Производство конъюгированной линолевой кислоты Пропионибактериями

Конъюгированная линолевая кислота (CLA) и её производство молочными пропионибактериями

Конъюгированная линолевая кислота. Общая информация

Конъюгированные линолевые кислоты (CLA) представляют собой семейство изомеров линолевой кислоты, в молекулах которых две двойные связи «углерод-углерод» (C = C) конъюгированы (т.е. разделены одинарной связью). Иными словами, CLA - это общий термин, используемый для обозначения геометрических (т.е. цис- или транс-) и позиционных изомеров линолевой кислоты с двумя сопряженными двойными связями в положениях углерода от 6-8 до 13-15.

Цис-транс-изомерия CLA: Как известно, геометрические изомеры, отличаются друг от друга пространственным расположением заместителей относительно плоскости двойной связи (заместитель - любой атом или группа атомов, которые замещают в исходном соединении атом водорода – ред.). Если заместители расположены по одну сторону от плоскости двойной связи, такой изомер обозначают как цис-, если они расположены по разные стороны от плоскости двойной связи, то это транс-изомер. И здесь стоит особо отметить, что конъюгированная линолевая кислота является одновременно транс-жирной кислотой и цис-жирной кислотой. Цис-связь вызывает более низкую температуру плавления и, предположительно, наблюдаемые полезные эффекты для здоровья.

Рис. 1. Структура линолевой кислоты и двух ее основных конъюгированных производных. Конъюгированные линолевые кислоты (CLA) обычно вырабатывается симбиотическими бактериями в желудке (рубце) жвачных животных. Таким образом, CLA содержится в основном в мясе и молочных продуктах, полученных от жвачных. Преобладающим изомером в пищевых источниках является цис-9, транс-11-CLA (c9, t11-CLA) (пункт 2 рисунка), который составляет до ~ 90% от общего количества CLA. Транс-10, цис-12-CLA (t10, c12-CLA) (пункт 3) - еще один распространенный изомер, составляющий 1-10% от общего количества CLA в пищевых источниках.

Рис. 2. Альтернативное изображение структур линолевой кислоты и двух ее основных конъюгированных производных (дополнение к рис. 1)

На протяжении многих лет CLA привлекала большое внимание благодаря своим полезным свойствам для здоровья. Существует около 28 различных изомеров CLA, полученных природным и промышленным способом при гидрировании жирных кислот [4], но наиболее важными по биологическому действию являются формы c9,t11 и t10,c12. Однако изомерами CLA в молочном жире по важности являются c9,t11 (около 80%), за которыми следует t7,c9, который количественно является вторым по значимости и достигает уровня от 3 до 16% от общего количества CLA [5]. Широко сообщалось о факторах, влияющих на содержание CLA в молоке, таких как питание жвачных животных [6-7], тип выращивания животных и стадия лактации [8]. Многие исследования продемонстрировали действие CLA как антиканцерогенного [9], антидиабетического [10] и иммуномодулирующего [11] соединения. Хотя нет единого мнения относительно его роли в жировом обмене, некоторые авторы обнаружили, что его потребление также уменьшает отложение жира [12].

Хотя пища от жвачных (с 2-камерным желудком) животных является самым богатым источником CLA для человека, она также содержится в продуктах животного происхождения с однокамерным желудком, таких как свинина [37], курица [30], индейка [30], рыба и мясо кролика [38], но в гораздо меньших количествах. У южноамериканских верблюдовых CLA определяли в молоке ламы (Lama glama) [39]. Растительные масла содержат мало CLA, и, по мнению некоторых авторов, содержание CLA в растительных маслах не обнаружено. Типичные значения CLA в продуктах от нежвачных животных приведены в таблице 1.

Таблица 1. Содержание CLA в продуктах от нежвачных животных

Продукт	Общее содержание CLA (мг/100 г жира)	Автор исследования
Мясо Индейка Рыба Свинья Кролик Курица	0.25 0.01-0.09 0.3-0.9 0.11 0.09-0.2	Chin et al. [30] Fristche and Steinhart [105] Ross et al.[ 37] Fristche and Steinhart [105] Chin et al. [30]
Яичный желток	N.D N.D	Raes et al. [106] Gultemiriam et al. [107]
Молоко Человек Лошадь Сеять Лама (Lama glama)	0.1 0.05-0.12 0.19-0.27 0.7	Park et al. [108] Jahreis et al. [8] Jahreis et al. [8] Schoos et al. [39]
Растительные масла	<0.01	Fristche and Steinhart [105]

ND: не определено

Рекомендуемая для потребления человеком концентрация CLA

Концентрация CLA в молочных продуктах широко варьируется в соответствии с представленными данными (0,55–9,12 мг/г жира), но даже при этом ниже, чем требуется для достижения биологического эффекта у человека. Биологические свойства после введения CLA зависят от изомера, вводимых доз и периода исследования. Так, в исследованиях на животных моделях сообщалось о противоатеросклеротическом эффекте после приема кроликам 0,1-1% CLA в день [42]. Более того, антиканцерогенный эффект был определен авторами с использованием уровней от 0,5% до 4% в рационе [43-44].

Хотя механизм действия до конца не изучен, сообщалось, что CLA является антиоксидантным соединением у животных и на моделях in vitro [15]. Точно так же, как в экспериментальных моделях существуют различия в эффективных дозах CLA, в зависимости от модели на животных и оцениваемого биологического эффекта, рекомендуемая суточная доза для человека также сильно варьируется. В целом, путем экстраполяции результатов, полученных на животных, рекомендуемая суточная доза CLA составляет около 0,35-1 г/сут [15]. Некоторые авторы оценивали суточную дозу в 650 мг [45], но в других исследованиях считалось, что более высоких доз (от 3,0 до 4,2 г/сут) достаточно для снижения жировой массы тела [46-47]. Однако в настоящее время реальное потребление CLA в разных странах ниже рекомендуемой дозы.

Производство CLA бактериями

Исследованиям, касающимся увеличения содержания CLA в пищевых продуктах, уделяется большое внимание, поскольку включение бактерий повышает уровень CLA в некоторых кисломолочных продуктах или может генерировать CLA на уровне кишечника после введения пробиотиков. Таким образом, исследования бактериальной продукции CLA актуальны…

Руминальный анаэроб (т.е. содержащийся в рубце жвачных) Butyrivibrio fibrisolvens был первой бактерией, у которой было обнаружено производство CLA [18]. Спустя годы выяснилось, что не только бактерии рубца способны образовывать CLA. Так, микроорганизмы, выделенные из молочных продуктов, кишечника человека и животных, были продемонстрированы как бактерии-продуценты CLA, в том числе молочнокислые бактерии (МКБ) и бифидобактерии. В настоящее время Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum; Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus; Lactococcus Lactis, Propionibaterium freudenrehichii, Bifidobacterium sp, Streptococcus и другие способны образовывать CLA [52-54].

Propionibacteria

Пропионибактерии обычно присутствуют в молоке и молочных продуктах, а некоторые виды играют важную роль в создании сыров, таких как сыр Эмменталь. Пропионовокислые бактерии (ПКБ) представляют собой еще одну важную группу бактерий, которые за счет наличия в них фермента изомеразы линолевой  кислоты (Linoleic acid isomerase (LAI)) продемонстрировали способность к изомеризации LA in vitro, что актуально, поскольку ПКБ можно включать в ферментированные продукты, такие как сыры. Так, P. freudenrehichii была способна продуцировать CLA преимущественно в форме c9, t11, согласно различным исследованиям [58, 65, 70-71, 129-130], хотя другой автор сообщил о восьми различных изомерах CLA, продуцируемых ферментным экстрактом у этой бактерии [72].

Рис. 3. Сравнение структуры (А) линолевой кислоты (цис-9, цис-12 18:2) и (В) цис-9, транс-11 конъюгированной линолевой кислоты.

Прим. ред.: Есть ряд интересных работ по изучению активности изомеразы линолевой кислоты (LAI) в ПКБ. Например, активность LAI в P. freudenrehichii изучалась в работе Lin, T.Y, et al. / Linoleic acid Isomerase Activity in Enzyme Extracts from Lactobacillus Acidophilus and Propionibacterium Freudenreichii ssp. Shermanii / Journal of Food Science, (2002) 67: 1502-1505. В 2004 г. в работе тайваньских ученых также была продемонстрирована LA-изомеразная активность молочных ПКБ. Так производство CLA в модели жирного молока с добавлением гидролизованного соевого масла в течение 24–48 часов было продемонстрировано у двух P. freudenreichii ssp shermanii и P. freudenreichii ssp freudenreichii [65]. Более высокие уровни CLA были определены в обезжиренном молоке, чем в бульоне MRS.

Также была доказана способность и кожных ПКБ (P. acnes), выделенных от овец, образовывать CLA, однако только в форме t10, c12-изомера [73]. (см. рис. 4).

Рис. 4. Изомеризация линолевой кислоты бактерией P. acnes (PAI - изомераза линолевой кислоты Propionibacterium acnes)

Производство конъюгированной линолевой кислоты бактерией Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii

Аннотация.

Прим. ред.: Выше уже была кратко затронута тема LA-изомеразной активности молочных ПКБ. Здесь же приводится описание биотехнологической практики получения CLA из ПКБ). Кинетику изомеризации линолевой кислоты в конъюгированную линолевую кислоту (CLA) Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS изучали в ходе периодической ферментации с контролируемым pH и периодической ферментации с подпиткой (по т.н. принципу «fed-batch» - ред.).

При периодической ферментации с добавлением 600–2000 мкг•мл^-1 линолевой кислоты скорость образования CLA была самой высокой во время экспоненциальной фазы роста. К концу периодической ферментации накапливались высокие количества CLA, соответствующие конверсии 80–87%, с исходной концентрацией линолевой кислоты до 2000 мкг•мл^-1.

При периодической ферментации с подпиткой, когда в культуру добавляли 600 мкг•мл^-1 линолевой кислоты после экспоненциального роста, происходил быстрый, но короткий период конверсии. Таким образом, как активно растущие, так и нерастущие культуры смогли эффективно формировать CLA. Однако скорость продукции на клетку была значительно выше в растущих культурах. Эта реакция изомеризации может быть системой детоксикации линолевой кислоты в изученном штамме пропионибактерий.

1. ВВЕДЕНИЕ

Конъюгированная линолевая кислота (CLA) вызывает большой интерес благодаря своим потенциально полезным физиологическим эффектам и антиканцерогенным свойствам [110, 111, 118, 119]. Положительные эффекты CLA, полученные в ходе исследований на животных моделях, в настоящее время проверяются в клинических испытаниях на людях [109, 112, 114].

Коммерчески доступные продукты CLA производятся путем щелочной изомеризации растительных масел [112]. Эти синтетические смеси состоят из нескольких изомеров CLA, из которых конфигурация цис-9,транс-11 считается обладающей наибольшей биологической активностью [111]. Этот изомер был впервые обнаружен в качестве промежуточного продукта при биогидрировании линолевой кислоты (LA) рубцовой бактерией Butyrivibrio fibrisolvens [116]. Также было показано, что другие бактерии способны превращать LA в ее конъюгированную форму, включая некоторые молочнокислые бактерии и пропионибактерии, используемые в качестве молочных заквасок. В этих случаях основная часть образовавшейся CLA находилась в конфигурации цис-9, транс-11 изомера. Реакцию конверсии изучали как на растущих культурах бактерий, так и на суспензиях отмытых клеток [113, 117, 120, 121, 125, 128]. Из этих небольших исследований микробиологической изомеризации можно сделать вывод, что токсичность LA (для бактерий – ред.) и ее низкая растворимость в водных растворах могут иметь серьезные осложнения при производстве CLA. Однако обе эти проблемы можно, по крайней мере, в значительной степени преодолеть, используя системы мицеллярных субстратов, стабилизированных детергентами [125]. Путем правильной оптимизации концентраций реагентов можно использовать концентрации LA, которые в противном случае были бы смертельными для организмов, и изомеризовать их до CLA. В данном исследовании описана такая система преобразования. Используя Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS в качестве изомеризующегося организма, кинетику роста и образования CLA изучали с различными начальными концентрациями LA в периодической ферментации с контролируемым pH и периодической ферментации с подпиткой.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii штамм JS (DSM 7067) был из коллекции культур Valio Ltd. (Хельсинки, Финляндия). Инокулят выращивали на среде, описанной Суомалайненом и Мяйря-Мякинен [126] при 30 ℃ в течение 72 часов. В экспериментах по образованию CLA штамм культивировали в среде пермеата сыворотки (WPM), содержащей 2% (мас./об.) пермеата сыворотки (Valio), 1% (мас./об.) дрожжевого экстракта (LabM, Бери, Англия) и 0,5% (мас./об.) триптона (LabM) с добавлением линолевой кислоты (LA; чистота 99%, Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в диапазоне концентраций 0–2000 мкг•мл^-1. В присутствии LA в ферментационную среду также добавляли моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (SO; Kotilen-O/1 VL, Chemische Fabrik Dr. W. Kolb Ag, Швейцария) в концентрации 9 или 15 мг•мл^–1 (SO также известен как полисрбат-80 или добавка Е-433 – ред.). LA добавляли в среду в виде маточного раствора мицеллярной LA перед стерилизацией. Мицеллярную LA получали путем взвешивания 300 мг LA в 5 мл дезоксигенированной деионизированной воды, содержащей 0,36 мл SO. Смесь перемешивали и добавляли 0,56 мл 2 моль•л^-1 раствора гидроксида натрия для осветления смеси. Раствор переносили в мерную колбу емкостью 50 мл и заливали деоксигенированной водой. Чтобы облегчить добавление самых высоких концентраций LA без чрезмерного разбавления питательной среды, также готовили концентрированные исходные растворы, сохраняя постоянным соотношение LA, SO и гидроксида натрия.

2.2. Ферментации

Ферментацию проводили в ферментере Biostat MD 2 (B. Braun, Melsungen, Germany) с рабочим объемом 2 л при 30 ℃. Показатель рН среды контролировали на уровне 6,3±0,2 с помощью 8% раствора аммиака. Инокулят составлял 2% от объема ферментации. При периодической ферментации с подпиткой культивирование состояло из фазы первичного роста, за которой следовала отдельная фаза производства. Организм выращивали до поздней экспоненциальной фазы (количество жизнеспособных микроорганизмов 2•10¹⁰ КОЕ•мл^–1). При периодической ферментации А с подпиткой (FBA) среда содержала 9 мг•мл^–1 SO. После фазы роста добавляли исходный запас LA до концентрации 600 мкг•мл^–1. При периодической ферментации с подпиткой B (FBB) водный SO добавляли до концентрации 9 мг•мл^–1 непосредственно перед добавлением исходного количества LA в поздней экспоненциальной фазе. Рост контролировали по оптической плотности (OD) при 600 нм (спектрофотометр U-2000, Hitachi, Япония) и по количеству жизнеспособных клеток. Количество жизнеспособных микроорганизмов определяли путем нанесения на натрий-лактатный агар, содержащий 1% (по массе) дрожжевого экстракта (LabM), 0,5% (по массе) триптона (LabM), 1% (по массе) b-глицерофосфата (Merck, Дармштадт, Германия), 1,7% (по объему) лактата натрия (Merck) и 1,2% (по объему) агара (LabM). Планшеты инкубировали в анаэробных условиях при 30 ℃ в течение 6-7 дней. Пробы для анализа жирных кислот и подсчета жизнеспособных микроорганизмов отбирали после инокуляции и с интервалом в 24 часа. При концентрации LA мкг•мл^–1 пробы отбирали каждые два часа в течение времени ферментации от 0 до 10 часов. При концентрациях LA 930 и 1400 мкг•мл^–1 пробы отбирали каждые три часа в течение времени ферментации от 13,5 до 22 ч и от 10 до 22 ч соответственно. После этого пробы отбирали с интервалом в 24 часа.

2.3.  Определение содержания жирных кислот

Для определения состава жирных кислот в клеточной массе и среде образцы культуры (4-10 мл) центрифугировали при 4300 g в течение 15 мин при 15-20 ℃. Надосадочную жидкость отфильтровывали с помощью 0,2 мм фильтра и при необходимости разбавляли деионизированной водой. Гранулы клеток промывали 8 мл водопроводной воды. Образцы замораживали и лиофилизировали. Жирные кислоты определяли по методу метилирования, описанному Suutari et al [127]. Жирные кислоты омыляли 1–2 мл 3.7 моль•л^–1  NaOH в 49% (по объему) метаноле при 100 ℃ в течение 30 мин. Омыленные жирные кислоты метилировали 4–8 мл 2.2 моль•л^–1 HCl в 64% (по объему) метаноле при 80 ℃ в течение 10 мин. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали в 1,5 мл раствора гексана/метил-трет-бутилового эфира (1:1, по объему) при энергичном встряхивании в течение 10 мин. Органическую фазу промывали 3 мл 0.3 моль•л^–1 NaOH при встряхивании в течение 5 мин. Образец высушивали безводным Na₂SO₄ и анализировали на газовом хроматографе (ГХ). ГХ-анализ проводили на газовом хроматографе Hewlett-Packard Model 5890A, оснащенном пламенно-ионизационным детектором, капиллярной системой впуска и высокоскоростным автоматическим пробоотборником модели 7673A со шприцем объемом 10 мл.

2.4. Расчеты

Удельную скорость роста (μ•ч^–1) для культуры в экспоненциальной фазе роста рассчитывали путем деления изменения натурального логарифма значений оптической плотности на продолжительность времени наблюдения. Количество CLA, образованной бактерией, рассчитывали путем вычитания начальной концентрации CLA в ростовой среде (CLA в SO) из общего количества CLA. Выход CLA (%) определяли как [количество образовавшегося CLA (г•л^–1), деленное на исходное количество LA в среде (г•л^–1)] × 100%. Продуктивность ферментации выражали как объемную скорость производства CLA (VPR, мкг•мл^-1•ч^-1) и удельную скорость производства CLA (SPR, мкг•10^-9КОЕ^-1.ч^-1). VPR рассчитывали путем деления количества образовавшегося CLA (мкг•мл^-1) на продолжительность периода наблюдения (ч). SPR рассчитывали путем деления VPR на количество жизнеспособных клеток (КОЕ•мл^-1) в конце периода наблюдения. Содержание жирных кислот в клетках (мг•г^-1) рассчитывали как количество жирных кислот на сухой вес клеток. Результаты на рисунках и в таблицах представлены как средние значения ± стандартное отклонение (n = 3-4).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1.  Ферментация периодическая

Превращение LA в CLA во время роста Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS изучали в периодической ферментации объемом 2 л и периодической ферментации с подпиткой, оборудованной контролем pH. Исходные концентрации LA в WPM колебались от 600 до 2 000 мкг•мл^–1. Эффект предотвращения роста LA был преодолен путем добавления исходного раствора мицеллярной LA в WPM с добавкой SO так, чтобы окончательное соотношение LA:SO составляло 1:7.5–1:15 (по массе). Было обнаружено, что при таких соотношениях одновременный рост и превращение LA в CLA возможен без контроля pH [125].

Рисунок 1. Динамика типичной периодической ферментации P. freudenreichii ssp. shermanii JS в WPM при наличии LA и SO. Условные обозначения: ▲ формирование CLA; ∆ потребление LA; и ● жизнеспособное количество.

Таблица I. Рост и образование CLA при периодической (порционной) ферментации P. freudenreichii ssp. shermanii JS при различных исходных концентрациях LA в WPM с добавлением SO. Удельная скорость роста (μ_m), количество жизнеспособных клеток, количество образовавшейся CLA, объемная и удельная скорость производства CLA (VPR и SPR соответственно) являются максимальными полученными значениями. Максимальные VPR и SPR были получены в диапазоне наблюдений, указанном в скобках.

LA (μg/mL)	SO (mg/mL)	μm (h–1)	Жизне-способное кол-во (log[cfu/mL])	CLA (μg/mL)	цис-9, транс-11-изомер от общего кол-ва CLA, %	VPR (μg·mL–1·h–1)	SPR (mg·10–9cfu–1·h–1)
0	0	0.044 ± 0.007	10.49 ± 0.02	0	-	-	-
600 ± 13	9	0.034 ± 0.001	10.29 ± 0.02	490 ± 21	85 ± 3	22 ± 2 (10–25 h)	36 ± 4 (8–10 h)
930 ± 38	15	0.031 ± 0.001	10.19 ± 0.01	812 ± 7	93 ± 1	57 ± 5 (13.5–16 h)	76 ± 7 (13.5–16 h)
1 400 ± 46	15	0.022 ± 0.001	10.11 ± 0.01	1 140 ± 51	95 ± 1	34 ± 3 (13–16 h)	36 ± 4 (13–16 h)
2 000 ± 28	15	0.014 ± 0.001	10.04 ± 0.02	1 600 ± 87	95 ± 1	19 ± 2 (0–15 h)	51 ± 5 (0–15 h)

На рисунке 1. показана кинетика роста при периодической ферментации при начальном уровне LA 930 мкг•мл^–1. Образование CLA хорошо коррелировало с ростом с сопутствующим снижением LA. Ферментации при различных начальных концентрациях LA показали, что увеличение начального уровня LA снижало удельную скорость роста (табл. I), а также незначительно снижало конечную плотность клеток. Несмотря на это, конечное количество CLA увеличивалось по мере увеличения начальной концентрации LA, и даже при 2000 мкг•мл^–1 LA выход CLA составлял 80%. В конце ферментации в среде оставалось менее 10% исходной LA. При всех периодических ферментациях цис-9, транс-11 изомеры CLA составляли 85-95% образующейся CLA, и более 98% образующейся CLA было внеклеточным.

Объемные и удельные показатели выработки CLA были самыми высокими в течение первых 24 ч ферментации (табл. I). Однако на эти значения сильно влияла продолжительность периода наблюдения. При ферментации с соотношением LA:SO 1:15 почти 70% от общего количества CLA образовывалось в течение первых 40 часов. При начальных концентрациях LA, превышающих 930 мкг•мл^–1, наблюдалась небольшая тенденция к снижению максимальных объемных показателей продукции. Однако значения удельной скорости производства указывают на то, что культуры, растущие медленнее из-за высоких начальных концентраций LA, все равно эффективно преобразовывали LA в CLA в расчете на клетку (табл. I).

Согласно представленным результатам, казалось, что большая часть CLA образовалась на ранних стадиях роста. Поэтому первые десять часов культивирования были изучены более внимательно. После инокуляции деление клеток началось немедленно (рис. 2.2), а изомеризация LA началась после первых четырех часов после инокуляции. После этого наблюдалась положительная корреляция между увеличением количества жизнеспособных клеток и количеством CLA.

3.2. Периодическая ферментация с подпиткой

Рисунок 2. Начало образования CLA при периодической ферментации P. freudenreichii ssp. shermanii JS в WPM при наличии LA и SO. Символы: ▲ формирование CLA; ∆ потребление LA; и ● жизнеспособное количество.

Рисунок 3. Рост P. freudenreichii ssp. shermanii JS при периодической ферментации в WPM. Вертикальные линии указывают время добавления 600 мкг•мл^-1 LA (FBA) (■) и 15 мг•мл^-1 SO и 600 мкг•мл^-1 LA (FBB) (▲). Ферментация без LA и SO (●).

Кинетику образования CLA и ее связь с ростом дополнительно исследовали при периодической ферментации с подпиткой. Ферментации состояли из фазы роста для получения высоких концентраций клеток в отсутствие LA, за которой следовала фаза конверсии. Фазу роста проводили в WPM с SO или без него до поздней экспоненциальной фазы (количество жизнеспособных клеток 2 × 10¹⁰ КОЕ/мл) перед добавлением исходного мицеллярного раствора LA до концентрации LA 600 мкг•мл^-1. При периодической ферментации с подпиткой A (FBA) культуру развивали в присутствии 9 мг•мл^–1 SO, а при ферментации B (FBB) SO добавляли непосредственно перед добавлением LA.

Присутствие SO в WPM с начала фазы роста (FBA) снижало скорость роста, а поздняя экспоненциальная фаза роста достигалась примерно на 30 ч позже, чем в FBB (рис. 3). В обеих периодических ферментациях с подпиткой (А и В) добавление LA останавливало рост сразу или в течение 3 часов. Несмотря на это, CLA быстро образовывалась в обеих ферментациях после добавления LA. В FBB превращение LA в CLA начиналось практически мгновенно после добавления SO и LA, а максимальные объемная и удельная скорости продукции достигались уже через 0,5–3 ч (табл. II). В FBA образование CLA происходило быстрее всего в течение 3–6 часов после добавления LA.

Таблица II. Продуктивность P. freudenreichii ssp. shermanii JS при периодическом брожении в WPM. В FBA приблизительно 600 мкг•мл^–1 LA добавляли в культуру, содержащую 15 мг•мл^–1 SO, а в FBB аналогичные количества SO и LA добавляли в культуру на поздней экспоненциальной фазе роста. Время реакции отсчитывали от добавления LA. Объемная и удельная скорости образования CLA (VPR и SPR соответственно) были рассчитаны с учетом времени реакции, указанного в таблице.

	Время реакции (h)	CLA (μg·mL–1)	VPR (μg·mL–1·h–1)	SPR (μg·10–9 cfu–1·h–1)
FBA	0	0	0	0
	3	58 ± 5	19 ± 3	1.0 ± 0.3
	6	170 ± 15	37 ± 7	2.2 ± 0.5
	28	518 ± 60	16 ± 4	0.6 ± 0.1
FBB	0	0	0	0
	0.5	6 ± 1	12 ± 2	0.6 ± 0.1
	3	246 ± 25	96 ± 10	4.6 ± 0.6
	6	322 ± 33	25 ± 3	0.8 ± 0.2
	22	338 ± 52	1 ± 0.2	<0.1

Темпы производства в FBB были в два раза выше, чем в FBA. С другой стороны, конечная концентрация CLA в FBB была значительно ниже, чем в FBA, где конечный уровень CLA был примерно таким же, как и при периодической ферментации при соответствующей начальной концентрации LA 600 мкг•мл^–1. Максимальные удельные продуктивности при периодическом брожении с подпиткой были значительно ниже значений, полученных при просто периодической (порционной) ферментации (табл. I и II). Например, максимальные значения удельной производительности в FBB и периодической ферментации, содержащей 600 мкг•мл^-1 LA, составили 4,6 и 36 мкг•10^-9КОЕ^-1•ч^-1 соответственно. Это указывает на важность физиологического состояния культуры в эффективности реакции конверсии.

3.3. Клеточные композиции жирных кислот

Хотя основная часть образующейся CLA была обнаружена в питательной среде, LA и CLA также были обнаружены среди клеточных жирных кислот. Клетки также содержали олеиновую кислоту, полученную из SO. При периодическом сбраживании количество клеточного LA зависело как от начальной концентрации LA в WPM, так и от возраста культуры. Уровень клеточной LA был самым высоким при высоких начальных концентрациях LA (рис. 4).

Рисунок 4. Клеточная LA (открытые символы) и CLA (закрытые символы) при периодическом сбраживании P. freudenreichii ssp. shermanii JS в WPM с добавлением SO при начальных концентрациях LA в 600 (▲), 1 400 (■) и 2 000 (●) мкг•мл^–1.

В каждой культуре клеточная LA значительно снижалась по мере прогрессирования ферментации. С другой стороны, количество клеточной CLA, составляющее менее 1,7% от общего количества образовавшейся CLA, не зависело от исходной концентрации LA и лишь незначительно зависело от возраста культуры.. При периодической ферментации с подпиткой образцы клеток, взятые сразу после добавления LA, содержали как LA, так и CLA (3–5 и 1 мг на г сухой массы клеток соответственно). Это позволяет предположить, что изомеризация LA началась очень быстро, когда клетки вступили в контакт с LA.

Интересно, что добавление к WPM LA и SO при периодической ферментации не вызывало какого-либо существенного увеличения общего содержания жирных кислот в клетках. В присутствии LA и SO содержание жирных кислот в клетках варьировалось от 39 до 50 мг•г^–1, а в обычном WPM это значение составляло 44 мг•г^–1. Это указывает на то, что клеточные жирные кислоты, характерные для этого организма, были частично заменены внешними LA, CLA и олеиновой кислотой.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS эффективно преобразовывала LA в CLA в процессе периодического культивирования с контролем pH. По мере преобразования соотношение LA:SO также изменялось по сравнению с оптимальным, поэтому скорость роста и скорость производства CLA одновременно снижались в процессе культивирования. Однако это не повлияло на выход CLA, когда начальная концентрация LA находилась в диапазоне от 600 до 2000 мкг•мл^-1. Это отличается от предыдущих культивирований без контроля рН. Например, при начальной концентрации LA 1000 мкг•мл^-1 конечный pH составлял 4,8, а выход CLA - 57 % [125]. Снижение рН могло неблагоприятно повлиять не только на активность фермента, но и, вероятно, на состояние дисперсии смеси LA-SO в WPM. Kepler and Tove [115] показали, что оптимальный рН для линолевой изомеразы B. fibrisolvens составляет 7.0-7.2, хотя диапазон рН для активности фермента широк - от 5.5 до 8.5, что подтвердили Kim et al. [117]. По данным Pariza and Yang [123], оптимальный диапазон рН для образования CLA в суспензии клеток Lactobacillus reuteri составляет 7.4-8.8, хотя превращение все еще происходит при рН 5.5. Эта информация вместе с настоящими данными позволяет предположить, что снижение pH уменьшает выход CLA. Снижение выхода, вероятно, более заметно при высоких исходных концентрациях LA, поскольку при достижении pH, препятствующего конверсии, значительная часть LA может оставаться неконвертированной.

Значительные количества CLA также образовывались при периодической ферментации с подпиткой. Высокая плотность клеток при добавлении LA обеспечивала высокие объемные скорости производства и выходы в течение относительно короткого периода реакции. Реакция конверсии начиналась сразу же, когда клетки вступали в контакт с LA. Однако, сравнивая удельную производительность периодической и периодической ферментации с подпиткой, становится очевидным, что активно растущие культуры были значительно более эффективными, чем культуры, приближающиеся к стационарной фазе. Периодическая ферментация с подпиткой с использованием настоящего штамма Propionibacterium и более ранние наблюдения Паризы и Янга [123] и Огавы с соавт. [122] подтверждают точку зрения, что наличие активного фермента LA-изомеразы даже в нерастущих клетках может быть общим свойством широкого спектра бактерий.

Физиологическая основа изомеризации LA пропионибактериями неизвестна. Было высказано предположение, что реакция изомеризации инициирует серию биогидрирований для акцепции метаболического водорода в B. fibrisolvens [124]. Однако в настоящем организме такая последовательность восстановительных реакций не происходила, поскольку образовавшийся цис-9,транс-11-изомер CLA не превращался далее в другие жирные кислоты. Вместо этого детоксикация LA путем преобразования в CLA, как предложено Jiang et al. [113] является более вероятной физиологической ролью изомеризации в настоящем организме. Цзян и др. [113] наблюдали положительную корреляцию между образованием CLA и способностью толерантности к LA среди трех CLA-образующих штаммов пропионибактерий. Другие исследования показали, что способность переносить LA зависит от плотности клеток и фазы роста. Ким и др. [117] показали, что инокулят B. fibrisolvens A38 ингибировался уже при уровне LA 4 мкг•мл^–1, но растущие культуры переносили десятикратные концентрации LA. Эти фрагменты информации вместе с имеющимися данными свидетельствуют в пользу механизма детоксикации.

ВЫВОДЫ

В заключение следует отметить, что как активно растущие, так и находящиеся в стационарной фазе культуры P. freudenreichii ssp. shermanii JS способны конвертировать LA в CLA с высокой эффективностью. Однако скорость производства в расчете на клетку была значительно выше в растущих культурах. При ферментации по принципу «fed-batch», когда реакция конверсии происходила после экспоненциального роста, высокие начальные показатели продукции быстро снижались со временем. Эта реакция изомеризации может быть системой детоксикации LA в исследуемом штамме пропионибактерий.

Дополнительная информация:

• Конъюгированная линолевая кислота и ПКБ (кратко)
• Подборка ссылок на статьи о ПКБ и CLA (на англ.)
• Подборка ссылок на статьи о ПКБ на нашем сайте.

Литература (для ч.1. и ч.2)

1. Parodi PW. Conjugated linolenic acid in food. Advances in conjugated linolenic acid research. AOCS Press, Champaign, IL. 2003;2:101-21.
2. Yücel O. Determination of conjugated linoleic acid content of selected oil seeds grown in Turkey. Journal of the American Oil Chemists Society. 2005;82(12):893-7.
3. Suzuki R, Noguchi R, Ota T, Abe M, Miyashita K, Kawada T. Cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on mouse tumor and human monocytic leukemia cells. Lipids. 2001 May;36(5):477-82.
4. Bhattacharya A, Banu J, Rahman M, Causey J, Fernandes G. Biological effects of conjugated linoleic acids in health and disease. The Journal of Nutritional Biochemistry. 2006 Dec;17(12):789-810.
5. Yurawecz MP, Roach JA, Sehat N, Mossoba MM, Kramer JK, Fritsche J, et al. A new conjugated linoleic acid isomer, 7 trans, 9 cis-octadecadienoic acid, in cow milk, cheese, beef and human milk and adipose tissue. Lipids. 1998 Aug;33(8):803-9.
6. Dhiman TR, Anand GR, Satter LD, Pariza MW. Conjugated linoleic acid content of milk from cows fed different diets. Journal of Dairy Science. 1999 Oct;82(10):2146-56.
7. Sarrazin P, Mustafa AF, Chouinard PY, Raghavan G, Sotocinal S. Performance of dairy cows fed roasted sunflower seed. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2004(84):1179-85.
8. Jahreis G, Fristche J, Möckel P, Schöne F, Möller U, Steinhart H. The potential anticarcinogenic conjugated linoleic acid, cis-9,trans-11 C18:2, in milk of different species: Cow, goat, ewe, spw, mare, woman. Nutrition Research. October 1999;19(10):1541-9.
9. Ip C, Chin SF, Scimeca JA, Pariza MW. Mammary cancer prevention by conjugated dienoic derivative of linoleic acid. Cancer Research. 1991 Nov 15;51(22):6118-24.
10. Houseknecht KL, Vanden Heuvel JP, Moya-Camarena SY, Portocarrero CP, Peck LW, Nickel KP, et al. Dietary conjugated linoleic acid normalizes impaired glucose tolerance in the Zucker diabetic fatty fa/fa rat. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1998 Mar 27;244(3):678-82.
11. Hayek MG, Han SN, Wu D, Watkins BA, Meydani M, Dorsey JL, et al. Dietary conjugated linoleic acid influences the immune response of young and old C57BL/6NCrlBR mice. Journal of Nutrition. 1999 Jan;129(1):32-8.
12. Chouinard PY, Corneau L, Barbano DM, Metzger LE, Bauman DE. Conjugated linoleic acids alter milk fatty acid composition and inhibit milk fat secretion in dairy cows. Journal of Nutrition. 1999 Aug;129(8):1579-84.
13. Kelly GS. Conjugated linoleic acid: a review. Alternative Medicine Reviews. 2001 Aug;6(4):367-82.
14. Ip MM, Masso-Welch PA, Shoemaker SF, Shea-Eaton WK, Ip C. Conjugated linoleic acid inhibits proliferation and induces apoptosis of normal rat mammary epithelial cells in primary culture. Experimental Cell Research. 1999 Jul 10;250(1):22-34.
15. MacDonald HB. Conjugated linoleic acid and disease prevention: a review of current knowledge. Journal of American College of Nutrition. 2000 Apr;19 (2 Suppl):111S-8S.
16. Igarashi M, Miyazawa T. Newly recognized cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on cultured human tumor cells. Cancer Letters. 2000 Feb 1;148(2):173-9.
17. Harfoot CG, Hazlewood GP. Lipid metabolism in the rumen. In the rumen microbial ecosystem Elsevier Science Publishers, London, UK. 1988:285-322.
18. Kepler CR, Hirons KP, McNeill JJ, Tove SB. Intermediates and products of the biohydrogenation of linoleic acid by Butyrinvibrio fibrisolvens. The Journal of Biological Chemistry. 1966 Mar 25;241(6):1350-4.
19. Kim YJ, Liu RH, Bond DR, Russell JB. Effect of linoleic acid concentration on conjugated linoleic acid production by Butyrivibrio fibrisolvens A38. Applied and Environmental Microbiology. 2000 Dec;66(12):5226-30.
20. Kishino S, Ogawa J, Ando A, Omura Y, Shimizu S. Ricinoleic acid and castor oil as substrates for conjugated linoleic acid production by washed cells of Lactobacillus plantarum. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 2002 Oct;66(10):2283-6.
21. Kishino S, Ogawa J, Ando A, Shimizu S. Conjugated α-linolenic acidproduction from α- linolenic acid by Lactbacillus plantarum AKU1009a. European Journal of Lipid Science and Technology. 2003(105):572–7.
22. Akraim F, Nicot MC, Juaneda P, Enjalbert F. Conjugated linolenic acid (CLnA), conjugated linoleic acid (CLA) and other biohydrogenation intermediates in plasma and milk fat of cows fed raw or extruded linseed. Animal. 2007 Jul;1(6):835-43.
23. Loor JJ, Lin X, Herbein JH. Dietary trans-vaccenic acid (trans11-18:1) increases concentration of cis9,transll-conjugated linoleic acid (rumenic acid) in tissues of lactating mice and suckling pups. Reproduction Nutrition Development. 2002 Mar- Apr;42(2):85-99.
24. Kemp P, Lander DJ. Hydrogenation in vitro of alpha linolenic acid to stearic acid by mixed cultures of pure strains of rumen bacteria. Journal of General Microbiology. 1984(130):527-33.
25. Griinari JM, Corl BA, Lacy SH, Chouinard PY, Nurmela KV, Bauman DE. Conjugated linoleic acid is synthesized endogenously in lactating dairy cows by Delta(9)- desaturase. Journal of Nutrition. 2000 Sep;130(9):2285-91.
26. Lock AL, Garnsworthy PC. Independent effects of dietary linoleic and linolenic fatty acids on the conjugated linoleic acid content of cows milk. Animal Science. 2002(74):163-76.
27. Dhiman TR, Nam SH, Ure AL. Factors affecting conjugated linoleic acid content in milk and meat. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2005;45(6):463-82.
28. Jiang J, Bjorck L, Fondén R. Conjugated linoleic acid in Swedish dairy products with special reference to the manufacture of hard cheeses. International Dairy Journal. 1997;(241):863-7.
29. Schmid A, Collomb M, Sieber R, Bee G. Conjugated linoleic acid in meat and meat products: A review. Meat Science. 2006 May;73(1):29-41.
30. Chin SF, Liu W, Storkson JM, Ha YL, Pariza MW. Dietary sources of conjugated dienoic isomers of linoleic acid, a newly recognized class of anticarcinogens. Journal of Food Composition and Analysis. 1992;5(3):185-97.
31. Parodi PW. Conjugated octadecadienoic acids of milk fat. Journal of Dairy Science. 1977(60):1550-3.
32. Luna P, Fontecha J, Juarez M, Angel de la Fuente M. Changes in the milk and cheese fat composition of ewes fed commercial supplements containing linseed with special reference to the CLA content and isomer composition. Lipids. 2005 May;40(5):445-54.
33. Khanal RC, Olson KC. Factors affecting conjugated linoleic acid(CLA) content in milk, meat and egg: A review. Pakistan Journal of Nutrition. 2004(3):82-98.
34. Destaillats F, Trottier JP, Galvez JM, Angers P. Analysis of alpha-linolenic acid biohydrogenation intermediates in milk fat with emphasis on conjugated linolenic acids. Journal of Dairy Science. 2005 Sep;88(9):3231-9.
35. Corl BA, Barbano DM, Bauman DE, Ip C. cis-9, trans-11 CLA derived endogenously from trans-11 18:1 reduces cancer risk in rats. Journal of Nutrition. 2003 Sep;133(9):2893- 900.
36. Adlof RO, Duval S, Emken EA. Biosynthesis of conjugated linoleic acid in humans. Lipids. 2000 Feb;35(2):131-5.
37. Ross GR, Van Nieuwenhove CP, Gonzalez SN. Fatty Acid Profile of Pig Meat after Probiotic Administration. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2012 Apr 16.
38. Fritsche J, Steinhart H. Amounts of conjugated linoleic acid (CLA) in German foods and evaluation of daily intake. European Food Research and Technology. 1998;206(2):77-82.
39. Schoos V, Medina M, Saad S, Van Nieuwenhove CP. Chemical and microbiological characteristics of Llama's (Lama glama) milk from Argentina. Milchwissenschaft. 2008;63(4):398-401.
40. Plourde M, Destaillats F, Chouinard PY, Angers P. Conjugated alpha-linolenic acid isomers in bovine milk and muscle. Journal of Dairy Science. 2007 Nov;90(11):5269-75.
41. Kohno H, Suzuki R, Noguchi R, Hosokawa M, Miyashita K, Tanaka T. Dietary conjugated linolenic acid inhibits azoxymethane-induced colonic aberrant crypt foci in rats. Japanese Journal of Cancer Research. 2002 Feb;93(2):133-42.
42. Lee KN, Kritchevsky D, Pariza MW. Conjugated linoleic acid and atherosclerosis in rabbits. Atherosclerosis. 1994 Jul;108(1):19-25.
43. Ip C, Carter CA, Ip MM. Requirements of essencial fatty acid for mammary tumorigenesis in the rat. Cancer Research. 1985(45):1997-2001.
44. Park HS, Ryu JH, Ha YL, Park JH. Dietary conjugated linoleic acid (CLA) induces apoptosis of colonic mucosa in 1,2-dimethylhydrazine-treated rats: a possible mechanism of the anticarcinogenic effect by CLA. British of Journal Nutrition. 2001 Nov;86(5):549-55.
45. Van Wijlen RPJ, Colombani PC. Grass-based ruminant production methods and human bioconversion of vaccenic acid with estimations of maximal dietary intake of conjugated linoleic acids. International Dairy Journal. 2010(20):433-48.
46. Whigham LD, Watras AC, Schoeller DA. Efficacy of conjugated linoleic acid for reducing fat mass: a meta-analysis in humans. Am J Clin Nutr. 2007 May;85(5):1203-11.
47. Ha YL, Grimm NK, Pariza MW. Newly recognized anticarcinogenic fatty acids: Identification and quantification in natural and processed cheeses. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1989;37(1):75-81.
48. Mullen A, Moloney F, Nugent AP, Doyle L, Cashman KD, Roche HM. Conjugated linoleic acid supplementation reduces peripheral blood mononuclear cell interleukin-2 production in healthy middle-aged males. The Journal of Nutritional Biochemistry. 2007 Oct;18(10):658-66.
49. Moloney F, Yeow TP, Mullen A, Nolan JJ, Roche HM. Conjugated linoleic acid supplementation, insulin sensitivity, and lipoprotein metabolism in patients with type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 2004 Oct;80(4):887-95.
50. Smedman A, Vessby B. Conjugated linoleic acid supplementation in humans--metabolic effects. Lipids. 2001 Aug;36(8):773-81.
51. Wang Y, Jones PJ. Dietary conjugated linoleic acid and body composition. Am J Clin Nutr. 2004 Jun;79(6 Suppl):1153S-8S.
52. Kim YJ, Liu RH. Increase of conjugated linoleic acid content in milk by fermentation with lactic acid bacteria. Journal of Food Science. 2002;67(5):1731-7.
53. Van Nieuwenhove CP, Oliszewski R, Gonzalez SN, Perez Chaia AB. Conjugated linoleic acid conversion by dairy bacteria cultured in MRS broth and buffalo milk. Lett Appl Microbiol. 2007 May;44(5):467-74.
54. Chung SH, Kim IH, Park HG, Kang HS, Yoon CS, Jeong HY, et al. Synthesis of conjugated linoleic acid by human-derived Bifidobacterium breve LMC 017: utilization as a functional starter culture for milk fermentation. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2008 May 14;56(9):3311-6.
55. Gorissen L, Raes K, Weckx S, Dannenberger D, Leroy F, De Vuyst L, et al. Production of conjugated linoleic acid and conjugated linolenic acid isomers by Bifidobacterium species. Applied Microbiology and Biotechnology. 2010 Aug;87(6):2257-66.
56. Gorissen L, Leroy F, Raes K, De Vuyst L, De Smet S. Conjugated linoleic acid and conjugated linolenic acid production by bifidobacteria. Communications in Agriculture and Applied Biological Sciences. 2011;76(1):7-10.
57. Coakley M, Ross RP, Nordgren M, Fitzgerald G, Devery R, Stanton C. Conjugated linoleic acid biosynthesis by human-derived Bifidobacterium species. Journal of Applied Microbiology. 2003;94(1):138-45.
58. Jiang J, Bjorck L, Fonden R. Production of conjugated linoleic acid by dairy starter cultures. Journal of Applied Microbiology. 1998 Jul;85(1):95-102.
59. Ogawa J, Matsumura K, Kishino S, Omura Y, Shimizu S. Conjugated linoleic acid accumulation via 10-hydroxy-12-octadecaenoic acid during microaerobic transformation of linoleic acid by Lactobacillus acidophilus. Applied and Environmental Microbiology. 2001 Mar;67(3):1246-52.
60. Lin TY, Hung TH, Cheng TSJ. Conjugated linoleic acid production by immobilized cells of Lactobacillus acidophilus. Food Chemistry. 2005;(92):23-8.
61. Kishino S, Ogawa J, Omura Y, Matsumura K, Shimizu S. Conjugated linoleic acid production from linoleic acid by lactic acid bacteria. JAOCS, Journal of the American Oil Chemists' Society. 2002;79(2):159-63.
62. Lin TY, Lin CW, Wang YJ. Production of conjugated linoleic acid by enzyme extract of Lactobacillus acidophilus CCRC 14079. Food Chemistry. 2003;83:27-31.
63. Bauman DE, Baumgard LH, Corl BA, Griinari JM. Biosynthesis of conjugated linoleic acid in ruminants. Proceedings of the American Scociety of Animal Science. 1999.
64. McIntosh FM, Shingfield KJ, Devillard E, Russell WR, Wallace RJ. Mechanism of conjugated linoleic acid and vaccenic acid formation in human faecal suspensions and pure cultures of intestinal bacteria. Microbiology. 2009;155(1):285-94.
65. Xu S, Boylston T, Glatz B. Effect of lipid source on probiotic bacteria and conjugated linoleic acid formation in milk model systems. Journal of the American Oil Chemists Society. 2004(81):589-95.
66. Lee HY, Park JH, Seok SH, Baek MW, Kim DJ, Lee KE, et al. Human originated bacteria, Lactobacillus rhamnosus PL60, produce conjugated linoleic acid and show anti-obesity effects in diet-induced obese mice. Biochimica et Biophysica Acta. 2006 Jul;1761(7):736- 44.
67. Xu H, Lee HY, Hwang B, Nam JH, Kang HY, Ahn J. Kinetics of microbial hydrogenation of free linoleic acid to conjugated linoleic acids. J Appl Microbiol. 2008 Dec;105(6):2239-47.
68. Rodríguez-Alcalá LM, Braga T, Xavier Malcata F, Gomes A, Fontecha J. Quantitative and qualitative determination of CLA produced by Bifidobacterium and lactic acid bacteria by combining spectrophotometric and Ag +-HPLC techniques. Food Chemistry. 2011;125(4):1373-8.
69. [69]  Gorissen L, Weckx S, Vlaeminck B, Raes K, De Vuyst L, De Smet S, et al. Linoleate isomerase activity occurs in lactic acid bacteria strains and is affected by pH and temperature. Journal of Applied Microbiology. 2011 Sep;111(3):593-606.
70. Rainio A, Vahvaselka M, Laakso S. Cell-adhered conjugated linoleic acid regulates isomerization of linoleic acid by resting cells of Propionibacterium freudenreichii. Applied Microbiology and Biotechnology. 2002 Dec;60(4):481-4.
71. Rainio A, Vahvaselkä M, Suomalainen T, Laakso S. Production of conjugated linoleic acid by Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii. Lait. 2002;82(1):91-101.
72. Lin TY, Lin CW, Wang YJ. Linoleic Acid Isomerase Activity in Enzyme Extracts from Lactobacillus acidophilus and Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Journal of Food Science. 2002;(67):1502–5.
73. Wallace RJ, Chaudhary LC, McKain N, McEwen BS, Richardson AJ, Vercoe PE, et al. Clostridium proteoclasticum: A ruminal bacterium taht forms stearic acid from linoleic acid. FEMS Microbiology Letters. 2006;265:195-201.
74. Hennessy AA, Barrett E, Paul Ross R, Fitzgerald GF, Devery R, Stanton C. The production of conjugated alpha-linolenic, gamma-linolenic and stearidonic acids by strains of bifidobacteria and propionibacteria. Lipids. 2012 Mar;47(3):313-27.
75. Favier CF, Vaughan EE, De Vos WM, Akkermans AD. Molecular monitoring of succession of bacterial communities in human neonates. Appl Environ Microbiol. 2002 Jan;68(1):219-26.
76. Picard C, Fioramonti J, Francois A, Robinson T, Neant F, Matuchansky C. Review article: bifidobacteria as probiotic agents -- physiological effects and clinical benefits. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 2005 Sep 15;22(6):495-512.
77. Saarela M, Virkajärvi I, Alakomi H-L, Sigvart-Mattila P, Mättö J. Stability and functionality of freeze-dried probiotic Bifidobacterium cells during storage in juice and milk. International Dairy Journal. [doi: 10.1016/j.idairyj.2005.12.007. 2006;16(12):1477-82.
78. Vinderola G, de los Reyes-Gavilán C, Reinheimer J. Probiotics and prebiotics in fermented dairy products. In Contemporary Food Engineering. 2009:601-34
79. Vinderola G, Binetti A, Burns P, Reinheimer J. Cell viability and functionality of probiotic bacteria in dairy products. Frontiers in Microbiology. 2011;2:70.
80. Oh DK, Hong GH, Lee Y, Min S, Sin HS, Cho SK. Production of conjugated linoleic acid by isolated Bifidobacterium strains. World J Microbiol Biotechnol. 2003(19):907-12.
81. Park HG, Cho SD, Kim JH, Lee H, Chung SH, Kim SB, et al. Characterization of conjugated linoleic acid production by Bifidobacterium breve LMC 520. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2009 Aug 26;57(16):7571-5.
82. Choi NJ, Park HG, Kim YJ, Kim IH, Kang HS, Yoon CS, et al. Utilization of monolinolein as a substrate for conjugated linoleic acid production by Bifidobacterium breve LMC 520 of human neonatal origin. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2008 Nov 26;56(22):10908-12.
83. Van Nieuwenhove CP, Gauffin Cano P, Pérez-Chaia AB, González SN. Effect of functional buffalo cheese on fatty acid profile and oxidative status of liver and intestine of mice. Journal of Medicinal Food. 2011 Apr;14(4):420-7.
84. Puniya AK, Chaitanya S, Tyagi AK, De S, Singh K. Conjugated linoleic acid producing potential of lactobacilli isolated from the rumen of cattle. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2008 Nov;35(11):1223-8.
85. Park SJ, Park KA, Park CW, Park WS, Kim JO, Ha YL. Purification and aminoacids sequence of the linoleate isomerase from Butyrivbrio fibrisolvens A-38 Journal of Food Science and Nutrition. 1996;1:244-51.
86. Irmak S, Dunford NT, Gilliland SE, Banskalieva V, Eisenmenger M. Biocatalysis of linoleic acid to conjugated linoleic acid. Lipids. 2006 Aug;41(8):771-6.
87. Deng MD, Grund AD, Schneider KJ, Langley KM, Wassink SL, Peng SS, et al. Linoleic acid isomerase from Propionibacterium acnes: purification, characterization, molecular cloning, and heterologous expression. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2007 Dec;143(3):199-211.
88. Rosson RA, Deng MD, Grund AD, Peng SS. PCT WO0100846. 2001.
89. Ross GR, Gauffin Cano P, Gusils León CH, Medina RB, González SN, Van Nieuwenhove CP. Lactic acid bacteria activities to promote health benefits. Multidisciplinary approaches on food science and nutrition for the 21st century. Research signpost ed. 2011:155-74.
90. Cho HJ, Kim WK, Jung JI, Kim EJ, Lim SS, Kwon DY, et al. Trans-10,cis-12, not cis- 9,trans-11, conjugated linoleic acid decreases ErbB3 expression in HT-29 human colon cancer cells. World Journal of Gastroenterology. 2005 Sep 7;11(33):5142-50.
91. Park Y, Albright KJ, Liu W, Storkson JM, Cook ME, Pariza MW. Effect of conjugated linoleic acid on body composition in mice. Lipids. 1997 Aug;32(8):853-8.
92. Yamasaki M, Ikeda A, Oji M, Tanaka Y, Hirao A, Kasai M, et al. Modulation of body fat and serum leptin levels by dietary conjugated linoleic acid in Sprague-Dawley rats fed various fat-level diets. Nutrition. 2003 Jan;19(1):30-5.
93. Mougios V, Matsakas A, Petridou A, Ring S, Sagredos A, Melissopoulou A, et al. Effect of supplementation with conjugated linoleic acid on human serum lipids and body fat. The Journal of Nutritional Biochemistry. 2001 Oct;12(10):585-94.
94. Thom E, Wadstein J, Gudmundsen O. Conjugated linoleic acid reduces body fat in healthy exercising humans. Journal of International Medical Research. 2001 Sep- Oct;29(5):392-6.
95. Lin TY, Lin CW, Lee CH. Conjugated Linoleic Acid Concentration as Affected by Lactic Cultures and Added Linoleic Acid. Food Chemistry. 1999;(67):1-5.
96. Shantha NC, Ram LN, O Leary J, Hicks CL, Decker EA. Conjugated linoleic acid concentrations in dairy products as affected by processing and storage. Journal of Food Science. 1995(60):695-7.
97. Colakoglu H, Gursoy O. Effect of lactic adjunct cultures on conjugated linoleic acid (CLA) concentration of yogurt drink. Journal of Food, Agriculture and Environment. 2011;9(1):60-4.
98. Lee K, Paek K, Lee HY, Park JH, Lee Y. Antiobesity effect of trans-10,cis-12-conjugated linoleic acid-producing Lactobacillus plantarum PL62 on diet-induced obese mice. Journal of Applied Microbiology. 2007 Oct;103(4):1140-6.
99. Wall R, Ross RP, Shanahan F, O'Mahony L, O'Mahony C, Coakley M, et al. Metabolic activity of the enteric microbiota influences the fatty acid composition of murine and porcine liver and adipose tissues. American Journal of Clinical Nutrition. 2009 May;89(5):1393-401.
100. Edionwe AO, Kies C. Comparison of palm and mixtures of refined palm and soybean oils on serum lipids and fecal fat and fatty acid excretions of adult humans. Plant Foods for Human Nutrition. 2001;56(2):157-65.
101. Fukuda S, Suzuki Y, Murai M, Asanuma N, Hino T. Isolation of a novel strain of Butyrivibrio fibrisolvens that isomerizes linoleic acid to conjugated linoleic acid without hydrogenation, and its utilization as a probiotic for animals. Journal of Applied Microbiology. 2006 Apr;100(4):787-94.
102. Ewaschuk JB, Walker JW, Diaz H, Madsen KL. Bioproduction of conjugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice. Journal of Nutrition. 2006 Jun;136(6):1483-7.
103. Rosberg-Cody E, Stanton C, O'Mahony L, Wall R, Shanahan F, Quigley EM, et al. Recombinant lactobacilli expressing linoleic acid isomerase can modulate the fatty acid composition of host adipose tissue in mice. Microbiology. 2011 Feb;157(Pt 2):609-15.
104. Lee K, Lee Y. Production of c9, t11- and t10, c12- conjugated linoleic acids in humans by Lactobacillus rhamnosus PL60. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2009 Oct;19(12):1617-9.
105. Fritsche J, Steinhart H. Analysis, occurence and physiological properties of trans fatty acids(TFA) with particular emphasis on conjugated linoleic acid isomers (CLA). A review. Fet/Lipid. 1998(100):190-210.
106. Raes K, Balcaen A, Claeys E, De Smet S, Demeyer D. Effect of duration of feeding diets rich in n-3 PUFA to Belgian Blue double-muscled young bulls, on the incorporation of long-chain n-3 and n-6 PUFA in the phospholipids and triglycerides of the longissimus thoracis. Proceedings of the 48th ICoMST. Rome, Italy. 2002;2:724-5.
107. Gultemiriam L, Van Nieuwenhove CP, Pérez Chaia A, Apella MC. Physical and chemical characterization of eggs from Araucana hens of free range fed in Argentina. Journal of the Argentine Chemical Society. 2009;97(2):19-30.
108. Park Y, Storkson JM, Albright KJ, Liu W, Pariza MW. Evidence that the trans-10,cis-12 isomer of conjugated linoleic acid induces body composition changes in mice. Lipids. 1999 Mar;34(3):235-41.
109. Berven G., Bye A., Hals O., Blankson H., Fagertun H., Thom E., Wadstein J., Gudmundsen O., Safety of conjugated linoleic acid (CLA) in overweight or obese human volunteers, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 102 (2000) 455–462.
110. Gnädig S., Rickert R., Sébédio J.L., Steinhart H., Conjugated linoleic acid (CLA): physiological effects and production, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103 (2001) 56–61.
111. Ip C., Chin S.F., Scimeca J.A., Pariza M.W., Mammary cancer prevention by conjugated dienoic derivative of linoleic acid, Cancer Res. 51 (1991) 6118–6124.
112. Jahreis G., Kraft J., Tischendorf F., Schöne F., von Loeffelholz C., Conjugated linoleic acids: Physiological effects in animal and man with special regard to body composition, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 102 (2000) 695–703.
113. Jiang J., Björck L., Fondén R., Production of conjugated linoleic acid by dairy starter cultures, J. Appl. Microbiol. 85 (1998) 95–102.
114. Kelley D.S., Taylor P.C., Rudolph I.L., Benito P., Nelson G.J., Mackey B.E., Erickson K.L., Dietary conjugated linoleic acid did not alter immune status in young healthy women, Lipids 35 (2000) 1065–1071.
115. Kepler C.R., Tove S.B., Biohydrogenation of unsaturated fatty acids, III. Purification and properties of a linoleate D12-cis, D11-trans-isomerase from Butyrivibrio fibrisolvens, J. Biol. Chem. 242 (1967) 5686–5692.
116. Kepler C.R., Hirons K.P., McNeill J.J., Tove S.B., Intermediates and products of the biohydrogenation of linoleic acid by Butyrivibrio fibrisolvens, J. Biol. Chem. 241 (1966) 1350–1354.
117. Kim Y.J., Liu R.H., Bond D.R., Russell J.B., Effect of linoleic acid concentration on conjugated linoleic acid production by Butyrivibrio fibrisolvens A38, Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000) 5226–5230.
118. Kritchevsky D., Antimutagenic and some other effects of conjugated linoleic acid, Br. J. Nutr. 83 (2000) 459–465.
119. Lee K.N., Kritchevsky D., Pariza M.W., Conjugated linoleic acid and atherosclerosis in rabbits, Atherosclerosis 108 (1994) 19–25.
120. Lin T.Y., Conjugated linoleic acid concentrations as affected by lactic cultures and additives, Food Chem. 69 (2000) 27–31.
121. Lin T.Y., Lin C-W., Lee C-H., Conjugated linoleic acid concentration as affected by lactic cultures and added linoleic acid, Food Chem. 67 (1999) 1–5.
122. Ogawa J., Matsumura K., Kishino S., Omura Y., Shimizu S., Conjugated linoleic acid accumulation via 10-hydroxy-12-octadecaenoic acid during microaerobic transformation of linoleic acid by Lactobacillus acidophilus, Appl. Environ. Microbiol. 67 (2001) 1246–1252.
123. Pariza M.W., Yang X.-Y., Method for producing conjugated fatty acids, United States Patent 5.856.149 (1999).
124. Polan C.E., McNeill J.J., Tove S.B., Biohydrogenation of unsaturated fatty acids by rumen bacteria, J. Bacteriol. 88 (1964) 1056–1064.
125. Rainio A., Vahvaselkä M., Suomalainen T., Laakso S., Reduction of linoleic acid inhibition in production of conjugated linoleic acid by Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii, Can. J. Microbiol. 47 (2001) 735–740.
126. Suomalainen T.H., Mäyrä-Mäkinen A.M., Propionic acid bacteria as protective cultures in fermented milks and breads, Lait 79 (1999) 165–174.
127. Suutari M., Liukkonen K., Laakso S., Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty acids, J. Gen. Microbiol. 136 (1990) 1469–1474.
128. Verhulst A., Janssen G., Parmentier G., Eyssen H., Isomerization of polyunsaturated long chain fatty acids by Propionibacteria, System. Appl. Microbiol. 9 (1987) 12–15.
129. Devillard E, McIntosh FM, Duncan SH, Wallace RJ. Metabolism of linoleic acid by human gut bacteria: different routes for biosynthesis of conjugated linoleic acid. J Bacteriol. 2007 Mar;189(6):2566-70.