непригодным для реализации в торговых сетях [1].

Негативно на качестве сыра сказывается как недостаточная, так и избыточная активность фермента-коагулянта. Низкая активность фермента влечет за собой увеличение времени прохождения этапа коагуляции, повышение температуры проведения процесса, нарушение структуры и консистенции сыра и сырных продуктов, изменение содержания свободных аминокислот и баланса азота, из-за чего ферментация может проходить несколько иначе, чем предполагается технологией [8].

Запах сыра и его консистенция определяются содержанием амино- и жирных кислот и их производными, а также соотношением данных соединений и его изменениями, происходящими  во время созревания и ферментации. Например, такой компонент, как метанэтиол, формирующий аромат сыра, образуется из метионина благодаря лиазам заквасочных культур. Количество метионина, в свою очередь, определяется глубиной прохождения протеолиза [11].

Горечь сыру придают небольшие пептиды массой до 1,4 кДа с гидрофобными аминокислотами на C-конце, три- и гексапептиды в водорастворимой фракции, являющиеся продуктами неспецифического протеолиза казеинов ферментными препаратами (например, реннином). В середине 1970-х гг. К. Х. Ней предложил так называемую Q-гипотезу о полуколичественном отношении между аминокислотным составом пептида и интенсивностью горького вкуса: была оценена зависимость выраженности горького вкуса от гидрофобности боковых цепей, ассоциированных с аминокислотными остатками основной цепи [12]. Рассчитав свободную энергию переноса боковой цепи аминокислоты от этанола к воде, исследователь показал, что для синтезированных пептидов с гидрофобностью (Q) > 1400 кал/моль и молекулярной массой < 6 кДа характерен горький вкус, что может объясняться способностью таких молекул взаимодействовать с соответствующими рецепторами сосочков языка. Таким образом, пептиды с массами менее 6 кДа и высоким содержанием таких аминокислот, как лейцин, пролин, фенилаланин, тирозин, изолейцин и триптофан, скорее всего, будут придавать продукту горечь [13]. Тем не менее несколько позже, И. Шинода с коллегами путем химического синтеза коротких пептидов горького вкуса и их аналогов доказали, что природа и стерические характеристики именно терминальных аминокислот играют определяющую роль в появлении выраженного вкуса горечи сыра [14].

Перед производителями не стоит задачи полностью лишить сыр характерного горького вкуса, особенно выраженного у таких популярных сортов, как «Гауда» и «Чеддер», однако доминирующая позиция во вкусоароматической композиции не должна принадлежать ему. В большей степени на концентрацию в продукте соединений, придающих сыру горький вкус, влияют тип и количество вносимых стартовых бактериальных культур («молочнокислого» и «немолочнокислого» типов, первичных и вторичных), их пролиферация, а также характеристики ферментного препарата-коагулянта – реннина или подобных ему [2, 10]. К первичной микробиоте относятся бактерии Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus и Lactobacillus delbrueckii. Вторичная микробиота обычно представлена сложным комплексом различных бактерий, дрожжей и плесневых грибов [1].

Некоторое значение в формировании вкуса и аромата сыра  и сырных продуктов также могут иметь ферменты, обнаруживаемые собственно в молоке. Например, катепсин Д, плазмин и некоторые другие протеиназы, источником которых являются соматические клетки лактирующего животного [9].

Катепсин Д относится к  кислым  протеазам,  аспартазам  (EC 3.4.23.5), содержится в молоке здорового животного в количествах около 0,4 мг/л, имеет оптимум рН в диапазоне 3,0–4,0, температурный – 37 °С, способен сохранять активность после пастеризации при 70 °С в течение 1 ч или 15 с при 72 °С; гидролизует многие из тех связей в составе αs1, β, κ-казеина, что и химозин [15, 16].

Плазмин (EC 3.4.21.7) и плазминоген в свежем молоке ассоциированы с казеиновыми мицеллами, которые организованы казеинами, фосфатом кальция; κ-казеиновые цепи экспонированы на поверхность. Сайты, характерные для проявления гидролитической активности плазмина: для β-казеина Lys28-Lys29, Lys105-His106 и Lys107-Glu108, для αs2-казеина – 8 сайтов, цепи κ-казеина достаточно устойчивы к воздействию данного фермента. Однако первоначальный гидролиз казеинов вызывается экзогенным ферментным препаратом и в меньшей степени плазмином молока; его результатом является формирование больших нерастворимых в воде и более мелких по размеру растворимых пептидных конгломератов, которые в ходе созревания изменяются вследствие гидролиза ферментами микробиоты стартовых культур. Роль плазмина в процессе формирования сыра неоднозначна: присутствие его в смеси положительно сказывается на реологических качествах и органолептических свойствах только тех сыров, для производства которых характерна невысокая температура и сдвиг рН в щелочную сторону, например, «Камамбера», «Бри» [17]. Тем не менее отмечается, что в случае отсутствия плазмина процесс созревания сыра  затягивается, на производство тратится больше времени   и средств, а аромат и вкус такого продукта отличаются неполноценностью [18].

Несмотря на то, что в процессах формирования сыра и его созревания определяющее значение имеет ферментативный протеолиз, нельзя исключать влияние других биохимических превращений, имеющих место, таких как: сложный метаболизм лактозы и лактата, цитрата, липолиз, вторичный метаболизм свободных жирных кислот и аминокислот [2].

Качество ферментов коагуляции белков молока, чистота препаратов, возможность их многократного использования, стабильность и устойчивость, приемлемые оптимумы активности – характеристики, сказывающиеся не только на качестве, но и на стоимости производства сыров, поскольку ферментные препараты коагулянтов являются продуктом высокотехнологичного производства.

Характеристика ферментов-коагулянтов белков молока.

В сыроделии важнейшая функция протеаз – гидролизовать специфическую пептидную связь (Phe105-Met106) с образованием пара-κ-казеина  и макропептидов. Среди прочих протеаз предпочтение отдают химозину, поскольку он высокоспецифичен по отношению к казеину [19].

Химозин принадлежит к  обширному  классу  эндопептидаз и является аспартазой (EC 3.4.23.4) [20], которая отвечает за коагуляцию белков молока, а именно κ-казеина, составляющего 8–15% всех белков молока [15], и in vivo синтезируется преимущественно главными железистыми клетками четвертого отдела желудка (сычуга) новорожденных детенышей жвачных животных. Данный белок синтезируется в форме неактивного предшественника препрохимозина (381 аминокислотный остаток (а.о.)), который в ходе секреции в полость желудка лишается лидерной последовательности из 16 гидрофобных а.о. Это приводит к образованию прохимозина с массой 40,8 кДа, что соответствует 365 а. о. В кислой среде прохимозин, являющийся каталитически неактивной формой химозина, способен расщепиться на две формы фермента: при рН 4,2 удаление участка размером 42 а.о. с N-конца  приводит  к  образованию  уже  активного  химозина с массой 35,6 кДа (323 а.о.), характеризующегося низким процентным содержанием основных и высоким дикарбоксильных, β-гидроксиламинокислотных остатков; удаление 27 а.о. при рН 2,0 определяет образование псевдохимозина – активной формы фермента, которая стабильна в диапазоне рН 3,0–6,0, а при рН 4,5 конвертируется в собственно химозин. Про-сегменты, представляющие собой небольшие фрагменты, отделяемые в ходе активации химозина, играют определенную роль в правильном фолдинге и обеспечении формирования субстратной специфичности активируемого зимогена [16]. N-концевой участок (Gly1-Tyr175) химозина состоит в основном из β-слоев, С-конец (Tyr176-Ile323) представлен цилиндрическими доменами. Глубокая полость длиной 40 Å, связывающая субстрат, располагается на внешней стороне между этими доменами [5]. В основании полости находятся два каталитически активных остатка аспарагиновой кислоты Asp34, Asp216 по обе стороны от места расщепления пептидной связи субстрата [21].

Итак, химозин участвует в специфическом гидролизе связи Phe105-Met106 κ-казеина, который приводит к образованию двух фрагментов: гидрофобного пара-κ-казеина и гидрофильного гликомакропептида казеина. Последний диффундирует в сыворотку и его стабилизирующий эффект теряется. Продуктивность прохождения этапа определяется активностью и стабильностью фермента: химозин стабилен при рН 5,3–6,3; скорость образования коагулянта максимальна в температурном  диапазоне  20–42 °С, однако при температурах, близких к верхней границе, скорость процесса снижается, так что оптимальное значение лежит в диапазоне 30–40 °С [5, 22]. Показано, что температурная стабильность аспартаз зависит от рН, а присутствие других белков дополнительно стабилизирует фермент [23]. Вторым этапом коагуляции белков можно считать собственно агрегацию белковых мицелл, индуцируемую ионами Са2+, заканчивающуюся образованием сгустка. Полнота коагуляции на данном этапе зависит от концентрации белка, ионов Са2+, температуры и рН.

Необходимо отметить, что пепсин А (ЕС 3.4.23.1), который также является желудочной протеазой, доминирующей в составе желудочных ферментов взрослых млекопитающих, крайне близок химозину: синтезируется в виде предшественника, активируемого удалением сигнального пептида в момент секреции, специфично гидролизует пептидные связи в αs1- и β-казеине [3, 17]. Пепсин, как и химозин, в основном применяется в производстве сыров и молочных продуктов [24]. В целом пепсин и химозин имеют схожую структуру и пространственную организацию (55% идентичности аминокислотного состава). Для ферментных препаратов, используемых в катализе коагуляции казеинов, важной характеристикой является соотношение уровня молокосвертывающей активности, выраженной в международных единицах коагуляции IMCU  (International  Milk-Clotting  Units), к уровню общей протеолитической активности: оптимальным считается значение,  приближающееся  к  единице  [21].  Однако в некоторых случаях наличие пепсинного минорного компонента в составе ферментного препарата положительно сказывается на качестве  получаемого  продукта:  пепсин  конкурирует  (1:1)  с химозином за связывание молекул ингибитора, например, пепстатина; при значении рН около 7,0 способен долго сохранять активность и взаимодействовать с белками сыворотки; в невысоких концентрациях способствует увеличению скорости образования сгустка [25].

Механизм гидролиза пептидной связи, общий для представителей класса аспартаз, предполагает нуклеофильную атаку молекулой каталитической воды атома углерода в составе карбонильного  остатка  белка-субстрата.  Первый  этап  включает  в себя перенос протона от воды на аспарагиновую пару, который затем конкурентно переносится на атом кислорода в составе карбонильной группы в месте разрезания пептидной связи. Таким образом, вода является атакующим нуклеофилом, как в большинстве механизмов кислого и щелочного гидролиза. Протонирование приводит к образованию тетраэдрического интермедиата, разрушение которого инициируется переносом протона на аспартатную пару и далее на атом азота субстрата [26].

В соответствии с происхождением выделяют несколько разновидностей ферментов, используемых при производстве сыров и аналогичных продуктов: животные реннины, растительные протеазы, микробные коагулянты молока и генно-инженерные коагулянты, под которыми чаще всего подразумевают именно химозин.

Животные реннины.

животные реннины

Традиционным способом получения ферментов, коагулирующих белки молока, считается выделение реннинов из стенок четвертого отдела желудка детенышей жвачных животных, питающихся молоком. Для выработки данных ферментов наиболее часто используют следующих млекопитающих: Bos taurus taurus, Bubalos bubalos, Camelus bacterianus, Camelus dromedaries, Capra hircus, Equus asinus asinus, Equus ferus caballus, Ovus aries, Sus scrofa domesticus и др. [27–33]. Получаемые реннины отличаются относительно высоким содержанием химозина по отношению к другим протеазам, составляющим препарат, что положительно сказывается на основных органолептических качествах производимых с их использованием сыров. Однако животные реннины содержат ряд минорных примесей, что приводит к появлению продуктов неспецифического протеолиза, снижению общей эффективности препарата, увеличению общего времени створаживания, изменению характеристик сгустка, ухудшению потребительских свойств конечного продукта – изменению вкуса, аромата, структуры и консистенции. Так, было показано, что индивидуальное использование химозина в качестве коагулянта, повышает общий выход продукта и улучшает его потребительские качества, в частности, у такого сыра исчезает горький вкус, срок хранения более продолжителен, а при температурной обработке сыр становится в меру тянущимся, что подтверждает правильность его структуры [28]. Кроме того, ферменты животного происхождения, получаемые из желудков телят, молодняка коз, овец, характеризуются невысокой стабильностью и активностью, и могут быть использованы в производстве сыра лишь из соответствующего молока [34].

Забой молодняка в целом экономически не оправдан, более того, по различным причинам, таким как квота на молоко и колебания цен на мясо, количество телят, доступных для убоя, снижается. Как следствие, снижается и количество сычужных ферментов, получаемых из желудков телят. С другой стороны, объемы производства и уровень потребления сыра в мире неуклонно растет (табл. 2.1), вызывая постоянный рост спроса на сычужные ферменты, что, в свою очередь, приводит к поиску альтернативных источников данных ферментов [34–36]. Следует  отметить, что в Беларуси производится около 1,1 % мирового объема молока, а по производству сыров и сырных продуктов страна занимает 34-ю позицию в списке крупнейших стран-экспортеров [37].

Таблица 2.1. Мировое производство и потребление сыра, 2000–2020 гг.

 

 

Регион
 2000 г., 103 т
 2012 г., 103 т
 2012/2000
2020 г.,
103 т (прогноз)
2020/2012
103 т (прогноз)
произ-вод- ство
потреб-ление
произ-вод- ство
потреб-ление
произ-вод- ство, %
потреб-ление, %
произ-водство
потреб-ление
произ-водство, %
потреб-ление,
%
Cтраны Европы
7709 +266
7502
+245
9333 +291
8870
+318
+21/ +9
+18/
+30
10,606 +338
9629
+372
+14/
+16
+9/
+12
СНГ
448
714
866
1150
+93
+61
1072
1145
+24
+26
США
4227
4390
5618
5557
+22
+27
6720
6950
+20
+25
Океания
665
266
700
268
+5
+1
930
302
+33
+13
Азия
293
557
456
1642
+55
+84
1288
1672
+182
+63
Средний Воток, Африка
744
1108
1512
1840
+103
+66
2054
2676
+36
+45
Общее количество
15470
15700
20401
20668
+32
+32
25075
25087
+23
+21

Примечание. По данным IDF, ZMB, FAPRI, CNIEL, PM FOOD & DAIRY CONSULTING [35].

Разные климатические зоны Земли, характеризующиеся совокупностью природных особенностей, располагают оптимальными условиями для разведения человеком строго определенных видов сельскохозяйственных животных, что во многом обуславливается ландшафтом, влияющим на видовое разнообразие растений. Необходимо также отметить, что совокупность особенностей природных условий способствовала определенному сценарию развития исторических событий, что сформировало некоторый культурный пласт, одним из компонентов которого можно считать распространение какой-либо преобладающей мировой религии. Культура питания, пищевые привычки, традиционные продукты – все это, так или иначе, регламентируется главенствующей в конкретной стране на определенной территории конфессией. Так, в большинстве штатов Индии и Непала существует запрет на убийство коров. Для иудеев действует кашрут – система ритуальных правил, определяющих соответствие чего-либо требованиям еврейского Закона Галахи; термин используют применительно к своду религиозных предписаний, связанных, в том числе с пищей. Мусульмане в быту руководствуются понятием халяль, под которым обычно понимают  мясо животных, употребление которого не нарушает исламские пищевые запреты, но  в  целом  халяль относится практически к любой сфере человеческой жизни. Вегетарианство является обязательным для последователей джайнизма, широко практикуется среди последователей буддизма и индуизма, и в настоящий момент достаточно популярно среди жителей Земли (табл. 2.2) [38, 39]. В целом, по религиозным убеждениям, в угоду моде или из-за индивидуальных особенностей, население формирует спрос на товары, произведенные без нанесения вреда окружающей среде, в том числе, без эксплуатации как диких, так и сель- скохозяйственных животных. В определенной степени данный факт также играет роль в развитии альтернативных технологий производства молочных продуктов, в частности, сычужных сыров.

Таблица 2.2.  Распространенность вегетарианцев в различных странах [39]

Страна
Население,
млн человек
Вегетарианцы,
млн человек
Вегетарианцы,
%
Индия
1260
450
35
Италия
61
5,9
9
Великобритания
63
5,4
9
Германия
82
7,4
9
Нидерланды
17
0,7
4
США
320
12,1
4
Канада
35
1,3
4
Австрия
8
0,25
3
Швейцария
8
0,23
3
Франция
64
1,2
2

Примечание. Данные, представленные в таблице 2.2., являются средними значениями и получены в ходе проведения опросов населения указанных стран различными вегетарианскими сообществами.  В  Африке,  Восточной  Европе и Южной Америке количество вегетарианцев составляет меньше 1%.

Еще одним фактором, способствующим продвижению разработок альтернативных источников ферментов, коагулирующих белки молока, является открытие белков прионов и трансмиссивной губчатой энцефалопатии рогатого скота [40]. По информации Всемирной организации здравоохранения и Международного эпизоотического бюро, в Европе за 1986–2000 гг. зарегистрировано около 200 тыс. случаев заболевания крупного рогатого скота губчатой энцефалопатией и более миллиона случаев заражения. Также выявлено 85 случаев болезни Крейтцфельдта-Якоба у людей молодого возраста. Наибольшее количество заболеваний губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота выявлено в Великобритании (свыше 180 тыс. случаев), Бельгии, Дании, Германии, Ирландии, Испании, Лихтенштейне, Люксембурге, Португалии, Франции, Швейцарии (более 1500 случаев) [41]. В то же время на территории вышеперечисленных стран располагаются крупные заводы и фабрики, традиционно производящие сычужные сыры. Во многих странах действуют соответствующие законы и правила, ограничивающие ввоз продуктов животного происхождения, а также регулирующие их производство внутри страны. Так, для стран – членов Таможенного союза в соответствии с Приложением 7, пунктом 1.3 к техническому регламенту Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) к запрещенным для использования в составе биологически активных добавок к пище объектам относятся органы и ткани животных и продукты их переработки, являющиеся специфическими материалами, повышающими риск передачи прионовых заболеваний (трансмиссивной губчатой энцефалопатии) [42].

Поиск замены стандартным ферментам ведется исследователями среди представителей царства животные. В ряде исследований была показана принципиальная возможность использования в сфере производства сыра некоторых ферментов рыб (Gadus morhua, Thunnus atlanticus и других промысловых видов), выделяемых из отходов производств (внутренности, потроха, идущие на гидролизную переработку для использования в качестве кормовой добавки), и ферментов из желудка морских млекопитающих (Phoca groenlandica) [24, 25]. Для таких ферментов характерно проявление высокой активности при низких температурах. Кроме того, удалось обнаружить химозиноподобные протеазы в составе тканей гепатопанкреаса ракообразных Munida, которые не являются промысловыми морскими организмами, однако составляют определенную часть улова, и после вылова фактически не используются и погибают [43].

Растительные протеазы.

Plant Proteases

Достаточно привлекательным с экономической точки зрения выглядит использование растительных белков, так как спектр проявляющих протеолитическую активность ферментов (аспартаз), обнаруживаемых в различных частях растений многих видов, весьма значителен. Была создана база данных протеолитических ферментов, их субстратов и ингибиторов «MEROPS» [44]. По данным «MEROPS», класс аспартаз является вторым по распространенности среди пептидаз растений [45]. Для получения протеаз с доказанной принципиальной возможностью использования в качестве коагулянтов белков молока применяются следующие растения: Aloe variegate, Ananas sp., Actinidia sp., Asparagus officinalis, Balanites albizia, Benincasa cerifera, Brassica napus, Bromelia hieronymi, Calotropis procera, Centaurea calatrava, Cirsium vulgare, Cucumis melo, Cynaria cardunculus, C. humillis, Dieffenbachia maculata, Ficus carica, Panax ginseng, Solanum elaeagnifolium, S. dobium, Zingiber officinale и др. [8, 40, 45–71]. Для некоторых из перечисленных организмов характерен синтез ферментов подобных животным химозинам по многим параметрам, для других же – образование отличных от реннинов протеаз, которые, однако, имеют достаточную аспартазную активность.

Растения, как сырье для получения ферментных препаратов различного назначения, используются давно, а спектр доступных ферментов, различающихся по ряду характеристик, в частности, температурным и рН оптимумам, широк. Кроме того, препараты растительного  происхождения  являются  безопасными и могут быть использованы в пищевой промышленности. Некоторым ограничением выступает сезонность доступности сырья, а также то, что определенные виды растений вовсе нецелесообразно использовать в регионах, где они не произрастают [70].

Несмотря на многочисленные преимущества растительных ферментов и их разнообразие, лишь немногие могут использоваться для производства сыров и сырных продуктов в масштабах некрупных производств; растительные аспартазы очень разнообразны и каждый тип требует более подробного изучения, подбора условий, оценки эффективности применения такой замены [70]. Например, показано, что для получения сыров из цельного молока коров, фермент кардозин (цинараза, ципросин – синонимичные названия, используемые для обозначения кислых пептидаз, получаемых водной экстракцией из растений  рода Cynara видов scolymus, humillis, cardunculus) является неподходящим: сыр имеет излишне горький вкус [11, 59, 66]. Данный фермент в то же время отлично подходит для коагуляции белков  молока овец и коз и может быть использован для работы с молоком коров, прошедшим предварительную ультрафильтрацию (качество продукта аналогично получаемому с использованием животного реннина) [1, 11, 13]. Довольно перспективно выглядит возможность применения кукумизина (EC 3.4.21.25), источником которого являются плоды Cucumis melo. Уровень неспецифического протеолиза достаточно невысокий, сопоставим с таковым, характерным для препаратов реннина [55, 71].

Грибные протеазы.

Мукор - Rhizomucor miehei
Мукор: 1 – мицелий гриба; 2 – спорагиеносцы; 3 – спорангии; 4 – споры бесполого спороношения; 5 – образование гаметангиев; 6 – отделение гаметангиев мукора; 7 – многоядерная зигота; 8 – споры полового спороношения

Ряд исследователей в качестве природных источников коагулирующих ферментов предлагают использовать грибы, например, Amylomyces rouxii, Aspergillus niger, Aspergillus oryzаe, Aspergillus versicolor, Endothia (Cryphonectria) parasitica, Metschnikowia reukaufii, Mucor baciliformis, Nocardiopsis sp., Penicillum oxalicum, Penicillum duponti, Rhizomucor miehei, Rhizopus microspores, Rhizopus pusillus var Lindt и др. [20, 72–79]. Уровень экспрессии генов термофильных грибов, кодирующих ферменты, способные к сбраживанию молока, часто определяется условиями их культивирования, а именно составом питательных сред и вносимыми добавками. Тем не менее производство ферментов грибного происхождения является относительно недорогим, а качество получаемых препаратов (сохранение активности при длительном непрерывном использовании, способность выдерживать продолжительное нагревание, предполагаемое технологическим процессом) достаточно высоким. Например, M. reukaufii W6b – несколько необычный дрожжевой продуцент химозиноподобной протеазы, ассоциированной с мембраной, выделенный из придонного слоя Южно-Китайского моря; используя оптимизированные условия, удалось получить целевой фермент, проявляющий активность при 40 °С, рН 3,4 [75]. Ген sap6, кодирующий данную протеазу, был клонирован в составе экспрессионных векторов в штаммах E. coli и Saccharomyces сerevisiae; полученный ферментный препарат проявлял молокосвертыва- ющую активность, сопоставимую с уровнем коммерческих препаратов [80].

Многие крупные фирмы-производители имеют в своем ассортименте ферментные препараты для молочной промышленности, получаемые ферментацией, в том числе, природных штаммов грибов: в компании «Пфайзер» был разработан продукт «CHY-MAX» (получен ферментированием A. niger), «MEITO SANGYO» – «Meito Microbial Rennet» (R. miehei, R. pusillus var Lindt), «DSM Food Specialties Dairy Ingredients» – «Fromase®750XLG», CSK Food Enrichment – «Milase» (R. miehei), «DSM Food Specialties Dairy Ingredients» также производит препарат «Suparen» (E. parasitica) [81]. Необходимо отметить, что процедура регистрации и присвоения продукту соответствующего применению в пищевой промышленности статуса безопасного несколько осложнена тем, что, хотя все перечисленные грибы являются непатогенными для человека, некоторые из них синтезируют токсичные соединения в малых концентрациях. Исходя из требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011), недопустимо присутствие афлатоксина В, зеараленона, Т-2 токсина и охратоксина А в разрешенных к использованию молокосвертывающих ферментных препаратах грибного происхождения [42].

Протеазы бактерий.

протеазы бактерий

Еще одним природным источником протеаз, которые могут применяться в производстве сыров, являются бактерии, не подвергавшиеся генетической модификации: Bacillus licheniformis, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis (natto), Myxococcus xanthus, Proteus mirabilis и др. [47, 82, 83]. Природные бактериальные продуценты часто применяются производителями в качестве замены препаратов животного происхождения и альтернативы рекомбинантным продуцентам. Однако у них существует два основных недостатка: присутствие больших количеств неспецифических и термоустойчивых протеаз, приводящих к появлению горечи у сыра во время хранения, а также низкий выход необходимого фермента [19].

Тем не менее традиционным способом получения ферментов, коагулирующих белки молока, т.  е.  путем  выделения  их из стенок желудков жвачных животных, по-прежнему активно пользуются на многих предприятиях различных стран мира. Выбор ферментов животного происхождения во многом объясняется традицией; животные реннины остаются образцом для сравнения всех ферментов альтернативного происхождения, которые должны по крайней мере воспроизводить их свойства либо демонстрировать характеристики более высокого уровня качества. Сорт сыра – это характеристика продукции, строго регламентированная государственным стандартом. Замена одного фермента на другой является изменением технологии, принятой схемы производства – таким образом, вырабатываемая продукция не всегда может быть классифицирована как заявленный производителем сорт и  носить  соответствующую  маркировку и торговое название. Некоторые сорта сыра в настоящее время можно приготовить только с использованием животных реннинов; подбор альтернативной по происхождению замены требует более тщательной проработки и изучения свойств ферментов, подготовки документации [57, 61]. Однако отдельные сорта сыра производят без животных реннинов – катализирующими коагуляцию агентами являются аспартазы растительной, грибной природы. Например, некоторые традиционные португальские, испанские сорта из овечьего, козьего молока и их смесей с давних времен готовят с добавлением экстрактов и непосредственно цветков растения Cynara cardunculus [27, 61]. Исследования показали, что входящие в водные экстракты указанных растений белки являются химозиноподобными аспартазами, которые имеют невысокую активность по отношению к коротким пептидам, что благоприятно сказывается на вкусе продукта.

Получение рекомбинантного химозина.

рекомбинантный химозин синтезируемый бактериями

Традиционная технология получения препаратов, содержащих химозин животного происхождения, имеет ряд значительных недостатков: высокая себестоимость, низкая активность, нестабильный температурный и рН оптимум, присутствие протеаз с другим спектром активности, несоответствие потребительским категориям «вегетарианский продукт», «кошерный продукт» и др. Поэтому большинство современных предприятий используют высококачественный и доступный рекомбинантный химозин. Примеры создания рекомбинантных форм химозина приведены в табл. 2.3.

Последовательность мРНК химозина коров была использована для синтеза кДНК in vitro и клонирована в составе вирусных и бактериальных векторов еще в начале 1980-х гг.  [84–86],  а аминокислотная последовательность химозина известна еще с 1977 г. [87]. Первая форма рекомбинантного химозина (прохимозина) была получена К. Нишимори с коллегами в 1982 г. путем экспрессии прохимозина в качестве слитого с N-терминальным фрагментом β-галактозидазы бактерий E. coli. Для этого была создана плазмидная конструкция pCR301, где lacUV5 промотор служил регулятором экспрессии прохимозина [86].

Таблица 2.3. получение химозина с помощью рекомбинантных микроорганизмов
[28, 32, 82, 86, 88, 95, 96, 99–113]

Источник гена
Форма химозина
Плазмида
Промотор
Продуцент
Автор
Корова
Прохимозин
pCR301
lacUV5
E. coli
Nishimori et al., 1982
Корова
Прохимозин
pCT66,67,70
trp
E. coli
Emtage et al., 1983
Корова
Прохимозин
P501
tpr
E. coli
Nishimori et al., 1984
Корова
Прохимозин
pTaAc
tac
E. coli
Zhang et al., 1991
Овца
Met-прохимозин
pKP1500
E. coli
Rogelj et al., 2001
Коза
Прохимозин
pET43.1a(+)
T7
E. coli
Kumar et al., 2007
Корова
CHY-Tol-A-III
pTOLT
T7
E. coli
BL21 (DE3)
Ulusu et al., 2016
Корова
Прохимозин
pKM636, pKM1361, pKM6361
speA
P. mirabilis
Klessen et al., 1989
Корова
Прохимозин
pSM316
Нейтральной протеазы
B. subtilis
Parente et al., 1991
Коза
Прохимозин
pQSec1
PGK
Kluyveromyces lactis
Vega-Hernandez et al., 2004
Коза
Прохимозин
pQFlag1
ADH2
S. cerevisiae
Vega-Hernandez et al., 2004
Буйвол
Пре-, про-, химозин
pGAPZαA
GAP
Pichia pastoris
Vallejo et al., 2008
Корова
Прохимозин
pPICZaA-Prochy
AOX1
P. pastoris
Zhang et al., 2009
Корова
Про-,
химозин
pGAPZα-A
GAP
P. pastoris
Jiang et al., 2012
Мукор улитковидный (Mucor circinelloides)
Внеклеточная
аспарагиновая протеиназа
(MCAP)
 
pGAPZα-A
 
GAP
 
P. pastoris
Gama Salgado et al., 2013
Корова
Про-,
химозин
pPIC9K
AOX1
P. pastoris
Noseda et al., 2013, 2014
Верблюд
Про-,
химозин
pPIC9K
AOX1
P. pastoris
Wang et al., 2015
Корова
Прохимозин
pPICZαA
AOX1
P. pastoris
Espinoza-Molina et al., 2016
Як
Пре-, про-,
химозин
pPICZαA
AOX1
P. pastoris
Luo et al., 2016
Корова
Химозин
pMARG-CHY
glaA
A. oryzae
Tsuchiya et al., 1993
Корова
Химозин
pGDHQ
pdA, pepB
A. awamori
Cardoza et al., 2003
Верблюд
Прохимозин
pGAMpR
glaA
A. niger
Kappeler et al., 2006

Дж. С. Эмтэдж с коллегами в 1983 г. также клонировал прохимозиновую последовательность в составе векторной молекулы в E. coli: соответствующая прохимозину кДНК была встроена в плазмидный вектор pCT70 (собирался из двух фрагментов) так, что ее экспрессия находилась под контролем trp-промотора, оператора и Т7-терминаторной области. Полученной конструкцией трансформировали штамм E. coli K12 HB101. Индукция экспрессии гена целевого продукта запускалась культивированием на минимальной питательной среде, не содержащей триптофан. С помощью гель-электрофореза белков в полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирования и иммунопреципитации соответствующими мечеными антителами подтвердили, что трансформированные клетки экспрессируют прохимозин (50–250 тыс. молекул на клетку). Оказалось, что у бактерий синтезируемый белок накапливается в тельцах включения. Очистка фермента проводилась хроматографически на ДЭАД-целлюлозе после денатурации в растворе 9 М мочевины с последующим диализом. Кроме того, исследователям удалось показать, что активность получаемого таким  способом  фермента  сопоставима с вариантами животного реннина коров, используемого в про- мышленности [88].

Годом позже, в 1984 г., была опубликована статья, описывающая использование трансформированных дрожжей S. cerevisiae для получения реннина. Последовательность ДНК, кодирующую метионил-прохимозин, лигировали с фрагментом дрожжевой хромосомы, несущей промотор GAL1, а затем клонировали  в составе челночного вектора (E. coli / S. cerevisiae) с или без терминатора транскрипции от дрожжевого гена suc2. Обе конструкции в составе клеток S. cerevisiae показали одинаковый уровень интенсивности экспрессии целевого гена (по количеству белка и соответствующей ему мРНК) [89].

М. МакКаман с коллегами, используя обратную транскрипцию мРНК химозина, выделенной из четвертого отдела желудка теленка, сконструировал вектор p5G3 на основе плазмиды pBR322. Далее эту конструкцию использовали для создания вектора для экспрессии pWHA43: был добавлен линкер, содержащий кодон ATG, и произведена вставка участка, кодирующего химозин. Из всех вариантов (с разными промоторными участками: lac, λPr, trp) самый высокий уровень экспрессии целевого гена в 5% от всего клеточного белка был показан для конструкции, содержащей тандемный промотор lac-trp. Терминатор транскрипции прохимозина в данном варианте отсутствовал, его функционально заменял терминатор стоящего рядом гена β-лактамазы. Для экспрессии использовался штамм E. coli CY150001. Смесь всех клеточных белков (т. е. химозин в смеси с другими белками) не проявляла активности по отношению к белкам молока без активации с помощью низких значений pH. Электронная микроскопия подтвердила наличие многочисленных телец включения внутри клеток экспрессирующего химозин штамма E. coli. Проведение ультразвуковой дезинтеграции с последующим циклом денатурации-ренатурации молекул целевого белка позволило получить активный фермент. Кроме того, исследователям удалось в рамках работы подтвердить предположение о том, что структурные и функциональные свойства рекомбинантного варианта химозина практически идентичны свойствам, характерным для природного химозина коров [90].

Аналогичные работы по изучению экспрессии прохимозина в клетках бактерий и дрожжей проводились в различных лабораториях: исследователи столкнулись с общей проблемой неправильного фолдинга нарабатываемого белка, его нерастворимостью, т. е. для получения активной формы фермента требуются дополнительные стадии, что снижает эффективность биотехнологического способа производства ферментного препарата для промышленного использования [91–93].

Д. Каллену с коллегами в 1987 г. удалось добиться секреции синтезируемого прохимозина, используя Aspergillus nidulans. Они протестировали несколько вариантов сигнальных пептидов (16 а. о. сигнального пептида прохимозина млекопитающих, глюкоамилазы A. niger) и показали, что для экспрессии в A. nidulans одинаково хорошо работают разные сигнальные пептиды: более 90% всего синтезируемого химозина секретировалось во внешнюю среду. Экспрессия гена прохимозина находилась под контролем глюкоамилазного промотора A. niger; использование селективного маркера pyr4 Neurospora crassa обеспечивало множественную интеграцию фрагмента вектора, несущего ген целевого белка, в хромосомы A. nidulans. Таким образом был достигнут уровень эффективности экспрессии в 145  мкг химозина на  1 г сухого мицелия [94].

Для экспрессии химозина у дрожжей Pichia pastoris в ряде работ было предложено использовать промотор гена алкоголь-оксидазы (AOX1), индуцируемый метанолом [95, 96]. В другой работе была описана интегративная конструкция на основе плазмиды pGAPZα для штамма P. pastoris GS115, где последовательность, кодирующая прохимозин, находилась под контролем конститутивного промотора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH); кроме того, в составе вектора содержался участок α-фактора секреции. По такой схеме был получен химозин, секретируемый в среду и обладающий нормальным уровнем ак- тивности [97].

В 1989 г. К. Клессен с коллегами предложил использовать генетически модифицированные L-формы Proteus mirabilis для получения секретируемого химозина коров. Плазмидная кон- струкция включала кДНК прохимозина,  последовательность гена speA (экзотоксин типа А Streptococcus pyogenes), промотор speA, сайт связывания рибосом, сигнальную последовательность. Максимальный выход фермента, который удалось достигнуть, используя описываемую систему, был равен 40–50 мг/мл бесклеточной культуральной жидкости [82]. Следует отметить, что в большинстве подобных работ использовалась форма прохимозина, так как стало известно, что просегмент имеет определенное значение для фолдинга данного белка [98].

Попытки добиться секреции синтезируемого белка из клетки при использовании E. coli привели к созданию генно-инженерных конструкций, включающих последовательности различных мембранных белков бактерий. Например, Г. Эллиот с коллегами предложил использовать фрагмент мембранного белка А (ompA) бактерий на N-конце прохимозина, И. Б. Холланд и коллеги – гемолизин Hly8 на С-конце [114, 115]. Кроме того, в работах П. Тихого с коллегами были подобраны оптимальные условия для перевода телец включения в растворимую форму и проведения рефолдинга химозина с сохранением максимально возможного уровня активности, что дало суммарно восьмикратный прирост по выходу целевого фермента [116]. Дж. Рех и другие исследователи предложили использовать двухфазные водные системы для экстракции белков, в частности, химозина из телец включения. Для этого применяли системы с полиэтиленгликольфосфатом или полиэтиленполипропиленоксидом. Выяснилось, что для рекомбинантного химозина коров характерен коэффициент распределения от 4 до 6 (по отношению к органической фазе), что объясняется наличием гидрофобных областей на поверхности молекул данного белка. Рекомбинантный химозин показал высокую аффинность к полиэтиленгликолевой фазе; после рефолдинга активность выделяемого из этой фракции химозина составляла 50–59% от исходной [117]. Для внеклеточной и внутриклеточной экспрессии гена химозина Д. Паренте с коллегами использовал грамположительные бактерии B. subtilis SMS118 и челночный вектор pSM214 или бациллярный вектор pSM308; целевая конструкция имела название pSM316 (или pSM341 – с усиленным рибосомсвязывающим сайтом) [107].

Перспективно выглядят продуцирующие химозин штаммы, создаваемые на основе бактерий  Lactococcus lactis.  Г.  Симонс  с коллегами добился экспрессии прохимозина под контролем промотора гена, кодирующего протеиназу PrtP, объединив таким образом последовательность химозина с последовательностями мембранных протеаз различной длины. Однако, по данным полученным Т. Луэрце с сотрудниками в 2015 г., использование штамма L. lactis NCDO2118, ксилозоиндуцируемой системы экспрессии и векторных конструкций, собранных из плазмиды pXYSEC с последовательностью сигнального пептида основного секретируемого белка Usp45 и гена прохимозина (химозина форм А и В), не приводит к секреции целевого белка в активной форме [118]. Такие результаты исследователи объяснили предположением о том, что синтезируемый рекомбинантный белок остается связанным с клеточной стенкой лактококков.

Еще одним организмом-хозяином, который пригоден для получения пищевых белков и имеет классификацию «Общепризнанные как безопасные» (GRAS) [119], являются грибы K. lactis.

Для этих молочнокислых дрожжей система экспрессии химозина была разработана еще в 1990 г. Дж. Ван дер Берг с коллегами клонировал кДНК прохимозина в составе интегративных векторов pGB901, pGB902, pGB904, pGB905, pGB906 и pKS105, которые между собой различались типом используемого сигнала секреции; конструкциями трансформировали штамм K. lactis SL56. Система оказалась довольно эффективной, причем как с приме- нением дополнительной лидерной последовательности, так и без нее [120].

Одним из способов по усовершенствованию получения гетерологичных белков в дрожжах является направленный мутагенез генов белков, участвующих в процессинге и фолдинге в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. Известно, что инактивация гена pmr1, кодирующего Р-тип Са2+ АТФазы, обнаруживаемой в аппарате Гольджи, приводит к значительному увеличению секреции некоторых чужеродных белков. Ч. Фэн с коллегами использовал данный подход при работе с дрожжами K. lactis GG799. Экспрессия прохимозиновой последовательности в составе плазмиды pKLAC1 показала, что мутантный штамм способен синтезировать в 6 раз больше химозина, чем штамм дикого типа [121].

На сегодняшний день наиболее широко используется рекомбинантный химозин коров, получаемый экспрессией в различных микроорганизмах. Тем не менее доступны также химозины других млекопитающих: коз, верблюдов и буйволов [111]. Например, И. Роджели и его коллеги в 2001 г. выполнили работу по созданию бактериального штамма-продуцента химозина  овец на основе бактерий E. coli JM109 и мРНК, полученной из биологического материала ягнят; использовали экспрессионный вектор pKP1500. Целевой белок, агрегированный в телах включения, подвергали рефолдингу, очищали на колонках ДЭАД-целлюлозы [108]. Полученный препарат химозина обладал лучшими, чем химозин животного происхождения, качествами, – того же уровня, что и рекомбинантный химозин, получаемый с использованием гена химозина коров.

Рекомбинантный реннин на основе гена химозина коз был получен А. Кумаром с коллегами в 2007 г. Последовательность в 1101 п. н. была клонирована в плазмидном векторе pET43.1a(+), конструкция также имела в своем составе последовательность, кодирующую белок NusA, который способен повышать растворимость получаемого химерного белка [103].

Для гетерологичной экспрессии гена химозина коз также успешно применялись молочнокислые дрожжи K. lactis PM5-3C. М. Вега-Хернандез с коллегами собрали генно-инженерную конструкцию на основе плазмиды pSPGK1, где кДНК химозина была слита в единую рамку считывания с лидерной последовательностью α-субъединицы зимоцина K. lactis под контролем конститутивного промотора и терминатора гена pgk. В той же работе авторами была создана другая конструкция для S. cerevisiae на основе вектора YEpFLAG-1, последовательности сигнального α-фактора FLAG, селективного ауксотрофного маркера  TRP и гена устойчивости к амипициллину. Для двух вариантов была показана  экспрессия  гена  целевого белка, секреция его в культуральную среду, и активность после кислотной активации [32].

Таким образом, было проведено множество работ по получению рекомбинантного химозина с использованием различных микроорганизмов (E. coli, P. mirabilis, B. subtilis, S. cerevisiae, K.  lactis, A. niger, A. awamori, A. oryzae, P. pastoris) и систем экспрессии. Среди других организмов предпочтение отдают бактериям E. coli и дрожжам P. pastoris.

Было установлено, что оптимальной формой синтеза химозина является его предшественник – прохимозин, который в дальнейшем с помощью кислотной активации переводят в активную форму. Кроме того, были предложены способы получения и очистки рекомбинантного химозина с помощью хроматографии и двухфазных водных систем с полиэтиленгликолем, которые значительно повышают выход целевого фермента.

Заключение. Химозин – основной фермент, применяемый в производстве сычужных сыров. Традиционный способ получения химозина предполагает использование желудка (сычуга) новорожденных детенышей жвачных животных. В настоящее время в связи с гуманизацией производства ведется активный поиск альтернативных источников данного фермента среди других животных, а также растений, бактерий и грибов. Большинство современных предприятий отдают предпочтение высококачественному и доступному рекомбинантному химозину.

Источник: S.V. Chubanova, et.al. Proteolytic enzymes used in cheesemaking (Review) / Biotechnologies for medicine and industry, 2018 - C. 403-437

3. Молокосвёртывающие ферментные препараты (МФП) в сыроделии

внесение сычужного фермента в молоко

3.1. МФП - ОБЗОР РЫНКА (2019)

Молокосвёртывающие ферментные препараты (МФП) входят в число необходимых компонентов для производства сыров. На примере России рассмотрим современное состояние рынка таких препаратов, проанализируем причины популярности или непопулярности у сыроделов отдельных их видов.

А) МФП животного происхождения

Традиционно для производства сыров использовался сычужный фермент (СФ), получаемый из желудков телят. В его составе — ферменты химозин и пепсин. Химозин обладает высокой молокосвертывающей активностью и низким уровнем нежелательной протеолитической активности. Пепсин имеет сравнительно низкую молокосвертывающую активность при высоком уровне протеолитической активности. Чем больше значение соотношения химозин / пепсин в СФ, тем лучше качество получаемых сыров.

Развитие сыроделия в XX веке происходило столь высокими темпами, что столкнулось с проблемой получения в необходимых количествах телячьего сычужного фермента. Его стали заменять пепсином, выделяемым из желудков взрослых коров, других сельскохозяйственных животных и птиц. Однако такие заменители в сравнении с СФ имели ряд существенных недостатков:

  • худшую стабильность свертывания молока (как по продолжительности, так и по плотности получаемого сгустка);
  • меньший выход сыра;
  • меньший срок хранения сыра;
  • риск образования порока горького вкуса в процессе созревания сыра.

Для компенсации этих недостатков были созданы комбинированные молокосвертывающие ферментные препараты (МФП), содержащие в своем составе химозин и пепсины (не более 50%). Использование комбинированных препаратов позволило получать сыр приемлемого качества и отчасти решило проблему дефицита СФ.

В настоящее время на рынке представлен широкий ассортимент МФП животного происхождения: от самых дешевых (с наибольшим содержанием пепсина) до самых дорогих (с максимальным содержанием химозина). В 2017 году МФП российского производства составляли менее 7% на российском рынке (в пересчете на молокосвертывающую активность). Полная картина сегмента, конечно, включает и поставки по импорту.

Табл. 3.1.1. Перечень импортируемых в Россию марок МФП животного происхождения

Производитель
Марка МФП (состав препарата: химозин/пепсин)
Chr. Hansen A/S (Дания)
Naturen Extra (95/5), Premium (90/10), Stamix (50/50), Stabo (30/70)
Danisco France SAS (Франция)
Carlina (95/5)
CSK Food Enrichment B.V. (Нидерланды)
Kalase (80/20)
Caglificio Clerici S.P.A. (Италия)
Clerici (96/4; 50/50; 20/80)
Mayasan A.S. (Турция)
Agroren (90/10), Renna (95/5)
Österreichische Laberzeugung Hundsbichler GmbH (Австрия)
BIOREN Rennet Classic (80/20)
BIOREN Rennet Premium (97/3)
Proquiga Productos Quimicos Gallegos S.A. (Испания)
ASK/M (80/20; 90/10)

На основании анализа ассортимента МФП, используемых российскими сыроделами, можно сделать выводы о востребованности животных МФП разного состава. Распределение на рынке импортируемых в Россию МФП животного происхождения по составу и марке препарата представлено на рис. 3.1.1.

Как видно из рисунка, наибольшей популярностью среди МФП животного происхождения пользуются препараты в жидкой форме с содержанием химозина 80%. Они имеют лучшее соотношение цены и качества и позволяют производить высококачественные сыры при умеренных затратах на фермент. МФП с более высоким содержанием химозина (90 и 95%) — на втором месте по востребованности из-за высокой цены. Так, препараты Carlina и Clerici в 2–3 раза дороже, чем Kalase или Naturen.

Комплексные препараты с содержанием химозина менее 80 % пользуются гораздо меньшим спросом. МФП с 20% химозина (пепсины) представлены на рынке в ничтожно малом количестве. Это свидетельствует о том, что их качество не устраивает производителей сыра. Пепсины — традиционные, более дешевые заменители СФ — в настоящее время в промышленном сыроделии не применяются. На смену им пришли микробные МФП, имеющие столь же низкую цену, но позволяющие производить более качественные сыры.

Распределение МФП по составу и по марке (химозин - пепсин)

Рис. 3.1.1. Распределение МФП: а — по составу (химозин/пепсин); б — по марке

В) МФП микробного происхождения

В конце 1960-х годов было начато производство микробных МФП, получаемых от специально отобранных микроорганизмов. Микробные МФП ранних серий выпуска имели существенные недостатки: излишне высокую протеолитическую активность (что приводило к быстрому перезреванию сыров) и термоустойчивость (вызывало ферментативную порчу подсырной сыворотки). С использованием таких МФП можно было выпускать только не созревающие разновидности сыров, так как в процессе созревания образовывались горький вкус и мажущаяся консистенция.

Из-за недостаточной информированности технологи сыродельных предприятий считают, что подобные недостатки сохраняются и у современных микробных МФП, и опасаются использовать такие препараты в производстве. На самом деле, современные препараты имеют очень высокую степень очистки, а их протеолитическая активность и термоустойчивость снижены до требуемых пределов. Сыры на основе современных микробных МФП по качеству сопоставимы с сырами, произведенными с натуральным СФ.

В табл. 3.1.2 приведен список МФП микробного происхождения, импортируемых на российский рынок.

Табл. 3.1.2. Коммерческие МФП микробного происхождения

Производитель
Торговая марка препарата
DSM Food Specialties (Франция)
Fromase
Chr. Hansen A/S (Дания)
Hannilase
Danisco France SAS (Франция)
Marzyme
CSK Food Enrichment (Нидерланды)
Milase
Caglificio Clerici SPA (Италия)
Microclerici
Meito Sangyo Со., Ltd  (Япония)
Meito
Mayasan Food lndustries A.S. (Турция)
Microzym, Valiren
Österreichische Laberzeugung Hundsbichler GmbH (Австрия)
Sumizyme

С) Рекомбинантные МФП

Микробные МФП, выпускаемые по технологиям, имевшимся к 1980-м годам, значительно уступали по своим технологическим свойствам сычужному ферменту из-за меньшего выхода и малого срока хранения сыров, связанного с их ускоренным перезреванием. Поэтому к концу 1980-х были разработаны рекомбинантные МФП. С помощью методов генной инженерии созданы штаммы микроорганизмов с внедренным генным кодом, позволяющим микробной клетке продуцировать молекулы химозина. После выделения из микробных клеток и очистки удалось получить препарат химозина, идентичный по специфике действия химозину теленка и полностью свободный от примеси пепсина, присущей натуральному СФ. Фермент, полученный от микроорганизмов с измененным генным кодом, так называемых рекомбинантных микроорганизмов, принято именовать рекомбинантным. Также принято пользоваться наименованием «ферментационный химозин». С помощью рекомбинантных МФП, производство которых начато с начала 1990-х годов, появилась возможность производить сыры, не уступающие по качеству сырам с натуральным сычужным ферментом.

В табл. 3.1.3 приведен современный ассортимент МФП на основе рекомбинантных химозинов.

Табл. 3.1.3. Современный ассортимент рекомбинантных МФП

Производитель
Торговая марка препарата
Chr. Hansen A/S (Дания)
СНY-МАХ, СНY-МАХМ
DSM Food Specialties (Франция)
Maxiren
Mayasan Food lndustries A.S. (Турция)
Faremax, Renmax
Proquiga Productos Quimicos Gallegos S.A. (Испания)
Renifer

Ожидалось, что большинство сыроделов незамедлительно перейдет с сычужного фермента к использованию рекомбинантных МФП ввиду их значительно более низкой стоимости при полной идентичности действия. Однако этого не произошло из-за предубеждения потребителей к продукции, полученной с применением методов генной инженерии, и запрета в отдельных странах на продажу таких продуктов.

В соответствии с ТР ТС 033/2013 (раздел XII, п. 89), ТР ТС 029/2012 (Приложение 26) и ТР ТС 022/2011 (п. 4.11, пп. 2) маркировка сыров, произведенных с использованием рекомбинантных МФП, должна включать:

  1. наименование используемого фермента «молокосвертывающий ферментный препарат микробного происхождения», приводимое в расшифровке состава продукта;
  2. отдельной строкой информацию — «Продукт содержит компоненты, полученные с использованием генно-модифицированных микроорганизмов».

Однако такая информация вызывает негативную реакцию у потребителей. Это сдерживает распространение рекомбинантных МФП в сыроделии.

Сведения о 10 наиболее распространенных на российском рынке зарубежных МФП приведены в табл. 3.1.4.

Табл. 3.1.4. Десятка наиболее представленных на рынке РФ импортных МФП

Производитель
Марка
МФП
Тип
МФП
Форма
выпуска
Доля, %, среди  препаратов
(в пересчете на активность)
Chr. Hansen A/S
СНY-МАХ Powder Extra
Рекомбинантный
Сухой
21
DSM Food Specialites
Fromase 750 XLG
Микробный
Жидкий
19
CSK Food Enrichent B.V.
Kalase 150
Животный
Жидкий
11
Meito Sangyo Со., LTD
Meito
Микробный
Сухой
7
Chr. Hansen A/S
Naturen Extra 220
Животный
Жидкий
6
СНY-МАХ М 1000
Рекомбинантный
Жидкий
6
СНY-МАХ Extra
Рекомбинантный
Жидкий
4
Naturen Premium 225
Животный
Жидкий
4
DSM Food Specialites
Maxiren 1800
Рекомбинантный
Сухой
3
Fromase 2200 TL
Микробный
Сухой
2

Из табл. 1.4 следует, что самым востребованным препаратом на российском рынке является рекомбинантный МФП Chy-Max Powder Extra. Мало уступает лидеру рынка микробный МФП Fromase 750 XLG, третье место принадлежит традиционному МФП животного происхождения Kalase 150.

Следует также отметить, что в пересчете на молокосвертывающую активность импортируемые в Россию рекомбинантные и микробные МФП имеют более низкую цену, чем традиционные МФП животного происхождения.

Выводы. Преимущественное использование современных микробных и рекомбинантных МФП — рутинная практика российского сыроделия. Анализ иностранной литературы свидетельствует, что ситуация на российском рынке МФП в целом соответствует общей ситуации на мировом рынке. Скорее всего, в соответствии с общемировыми тенденциями использование животных МФП в российском сыроделии в перспективе будет снижаться. Причина — довольно высокая стоимость традиционных животных МФП, а также растущее в связи с развитием технологий качество микробных и рекомбинантных МФП. 

3.2. Современные ферменты микробного происхождения

mikrobnye_fermenty.jpg

Строгий отбор

Наука продолжает искать адекватную замену традиционным сычужным ферментам для производства сыров. Одно из направлений развития этой важной темы — ферменты, выделяемые из микроорганизмов.

Микробные ферменты изначально вызывали значительный интерес благодаря низкой стоимости, связанной с простотой технологии их производства и возможностью выпуска в любых необходимых количествах. Проблема заключалась в поиске и подборе подходящих микроорганизмов-продуцентов. К микробному ферменту, претендующему на роль молокосвертывающего ферментного препарата (МФП), выдвигался ряд обязательных требований:

  • расщепление пептидной связи Phe105–Met106 в молекуле каппа-казеина, чувствительной для телячьего сычужного фермента;
  • минимальная способность к расщеплению иных пептидных связей в молекулах каппа-казеина и других белков молока;
  • максимальная активность при уровне кислотности молока в процессе производства сыра.

Опираясь на продолжительную практику использования, для производства молокосвертывающих ферментов были отобраны только мицеллярные грибы видов Rhizomucor miehei (старое название — Mucor miehei), Rhizomucor pusillus (Mucor pusillus) и Cryphonectria parasitica (Endothia parasitica). Для получения молокосвертывающего препарата получаемую от микроорганизмов ферментную смесь подвергают очистке от примесных ферментов, выделяемых микробной клеткой (амилазы, липазы и др.), а также модифицируют химическими методами для снижения термоустойчивости. Глубина очистки ферментного препарата в значительной мере сказывается на его стоимости: чем выше очистка, тем дороже получаемый препарат. Малая стоимость является одним из важных конкурентных преимуществ микробных МФП. Для сохранения низкой стоимости некоторые марки МФП подвергаются минимальной очистке без дальнейшей обработки.

Таблица от редактора

Наиболее известные МФП микробного происхождения:

Название
Источник фермента (микроорганизм)
Hannilase
Mucor miehei
Реннилаза
Mucor miehei
Фромаза
Mucor miehei
Марзим
Mucor miehei
Mild
Mucor miehei
Novadel
Mucor pusillus
Ноури
Mucor pusillus Lindt
Мейто
Mucor pusillus Lindt
Емпораза
Mucor pusillus Lindt
Супарен
Endothia parasitica
Шуэ-кёд
Eadothia parasitica
Микрозим
Bacillus subtilis
Chymogen*
Aspergillus niger
Chy-Max*
Escherichia coli
Максирен*
Klyveromyces lactis
* Рекомбинантные химозины - см. отдельно

Технологические характеристики микробных МФП

Ассортимент современных микробных МФП представлен разными вариантами исполнения, отличающимися по степени термоустойчивости и уровню очистки.

Отличия МФП:

1) По степени термоустойчивости:

  • термоустойчивые или термостабильные (thermostable) — сохраняют около 50% активности после пастеризации при 72°С в течение 15 с при рН = 6,3 (термическая устойчивость возрастает при снижении рН от 7,0 до 5,2 и менее). Полностью инактивируются после пастеризации при 72°С в течение 5 мин;
  • термически неустойчивые или термолабильные (thermolabile) — сохраняют менее 10 % активности после выдержки при 50°С в течение 60 мин при рН = 6,3. Практически полностью инактивируются после пастеризации при режимах 72°С, 15 с или 65°С, 15 мин. Протеиназа Cryphonectria parasitica по своим природным свойствам является термолабильной и в дополнительной модификации для снижения термической стабильности не нуждается. Протеиназа Rhizomucor pusillus менее термически устойчива, чем протеиназа Rhizomucor miehei, но немногим более термоустойчива, чем телячий химозин. Препараты с протеиназой Rhizomucor pusillus дополнительной обработке для снижения термической устойчивости также не подвергаются;

2) По степени очистки:

  • стандартная: удалена большая часть сопутствующих нежелательных ферментов до уровня, не обнаруживаемого аналитическими методами;
  • улучшенная: полностью удалены все сопутствующие ферменты, в препарате присутствуют только белковые молекулы молокосвертывающего фермента;

3) По протеолитической специфичности:

  • неизмененная: микробная протеаза содержится в МФП в неизменном природном виде и сохраняет способность к расщеплению αs1- и β-казеинов, а также большего количества связей в каппа-казеине, чем телячий химозин;
  • улучшенная: в результате специальной обработки микробная протеаза утрачивает способность к расщеплению большинства пептидных связей в молекулах казеинов, сохраняя активность к расщеплению связи Phe105–Met106 в молекуле каппа-казеина. По своим протеолитическим свойствам такие микробные МФП приближаются к телячьему сычужному ферменту.

Большинство производителей ферментов не маркируют свою продукцию по уровням термоустойчивости и очистки. Однако они указывают ограничения по применению для изготовления отдельных видов сыров. Как правило, степень очистки препарата пропорциональна его цене — чем большей очистке он подвергнут, тем дороже.

Современный ассортимент МФП микробного происхождения

В табл. 3.2.1–3.2.3 приведен список наиболее распространенных на рынке МФП микробного происхождения. В табл. 3.2.1 перечислены марки микробных МФП, которые можно назвать эконом-классом. Такие МФП имеют самую низкую стоимость. Дело в том, что дополнительные обработка и очистка микробных МФП приводят к значительной (в два-три раза) потере активности препарата. Поэтому отсутствие очистки, с одной стороны, снижает потребительские свойства препаратов, с другой — дает очень низкую их стоимость. К примеру, фирма Chr. Hansen рекомендует использовать Hannilase L для изготовления сыров в случае, когда не требуется сбор сыворотки для дальнейшей ее переработки.

Таблица 3.2.1. Микробные МФП эконом-класса

Производитель
Марка МФП
Информация о препарате
Chr. Hansen A/S
Hannilase L
Продуцент Rhizomucor miehei. Степень очистки стандартная. Термостабилен. Рекомендуется при отсутствии необходимости в сборе сыворотки для дальнейшей ее переработки
DSM Food Specialties SAS
Fromase TL
Mayasan Food lndustries A.S.
Valiren «THERMOSTABLE»
CSK Food Enrichment B.V.
Milase TQL
Meito Sangyo Со.
Meito Microbial Rennet Liquid
Chr. Hansen A/S
Thermolase
Продуцент Cryphonectria parasitica. Степень очистки стандартная. Термолабилен. Термически не устойчив: позволяет получать незагрязненную сыворотку, пригодную для дальнейшей ее переработки
DSM Food Specialties SAS
Suparen
Достоинство: у представленных марок - самая низкая стоимость среди всех видов МФП. Недостаток: высокий неспецифический протеолиз. Быстрое перезревание и образование горечи. Рекомендуется использовать только для производства несозревающих мягких сыров и творога.

Несмотря на низкую стоимость, МФП эконом-класса не пользуются популярностью у сыроделов. Основную долю рынка занимают микробные МФП, прошедшие специальные процедуры очистки и снижения термостабильности. Такие препараты можно использовать для производства всех видов сыров. Получаемая при этом подсырная сыворотка имеет высокое качество и пригодна для промышленной переработки. Ассортимент наиболее распространенных микробных МФП, которые можно применять для выработки всех видов сыров, представлен в табл. 3.2.2.

Таблица 3.2.2. Микробные МФП общего назначения

Производитель
Марка МФП
Информация о препарате
Chr. Hansen
Hannilase XL
Продуцент: Rhizomucor miehei. Степень очистки стандартная. Термолабилен
DSM Food Specialties SAS
Fromase XL
Clerici-Sacco Grouр
Мicroclerici
CSK Food Enrichment BV
Milase XQL
Danisco France SAS
Marzyme
Mayasan Food lndustries A.S.
Valiren «THERMOLABILE»
Microzym
Osterreichische Laberzeugung Hundsbichler GmbH
Sumizyme TL
Proquiga Biotech, SA
Reniplus, Proquiren
ALCE lnternational S.R.L.
Micro-Ren
 
 
Meito Sangyo Со.
Meito Microbial Rennet (порошкообразный)
Продуцент: комбинация протеиназ микроскопических грибов Rhizomucor miehei и Rhizomucor pusillus var. Lindt. Степень очистки стандартная. Термолабилен
Достоинства: у представленных марок низкая цена, умеренный протеолиз. Могут быть использованы при производстве созревающих сыров всех видов. Термолабильны: позволяют получать чистую сыворотку, пригодную для промышленной переработки.

Прогресс не стоит на месте, и за последние несколько лет появился ряд новых марок микробных МФП. Внедрение современного оборудования и прогрессивных технологий позволило получить микробные МФП с улучшенными показателями. У новинок, таких как Milase Premium и Microlant Supreme (табл. 3.2.3), характеристики показателей соответствуют натуральному сычужному ферменту.

Таблица 3.2.3. Микробные МФП премиум-класса

Производитель
Марка МФП
Информация о препарате
Chr. Hansen
Hannilase ХР
Продуцент Rhizomucor miehei.
Степень очистки улучшенная. Термолабилен.
DSM Food Specialties SAS
Fromase XLG
Meito Sangyo Со.
Meit o Rennet Super
Chr. Hansen
Microlant Supreme
Продуцент Rhizomucor miehei. Степень очистки улучшенная. Улучшенная протеолитическая
специфичность (на уровне химозина). Термолабилен.
CSK Food Enrichment BV
Milase Premium
Достоинства: у представленных марок умеренная цена, протеолиз практически на уровне сычужного фермента. Могут быть использованы при производстве созревающих сыров всех видов. Термолабильны: позволяют получать чистую сыворотку, пригодную для промышленной переработки.

Во ВНИИМС были выполнены практические исследования по возможности применения молокосвертывающих ферментов микробного происхождения в процессе производства созревающих сыров. В рамках исследований проведена выработка сыра «Голландский брусковый» с микробными МФП Fromase типов TL и XLG и препаратом сычужного фермента в качестве контроля. Результаты органолептической оценки показали, что сыры с микробными МФП имели немного большую степень зрелости как в конце срока созревания (60 сут), так и через три месяца хранения — в сравнении с контрольными образцами сыров, произведенными с сычужным ферментом. Достаточная степень зрелости выражалась в большем содержании продуктов протеолиза, в более пластичной конситенции и в чуть большей выраженности сырного вкуса в сравнении с контрольными образцами. Сыры с микробными МФП Fromase получили равную и даже чуть более высокую оценку за вкус и консистенцию, чем контрольные сыры, произведенные с сычужным ферментом.

Обобщая изложенное, следует отметить, что современные марки МФП микробного происхождения, подвергнутые тонкой очистке, могут быть рекомендованы для производства всех видов сычужных сыров без исключения. Марки МФП микробного происхождения эконом-класса, не подвергаемые тонкой очистке, можно рекомендовать только для изготовления свежих сыров или сыров с короткими сроками созревания.

3.3. Использование в сыроделии рекомбинантных молокосвертывающих ферментов

В настоящее время в производстве сыров телячий сычужный фермент (далее - СФ) и прочие молокосвертывающие ферментные препараты (далее – МФП) животного происхождения уступили свое место на рынке микробным ферментам. Доля использованных в России МФП животного происхождения за 2017 год в пересчете на молокосвертывающую активность составила менее 25 % от общего количества МФП. Широкое использование МФП микробного происхождения требует обязательного рассмотрения вопроса о специфике их применения в сыроделии. У мастеров-сыроделов сложилось мнение, что микробные ферменты это то же, что и телячий СФ, но по более низкой цене, либо мнение, что микробные ферменты – это нечто искусственное, от чего следует держаться подальше. Обе точки зрения имеют свои обоснованные причины. Истинное положение дел состоит в том, что микробные МФП имеют некоторые особенности применения, которые необходимо учитывать.

Молокосвертывающие ферментные препараты микробного происхождения можно разделить на 2 группы:

  • получаемые от микробных клеток в их природном виде;
  • получаемые от микробных клеток с искусственно измененным генным кодом.

В данной статье будет дан обзор МФП, полученных от микробных клеток с искусственно измененным генным кодом. Ферменты, получаемые от микроорганизмов с измененным генным кодом, так называемых «рекомбинантных» микроорганизмов, также принято именовать рекомбинантными  (ссылка > стр.47). Для обозначения таких ферментов также принято использовать наименование «ферментационно продуцируемый химозин» (от английского «fermented produced chymosin» - FPC).

Проведенные ранее исследования позволили к концу 60-х годов XX века начать массовый выпуск МФП микробного происхождения на основе протеаз микроскопических грибов Crypthonecritica parasitica, Rhyzomucor meihei и Rhyzomucor pussilus. Подобные микробные заменители СФ, имели ряд недостатков, в т. ч. излишне высокую протеолитическую активность, которая приводит к снижению выхода сыра, к сокращению срока хранения сыра и к риску получения горького вкуса сыра. Производители микробных МФП проделали большая работа по улучшению технологии очистки ферментов от посторонних примесей. В результате удалось получить микробные МФП свободные от нежелательных примесных ферментов, продуцируемых микробной клеткой. Качество сыров, производимых с такими усовершенствованными микробными МФП, приблизилось к качеству сыров с натуральным СФ. Однако полностью избавиться от излишней протеолитической активности, присущей микробным коагулянтам, не удавалось. Сыры, произведенные с даже с улучшенными микробными коагулянтами, все-равно уступали сырам, произведенным с натуральным СФ, из-за меньшего выхода и меньшего срока хранения, связанного с ускоренным созреванием и перезреванием таких сыров (ссылка> и ссылка>).

Это побудило исследователей продолжить работы по созданию адекватного заменителя телячьего СФ. Дальнейшее развитие науки, в частности генной инженерии, позволило создать штаммы микроорганизмов с внедренным генным кодом, обеспечивающим продуцирование микробной клеткой белковых молекул прохимозина. Пионером направления стала фирма Pfizer, разработавшая в 1990 году МФП под торговой маркой Chy-max, получаемый от генетически-модифицированной культуры бактерий Esherichia coli штамм K-12. Но разработанная технология имела недостатки. Продуцируемый бактериями E. coli химозин накапливался внутри микробной клетки. После завершения процесса выращивания биомассы клетки приходилось разрушать, а из полученного «коктейля» путем многоступенчатой очистки выделять целевой фермент – химозин. Большую проблему при очистке составляло сохранение активности выделяемого химозина. При очистке часть химозина терялась из-за инактивации. Это вело к высокой стоимости рекомбинантного химозина, получаемого по такой технологии. Позднее технология производства рекомбинантного химозина была существенно удешевлена, путем перехода на другие микроорганизмы-продуценты. На роль продуцентов рекомбинантного химозина были отобраны дрожжи вида Kluyveromyces marxianus var. lactis и микроскопические грибы видов Aspergillus niger var. awamori и Trichoderma reesei. Главным достоинством дрожжевых и грибных клеток является их способность выделять генерируемый химозин через клеточную стенку наружу, а не накапливать внутри клетки. Это существенно упрощает технологию, т.к. не требуется операция разрушения клеток, а фермент получают освобожденным от массы примесей. К тому же, количество выделяемого химозина в пересчете на единицу биомассы дрожжей или микроскопических грибов в несколько раз больше, чем на единицу биомассы клеток E. coli. В 1990 году при сотрудничестве Chr. Hansen A/S и Genencor Inc. на рынок был выпущен получаемый от продуцента Aspergillus niger var. awamori препарат рекомбинантного химозина под торговой маркой Chymogen®, впоследствии переименованный в Chy-max®. В 1992 году фирма Gist-brocades выпустила на рынок препарат с торговой маркой Maxiren®, получаемый от Kluyveromyces marxianus var. lactis. В 2008 году Danisco начала выпуск препарата рекомбинантого химозина под маркой Chymostar Suprême получаемого от грибка-продуцента Trichoderma reesei (ссылка>). Получаемые по такой технологии ферменты принято называть рекомбинантными ферментами 1-го поколения. В настоящее время рекомбинантные МФП 1-го поколения доминируют в сыродельной отрасли России (ссылка >).

С полученными препаратами рекомбинантного химозина 1-го поколения стало возможным производить сыры, не уступающие по качеству сырам с натуральным сычужным ферментом. Однако прогресс на этом не остановился. К моменту выпуска на рынок рекомбинантного химозина критерием оценки качества молокосвертывающих ферментов в сыроделии было признано отношение молокосвертывающей активности «C» (clotting activity) к общей протеолитической активности «P» (proteolitic activity) фермента (ссылка>). Руководствуясь этим, технология рекомбинантного химозина совершенствовалась в направлении увеличения соотношения C/P. Для этого были использованы два подхода. Первый из них состоял в модификации свойств самого фермента, а второй – в повышении качества очистки получаемого фермента. Примером применения первого подхода является создание микроорганизмов с измененным генным кодом, позволяющим продуцировать молекулы прохимозина верблюда. Препарат рекомбинантного химозина верблюда под торговой маркой Chy-max® M был выпущен фирмой Chr. Hansen на рынок в 2008 году. Используя второй подхода, фирмой DSM Food Specialties был создан препарат Maxiren® XDS, представляющий собой высокоочищенный рекомбинантный химозин теленка, выпуск которого ведется с 2014 года. В результате совершенствования технологии производства удалось поднять соотношение C/P у препаратов рекомбинантного химозина на уровень, превышающий это соотношение для самого высокоочищенного натурального СФ. Получаемые по такой технологии ферменты составляют ряд рекомбинантных ферментов 2-го поколения. Рекомбинантные ферменты 2-го поколения характеризуются высоким экономическим эффектом от применения за счет получения более высокого выхода сыра при более низкой дозе внесения в сравнении с рекомбинантными МФП 1-го поколения. В настоящее время рекомбинантные ферменты 2-го поколения начинают занимать доминирующее положение на зарубежном рынке МФП.

В рамках борьбы за снижение стоимости МФП, был создан рекомбинантный ферментный препарат Marzyme®, производимый компанией Danisco/DuPont, который является МФП микробного происхождения, получаемым от генетически модифицированных микроорганизмов. Принципиальным отличием Marzyme® от всех прочих рекомбинантных МФП присутствующих на рынке является то, что для его создания использовался генетический материал не от животных источников (теленка, верблюда или др.), а от другого микроорганизма. Для изготовления Marzyme® генетическая информация, отвечающая за производство молокосвертывающего фермента, была взята от гриба Rnyzomucor miehei и внедрена в генный код гриба Aspergillus oryzae. Главным преимуществом препарата Marzyme® над рекомбинантными химозинами является его значительно более низкая цена (в 3 раза меньшая в пересчете на единицы молокосвертывающей активности) (ссылка>).

В 2019 году фирма Chr. Hansen A/S выпустила на рынок препарат Chy-max® Supreme, обладающий еще более высоким соотношение C/P, чем у препаратов рекомбинантного химозина 2-го поколения [Chr Hansen Working together to produce more cheese from milk – (дата обращения 27.07.2019)]. Так было положено начало производству рекомбинантных ферментов 3-го поколения. По сообщениям фирмы-производителя, при использовании Chy-max® Supreme удается достигнуть еще более высокого выхода сыра, чем при использовании препарата 2-го поколения Chy-max® М. В информационных материалах о препарате Chy-max® Supreme указано, что он является высокоочищенным химозином. При этом тип химозина (телячий, верблюжий или иной) не указывается. Это позволяет сделать предположение о том, что препарат Chy-max® Supreme представляет собой так называемый «синтетический» химозин, полученный путем модификации аминокислотного состава молекулы природного химозина. Работы по созданию подобных химозинов велись с начала 2000-х годов. Согласно сведениям Kumar A. et al., такие модифицированные химозины обладают улучшенными, в сравнении с природными химозинами, технологическими свойствами: смещенным в сторону более высокого рН оптимумом активности, а также большей специфичностью в отношении каппа-казеина.

Разрешения и ограничения на использование рекомбинантных химозинов

Ожидалось, что большинство сыроделов незамедлительно перейдут от использования сычужного фермента к использованию рекомбинантного химозина в виду его значительно более низкой стоимости при полной идентичности действия. Однако этого не произошло из-за предубеждения потребителей против продукции полученной от генно-модифицированных организмов (ГМО), даже несмотря на то, что рекомбинантный химозин сам по себе не содержит ГМО (прим. ред.: почти весь инсулин, необходимый для диабетиков, также получают с использованием ГМО, и полученный гормон также не содержит ГМО).

Потребовалось определенное время, чтобы рекомбинантный химозин завоевал доминирующее положение среди МФП используемых для производства сыров. Первое разрешение на использования рекомбинантных химозинов было выдано в США. В 1990 году фирма Pfizer Inc. получила одобрение от Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) на продажу полученного с помощью генных технологий продукта - молокосвертывающего ферментного препарата Chy-Max, получаемого от генетически-модифицированной культуры бактерий Esherichia coli штамм K-12. FDA пришло к выводу, что созданный фирмой Pfizer биоинженерный химозин в значительной степени эквивалентен сычужному ферменту и не нуждается ни в специальной маркировке, ни в указании его источника или метода производства. Свое решение FDA аргументировало следующим образом: «произведенный микробной клеткой химозин имеет такую же структуру и функциональность, как и натуральный животный химозин. В процессе производства продукт очищается от основной массы загрязнителей. Микроорганизмы, используемые для производства рекомбинантного химозина, являются не токсикогенными, не патогенными, а их клетки разрушаются или удаляются из продукта во время процесса производства. Генетический материал, отвечающий за устойчивость к антибиотикам, также полностью удаляется во время производственного процесса».

FDA распространило GRAS-статус (Generally Regarded As Safe), присвоенный телячьему химозину, на рекомбинантный химозин.

Через несколько лет статус GRAS получили рекомбинантные химозины, получаемые от генетически модифицированных микроорганизмов видов Kluyveromyces marxianus var. lactis и Aspergillus niger var. awamori.

В 1991 году разрешение на использование рекомбинантного химозина выдала Швейцария, а в 1992 – Голландия. Дольше всех в Европе сопротивлялись использованию рекомбинантного химозина Германия и Франция. Однако из-за масштабной эпидемии губчатой энцефалопатии КРС (т.н. «коровьего бешенства»), произошедшей в Европе в середине 1990-х годов, возник риск передачи болезни через продукты скотоводства, в т.ч. через сычужный фермент (ссылка>). Кроме того, вспышка эпидемии «коровьего бешенства» повлекла снижение поголовья скота и, как следствие этого, сокращение сырьевой базы для производства натурального сычужного фермента (ссылка>). В таких условиях отказ от использования заменителей сычужного фермента ставил под угрозу индустрию производства сыров. В 1997 году запрет на использование рекомбинантного химозина сняла Германия, а в 1998 году – Франция. Интересным выглядит тот факт, что Голландия, являющая родиной рекомбинантного химозина (фирма Gist-brocades, в настоящее время являющаяся подразделением фирмы DSM) и производящая его в промышленных масштабах, где рекомбинантный химозин разрешен к применению с 1992 года, практически не использует его в производстве сыров. Дело в том, что значительная часть сыров, производимых в Голландии, идет на экспорт в Германию, в которой существуют серьезные предубеждения против генно-инженерной продукции. Стремясь сохранить германский рынок, крупнейший для голландский сыров, сыроделы Голландии вынуждены отказываться от использования рекомбинантного химозина. В то же время значительная часть сыров, закупаемых Голландией по импорту, произведены с рекомбинантным химозином (ссылка>).

В России в настоящее время использование МФП полученных от рекомбинантных микроорганизмов, регламентируется ТР ТС 029/2012 [ТР ТС 029/2012 Технический регламент Таможенного союза "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств" (с изменениями на 18 сентября 2014 года)] (приложение 26), в котором на территории стран Таможенного союза среди «ферментных препаратов микробного происхождения» разрешен к использованию химозин, полученный от микроорганизмов Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Escherichia coli и Kluyveromyces lactis. Исходя из этого, рекомбинантные химозины классифицируются как «ферментные препараты микробного происхождения».

Технологические особенности применения рекомбинантных химозинов

Ранее (на момент начала промышленного выпуска рекомбинантных МФП в 1990-х годах) считалось, что рекомбинантные химозины (FPC) полностью вытеснят микробные коагулянты, а натуральный сычужный фермент (СФ) будет востребован только в очень малых объемах для производства т.н. «крафтовых» сыров в малых сыроварных. Причина наличия на рынке наряду с рекомбинантными МФП также МФП животного и микробного происхождения связана с наличием у FPC как преимуществ, так и некоторых недостатков в сравнении с МФП животного или микробного происхождения. Среди них главными являются: предубеждения потребителей против FPC и, в противовес, более привлекательная цена микробных МФП.

Однако, FPC имеют множество важных для сыроделов преимуществ, благодаря которым их использование в сыродельной отрасли год от года расширяется. Рассмотрим далее преимущества и недостатки FPC.

Стабильность свертывания молока. Основное преимущество рекомбинантных химозинов – высокая стабильность действия при свертывании молока. Рекомбинантные химозины гарантировано свертывают молоко даже при активной кислотности свежего молока (рН 6,6-6,7), а на продолжительность свертывания мало влияют колебания по содержанию белка и ионов кальция в молоке.

Способность к свертыванию FPC не подкисленного молока весьма важна в виду двух причин:

  1. Повышение качества молока, произошедшее к настоящему времени достигнутое за счет повышения гигиены содержания коров, условий дойки и хранения молока, приводит к тому, что на завод поступает молоко с недостаточной кислотностью (на уровне рН 6,6-6,7).
  2. Широкое использование в сыроделии бактериальных концентратов и заквасок прямого внесения (DVS – Direct to Vat Starter или DVI – Direct Vat Inoculation). После внесения в сыродельную ванную таких заквасок, происходит процесс активизации, продолжающийся 30-45 мин и не сопровождающийся ростом кислотности молока. Предварительное внесение DVS за 30-45 мин до внесения сычужного фермента в настоящее время признано нежелательным, т.к. это повышает риск поражения культуры бактериофагом и увеличивает продолжительность технологического процесса.

Повышение выхода сыра. При использовании рекомбинантных химозинов достигается более высокий выход сыров, чем при использовании МФП животного или микробного происхождения. Более протеолитически активные, животные и микробные МФП сразу же после внесения в молоко начинают расщепление казеинов с образованием водорастворимых азотистых веществ, которые необратимо переходят в сыворотку на стадии обработки зерна. FPC обладают значительно более низкой протеолитической активностью в отношении казеинов молока. При сравнительных испытаниях рекомбинантных МФП 1-го поколения и натурального сычужного фермента, были получены практически одинаковые показатели по выходу сыров. Лучших результатов по увеличению выхода сыра стало возможным достигнуть после появления рекомбинантных МФП 2-го  +(0,9 – 1,1%) и 3-го +(1,3 – 1,8%) поколения.

Увеличение срока хранения сыра. Низкая степень неспецифического протеолиза рекомбинантных химозинов позволяет достигнуть увеличения срока хранения сыров выработанных с такими МФП. Известно, что плотность консистенции сыра зависит от степени протеолиза белков сырной массы. Чем медленнее процесс протеолиза, тем медленнее идет разрушение белковой матрицы сыра, тем медленнее размягчается сырная масса, тем дольше срок хранения сыра. К примеру, плотная консистенция обязательна для некоторых видов сыров, например – для сыра Чеддер. Долгое время проблемой было сохранение плотной консистенции сыров в течение длительного срока хранения. В отличие от сыров с высокой температурой второго нагревания, в которых МФП инактивируется под действием температуры 2-го нагревания и не оказывает расщепляющего действия на белковый каркас сыра, в технологии сыра Чеддер используется низкая температура 2-го нагревания не позволяющая инактивировать фермент. В результате МФП сохраняет активность, переходит в состав сыра Чеддер и, далее, в результате протеолитического действия приводит к нежелательному размягчению консистенции. Существовавшая проблема размягчения консистенции сыра Чеддер (и других сыров с низкой температурой второго нагревания) может быть успешно решена за счет использования в производстве сыров FPC. Использование для производства сыра Чеддер рекомбинантных МФП с низкой протеолитической активностью позволяет обеспечить сохранность консистенции сыра Чеддер на протяжении длительного срока хранения.

В сырах с высоким содержанием влаги, протеолиз протекает с повышенной скоростью. В т.ч. это касается и сыров с чеддеризацией и плавлением сырной массы (Паста Филата, Моцарелла, Сулугуни). Типичная тянущаяся при нагревании текстура этих сыров утрачивается в результате протеолиза белков сырной массы. Использование при производстве сыра Моцарелла МФП с высоким соотношение C/P позволит обеспечить сыру длительное сохранение желательной консистенции и увеличить срок хранения до 12 недель (2,5-3 месяца) [Syrning og koagulering I mozzarella produktion – (дата обращения 11.07.2019 г.)].

На рис. 3.3.1 приведена динамика протеолиза в сырах с чеддеризацией и плавлением сырной массы, произведенных с использованием МФП разного вида.

динамика протеолиза в сырах с чеддеризацией и плавлением сырной массы типа

Рис. 3.3.1. – динамика протеолиза в сырах с чеддеризацией и плавлением сырной массы типа «Паста Филата» (Моцарелла, Сулугуни, Качкавалло), произведенных с МФП разного вида (по данным [Syrning og koagulering I mozzarella produktion – (дата обращения 11.07.2019 г.)])

Применение МФП с низким уровнем неспецифического протеолиза позволяет достигнуть длительного сохранения консистенции сыров типа Паста Филата (см. рис. 3.3.2).

влияние типа используемого МФП на степень протеолиза и продолжительность хранения сыров типа «Паста Филата»

Рис. 3.3.2. – влияние типа используемого МФП на степень протеолиза и продолжительность хранения сыров типа «Паста Филата» [Syrning og koagulering I mozzarella produktion – (дата обращения 11.07.2019 г.)].

Аналогично, в целях повышения срока хранения, МФП с высоким соотношением C/P целесообразно применять и для других разновидностей сыров.

Согласно рекомендациям зарубежных исследователей, рекомбинантные химозины целесообразно применять:

  • в целях повышения выхода сыра
  • для увеличения сроков хранения сыров
  • при производстве сыров с чеддеризацией и плавлением сырной массы для получения тянущейся структуры сохраняющейся на протяжении длительного срока хранения
  • при производстве сыров, созревающих с участием микрофлоры поверхностной слизи (для замедления размягчения консистенции и удлинения сроков хранения)
  • получения плотной консистенции сыра, облегчающей нарезание и натирание сыра для порционной упаковки.

Вместе с тем, рекомбинантные химозины имеют и ряд недостатков, которые являются прямым следствием их достоинств. Как сказано выше, вследствие наличия низкой протеолитической активности у рекомбинантных химозинов, использование их при производстве сыров позволяет обеспечить высокий выход и длительный срок хранения сыра. Но низкая степень протеолиза желательна не для всех видов сыров. К примеру, для сыров Голландского типа недостаточная степень протеолиза ведет к получению излишне плотной, резинистой консистенции и менее выраженному вкусу сыра. Для таких случаев, т.е. для получения сыра Голландского типа с более выраженным вкусом при использовании рекомбинантного химозина верблюда (обладающего меньшей протеолитической активностью в сравнении с телячьим), рекомендуется использовать специальные заквасочные культуры для ускорения созревания.

Признавая низкую протеолитическую активность за недостаток рекомбинантных МФП, производители начали выпуск МФП на основе рекомбинантных химозинов, обладающих «контролируемым» протеолизом. Для усиления недостаточной протеолитической активности или изменения ее специфичности, препараты рекомбинантного химозина модифицировали, путем введения в их состав дополнительных протеолитических ферментов (например, добавляют до 20% бычьего пепсина или смешивают с карбоксипептидазой, полученной из отобранного штамма Aspergillus niger). Препараты рекомбинантного химозина с «дополненной» протеолитической активностью появились сравнительно недавно и пока не оценены сыроделами.

Результаты использования рекомбинантных химозинов при производстве сыров широко описаны в литературе. Рекомбинантные химозины вырабатываемые E. coli, Aspergillus niger и Kluyveromyces lactis, были исследованы при производстве множества различных видов сыров (мягкие сыры, сыры с низкой и высокой температурой второго нагревания, рассольные сыры, сыры с чеддеризацией и плавлением сырной массы, сыры созревающие с участием плесени, сыры созревающие с участием поверхностной микрофлоры). Во всех случаях, исследователями не было обнаружено существенных различий по выходу сыра, по скорости созревания и по вкусовым показателям между сырами изготовленными с применением рекомбинантных химозинов 1-го поколения и между сырами, произведенными с натуральным телячьим сычужным ферментом [Jacob M. Recent advances in milk clotting enzymes / M. Jacob, D. Jaros, H. Rohm // International Journal of Dairy Technology. –2011. – Vol. 64(1). – P. 14–33].

При сравнении препарата рекомбинантного химозина теленка и микробных коагулянтов при производстве сыра Моцарелла, было обнаружено, что рекомбинантный химозин 1-го поколения дает меньший уровень протеолиза в сравнении с микробными коагулянтами, что позволяет увеличить срок хранения сыра с рекомбинантным химозином  [Sheehan J.J. Effect of coagulant type and storage temperature on the functionality of reduced-fat Mozzarella cheese / J.J. Sheehan, K. O’Sullivan, T.P. Guinee // Lait – 2004. – Vol. 84(6). – P. 551–566].

В следствие меньшей протеолитической активности рекомбинантного химозина верблюда, сыры производимые с его использованием имеют более плотную консистенцию и менее выраженный вкус, чем сыры производимые с сычужным ферментом или микробными коагулянтами.

При производстве низкожирного сыра Чеддер использование рекомбинантного химозина верблюда привело к получению излишне плотной консистенции, что было связано с более плотной структурой белковой матрицы сыра из-за слабого протеолиза, проявляемого препаратом химозина верблюда [Soodam K. Effect of rennet on the composition, proteolysis and microstructure of reducedfat Cheddar cheese during ripening / K. Soodam, L. Ong, I.B. Powell, S.E. Kentish, S.L. Gras // Dairy Sci. & Technol. –2015. – Vol. 95. – P. 665–686].

Сравнительное испытание препаратов рекомбинантного химозина теленка и верблюда при производстве полножирного сыра Чеддер показало, что после 150 сут созревания, что сыры выработанные с химозином верблюда обладали более плотной консистенции и менее выраженным вкусом. Сыры, произведенные с рекомбинантным химозином теленка получили более высокую оценку за более пластичную консистенцию и выраженный вкус. [Bansal N. Suitability of recombinant camel (Camelus dromedarius) chymosin as a coagulant for Cheddar cheese / N. Bansal, M.A. Drake, P. Piraino, M.L. Broe, M. Harboe, P.F. Fox, P.L.H. McSweeney // International Dairy Journal – 2009. – Vol. 19(9). – P. 510–517].

Выводы: На основании данных, полученных как при изучении иностранного опыта, так и в результате российских исследований:

  • консистенция сыров получаемых с использованием рекобминантного химозина более плотная
  • для получения выдержанных сыров при использовании рекобминантного химозина рекомендовано использовать специальные закваски для ускорения созревания
  • можно рекомендовать использовать рекомбинантные химозины в производстве сыров с низкой температурой второго нагревания для увеличения срока их хранения (такие сыры нужно упаковывать в пленку ранней стадии созревания для недопущения усушки сырной массы - ред.)
  • рекомбинантный химозин верблюда больше подходит для сыров с плотной консистенцией (н-р, сыр Чеддер) и для которых необходимо обеспечить длительную сохранность консистенции (н-р, сыр Моцарелла), но не совсем подходят для сыров Голландского типа из-за получения излишне плотной консистенции и бедного вкуса

Неоспоримым преимуществом рекомбинантного химозина является гарантированное стабильно высокое качество производимых с ним сыров и возможность промышленного выпуска рекомбинантного химозина в любых необходимых объемах. Исходя из текущих тенденций на рынке МФП, следует ожидать дальнейшего усовершенствования свойств МФП и разделения их по направления использования, например, создание МФП для сыров с ускоренным сроком созревания, для сыров с длительным сроком хранения и для сыров разных видов с разной спецификой созревания.

Источник: Использованы материалы PRODUKT.BY & ВНИИМС филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М.Горбатова» РАН, Углич - Авторы: Дмитрий Сергеевич Мягконосов, канд. техн. наук, ведущий научный сотрудник, Дмитрий Васильевич Абрамов, канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник и др.

Дополнительная информация

Литература

  1. Recent advances in cheese microbiology / T. P. Beresford [et al.] // Int. Dairy J. – 2001. – Vol. 11, № 4–7. – P. 259–274.
  2. McSweeney, P. L. H. Biochemistry of cheese ripening / P. L. H. McSweeney // Int. J. Dairy Technol. – 2004. – Vol. 57, № 2–3. – P. 127–144.
  3. Fernandes, P. Enzymes in food processing: a condensed overview on strategies for better biocatalysts / P. Fernandes // Enzyme Res. – 2010. – Vol.  2010.  –  Art. 862537.
  4. Modern dairy technology / ed. R. K. Robinson. – Springer Science & Business Media, 2012. – Vol. 2: Advances in Milk Products. Modern Dairy Technology. – 523 p.
  5. Yegin, S. Progress in the field of aspartic proteinases in cheese manufacturing: structures, functions, catalytic mechanism, inhibition, and engineering / S. Ye- gin, P. Dekker // Dairy Sci. Technol. – 2013. – Vol. 93, № 6. – P. 565–594.
  6. Хр. Хансен | Заквасочные и стартовые культуры | Ферменты | Натуральные красители | Тесты на антибиотики [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.chr-hansen.ru/. – Дата доступа: 12.03.2017.
  7. Food-processing enzymes from recombinant microorganisms – a review / Z. S. Olempska-Beer [et al.] // Regul. Toxicol. Pharmacol. RTP. – 2006. – Vol. 45, № 2. – P. 144–158.
  8. Fox, P. f. Exogenous enzymes in dairy technology — a review / P. F. Fox // J. Food Biochem. – 1993. – Vol. 17, № 3. – P. 173–199.
  9. Sousa, M. J. Advances in the study of proteolysis during cheese ripening / M. J. Sousa, Y. Ardö, P. L. H. McSweeney // Int. Dairy J. – 2001. – Vol. 11,  № 4–7. – P. 327–345.
  10. O’Mahony, J. A. Chymosin-mediated proteolysis, calcium solubilization, and texture development during the ripening of cheddar cheese / J. A. O’Mahony, J. A. Lucey, P. L. H. McSweeney // J. Dairy Sci. – 2005. – Vol. 88, № 9. – P. 3101–3114.
  11. Mistry, V. Low fat cheese technology / V. Mistry // Int. Dairy J. – 2001. – Vol. 11. – P. 413–422.
  12. Lemieux, L. Bitter flavour in dairy products. I. A review of the factors likely to influence its development, mainly in cheese manufacture / L. Lemieux, R. E. Simard // Le Lait. – 1991. – Vol. 71, № 6. – P. 599–636.
  13. FitzGerald, R. J. Enzymatic debittering of food protein hydrolysates / R. J. FitzGerald, G. O’Cuinn // Biotechnol. Adv. – 2006. – Vol. 24, № 2. – P. 234–237.
  14. Shinoda, I. Bitter Taste of H-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-OH Corresponding to the Partial Sequence (Positions 82-88) of Bovine β-Casein, and Related Peptides / I. Shinoda, H. Okai, S. Fukui // Agric. Biol. Chem. – 1986. – Vol. 50, № 5. – P. 1255–1260.
  15. The milk acid proteinase cathepsin D: a review / M. J. Hurley [et al.] // Int. Dairy J. – 2000. – Vol. 10, № 10. – P. 673–681.
  16. Contribution of proteolytic activity associated with somatic cells in milk to cheese ripening / R. Marino [et al.] // Int. Dairy J. – 2005. – Vol. 15, № 10. – P. 1026– 1033.
  17. Nielsen, S. S. Plasmin system and microbial proteases in milk: characteristics, roles, and relationship / S. S. Nielsen // J. Agric. Food Chem. – 2002. – Vol. 50, № 22. – P. 6628–6634.
  18. Bastian, E. D. Plasmin in milk and dairy products: An update / E. D. Bastian, R. J. Brown // Int. Dairy J. – 1996. – Vol. 6, № 21. – P. 435–457.
  19. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases / M. B. Rao [et al.] // Microbiol. Mol. Biol. Rev. MMBR. – 1998. – Vol. 62, № 3. – P. 597–635.
  20. Johri, B. N. Enzymes from thermophilic fungi: proteases and lipases / B. N. Johri, S. Jain, S. Chouhan //  Proc. Plant Sci. – 1985.  – Vol.  94, № 2–3. –  P. 175–196.
  21. Exchanging lactocepin plasmids in lactococcal starters to study bitterness development in Gouda cheese: a preliminary investigation / C. J. Pillidge [et al.] // Int. Dairy J. – 2003. – Vol. 13, № 5. – P. 345–354.
  22. Chymosin and other milk coagulants: sources and biotechnological interventions / А. Kumar [et al.] // Crit. Rev. Biotechnol. – 2010. – Vol. 30, № 4. – P. 243–258.
  23. Thunell, R. K. Thermal Inactivation of Residual Milk Clotting Enzymes in Whey / R. K. Thunell, J.  W.  Duersch, C. А. Ernstrom //  J.  Dairy Sci. – 1979.  –  Vol. 62, № 3. – P. 373–377.
  24. Shamsuzzaman, K. Evaluation of Harp Seal Gastric Protease as a Rennet Substitute for Cheddar Cheese / K. Shamsuzzaman, N. F. Haard // J. Food Sci. – 1983. – Vol. 48. – P. 179–182.
  25. Shahidi, F. Enzymes from fish and aquatic invertebrates and their application in the food industry / F. Shahidi, Y. V. A. Janak Kamil // Trends Food Sci. Technol. – 2001. – Vol. 12, № 12. – P. 435–464.
  26. The catalytic mechanism of an aspartic proteinase explored with neutron and X-ray diffraction / L. Coates [et al.] // J. Am. Chem. Soc. – 2008. – Vol. 130, № 23. – P. 7235–7237.
  27. Freitas, A. C. Review: Technological and organoleptic issues pertaining to cheeses with denomination of origin manufactured in the Iberian Peninsula from ovine and caprine milks Revisión: Aspectos tecnológicos y sensoriales de quesos con denominación de origen elaborados en la Península Ibérica con leche de oveja   y de cabra / A. C. Freitas, A. C. Macedo, F. X. Malcata // Food Sci. Technol. Int. – 2000. – Vol. 6, № 5. – P. 351–370.
  28. Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk / S. R. Kappeler [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2006. – Vol. 342, № 2. – P. 647–654.
  29. Camel and bovine chymosin: the relationship between their structures and cheese-making properties / J. Langholm Jensen [et al.] // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. – 2013. – Vol. 69, № Pt 5. – P. 901–913.
  30. Isolation, purification and characterization of chymosin from riverine buffalo (Bubalos bubalis) / A. K. Mohanty [et al.] // J. Dairy Res. – 2003. – Vol. 70, № 1. – P. 37–43.
  31. Influence of pig rennet on proteolysis, organic acids content and microbiota of Pecorino di Farindola, a traditional Italian ewe’s  raw milk cheese / R. Tofalo  [et al.] // Food Chem. – 2015. – Vol. 175. – P. 121–127.
  32. Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin / M. C. Vega-Hernández [et al.] // J. Biotechnol. – 2004. – Vol. 114, № 1–2. – P. 69–79.
  33. Chemical and microbiological characteristics of ewes’ milk cheese manufactured with extracts from flowers of Cynara cardunculus and Cynara humilis as coagulants / M. Vioque [et al.]  //  J.  Agric. Food Chem. – 2000. – Vol.  48, № 2. –  P. 451–456.
  34. Dijck, P. W. M. Chymosin and phytase. Made by genetic engineering (No. 10 in a series of articles to promote a better understanding of the use of genetic engineering) / P.W.M. Dijck // J. Biotechnol. – 1999. – Vol. 67, № 10. – P. 77–80.
  35. WORLD CHEESE MARKET REPORT 2000–2020 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://pmfood.dk/9721/WORLD%20CHEESE%20 MARKET%20REPORT%202000-2020. – Дата доступа: 28.03.2018.
  36. World cheese production [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://pmfood.dk/upl/9739/CHEESEARTICLE1.pdf. – Дата доступа: 23.03.2018.
  37. Mann, E. J. The world dairy situation / E. J. Mann // Dairy Ind. Int. – 2010. – Vol. 70 – P. 37–38.
  38. Eliasi, J. R. Kosher and Halal: religious observances affecting dietary intakes / J. R. Eliasi, J.  T.  Dwyer //  J.  Am. Diet. Assoc. – 2002. – Vol.  102, № 7.  –  P. 911–913.
  39. Leitzmann, C. Vegetarian nutrition: past, present, future / C. Leitzmann // Am. J. Clin. Nutr. – 2014. – Vol. 100, Suppl. 1 – P. 496S–502S.
  40. Cheesemaking with vegetable coagulants – the use of Cynara L. for the production of ovine milk cheeses / L. B. Roseiro [et al.] // Int. J. Dairy Technol. – 2003. – Vol. 56, № 2. – P. 76–85.
  41. Зуев, В. А. Медленные инфекции человека и животных / В. А. Зуев // Вопросы вирусологии. – 2014. – Т. 59, № 5. – С. 5–12.
  42. Технический регламент ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» [Электронный ресурс] // Центр Сертификации Стандарт. – Режим доступа: https://certifikat.by/pravo/tehnicheskiy-reglament-tr-ts-0212011-o-bezopasnosti-pishhevoj-produkcii. – Дата доступа: 27.04.2018.
  43. Rossano, R. Digestive enzymes of the crustaceans Munida and their application in cheese manufacturing: A review / R. Rossano, M. Larocca, P. Riccio // Mar. Drugs. – 2011. – Vol. 9, № 7. – P. 1220–1231.
  44. Rawlings, N. D. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors / N. D. Rawlings, A. J. Barrett, A. Bateman // Nucleic Acids Res. – 2012. – Vol. 40. – P. D343–350.
  45. Molecular cloning and characterization of procirsin, an active aspartic protease precursor from Cirsium vulgare (Asteraceae) / D. Lufrano [et al.] // Phyto- chemistry. – 2012. – Vol. 81. – P. 7–18.
  46. Can the use of Australian cardoon (Cynara cardunculus L.) coagulant overcome the quality problems associated with cheese made from ultrafiltered milk? / S. O. Agboola [et al.] // LWT – Food Sci. Technol. – 2009. – Vol.  42, № 8. – P. 1352–1359.
  47. Ahmed, S. A. Comparative evaluation of Bacillus licheniformis 5A5 and Aloe variegata milk-clotting enzymes / S. A. Ahmed, W. A. Helmy // Braz. J. Chem. Eng. – 2012. – Vol. 29, № 1. – P. 69–76.
  48. Engineering a cardosin B-derived rennet for sheep and goat cheese manufacture / C. M. Almeida [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2015. – Vol. 99, № 1. – P. 269–281.
  49. Expression, purification, and characterization of a recombinant stem bromelain from Ananas comosus / A. Amid [et al.] // Process Biochem. – 2011. – Vol. 46, № 12. – P. 2232–2239.
  50. Bromelain: an overview of industrial application and purification strategies / Z. I. M. Arshad [et al.] //  Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2014.  – Vol.  98, № 17.  –  P. 7283–7297.
  51. Milk clotting and proteolytic activity of an enzyme preparation from Bromelia hieronymi fruits / M. A. Bruno [et al.] // LWT – Food Sci. Technol. – 2010. – Vol. 43, № 4. – P. 695–701.
  52. Devaraj, K. B. An unusual thermostable aspartic protease from the latex of Ficus racemosa (L.) / K. B. Devaraj, L. R. Gowda, V. Prakash // Phytochemistry. – 2008. – Vol. 69, № 3. – P. 647–655.
  53. Elmazar, M. Screening some local Egyptian seeds extract for milk-Clotting activity and physicochemical characterization of Brassica napus seed extract / M. Elmazar, S. El-Sayed, R. Al-Azzouny // J. Agric. Food Technol. – 2012. – Vol. 2 – P. 28–34.
  54. Proteolysis of Cacioricotta cheese made from goat milk coagulated with caprifig (Ficus carica sylvestris) or calf rennet / M. Faccia [et al.] // Eur. Food Res. Technol. – 2012. – Vol. 234, № 3. – P. 527–533.
  55. Feijoo-Siota, L. Native and biotechnologically engineered plant proteases with industrial applications / L. Feijoo-Siota, T. G. Villa // Food Bioprocess Technol. – 2011. – Vol. 4. – P. 1066–1088.
  56. Effect of vegetable coagulant, microbial coagulant and calf rennet on physicochemical, proteolysis, sensory and texture profiles of fresh goats cheese / V. García [et al.] // Dairy Sci. Technol. – 2012. – Vol. 92, № 6. – P. 691–707.
  57. Ginger protease used as coagulant enhances the proteolysis and sensory quality of Peshawari cheese compared to calf rennet / M. M. Hashim [et al.] // Dairy Sci. Technol. – 2011. – Vol. 91. – P. 431–440.
  58. Ginger rhizome as a potential source of milk coagulating cysteine protease / M. M. Hashim [et al.] // Phytochemistry. – 2011. – Vol. 72, № 6. – P. 458–464.
  59. Purification, characterization, and milk coagulating properties of ginger proteases / X. W. Huang [et al.] // J. Dairy Sci. – 2011. – Vol. 94, № 5. – P. 2259–2269.
  60. Anthelmintic activity of Calotropis procera (Ait.) Ait. F. flowers in sheep / Z. Iqbal [et al.] // J. Ethnopharmacol. – 2005. – Vol. 102, № 2. – P. 256–261.
  61. Use of artichoke (Cynara scolymus) flower extract as a substitute for bovine rennet in the manufacture of Gouda-type cheese: Characterization of aspartic proteases / B. E. Llorente [et al.] // Food Chem. – 2014. – Vol. 159. – P. 55–63.
  62. Llorente, B. E. Purification and characterization of a milk-clotting aspartic proteinase from globe artichoke (Cynara scolymus L.) / B. E. Llorente, C. B. Brutti, N. O. Caffini // J. Agric. Food Chem. – 2004. – Vol. 52, № 26. – P. 8182–8189.
  63. Comparison of the milk-clotting properties of three plant extracts / M. A. Mazorra-Manzano [et al.] // Food Chem. – 2013. – Vol. 141, № 3. – P. 1902–1907.
  64. Nestor, G.-M. Exploring the milk-clotting properties of a plant coagulant from the berries of S. elaeagnifolium var. Cavanilles / G.-M. Nestor, C.-G.D. Rubí, J.-C. Hector // J. Food Sci. – 2012. – Vol. 77, № 1. – P. 89–94.
  65. A novel serine protease cryptolepain from Cryptolepis buchanani: purification and biochemical characterization / M. Pande [et al.] // J. Agric. Food Chem. – 2006. – Vol. 54, № 26. – P. 10141–10150.
  66. Piero, A. R. L. Characterization of the purified actinidin as a plant coagulant of bovine milk / A. R. L. Piero, I. Puglisi, G. Petrone // Eur. Food Res. Technol. – 2011. – Vol. 233, № 3. – P. 517.
  67. Puglisi, I. A kiwi juice aqueous solution as coagulant of bovine milk and its potential in Mozzarella cheese manufacture / I. Puglisi, G. Petrone, A. R. Lo Piero // Food Bioprod. Process. – 2014. – Vol. 92, № 1. – P. 67–72.
  68. Raheem Dele. The characterization and application of Calotropis procera, a coagulant in Nigerian Wara cheese / Raheem Dele, Suri Narinder, Saris Per E. // Int. J. Food Sci. Technol. – 2007. – Vol. 42, № 2. – P. 220–223.
  69. Applicability of extracts from Centaurea calcitrapa in ripening of bovine cheese / P. M. Reis [et al.] // Int. Dairy J. – 2000. – Vol. 10, № 11. – P. 775–780.
  70. Shah, M. A. Plant proteases as milk-clotting enzymes in cheesemaking: a review / M. A. Shah, S. A. Mir, M. A. Paray //  Dairy Sci. Technol. – 2014.  –    Vol. 94. – P. 5–16.
  71. Uchikoba, T. Milk-clotting activity of cucumisin, a plant serine protease from melon fruit / T. Uchikoba, M. Kaneda // Appl. Biochem. Biotechnol. – 1996. – Vol. 56, № 3. – P. 325–330.
  72. Channe, P. S. Continuous production of cheese by immobilized milk-clotting protease from aspergillus niger MC4 / P. S. Channe, J. G. Shewale // Biotechnol. Prog. – 1998. – Vol. 14, № 6. – P. 885–889.
  73. Hashimoto, H. Thermostable acid protease produced by Penicillium duponti K1014, a true thermophilic fungus newly isolated from compost / H. Hashimoto, T. Iwaasa, T. Yokotsuka // Appl. Microbiol. – 1972. – Vol. 24, № 6. – P. 986–992.
  74. Casein phosphopeptides drastically increase the secretion of extracellular proteins in Aspergillus awamori. Proteomics studies reveal changes in the secretory pathway / K. Kosalková [et al.] // Microb. Cell Factories. – 2012. – Vol. 11. – P. 5.
  75. Optimum production and characterization of an acid protease from marine yeast Metschnikowia reukaufii W6b / J. Li [et al.] // J. Ocean Univ. China. – 2010. – Vol. 9, № 4. – P. 359–364.
  76. Pei-Jing, Y. Factors affecting the growth and milk-clotting enzyme production by Amylomyces rouxii in rice medium / Y. Pei-Jing, C. Cheng-Chun // Food Technol. Biotechnol. – 2005. – Vol. 43, № 3. – P. 283–288.
  77. Cloning and expression of clt genes encoding milk-clotting proteases from Myxococcus xanthus 422 / M. Poza [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, № 10. – P. 6337–6341.
  78. Sardinas, J. L. Rennin enzyme of Endothia parasitica / J. L. Sardinas // Appl. Microbiol. – 1968. – Vol. 16, № 2. – P. 248–255.
  79. Purification and characterization of a chymosin from Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis / Q. Sun [et al.] // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2014. – Vol. 174, № 1. – P. 174–185.
  80. Cloning and characterization of a novel aspartic protease gene from marine-derived Metschnikowia reukaufii and its expression in E. coli / J. Li [et al.] // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2009. – Vol. 159, № 1. – P. 119–132.
  81. Barrett, A. J. Handbook of proteolytic enzymes / A. J. Barrett, J. F. Woessner, N. D. Rawlings. – Elsevier, 2012. – 1182 p.
  82. Complete secretion of activable bovine prochymosin by genetically engineered L forms of Proteus mirabilis / C. Klessen [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1989. – Vol. 55, № 4. – P. 1009–1015.
  83. Wu, F.-C. Optimization of the production and characterization of milk clotting enzymes by Bacillus subtilis natto / F.-C. Wu, C.-W. Chang, I.-L. Shih // SpringerPlus. – 2013. – Vol. 2, № 1. – P. 33.
  84. Molecular cloning and nucleotide sequence of cDNA coding for calf preprochymosin / T. J. Harris [et al.] // Nucleic Acids Res. – 1982. – Vol. 10, № 7. – P. 2177–2187.
  85. Molecular cloning and characterization of double-stranded cDNA coding for bovine chymosin / D. Moir [et al.] // Gene. – 1982. – Vol. 19, № 1. – P. 127–138.
  86. Expression of cloned calf prochymosin gene sequence in Escherichia coli / K. Nishimori [et al.] // Gene. – 1982. – Vol. 19, № 3. – P. 337–344.
  87. The primary structure of calf chymosin / B. Foltmann [et al.] // J. Biol. Chem. – 1979. – Vol. 254, № 17. – P. 8447–8456.
  88. Synthesis of calf prochymosin (prorennin) in Escherichia coli. / J. S. Emtage [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1983. – Vol. 80, № 12. – P. 3671–3675.
  89. Expression of calf prochymosin in Saccharomyces cerevisiae / C. G. Goff [et al.] // Gene. – 1984. – Vol. 27, № 1. – P. 35–46.
  90. McCaman, M. T. Enzymatic properties and processing of bovine prochymosin synthesized in Escherichia coli / M. T. McCaman, W. H. Andrews, J. G. Files //  J. Biotechnol. – 1985. – Vol. 2, № 3. – P. 177–190.
  91. Beppu, T. The cloning and expression of chymosin (rennin) genes in microorganisms / T. Beppu // Trends Biotechnol. – 1983. – Vol. 1, № 3. – P. 85–89.
  92. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae / J. Mellor [et al.] // Gene. – 1983. – Vol. 24, № 1. – P. 1–14.
  93. Smith,  R. А. Heterologous protein secretion from yeast / R. А. Smith, M. J. Duncan, D. T. Moir // Science. – 1985. – Vol. 229, № 4719. – P. 1219–1224.
  94. Controlled expression and secretion of bovine chymosin in aspergillus Nidulans / D. Cullen [et al.] // Nat. Biotechnol. – 1987. – Vol. 5, № 4. – P. 369–376.
  95. Cloning, expression and optimized production in a bioreactor of bovine chymosin B in Pichia (Komagataella) pastoris under AOX1 promoter / D. G. Noseda [et al.] // Protein Expr. Purif. – 2013. – Vol. 92, № 2. – P. 235–244.
  96. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris / N. Wang [et al.] // Protein Expr. Purif. – 2015. – Vol. 111. – P. 75–81.
  97. Short communication: A comparative analysis of recombinant chymosins / J. A. Vallejo [et al.] // J. Dairy Sci. – 2012. – Vol. 95, № 2. – P. 609–613.
  98. Sheikh, A. Translation of preprochymosin in vitro. Evidence for folding of pro-chymosin to the native conformation / A. Sheikh, R. B. Freedman // Biochem. J. – 1990. – Vol. 272, № 3. – P. 659–664.
  99. Expression of a synthetic copy of the bovine chymosin gene in Aspergillus awamori from constitutive and pH-regulated promoters and secretion using two different pre-pro sequences / R. E. Cardoza [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2003. – Vol. 83, № 3. – P. 249–259.
  100. Codon optimization of the “Bos Taurus Chymosin” gene for the production of recombinant chymosin in Pichia pastoris / J. A. Espinoza-Molina [et al.] // Mol. Biotechnol. – 2016. – Vol. 58, № 10. – P. 657–664.
  101. Gama Salgado, J. A. Cloning and expression of an active aspartic proteinase from Mucor circinelloides in Pichia pastoris / J. A. Gama Salgado, M. Kangwa, M. Fernandez-Lahore // BMC Microbiol. – 2013. – Vol. 13. – P. 250.
  102. Constitutive expression, purification and characterization of bovine pro-chymosin in Pichia pastoris GS115 / X. P. Jiang [et al.] // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2012. – Vol. 28, № 5. – P. 2087–2093.
  103. Molecular cloning and expression of goat (Capra hircus) prochymosin in E. coli / A. Kumar [et al.] // Food Biotechnol. – 2007. – Vol. 21 – P. 57–69.
  104. Cloning and expression of yak active chymosin in Pichia pastoris / F. Luo  [et al.] // Asian-Australas. J. Anim. Sci. – 2016. – Vol. 29, № 9. – P. 1363–1370.
  105. Expression of cloned calf prochymosin cDNA under control of the tryptophan promoter / K. Nishimori [et al.] // Gene. – 1984. – Vol. 29, № 1–2. – P. 41–49.
  106. Bioprocess and downstream optimization of recombinant bovine chymosin B in Pichia (Komagataella) pastoris under methanol-inducible AOXI promoter / D. G. Noseda [et al.] // Protein Expr. Purif. – 2014. – Vol. 104. – P. 85–91.
  107. Prochymosin expression in Bacillus subtilis / D. Parente [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 1991. – Vol. 61, № 2–3. – P. 243–249.
  108. Recombinant lamb chymosin as an alternative coagulating enzyme in cheese production / I. Rogelj [et al.] // J. Dairy Sci. – 2001. – Vol. 84, № 5. – P. 1020–1026.
  109. Secretion of calf chymosin from the filamentous fungus Aspergillus oryzae / K. Tsuchiya [et  al.]  //  Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1993.  – Vol.  40, № 2–3. –    P. 327–332.
  110. Expression, purification, and characterization of bovine chymosin enzyme using an inducible pTOLT system / Y. Ulusu [et al.] // Prep. Biochem. Biotechnol. – 2016. – Vol. 46, № 6. – P. 596–601.
  111. Cloning and expression of buffalo active chymosin in Pichia pastoris / J. A. Vallejo [et al.] // J. Agric. Food Chem. – 2008. – Vol. 56, № 22. – P. 10606–10610.
  112. Recombinant expression of bovine chymosin in Pichia pastoris / L. Zhang [и др.] // Chin. J. Biotechnol. – 2009. – Vol. 25, № 8. – Р. 1160–1165.
  113. Expression of calf prochymosin gene in Escherichia coli / Y. Zhang [et al.] // Chin. J. Biotechnol. – 1991. – Vol. 7, № 3. – P. 169–175.
  114. Elliott, G. S. Construction of an ompA-prochymosin signal fusion in pIN-III-ompA2 / G. S. Elliott, A. F. Wilderspin, J. E. Pitts // Biochem. Soc. Trans. –  1989. – Vol. 17, № 4. – P. 764–765.
  115. Secretion of heterologous proteins in  Escherichia  coli  /  I.  B.  Holland [et al.] // Methods Enzymol. – 1990. – Vol. 182. – P. 132–143.
  116. Tichý, P. J. Improved procedure for a high-yield recovery of enzymatically active recombinant calf chymosin from Escherichia coli inclusion bodies / P. J. Tichý, F.  Kaprálek, P.  Jecmen //  Protein Expr. Purif. – 1993.  – Vol.  4, № 1.  – P. 59–63.
  117. Partition features and renaturation enhancement of chymosin in aqueous two-phase systems / G. Reh [et al.] // J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. – 2007. – Vol. 860, № 1. – P. 98–105.
  118. Recombinant Lactococcus lactis fails to secrete bovine chymosine / T. D. Lu- erce [et al.] // Bioengin. – 2014. – Vol. 5, № 6. – P. 363–370.
  119. Recognized as Safe (GRAS) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/ucm2006850. htm. – Дата доступа: 12.03.2017.
  120. Kluyveromyces as a host for heterologous gene expression: expression and secretion of prochymosin / J. A. van den Berg [et al.] // Nat. Biotechnol. – 1990. – Vol. 8, № 2. – P. 135–139.
  121. Disruption of PMR1 in Kluyveromyces lactis improves secretion of calf prochymosin / Z. Feng [et al.] // J. Sci. Food Agric. – 2011. – Vol. 91, № 1. – P. 100–103.
Этот сайт использует файлы cookie и метаданные. Продолжая просматривать его, вы соглашаетесь на использование нами файлов cookie и метаданных в соответствии с Политикой конфиденциальности.
Продолжить