ООО "ПРОПИОНИКС"
пн-пт с 09:00 до 18:00 | +7 (966) 348-80-35 |
Конъюгированные линолевые кислоты (CLA) представляют собой семейство изомеров линолевой кислоты, в молекулах которых две двойные связи «углерод-углерод» (C = C) конъюгированы (т.е. разделены одинарной связью). Иными словами, CLA - это общий термин, используемый для обозначения геометрических (т.е. цис- или транс-) и позиционных изомеров линолевой кислоты с двумя сопряженными двойными связями в положениях углерода от 6-8 до 13-15.
Цис-транс-изомерия CLA: Как известно, геометрические изомеры, отличаются друг от друга пространственным расположением заместителей относительно плоскости двойной связи (заместитель - любой атом или группа атомов, которые замещают в исходном соединении атом водорода – ред.). Если заместители расположены по одну сторону от плоскости двойной связи, такой изомер обозначают как цис-, если они расположены по разные стороны от плоскости двойной связи, то это транс-изомер. И здесь стоит особо отметить, что конъюгированная линолевая кислота является одновременно транс-жирной кислотой и цис-жирной кислотой. Цис-связь вызывает более низкую температуру плавления и, предположительно, наблюдаемые полезные эффекты для здоровья.
Рис. 1. Структура линолевой кислоты и двух ее основных конъюгированных производных. Конъюгированные линолевые кислоты (CLA) обычно вырабатывается симбиотическими бактериями в желудке (рубце) жвачных животных. Таким образом, CLA содержится в основном в мясе и молочных продуктах, полученных от жвачных. Преобладающим изомером в пищевых источниках является цис-9, транс-11-CLA (c9, t11-CLA) (пункт 2 рисунка), который составляет до ~ 90% от общего количества CLA. Транс-10, цис-12-CLA (t10, c12-CLA) (пункт 3) - еще один распространенный изомер, составляющий 1-10% от общего количества CLA в пищевых источниках.
Рис. 2. Альтернативное изображение структур линолевой кислоты и двух ее основных конъюгированных производных (дополнение к рис. 1)
На протяжении многих лет CLA привлекала большое внимание благодаря своим полезным свойствам для здоровья. Существует около 28 различных изомеров CLA, полученных природным и промышленным способом при гидрировании жирных кислот [4], но наиболее важными по биологическому действию являются формы c9,t11 и t10,c12. Однако изомерами CLA в молочном жире по важности являются c9,t11 (около 80%), за которыми следует t7,c9, который количественно является вторым по значимости и достигает уровня от 3 до 16% от общего количества CLA [5]. Широко сообщалось о факторах, влияющих на содержание CLA в молоке, таких как питание жвачных животных [6-7], тип выращивания животных и стадия лактации [8]. Многие исследования продемонстрировали действие CLA как антиканцерогенного [9], антидиабетического [10] и иммуномодулирующего [11] соединения. Хотя нет единого мнения относительно его роли в жировом обмене, некоторые авторы обнаружили, что его потребление также уменьшает отложение жира [12].
Хотя пища от жвачных (с 2-камерным желудком) животных является самым богатым источником CLA для человека, она также содержится в продуктах животного происхождения с однокамерным желудком, таких как свинина [37], курица [30], индейка [30], рыба и мясо кролика [38], но в гораздо меньших количествах. У южноамериканских верблюдовых CLA определяли в молоке ламы (Lama glama) [39]. Растительные масла содержат мало CLA, и, по мнению некоторых авторов, содержание CLA в растительных маслах не обнаружено. Типичные значения CLA в продуктах от нежвачных животных приведены в таблице 1.
Таблица 1. Содержание CLA в продуктах от нежвачных животных
Продукт
|
Общее содержание CLA
(мг/100 г жира)
|
Автор
исследования
|
Мясо
Индейка
Рыба
Свинья
Кролик
Курица
|
0.25
0.01-0.09
0.3-0.9
0.11
0.09-0.2
|
Chin et al. [30]
Fristche and Steinhart [105]
Ross et al.[ 37]
Fristche and Steinhart [105]
Chin et al. [30]
|
Яичный желток
|
N.D
N.D
|
Raes et al. [106]
Gultemiriam et al. [107]
|
Молоко
Человек
Лошадь
Сеять
Лама (Lama glama)
|
0.1
0.05-0.12
0.19-0.27
0.7
|
Park et al. [108]
Jahreis et al. [8]
Jahreis et al. [8]
Schoos et al. [39]
|
Растительные масла
|
<0.01
|
Fristche and Steinhart [105]
|
ND: не определено
Рекомендуемая для потребления человеком концентрация CLA
Концентрация CLA в молочных продуктах широко варьируется в соответствии с представленными данными (0,55–9,12 мг/г жира), но даже при этом ниже, чем требуется для достижения биологического эффекта у человека. Биологические свойства после введения CLA зависят от изомера, вводимых доз и периода исследования. Так, в исследованиях на животных моделях сообщалось о противоатеросклеротическом эффекте после приема кроликам 0,1-1% CLA в день [42]. Более того, антиканцерогенный эффект был определен авторами с использованием уровней от 0,5% до 4% в рационе [43-44].
Хотя механизм действия до конца не изучен, сообщалось, что CLA является антиоксидантным соединением у животных и на моделях in vitro [15]. Точно так же, как в экспериментальных моделях существуют различия в эффективных дозах CLA, в зависимости от модели на животных и оцениваемого биологического эффекта, рекомендуемая суточная доза для человека также сильно варьируется. В целом, путем экстраполяции результатов, полученных на животных, рекомендуемая суточная доза CLA составляет около 0,35-1 г/сут [15]. Некоторые авторы оценивали суточную дозу в 650 мг [45], но в других исследованиях считалось, что более высоких доз (от 3,0 до 4,2 г/сут) достаточно для снижения жировой массы тела [46-47]. Однако в настоящее время реальное потребление CLA в разных странах ниже рекомендуемой дозы.
Производство CLA бактериями
Исследованиям, касающимся увеличения содержания CLA в пищевых продуктах, уделяется большое внимание, поскольку включение бактерий повышает уровень CLA в некоторых кисломолочных продуктах или может генерировать CLA на уровне кишечника после введения пробиотиков. Таким образом, исследования бактериальной продукции CLA актуальны…
Руминальный анаэроб (т.е. содержащийся в рубце жвачных) Butyrivibrio fibrisolvens был первой бактерией, у которой было обнаружено производство CLA [18]. Спустя годы выяснилось, что не только бактерии рубца способны образовывать CLA. Так, микроорганизмы, выделенные из молочных продуктов, кишечника человека и животных, были продемонстрированы как бактерии-продуценты CLA, в том числе молочнокислые бактерии (МКБ) и бифидобактерии. В настоящее время Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum; Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus; Lactococcus Lactis, Propionibaterium freudenrehichii, Bifidobacterium sp, Streptococcus и другие способны образовывать CLA [52-54].
Пропионибактерии обычно присутствуют в молоке и молочных продуктах, а некоторые виды играют важную роль в создании сыров, таких как сыр Эмменталь. Пропионовокислые бактерии (ПКБ) представляют собой еще одну важную группу бактерий, которые за счет наличия в них фермента изомеразы линолевой кислоты (Linoleic acid isomerase (LAI)) продемонстрировали способность к изомеризации LA in vitro, что актуально, поскольку ПКБ можно включать в ферментированные продукты, такие как сыры. Так, P. freudenrehichii была способна продуцировать CLA преимущественно в форме c9, t11, согласно различным исследованиям [58, 65, 70-71, 129-130], хотя другой автор сообщил о восьми различных изомерах CLA, продуцируемых ферментным экстрактом у этой бактерии [72].
Рис. 3. Сравнение структуры (А) линолевой кислоты (цис-9, цис-12 18:2) и (В) цис-9, транс-11 конъюгированной линолевой кислоты.
Прим. ред.: Есть ряд интересных работ по изучению активности изомеразы линолевой кислоты (LAI) в ПКБ. Например, активность LAI в P. freudenrehichii изучалась в работе Lin, T.Y, et al. / Linoleic acid Isomerase Activity in Enzyme Extracts from Lactobacillus Acidophilus and Propionibacterium Freudenreichii ssp. Shermanii / Journal of Food Science, (2002) 67: 1502-1505. В 2004 г. в работе тайваньских ученых также была продемонстрирована LA-изомеразная активность молочных ПКБ. Так производство CLA в модели жирного молока с добавлением гидролизованного соевого масла в течение 24–48 часов было продемонстрировано у двух P. freudenreichii ssp shermanii и P. freudenreichii ssp freudenreichii [65]. Более высокие уровни CLA были определены в обезжиренном молоке, чем в бульоне MRS.
Также была доказана способность и кожных ПКБ (P. acnes), выделенных от овец, образовывать CLA, однако только в форме t10, c12-изомера [73]. (см. рис. 4).
Рис. 4. Изомеризация линолевой кислоты бактерией P. acnes (PAI - изомераза линолевой кислоты Propionibacterium acnes)
Аннотация.
Прим. ред.: Выше уже была кратко затронута тема LA-изомеразной активности молочных ПКБ. Здесь же приводится описание биотехнологической практики получения CLA из ПКБ). Кинетику изомеризации линолевой кислоты в конъюгированную линолевую кислоту (CLA) Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS изучали в ходе периодической ферментации с контролируемым pH и периодической ферментации с подпиткой (по т.н. принципу «fed-batch» - ред.).
При периодической ферментации с добавлением 600–2000 мкг•мл-1 линолевой кислоты скорость образования CLA была самой высокой во время экспоненциальной фазы роста. К концу периодической ферментации накапливались высокие количества CLA, соответствующие конверсии 80–87%, с исходной концентрацией линолевой кислоты до 2000 мкг•мл-1.
При периодической ферментации с подпиткой, когда в культуру добавляли 600 мкг•мл-1 линолевой кислоты после экспоненциального роста, происходил быстрый, но короткий период конверсии. Таким образом, как активно растущие, так и нерастущие культуры смогли эффективно формировать CLA. Однако скорость продукции на клетку была значительно выше в растущих культурах. Эта реакция изомеризации может быть системой детоксикации линолевой кислоты в изученном штамме пропионибактерий.
1. ВВЕДЕНИЕ
Конъюгированная линолевая кислота (CLA) вызывает большой интерес благодаря своим потенциально полезным физиологическим эффектам и антиканцерогенным свойствам [110, 111, 118, 119]. Положительные эффекты CLA, полученные в ходе исследований на животных моделях, в настоящее время проверяются в клинических испытаниях на людях [109, 112, 114].
Коммерчески доступные продукты CLA производятся путем щелочной изомеризации растительных масел [112]. Эти синтетические смеси состоят из нескольких изомеров CLA, из которых конфигурация цис-9,транс-11 считается обладающей наибольшей биологической активностью [111]. Этот изомер был впервые обнаружен в качестве промежуточного продукта при биогидрировании линолевой кислоты (LA) рубцовой бактерией Butyrivibrio fibrisolvens [116]. Также было показано, что другие бактерии способны превращать LA в ее конъюгированную форму, включая некоторые молочнокислые бактерии и пропионибактерии, используемые в качестве молочных заквасок. В этих случаях основная часть образовавшейся CLA находилась в конфигурации цис-9, транс-11 изомера. Реакцию конверсии изучали как на растущих культурах бактерий, так и на суспензиях отмытых клеток [113, 117, 120, 121, 125, 128]. Из этих небольших исследований микробиологической изомеризации можно сделать вывод, что токсичность LA (для бактерий – ред.) и ее низкая растворимость в водных растворах могут иметь серьезные осложнения при производстве CLA. Однако обе эти проблемы можно, по крайней мере, в значительной степени преодолеть, используя системы мицеллярных субстратов, стабилизированных детергентами [125]. Путем правильной оптимизации концентраций реагентов можно использовать концентрации LA, которые в противном случае были бы смертельными для организмов, и изомеризовать их до CLA. В данном исследовании описана такая система преобразования. Используя Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS в качестве изомеризующегося организма, кинетику роста и образования CLA изучали с различными начальными концентрациями LA в периодической ферментации с контролируемым pH и периодической ферментации с подпиткой.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii штамм JS (DSM 7067) был из коллекции культур Valio Ltd. (Хельсинки, Финляндия). Инокулят выращивали на среде, описанной Суомалайненом и Мяйря-Мякинен [126] при 30 ℃ в течение 72 часов. В экспериментах по образованию CLA штамм культивировали в среде пермеата сыворотки (WPM), содержащей 2% (мас./об.) пермеата сыворотки (Valio), 1% (мас./об.) дрожжевого экстракта (LabM, Бери, Англия) и 0,5% (мас./об.) триптона (LabM) с добавлением линолевой кислоты (LA; чистота 99%, Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в диапазоне концентраций 0–2000 мкг•мл-1. В присутствии LA в ферментационную среду также добавляли моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (SO; Kotilen-O/1 VL, Chemische Fabrik Dr. W. Kolb Ag, Швейцария) в концентрации 9 или 15 мг•мл–1 (SO также известен как полисрбат-80 или добавка Е-433 – ред.). LA добавляли в среду в виде маточного раствора мицеллярной LA перед стерилизацией. Мицеллярную LA получали путем взвешивания 300 мг LA в 5 мл дезоксигенированной деионизированной воды, содержащей 0,36 мл SO. Смесь перемешивали и добавляли 0,56 мл 2 моль•л-1 раствора гидроксида натрия для осветления смеси. Раствор переносили в мерную колбу емкостью 50 мл и заливали деоксигенированной водой. Чтобы облегчить добавление самых высоких концентраций LA без чрезмерного разбавления питательной среды, также готовили концентрированные исходные растворы, сохраняя постоянным соотношение LA, SO и гидроксида натрия.
2.2. Ферментации
Ферментацию проводили в ферментере Biostat MD 2 (B. Braun, Melsungen, Germany) с рабочим объемом 2 л при 30 ℃. Показатель рН среды контролировали на уровне 6,3±0,2 с помощью 8% раствора аммиака. Инокулят составлял 2% от объема ферментации. При периодической ферментации с подпиткой культивирование состояло из фазы первичного роста, за которой следовала отдельная фаза производства. Организм выращивали до поздней экспоненциальной фазы (количество жизнеспособных микроорганизмов 2•1010 КОЕ•мл–1). При периодической ферментации А с подпиткой (FBA) среда содержала 9 мг•мл–1 SO. После фазы роста добавляли исходный запас LA до концентрации 600 мкг•мл–1. При периодической ферментации с подпиткой B (FBB) водный SO добавляли до концентрации 9 мг•мл–1 непосредственно перед добавлением исходного количества LA в поздней экспоненциальной фазе. Рост контролировали по оптической плотности (OD) при 600 нм (спектрофотометр U-2000, Hitachi, Япония) и по количеству жизнеспособных клеток. Количество жизнеспособных микроорганизмов определяли путем нанесения на натрий-лактатный агар, содержащий 1% (по массе) дрожжевого экстракта (LabM), 0,5% (по массе) триптона (LabM), 1% (по массе) b-глицерофосфата (Merck, Дармштадт, Германия), 1,7% (по объему) лактата натрия (Merck) и 1,2% (по объему) агара (LabM). Планшеты инкубировали в анаэробных условиях при 30 ℃ в течение 6-7 дней. Пробы для анализа жирных кислот и подсчета жизнеспособных микроорганизмов отбирали после инокуляции и с интервалом в 24 часа. При концентрации LA мкг•мл–1 пробы отбирали каждые два часа в течение времени ферментации от 0 до 10 часов. При концентрациях LA 930 и 1400 мкг•мл–1 пробы отбирали каждые три часа в течение времени ферментации от 13,5 до 22 ч и от 10 до 22 ч соответственно. После этого пробы отбирали с интервалом в 24 часа.
2.3. Определение содержания жирных кислот
Для определения состава жирных кислот в клеточной массе и среде образцы культуры (4-10 мл) центрифугировали при 4300 g в течение 15 мин при 15-20 ℃. Надосадочную жидкость отфильтровывали с помощью 0,2 мм фильтра и при необходимости разбавляли деионизированной водой. Гранулы клеток промывали 8 мл водопроводной воды. Образцы замораживали и лиофилизировали. Жирные кислоты определяли по методу метилирования, описанному Suutari et al [127]. Жирные кислоты омыляли 1–2 мл 3.7 моль•л–1 NaOH в 49% (по объему) метаноле при 100 ℃ в течение 30 мин. Омыленные жирные кислоты метилировали 4–8 мл 2.2 моль•л–1 HCl в 64% (по объему) метаноле при 80 ℃ в течение 10 мин. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали в 1,5 мл раствора гексана/метил-трет-бутилового эфира (1:1, по объему) при энергичном встряхивании в течение 10 мин. Органическую фазу промывали 3 мл 0.3 моль•л–1 NaOH при встряхивании в течение 5 мин. Образец высушивали безводным Na2SO4 и анализировали на газовом хроматографе (ГХ). ГХ-анализ проводили на газовом хроматографе Hewlett-Packard Model 5890A, оснащенном пламенно-ионизационным детектором, капиллярной системой впуска и высокоскоростным автоматическим пробоотборником модели 7673A со шприцем объемом 10 мл.
2.4. Расчеты
Удельную скорость роста (μ•ч–1) для культуры в экспоненциальной фазе роста рассчитывали путем деления изменения натурального логарифма значений оптической плотности на продолжительность времени наблюдения. Количество CLA, образованной бактерией, рассчитывали путем вычитания начальной концентрации CLA в ростовой среде (CLA в SO) из общего количества CLA. Выход CLA (%) определяли как [количество образовавшегося CLA (г•л–1), деленное на исходное количество LA в среде (г•л–1)] × 100%. Продуктивность ферментации выражали как объемную скорость производства CLA (VPR, мкг•мл-1•ч-1) и удельную скорость производства CLA (SPR, мкг•10-9КОЕ-1.ч-1). VPR рассчитывали путем деления количества образовавшегося CLA (мкг•мл-1) на продолжительность периода наблюдения (ч). SPR рассчитывали путем деления VPR на количество жизнеспособных клеток (КОЕ•мл-1) в конце периода наблюдения. Содержание жирных кислот в клетках (мг•г-1) рассчитывали как количество жирных кислот на сухой вес клеток. Результаты на рисунках и в таблицах представлены как средние значения ± стандартное отклонение (n = 3-4).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Ферментация периодическая
Превращение LA в CLA во время роста Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS изучали в периодической ферментации объемом 2 л и периодической ферментации с подпиткой, оборудованной контролем pH. Исходные концентрации LA в WPM колебались от 600 до 2 000 мкг•мл–1. Эффект предотвращения роста LA был преодолен путем добавления исходного раствора мицеллярной LA в WPM с добавкой SO так, чтобы окончательное соотношение LA:SO составляло 1:7.5–1:15 (по массе). Было обнаружено, что при таких соотношениях одновременный рост и превращение LA в CLA возможен без контроля pH [125].
Рисунок 1. Динамика типичной периодической ферментации P. freudenreichii ssp. shermanii JS в WPM при наличии LA и SO. Условные обозначения: ▲ формирование CLA; ∆ потребление LA; и ● жизнеспособное количество.
Таблица I. Рост и образование CLA при периодической (порционной) ферментации P. freudenreichii ssp. shermanii JS при различных исходных концентрациях LA в WPM с добавлением SO. Удельная скорость роста (μm), количество жизнеспособных клеток, количество образовавшейся CLA, объемная и удельная скорость производства CLA (VPR и SPR соответственно) являются максимальными полученными значениями. Максимальные VPR и SPR были получены в диапазоне наблюдений, указанном в скобках.
LA
(μg/mL)
|
SO
(mg/mL)
|
μm
(h–1)
|
Жизне-способное
кол-во
(log[cfu/mL])
|
CLA
(μg/mL)
|
цис-9, транс-11-изомер от общего кол-ва CLA, %
|
VPR
(μg·mL–1·h–1)
|
SPR
(mg·10–9cfu–1·h–1)
|
0
|
0
|
0.044 ± 0.007
|
10.49 ± 0.02
|
0
|
-
|
-
|
-
|
600 ± 13
|
9
|
0.034 ± 0.001
|
10.29 ± 0.02
|
490 ± 21
|
85 ± 3
|
22 ± 2
(10–25 h)
|
36 ± 4
(8–10 h)
|
930 ± 38
|
15
|
0.031 ± 0.001
|
10.19 ± 0.01
|
812 ± 7
|
93 ± 1
|
57 ± 5
(13.5–16 h)
|
76 ± 7
(13.5–16 h)
|
1 400 ± 46
|
15
|
0.022 ± 0.001
|
10.11 ± 0.01
|
1 140 ± 51
|
95 ± 1
|
34 ± 3
(13–16 h)
|
36 ± 4
(13–16 h)
|
2 000 ± 28
|
15
|
0.014 ± 0.001
|
10.04 ± 0.02
|
1 600 ± 87
|
95 ± 1
|
19 ± 2
(0–15 h)
|
51 ± 5
(0–15 h)
|
На рисунке 1. показана кинетика роста при периодической ферментации при начальном уровне LA 930 мкг•мл–1. Образование CLA хорошо коррелировало с ростом с сопутствующим снижением LA. Ферментации при различных начальных концентрациях LA показали, что увеличение начального уровня LA снижало удельную скорость роста (табл. I), а также незначительно снижало конечную плотность клеток. Несмотря на это, конечное количество CLA увеличивалось по мере увеличения начальной концентрации LA, и даже при 2000 мкг•мл–1 LA выход CLA составлял 80%. В конце ферментации в среде оставалось менее 10% исходной LA. При всех периодических ферментациях цис-9, транс-11 изомеры CLA составляли 85-95% образующейся CLA, и более 98% образующейся CLA было внеклеточным.
Объемные и удельные показатели выработки CLA были самыми высокими в течение первых 24 ч ферментации (табл. I). Однако на эти значения сильно влияла продолжительность периода наблюдения. При ферментации с соотношением LA:SO 1:15 почти 70% от общего количества CLA образовывалось в течение первых 40 часов. При начальных концентрациях LA, превышающих 930 мкг•мл–1, наблюдалась небольшая тенденция к снижению максимальных объемных показателей продукции. Однако значения удельной скорости производства указывают на то, что культуры, растущие медленнее из-за высоких начальных концентраций LA, все равно эффективно преобразовывали LA в CLA в расчете на клетку (табл. I).
Согласно представленным результатам, казалось, что большая часть CLA образовалась на ранних стадиях роста. Поэтому первые десять часов культивирования были изучены более внимательно. После инокуляции деление клеток началось немедленно (рис. 2.2), а изомеризация LA началась после первых четырех часов после инокуляции. После этого наблюдалась положительная корреляция между увеличением количества жизнеспособных клеток и количеством CLA.
3.2. Периодическая ферментация с подпиткой
Рисунок 2. Начало образования CLA при периодической ферментации P. freudenreichii ssp. shermanii JS в WPM при наличии LA и SO. Символы: ▲ формирование CLA; ∆ потребление LA; и ● жизнеспособное количество.
Рисунок 3. Рост P. freudenreichii ssp. shermanii JS при периодической ферментации в WPM. Вертикальные линии указывают время добавления 600 мкг•мл-1 LA (FBA) (■) и 15 мг•мл-1 SO и 600 мкг•мл-1 LA (FBB) (▲). Ферментация без LA и SO (●).
Кинетику образования CLA и ее связь с ростом дополнительно исследовали при периодической ферментации с подпиткой. Ферментации состояли из фазы роста для получения высоких концентраций клеток в отсутствие LA, за которой следовала фаза конверсии. Фазу роста проводили в WPM с SO или без него до поздней экспоненциальной фазы (количество жизнеспособных клеток 2 × 1010 КОЕ/мл) перед добавлением исходного мицеллярного раствора LA до концентрации LA 600 мкг•мл-1. При периодической ферментации с подпиткой A (FBA) культуру развивали в присутствии 9 мг•мл–1 SO, а при ферментации B (FBB) SO добавляли непосредственно перед добавлением LA.
Присутствие SO в WPM с начала фазы роста (FBA) снижало скорость роста, а поздняя экспоненциальная фаза роста достигалась примерно на 30 ч позже, чем в FBB (рис. 3). В обеих периодических ферментациях с подпиткой (А и В) добавление LA останавливало рост сразу или в течение 3 часов. Несмотря на это, CLA быстро образовывалась в обеих ферментациях после добавления LA. В FBB превращение LA в CLA начиналось практически мгновенно после добавления SO и LA, а максимальные объемная и удельная скорости продукции достигались уже через 0,5–3 ч (табл. II). В FBA образование CLA происходило быстрее всего в течение 3–6 часов после добавления LA.
Таблица II. Продуктивность P. freudenreichii ssp. shermanii JS при периодическом брожении в WPM. В FBA приблизительно 600 мкг•мл–1 LA добавляли в культуру, содержащую 15 мг•мл–1 SO, а в FBB аналогичные количества SO и LA добавляли в культуру на поздней экспоненциальной фазе роста. Время реакции отсчитывали от добавления LA. Объемная и удельная скорости образования CLA (VPR и SPR соответственно) были рассчитаны с учетом времени реакции, указанного в таблице.
|
Время реакции
(h)
|
CLA
(μg·mL–1)
|
VPR
(μg·mL–1·h–1)
|
SPR
(μg·10–9 cfu–1·h–1)
|
FBA
|
0
|
0
|
0
|
0
|
3
|
58 ± 5
|
19 ± 3
|
1.0 ± 0.3
|
|
6
|
170 ± 15
|
37 ± 7
|
2.2 ± 0.5
|
|
28
|
518 ± 60
|
16 ± 4
|
0.6 ± 0.1
|
|
FBB
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0.5
|
6 ± 1
|
12 ± 2
|
0.6 ± 0.1
|
|
3
|
246 ± 25
|
96 ± 10
|
4.6 ± 0.6
|
|
6
|
322 ± 33
|
25 ± 3
|
0.8 ± 0.2
|
|
22
|
338 ± 52
|
1 ± 0.2
|
<0.1
|
Темпы производства в FBB были в два раза выше, чем в FBA. С другой стороны, конечная концентрация CLA в FBB была значительно ниже, чем в FBA, где конечный уровень CLA был примерно таким же, как и при периодической ферментации при соответствующей начальной концентрации LA 600 мкг•мл–1. Максимальные удельные продуктивности при периодическом брожении с подпиткой были значительно ниже значений, полученных при просто периодической (порционной) ферментации (табл. I и II). Например, максимальные значения удельной производительности в FBB и периодической ферментации, содержащей 600 мкг•мл-1 LA, составили 4,6 и 36 мкг•10-9КОЕ-1•ч-1 соответственно. Это указывает на важность физиологического состояния культуры в эффективности реакции конверсии.
3.3. Клеточные композиции жирных кислот
Хотя основная часть образующейся CLA была обнаружена в питательной среде, LA и CLA также были обнаружены среди клеточных жирных кислот. Клетки также содержали олеиновую кислоту, полученную из SO. При периодическом сбраживании количество клеточного LA зависело как от начальной концентрации LA в WPM, так и от возраста культуры. Уровень клеточной LA был самым высоким при высоких начальных концентрациях LA (рис. 4).
Рисунок 4. Клеточная LA (открытые символы) и CLA (закрытые символы) при периодическом сбраживании P. freudenreichii ssp. shermanii JS в WPM с добавлением SO при начальных концентрациях LA в 600 (▲), 1 400 (■) и 2 000 (●) мкг•мл–1.
В каждой культуре клеточная LA значительно снижалась по мере прогрессирования ферментации. С другой стороны, количество клеточной CLA, составляющее менее 1,7% от общего количества образовавшейся CLA, не зависело от исходной концентрации LA и лишь незначительно зависело от возраста культуры.. При периодической ферментации с подпиткой образцы клеток, взятые сразу после добавления LA, содержали как LA, так и CLA (3–5 и 1 мг на г сухой массы клеток соответственно). Это позволяет предположить, что изомеризация LA началась очень быстро, когда клетки вступили в контакт с LA.
Интересно, что добавление к WPM LA и SO при периодической ферментации не вызывало какого-либо существенного увеличения общего содержания жирных кислот в клетках. В присутствии LA и SO содержание жирных кислот в клетках варьировалось от 39 до 50 мг•г–1, а в обычном WPM это значение составляло 44 мг•г–1. Это указывает на то, что клеточные жирные кислоты, характерные для этого организма, были частично заменены внешними LA, CLA и олеиновой кислотой.
4. ОБСУЖДЕНИЕ
Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS эффективно преобразовывала LA в CLA в процессе периодического культивирования с контролем pH. По мере преобразования соотношение LA:SO также изменялось по сравнению с оптимальным, поэтому скорость роста и скорость производства CLA одновременно снижались в процессе культивирования. Однако это не повлияло на выход CLA, когда начальная концентрация LA находилась в диапазоне от 600 до 2000 мкг•мл-1. Это отличается от предыдущих культивирований без контроля рН. Например, при начальной концентрации LA 1000 мкг•мл-1 конечный pH составлял 4,8, а выход CLA - 57 % [125]. Снижение рН могло неблагоприятно повлиять не только на активность фермента, но и, вероятно, на состояние дисперсии смеси LA-SO в WPM. Kepler and Tove [115] показали, что оптимальный рН для линолевой изомеразы B. fibrisolvens составляет 7.0-7.2, хотя диапазон рН для активности фермента широк - от 5.5 до 8.5, что подтвердили Kim et al. [117]. По данным Pariza and Yang [123], оптимальный диапазон рН для образования CLA в суспензии клеток Lactobacillus reuteri составляет 7.4-8.8, хотя превращение все еще происходит при рН 5.5. Эта информация вместе с настоящими данными позволяет предположить, что снижение pH уменьшает выход CLA. Снижение выхода, вероятно, более заметно при высоких исходных концентрациях LA, поскольку при достижении pH, препятствующего конверсии, значительная часть LA может оставаться неконвертированной.
Значительные количества CLA также образовывались при периодической ферментации с подпиткой. Высокая плотность клеток при добавлении LA обеспечивала высокие объемные скорости производства и выходы в течение относительно короткого периода реакции. Реакция конверсии начиналась сразу же, когда клетки вступали в контакт с LA. Однако, сравнивая удельную производительность периодической и периодической ферментации с подпиткой, становится очевидным, что активно растущие культуры были значительно более эффективными, чем культуры, приближающиеся к стационарной фазе. Периодическая ферментация с подпиткой с использованием настоящего штамма Propionibacterium и более ранние наблюдения Паризы и Янга [123] и Огавы с соавт. [122] подтверждают точку зрения, что наличие активного фермента LA-изомеразы даже в нерастущих клетках может быть общим свойством широкого спектра бактерий.
Физиологическая основа изомеризации LA пропионибактериями неизвестна. Было высказано предположение, что реакция изомеризации инициирует серию биогидрирований для акцепции метаболического водорода в B. fibrisolvens [124]. Однако в настоящем организме такая последовательность восстановительных реакций не происходила, поскольку образовавшийся цис-9,транс-11-изомер CLA не превращался далее в другие жирные кислоты. Вместо этого детоксикация LA путем преобразования в CLA, как предложено Jiang et al. [113] является более вероятной физиологической ролью изомеризации в настоящем организме. Цзян и др. [113] наблюдали положительную корреляцию между образованием CLA и способностью толерантности к LA среди трех CLA-образующих штаммов пропионибактерий. Другие исследования показали, что способность переносить LA зависит от плотности клеток и фазы роста. Ким и др. [117] показали, что инокулят B. fibrisolvens A38 ингибировался уже при уровне LA 4 мкг•мл–1, но растущие культуры переносили десятикратные концентрации LA. Эти фрагменты информации вместе с имеющимися данными свидетельствуют в пользу механизма детоксикации.
ВЫВОДЫ
В заключение следует отметить, что как активно растущие, так и находящиеся в стационарной фазе культуры P. freudenreichii ssp. shermanii JS способны конвертировать LA в CLA с высокой эффективностью. Однако скорость производства в расчете на клетку была значительно выше в растущих культурах. При ферментации по принципу «fed-batch», когда реакция конверсии происходила после экспоненциального роста, высокие начальные показатели продукции быстро снижались со временем. Эта реакция изомеризации может быть системой детоксикации LA в исследуемом штамме пропионибактерий.
Дополнительная информация:
Литература (для ч.1. и ч.2)