Снижение холестерина бифидобактериями B. longum

СНИЖЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА БИФИДОБАКТЕРИЯМИ ЛОНГУМ

Влияние молочных продуктов, ферментированных Bifidobacterium longum, на липиды крови у крыс и здоровых взрослых добровольцев-мужчин

Примечание редактора: Атеросклероз - это заболевание, при котором бляшки накапливаются внутри ваших артерий. Артерии - это кровеносные сосуды, которые несут богатую кислородом кровь к вашему сердцу и другим частям вашего тела. Бляшка состоит из жира, холестерина, кальция и других веществ, содержащихся в крови. Со временем бляшка затвердевает и сужает ваши артерии. Это ограничивает приток богатой кислородом крови к вашим органам и другим частям вашего тела. Атеросклероз может привести к серьезным проблемам, включая сердечный приступ, инсульт или даже смерть. Несмотря на то, что первопричины атеросклероза бывают разные и до сих пор исследуются, повышенный холестерин все же остается одним из главных факторов риска развития ССЗ.

В данном разделе мы приводим раннее исследование одной известной японской компании «Моринага Милк» (Morinaga Milk IND Co Ltd), которая, как считается, одна из первых заложила основы в понимание функционального питания на основе пробиотических продуктов. Особое внимание эта компания уделяет исследованию бифидобактерий. Еще в  начале 90-х годов ею были опубликованы данные о высокой противоопухолевой активности клеточных стенок бифидобактерий. Примечательно, что «Моринага Милк» имеет много исследований, посвященных штаммам вида Bifidobacterium longum (в частности, эти штаммы используются в продукции Propionix в «КБЖ» и «Бификардио»). Здесь мы представляем одну из первых работ японских ученых по изучению влияния бифидобактерий лонгум (ферментированных молочных бифидо-йогуртов) на липидный профиль человека и крыс. Напомним, что данные исследования уже не в новинку, и холестеринметаболизирующая активность была установлена как у бифидобактерий B. longum, так и у молочных пропионовокислых бактерий P. freudenreichii (причем у исследованных штаммов пропионибактерий холестериндеградирующая способность не уступает бифидобактериям). Об этом можно отдельно прочитать на нашем сайте в разделе «Пробиотики и атеросклероз» и по ссылкам (там же). Именно поэтому, в целях профилактики атеросклероза мы всегда рекомендуем использовать любые наши биоконцентраты (на основе как бифидо- так и пропионовокислых бактерий) для приготовления кисломолочных пробиотических продуктов, положительно влияющих на липидный профиль человека (см. раздел «Домашние закваски»).

Резюме

Было изучено влияние молочных продуктов, сбраживаемых (ферментированных) пробиотическим штаммом Bifidobacterium longum BL1, на липиды крови у крыс и людей. Крысам давали экспериментальную диету, богатую холестерином, с добавлением лиофилизированных порошков: 1) кислого молока (контроль), 2) молока, ферментированного смешанной культурой из обычных йогуртовых заквасок, состоящих из Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (SL) и 3) молока bifidobacterium (бифидомолоко), ферментированного пробиотическим штаммом B. longum BL1, соответственно. Кормление бифидомолоком приводило к значительному снижению сывороточных концентраций общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности и триглицеридов по сравнению с контролем, в то время как изменений в концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности не наблюдалось. С другой стороны, добавление SL молока привело к незначительному снижению концентрации липидов в сыворотке по сравнению с контролем. В исследовании на людях 32 субъекта с холестерином в сыворотке крови в диапазоне от 220 до 280 мг / дл были случайным образом распределены на два вида лечения: 1) потребление питьевого йогурта с низким содержанием жира, приготовленного из обычных заквасок для йогурта, состоящих из S. thermophilus и L. delbrueckii subsp. bulgaricus (группа P) и 2) потребление йогурта с низким содержанием жира, приготовленного с двумя обычными заквасками для йогурта плюс штамм B. longum BL1 (группа B). После приема в течение 4 недель при 3 × 100 мл / день снижение общего холестерина в сыворотке крови наблюдалось примерно у половины субъектов группы B; особенно значительное снижение общего холестерина в сыворотке было обнаружено среди субъектов с умеренной гиперхолестеринемией (общий холестерин в сыворотке > 240 мг / дл). Однако сывороточные концентрации липидов у субъектов Р-группы были почти стабильными в течение экспериментальных периодов. Настоящие результаты показывают потенциал пробиотического штамма B. longum BL1 в улучшении уровня липидов в сыворотке.

ВВЕДЕНИЕ

Обычно считается, что высокий уровень общего холестерина в сыворотке крови является фактором риска ишемической болезни сердца и атеросклероза в США, Европе и Японии (Anderson et al., 1987; Law et al., 1994; Ross, 1993; Yamamoto et al. al., 1999). Снижение уровня вызывает снижение частоты и смертности от ишемической болезни сердца (ИБС) и атеросклероза (Frick et al., 1987; Mabuchi, 1999). Таким образом, большое внимание было уделено различным диетическим способам снижения уровня общего холестерина в сыворотке.

Mann и Spoerry (1974) впервые сообщили о гипохолестеринемическом эффекте у племен масаи от употребления молока, сбраживаемого заквасками дикого типа. После этого было проведено много исследований на экспериментальных животных и людях, чтобы выяснить влияние ферментированных молочных продуктов на уровень холестерина в сыворотке, особенно с отобранными штаммами молочнокислых бактерий (см. Обзор St-Onge et al., 2000). Предполагается, что механизмы гипохолестеринемической активности молочнокислых бактерий включают ингибирование абсорбции экзогенного холестерина из тонкой кишки путем связывания холестерина и желчных кислот с бактериальными клетками, ассимиляции холестерина, а также подавления резорбции желчных кислот путем деконъюгации в зависимости от бактериальной активности гидролазы желчных солей (Gilliland et al., 1985; Danielson et al., 1989; Salminen and von Wright, 1993; De Smet et al., 1998).

Чтобы гарантировать пробиотический эффект после введения, микроорганизмы должны выживать при прохождении через желудочный сок и тонкую кишку (Gilliland and Walker, 1990). Было обнаружено, что штамм Bifidobacterium longum BL1 обладает высокой устойчивостью к искусственному желудочному соку и желчи (см. Результаты). Было обнаружено, что этот штамм обладает сильной активностью гидролазы желчных солей (неопубликованные данные). Таким образом, предполагается, что штамм B. longum переживет прохождение через желудочно-кишечный тракт и будет функционировать in vivo в удалении холестерина.

На основании вышеизложенного настоящее исследование было проведено для демонстрации влияния молока, сбраживаемого штаммом B. longum, на липиды крови у крыс и людей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

_{Источник и содержание культур}

Штамм B. longum BL1 (MCC 1083) и йогуртовые закваски Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus были маточными культурами компании Morinaga Milk Industry Co., Лимитед., Канагава, Япония. Культуру штамма B. longum BL1 поддерживали субкультурой (10% инокуляцией) в 11% восстановленном обезжиренном молоке, содержащем 0,2% дрожжевого экстракта при 37°С в течение 5-6 ч. Смешанную культуру S. thermophilus и L. delbrueckii subsp. bulgaricus (SL) поддерживали субкультурой (3% инокуляцией) в 10% восстановленном обезжиренном молоке при 37° в течение 5 ч. Субкультуры хранили при 4°C между переносами. Для производства йогуртов использовались свежеприготовленные семенные культуры.

Измерение переносимости желудочного сока и желчи

Культуру штамма B. longum BL1 готовили так, как описано выше. К 100 мл искусственного желудочного сока (содержащего 0,2% пепсина, 0,35% хлорида натрия, доведенного до рН 3,0 по HCl) добавляли 0,01 мл культуры, смесь перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 1,5-2,0 ч. рН смеси составлял 3,04, а инкубацию прекращали добавлением равного объема охлажденного 10% пастеризованного восстановленного обезжиренного молока. В качестве контроля 0,01 мл культуры инкубировали в 100 мл 0,86% раствора хлорида натрия (рН 6,5) при 37°С в течение 2 ч. Жизнеспособность определяли сразу после инкубации на усиленном Клостридиальном агаре (Оксоид, Англия) в анаэробных условиях при 37°С в течение 72 ч. Показатель толерантности желудочного сока рассчитывали следующим образом:

Уровень толерантности (%) = [(КОЕ/мл) _{желудочный сок} / (КОЕ/мл)_{контроль}] x 100

Для теста на устойчивость к желчи 0,01 мл культуры добавляли к 100 мл 10% пастеризованного восстановленного обезжиренного молока, содержащего от 0 до 1,6% оксгалла (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, MO), и смесь инкубировали при 37 °С. С в течение 5 или 16 часов. Контролем служила культура без инкубации. Количество жизнеспособных микроорганизмов определяли, как описано выше, и показатель переносимости желчи рассчитывали следующим образом:

Показатель толерантности к желчи = (КОЕ/мл) _желчь / (КОЕ/мл) _{контроль}

Эксперимент на животных

Для производства SL молока, бифидобактериального молока и контрольного кислого молока основу обезжиренного молока (содержащую 11% порошка обезжиренного молока, 1% глюкозы и 0,2% дрожжевого экстракта) пастеризовали при 90 °C в течение 10 минут перед ферментацией, охлаждали до 40 °С, а затем разделить на три части. Одну порцию инокулировали 1% (w/w) смешанной семенной культурой обычных молочнокислых бактериальных стартеров, состоящих из S. thermophilus и L. delbrueckii subsp. bulgaricus для SL-молока, а вторая порция была инокулирована 1% (w/w) семенной культурой штамма B. longum BL1 для бифидомолока, соответственно. Каждую из инокулированных смесей инкубировали при 37°С до достижения рН 4,5, а затем охлаждали до 4°С. Продукты лиофилизировали для экспериментальных рационов. Перед лиофилизацией ферментированное молоко частично нейтрализовали путем смешивания с равными объемами пастеризованной 20%-ной обезжиренной молочной основы для улучшения выживаемости бактерий при замораживании. Приготовление лиофилизированного порошка проводили по три раза для каждого молочка SL и бифидомолока. Общие жизнеспособные КОЕ составили 3,8 ± 0,9 х 10⁸/г и 4,1 ± 0,7 х 10⁸/г лиофилизированного порошка для SL-молока и бифидобактериального молока соответственно. Молочную кислоту добавляли в третью порцию молока до рН 4,5 для контроля кислого молока, которое нейтрализовали и лиофилизировали таким же образом, как и ферментированное молоко.

Двадцать одна крыса (самец Sprague-Dawley) в возрасте 4 недель была приобретена у Japan SLC Co., Ltd., Сидзуока, Япония. После получения стандартной диеты (F2, Oriental Yeast Co., Ltd., Токио, Япония) в течение 1 недели их разделили на три группы (по семь в каждой), сбалансированных по массе тела (BW), и рандомизировали для экспериментальных диет, в которые были добавлены лиофилизированные порошки. SL молока, бифидомолока или контрольного кислого молока. Их помещали в кондиционированную комнату при 25 ± 2 ° C с влажностью 55 ± 5% в течение 12 ч цикла свет-темнота (свет с 08.00 до 20.00 ч и темнота с 20.00 до 08.00 ч). Вода была в свободном доступе, и экспериментальные рационы давались в количестве примерно 20 г / 100 г массы тела в день.

Состав экспериментальной диеты был основан на AIN-93M (лабораторной комбикоромовой смеси), с содержанием белка 14% (Таблица 1). Лиофилизированный порошок добавляли в рацион за счет сахарозы и крахмала. Поскольку было обнаружено, что большое количество лиофилизированных клеток, описанных выше, погибает после сочетания с рационом, предположительно из-за влажности рациона, основные компоненты (казеин, кукурузный крахмал, α-кукурузный крахмал, сахароза, целлюлоза и минеральная смесь) сушили в печи при 60 °С в течение ночи перед приготовлением диеты. Диетические материалы, за исключением лиофилизированных порошков, механически перемешивали, разделяли и упаковывали в герметичные алюминиевые пакеты и хранили в холодильнике (4 °С) до использования. Лиофилизированные порошки смешивали с основным рационом непосредственно перед тем, как давать животным, а свежеприготовленные рационы заменяли ежедневно в 16.00-17.00 часов, чтобы предотвратить потерю бактериальной выживаемости во время хранения и кормления. Количество жизнеспособных молочнокислых бактерий в рационах составляло от 10⁷ до 10⁸ КОЕ/г в свежеприготовленных рационах, но уменьшалось до приблизительно половины и 1/10 от исходного количества после введения для SL молока и бифидобактериального молока соответственно (таблица 1).

Таблица 1. Состав и КОЕ молочнокислых бактерий экспериментальных диет¹

Назначенные диеты давали крысам в течение 3 недель. Потребление корма измеряли ежедневно, а массу тела (BW) измеряли еженедельно. Чтобы определить уровни фекальных стероидов, фекальные образцы собирали в течение последних 2 дней экспериментального периода, лиофилизировали и затем хранили при -40 °C до анализа. В конце 3-недельного периода кормления крыс лишали рациона минимум на 16 часов и затем анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (Nembutal, Abbott Laboratories, Chicago, IL, USA) в дозе 50 мг/кг массы тела. Образцы крови отбирали из брюшной аорты, помещали в стерильные пробирки и центрифугировали при 2000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Полученные образцы сыворотки анализировали на общий холестерин, холестерин липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), триглицериды и фосфолипиды с использованием набора Cholesterol E TestWako: ЛПВП-холестерина Test Wako, триглицериды G Test Wako и фосфолипиды C Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Wako Pure Chemical Industries, Токио, Япония), тестовые наборы соответственно. Холестерин липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) рассчитывали с использованием уравнений Friedewald et al. (1972), как описано позже.

Общее количество фекальных желчных кислот определяли по методике Хашимото и др. (1999) с некоторыми изменениями. Измельченные сублимированные фекалии (0,05 г) дважды экстрагировали 3,5 мл этанола при 80°С в течение 1 ч. После двух экстракций этанол выпаривали под газом N₂ при 50°С, а остаток растворяли в 2,5 мл этанола. Количество общих желчных кислот анализировалось с помощью коммерческого тест-набора (Total Bile Acid Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., с уровнем чувствительности обнаружения от 10 до 50 мкмоль/л желчных кислот).

Исследования на человеке

Бифидобактерии и питьевые плацебо-йогурты были произведены в научно-информационном центре компании Morinaga Milk Industry Co., Ltd.. Бифидобактериальный йогурт ферментировали закваской штамма B. longum BL1 в присутствии обычных молочнокислых бактериальных заквасок, состоящих из S. thermophilus и L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Плацебо-йогурт ферментировали теми же обычными молочнокислыми бактериальными стартерами, которые использовались для приготовления бифидобактериального йогурта. Затем ферментированное молоко асептически гомогенизировали при давлении 15 МПа для приготовления питьевых йогуртов. Свойства и КОЕ этих продуктов приведены в таблице 2. Бифидобактериальный йогурт содержал более 10⁸ КОЕ штамма B. longum BL1 при испытании как на начальный, так и на 9-й день после производства. Сто грамм каждого из йогуртов с бифидобактериями и плацебо имели энергетическое содержание примерно 50 ккал и содержали 3,0 г белка, 8,2 г углеводов и 0,6 г молочного жира. Продукты готовились еженедельно и раздавались участникам эксперимента в пластиковых бутылках по 100 мл, которые хранились в холодильнике при температуре 4°С.

Table 2. Свойства бифидо- и плацебо-йогуртов (кислотность, КОЕ)

В исследовании приняли участие тридцать два добровольца. Добровольцами были здоровые взрослые мужчины, признанные пригодными для участия в тесте на основании предварительного физического обследования, уровня холестерина в сыворотке крови и истории болезни. Добровольцы были проинформированы о цели и подробном порядке проведения экспериментов. Был организован 2-недельный период предварительной подготовки к приему, в течение которого добровольцам было рекомендовано поддерживать свои обычные жизненные привычки, включая диету, за исключением ограниченного потребления кисломолочных продуктов и соленых огурцов. После периода предварительного приема пищи липиды сыворотки крови определяли по образцам крови, взятым перед завтраком, после того как испытуемые голодали всю ночь. Было отобрано тридцать два здоровых субъекта мужского пола, у которых уровень общего холестерина в сыворотке крови находился в пределах от 220 до 280 мг/дл при предварительном взятии пробы крови. Испытуемые были разделены на две группы, сопоставимые по уровню общего холестерина в сыворотке крови и возрасту, и рандомизированы либо в группу бифидобактериального йогурта (В-группа), либо в группу плацебо-йогурта (Р-группа). Характеристики испытуемых в двух группах представлены в таблице 3.

Таблица 3. Характеристики субъектов¹

Исследование было спланировано и проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией. Протокол исследования был одобрен и контролировался местным комитетом по этике компании Morinaga Milk Industry Co., Ltd.

Поскольку настоящее исследование было экспериментальным исследованием для будущих долгосрочных исследований, оно было разработано просто как краткосрочное, одиночное слепое, параллельное групповое исследование. Начиная с 1 недели после предварительного взятия пробы крови испытуемым предписывалось ежедневно употреблять 3 х 100 мл бифидо-йогурта или плацебо-йогурта в качестве части их привычного питания (завтрак, обед и ужин) в течение 4 недель. В течение периода приема испытуемые должны были заполнить анкету о соответствии требованиям, приеме лекарств, потреблении алкоголя и BW. Образцы крови для измерения уровня глюкозы и липидов сыворотки крови брали после голодания в течение ночи перед завтраком в течении 4-х недель. Образцы крови были взяты из локтевой вены. Анализ собранных образцов крови был проведен в компании BML Co. Ltd., Токио, Япония. Общий холестерин, холестерин ЛПВП и триглицериды измеряли с помощью автоматического анализатора 7450 (Hitachi Co., Ltd., Токио, Япония). Уровень глюкозы в крови измеряли с помощью автоматического анализатора JCA-BM12 (JEOL. Ltd., Токио, Япония). ЛПНП-холестерин вычисляли по формуле Фридевальда (Friedewald et al., 1972):

ЛПНП-холестерин = общий холестерин - ЛПВП-холестерин - (триглицериды сыворотки / 5).

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Экспериментальные данные представлены в виде средних и среднеквадратичных ошибок этих средних величин. Для определения статистической значимости различий в эффектах между тремя группами в исследовании на животных был применен t-тест Даннетта для мульти-сравнения с использованием пакета программного обеспечения JMP, версия 4.05J (Институт SAS, Япония), с установленным уровнем значимости при р <0,05. Парный t-критерий Стьюдента был проведен в Microsoft Excel версии 97, чтобы определить статистическую значимость различий в эффектах между двумя группами в исследовании на людях.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Желудочный сок и толерантность к желчи

Отмечена высокая толерантность штамма B. longum BL1 к желудочному соку. Инкубация в искусственном желудочном соке при рН 3,0 и 37°С в течение 1,5 и 2,0 ч дала показатели переносимости 32,4 и 11,3% соответственно. Штамм показал также высокую толерантность к желчи (табл.4). Размножение штамма в обезжиренном молоке с желчью или без нее происходило очень медленно, вероятно, из-за ограничения питательных веществ. Однако полная выживаемость наблюдалась после 5 ч инкубации в присутствии оксгалла (медицинской (бычей) желчи) на уровне 0,4 и 1,6%. Более половины бактериальных клеток выжили после 16-часовой инкубации в 1,6% оксгалла.

Таблица 4. Толерантность к желчи Bifidobacterium longum BL-1

¹Толерантность к желчи была проверена в обезжиренном молоке, содержащем разные концентрации оксгалла при 37 °С в течение разных периодов времени. Как описано в разделе «Материалы и методы». Показатель переносимости желчи рассчитывали следующим образом: показатель переносимости желчи = (КОЕ/мл) _желчи / (КОЕ/мл) _{контроль.}

Эксперимент на животных

Влияние ферментированнного молока на увеличение массы тела, потребление корма и эффективность кормления представлены в таблице 5. Среднее увеличение массы тела группы молока с бифидобактериями было несколько выше, чем у двух других групп, но разница не была статистически значимой (P> 0,05).

Таблица 5. Масса тела и потребление корма крысами, получавшими экспериментальные рационы, содержащие лиофилизированные молочные продукты.

Влияние ферментированного молока на липиды сыворотки крови показано в таблице 6. Средние сывороточные концентрации общего холестерина и триглицеридов в группе, получавшей бифидобактериальное молоко, были ниже, чем в контрольной группе (Р < 0,01) и группе, получавшей SL-молоко (Р < 0,05). Уровень холестерина ЛПНП в сыворотке крови был снижен (Р < 0,05) при использовании диеты, содержащей бифидобактериальное молоко, по сравнению с контролем. Концентрация ЛПВП-холестерина и фосфолипидов не влияла на бифидобактериальное молоко. Дополнение рационов молоком SL дало лишь незначительное, несущественное снижение содержания липидов в сыворотке.

Таблица 6. Концентрация липидов в сыворотке крови крыс, которых кормили экспериментальными диетами, содержащими сублимированные сухие молочные продукты.¹

Концентрация общей желчной кислоты в кале составила 1,70 ± 0,55, 2,07 ± 0,41 и 2,16 ± 0,26 мг/г кала для групп, получавших кислое молоко (контроль), SL-молоко и бифидобактериальное молоко соответственно. Добавление в рацион SL-молока или бифидобактериального молока приводило к тенденции к увеличению экскреции желчных кислот с калом, но этот эффект не был статистически значимым по сравнению с контрольным кислым молоком (Р = 0,187) и для SL-молока (Р = 0,068) и бифидобактериального молока соответственно.

Исследования на человеке

На 4 неделе все субъекты завершили исследование. Среднее значение массы тела составило 69,0 ± 6,7 и 67,3 ± 7,5 кг для группы, получавшей бифидобактериальный йогурт (B-) и группы плацебо-йогурта (P-), соответственно. Наблюдались лишь незначительные колебания BW, не связанные с лечением. Физикальное обследование всех испытуемых, проведенное в момент взятия пробы крови, не выявило никаких отклонений.

В таблице 7 приведены средние значения липидов сыворотки крови до и после экспериментального приема пищи для 32 испытуемых. В течение экспериментального периода не было обнаружено существенных изменений концентрации липидов в сыворотке крови как для группы В, так и для группы Р, хотя в группе В наблюдалась тенденция к снижению. Когда 16 испытуемых из группы В были проанализированы индивидуально, большинство из них показали снижение уровня общего холестерина. Рассматривая до 5% в качестве приемлемого отклонения в соответствии с лабораторным методом, мы обнаружили, что в группе B у пяти субъектов не было изменений (общее отклонение холестерина было менее 5%), у восьми пациентов наблюдалось снижение (более 5%) и три субъекта показали увеличение (более 5%) уровня холестерина. С другой стороны, в P-группе было 14 субъектов без изменений, один субъект со снижением и один субъект с повышением уровня холестерина.

Таблица 7. Изменения уровня липидов в сыворотке крови человека после 4 недель на экспериментальных диетах¹

Тенденция к снижению уровня общего холестерина в группе В была более заметна у лиц с умеренной гиперхолестеринемией. В таблице 8 приведены средние значения сывороточных липидов для лиц с исходными значениями общего холестерина более 240 мг/дл (n = 9). После приема экспериментальной диеты в группе В наблюдалось снижение (Р < 0,05) общего холестерина. Достоверная разница также наблюдалась между группой В и группой Р (р < 0,05). Когда каждый испытуемый анализировался индивидуально, у шести испытуемых наблюдалось снижение (более чем на 5%) и у трех испытуемых не было изменений (менее чем на 5%) общего холестерина в группе В, но семь испытуемых не изменились, один испытуемый имел снижение, а один испытуемый имел увеличение в группе Р. Изменения уровней ЛПВП-холестерина и ЛПНП-холестерина коррелировали со снижением или повышением общего холестерина как в группе В, так и в группе Р, но эти изменения не были статистически значимыми. В течение экспериментального периода не было отмечено существенных изменений уровня триглицеридов.

Таблица 8. Изменения уровня липидов в сыворотке крови человека после 4 недель на экспериментальной диете у испытуемых с исходным уровнем общего холестерина в сыворотке крови более 240 мг / дл¹

Не было никаких существенных изменений в глюкозе сыворотки (данные не показаны). Ни один из субъектов не сообщал об изменениях в диете, употреблении алкоголя, употреблении табака или физической активности в течение периода исследования. Оба продукта хорошо переносились, и соблюдение было хорошим (более 90%) согласно опроснику. Один субъект (группа В) прекратил прием пробы на 1 неделю из-за командировки. Один участник в группе P и пять участников в группе B заявили о повышении частоты фекалий во время участия в этом исследовании.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящего исследования показывают, что по сравнению с традиционным йогуртом, ферментированным с обычными молочнокислыми бактериями, йогурт, ферментированный бифидобактериями, был эффективен в улучшении сывороточных липидов у крыс, а также у людей с умеренной гиперхолестеринемией. В экспериментах на животных, по сравнению с контролем, диеты с бифидобактериальным молоком приводили к значительно более низким уровням общего холестерина в сыворотке, холестерина ЛПНП и триглицеридов, но SL-молоко вызывало лишь незначительные, несущественные изменения. Однократное слепое параллельное групповое исследование с использованием бифидобактериального йогурта и плацебо-йогурта у здоровых мужчин (n = 16) показало тенденцию к снижению уровня общего холестерина в сыворотке крови после приема бифидобактериального йогурта. Значительное снижение уровня сывороточного холестерина наблюдалось у лиц с умеренной гиперхолестеринемией (общий холестерин сыворотки крови > 240 мг/дл, n = 9).

Вывод о том, что бифидобактериальное ферментированное молоко снижает концентрацию общего холестерина в сыворотке крови крыс, согласуется с данными других исследований, включающих различные молочные продукты, содержащие отдельные штаммы молочнокислых бактерий.  Akalin et al. (1997) показали, что йогурт, ферментированный с L. acidophilus, значительно снижает концентрацию общего холестерина в сыворотке крови мышей, тогда как йогурт, ферментированный с обычными йогуртовыми заквасками, содержащими S. thermophilus и L. delbrueckii subsp. bulgaricus -нет. В экспериментах на крысах, Beena and Prasad (1997) продемонстрировали, что бифидо-йогурт, обогащенный сгущенной сывороткой, снижает уровень холестерина в большей степени, чем обычный йогурт, обогащенный сгущенной сывороткой. Снижение общего холестерина и триглицеридов в сыворотке наблюдалось у отдельных штаммов, включая L. acidophilus (Danielson et al., 1989), L. reuteri (Taranto et al., 1998, De Roos et al., 1999), L. casei (Hashimoto et al., 1999) и L. gasseri (Usman and Hosono, 2000) в экспериментальных исследованиях на животных.

Настоящие исследования на животных показали небольшое, незначительное снижение концентрации холестерина ЛПВП, но значительное снижение концентраций холестерина ЛПНП в группе, получавшей бифидобактерии, по сравнению с контрольной группой. Поскольку ЛПНП-холестерин рассчитывали по значениям общего сывороточного холестерина, триглицеридов и ЛПВП-холестерина, используя уравнения Friedewald et al. (1972), можно ожидать снижения концентрации сывороточного ЛПНП-холестерина. Настоящие результаты, связанные с холестерином ЛПВП и ЛПНП, в целом согласуются с другими результатами (Aklain et al., 1997; Danielson et al., 1989; De Smet et al., 1998), хотя снижение общего холестерина было обнаружено при одновременное повышение уровня холестерина ЛПВП в некоторых исследованиях (Hashimoto et al., 1999; Taranto et al., 1998).

Механизмы улучшения липидов в сыворотке были предложены в исследованиях in vitro и in vivo. Эксперименты in vitro показали, что кишечные молочнокислые бактерии обладают способностью ассимилировать и связывать холестерин, а также желчные кислоты с бактериальными клетками (Bottazzi et al., 1986; Gilliland et al., 1985, Hosono and Tono-oka, 1995). Исходя из этих результатов, можно предположить, что общий холестерин в сыворотке снижается путем ингибирования всасывания в кишечнике в результате ассимиляции и связывания холестерина, а также желчных кислот молочнокислыми бактериями. Стимуляция выведения желчных кислот из-за деконъюгации с образованием свободных желчных кислот была предложена в качестве еще одного механизма улучшения содержания липидов в сыворотке (Grundy, 1972). Известно, что уровень холестерина в сыворотке крови снижается, когда тот или иной компонент подавляет резорбцию желчной кислоты в кишечнике, поскольку катаболизм холестерина стимулируется в печени. Связывание холестерина или желчных кислот в настоящих исследованиях не исследовалось, но более высокая экскреция желчных кислот с калом, хотя и не статистически значимая (Р = 0,068), наблюдалась в группе, получавшей бифидобактериальное молоко. Повышенный фекальный выход нейтральных стеринов и солей желчи наблюдался у поросят, скармливаемых L. reuteri (De Smet et al., 1998).

Считается, что выживший пассаж через желудочно-кишечный тракт важен для функционирования пробиотиков в кишечнике (Gilliland and Walker, 1990; Salminen and von Wright, 1993). Очень немногие исследования упоминали о выживании бактериальных клеток, добавляемых в рацион питания в экспериментах на животных. Мы заметили, что лиофилизированные клетки лактобацилл и бифидобактерий погибали в основном в течение 1-2 дней после их сочетания с рационом, предположительно из-за влажности рациона. В настоящих исследованиях особое внимание уделялось поддержанию более высокой выживаемости бактериальных клеток с помощью таких средств, как использование высушенных диетических материалов, смешивание клеток в диеты непосредственно перед введением и ежедневная замена диет.

Было показано, что штамм B. longum BL1 выживает с высокой степенью в искусственном желудочном соке при рН 3,0 в течение 1,5-2 часов. Бактерии контактировали со значениями рН в пределах от 2,0 до 8,0 в желудке, в зависимости от того, потреблялась ли пища (Hood and Zottola, 1988). Сопротивление воздействию pH 3 в течение 1,5-2 часов считается одним из стандартов для устойчивости пробиотических бактерий при низком pH (Itoh, 1992). Выжившие бактерии из желудка затем связываются с желчью в тонкой кишке. Не следует ожидать размножения бифидобактерий в тонкой кишке, поскольку бактерии являются анаэробными (Mitsuoka, 1978). Таким образом, толерантность к желчи является критерием выживания бифидобактерий при прохождении через тонкую кишку. Было обнаружено, что настоящий штамм выживает при относительно высокой концентрации желчи в течение 5-16 часов, что, как предполагается, является обычным временем для прохождения пищи через тонкий кишечник. Однако S. thermophilus и L. delbrueckii subsp. bulgaricus, два наиболее важных организма, используемых для производства йогурта, фактически не наблюдались в кишечном тракте из-за их низкой толерантности к солям желчи, низкой устойчивости к кислотному рН и довольно избирательных требований к сахарам (Harvenaar and Minekus, 1996; Rasic and Kurmann, 1979). Было обнаружено, что штамм B. longum BL1 обладает сильной активностью гидролазы солей желчных кислот (неопубликованные результаты). Таким образом, выжившие клетки B. longum могут функционировать в плане снижения уровня холестерина, вероятно, путем связывания с холестерином и желчными кислотами, а также путем подавления резорбции желчных кислот путем деконъюгации.

Было отмечено, что потребление кисломолочного молока не всегда проявляет сходные эффекты у людей, как у животных, из-за различий между видами в механизме метаболизма холестерина (Friedewald et al., 1972; Kawase et al., 2000). Исследования на людях, однако, привели к противоречивым результатам. Hepner et al. (1979) провели первое рандомизированное перекрестное исследование с 17 субъектами и показали снижение уровня общего холестерина в сыворотке от непастеризованного йогурта на 5-9%. Рандомизированные, двойные слепые и плацебо-контролируемые исследования также продемонстрировали значительное снижение общего холестерина и холестерина ЛПНП в сыворотке с помощью молочного продукта, ферментированного Enterococcus faecium и двумя штаммами S. thermophilus (Agerbkӕk et al., 1995; Richelsen et al., 1996). Kiessling et al. (2002) отметили, что употребление йогурта увеличивает сывороточную концентрацию холестерина ЛПВП и приводит к желаемому улучшению соотношения холестерина ЛПНП / ЛПВП. Kawase et al. (2001) продемонстрировали подавляющий эффект на поглощение холестерина ферментированным молоком, дополненным S. thermophilus, у людей. Однако исследования, в которых использовались кисломолочные добавки с добавлением L. acidophilus, а также других обычных молочнокислых бактерий, приводили к отсутствию какого-либо эффекта (De Roos et al., 1999; Thompson et al., 1982). Таким образом, исследования, проведенные на людях, неоднозначны в отношении влияния ферментированных молочных продуктов на концентрацию холестерина в сыворотке. Кроме того, хотя в экспериментах на животных с бифидобактериями наблюдались изменения, касающиеся ассимиляции холестерина in vitro, а также снижения уровня холестерина (Tahri et al., 1995; Beena and Prasad, 1997), гипохолестеринемический эффект бифидобактерий на человеке еще не был продемонстрирован. Чтобы проверить влияние бифидобактериального йогурта на человеческие сывороточные липиды, наблюдаемое на крысах, мы провели настоящее пилотное исследование на людях. Бифидойогурт и йогурт плацебо имеют одинаковое содержание молочных жиров, белков, углеводов и энергии. Единственная разница заключалась в наличии или отсутствии целевых бифидобактерий. Тенденция к снижению концентрации общего холестерина в сыворотке крови наблюдалась в группе добровольцев, которые употребляли йогурт с бифидобактериями, но это изменение не было значительным. Значительное снижение общего холестерина после 4-недельного приема йогурта с бифидобактериями было обнаружено у пациентов с начальными значениями общего холестерина более 240 мг/дл (n = 9, P <0,05). У нас нет очевидного объяснения более заметного эффекта у пациентов с умеренной гиперхолестеринемией (общий холестерин в сыворотке > 240 мг / дл), чем у пациентов с общим холестерином в сыворотке в диапазоне от 220 до 240 мг / дл. Возможно, это может быть связано с небольшим количеством субъектов в каждой группе и относительно высоким различием в значениях некоторых субъектов в каждой группе. Мы не могли исключить влияние личного повседневного образа жизни на изменение уровня липидов в сыворотке, потому что каждому субъекту рекомендовалось поддерживать обычные жизненные привычки без больших ограничений в течение экспериментального периода. Тем не менее, следует отметить, что вариабельность эффективности обычно наблюдается при использовании гиполипидемических средств (Lees et al., 1977). Asaoka et al. (1996) также сообщили о селективном понижающем эффекте общего холестерина в сыворотке у взрослых мужчин, которым вводили напиток, содержащий деполимеризованный альгинат натрия, при этом снижение наблюдалось у тех субъектов, у которых начальный уровень общего холестерина был более 220 мг/дл, но не у тех, у кого был нормальный уровень (<220 мг/дл).

Корреляционное снижение холестерина ЛПНП и ЛПВП наблюдалось вместе со снижением общего холестерина, но статистическая значимость не наблюдалась ни для всей группы, ни для части с умеренной гиперхолестеринемией (общий холестерин в сыворотке <240 мг / дл). Связанные с этим изменения общего холестерина, холестерина ЛПНП и холестерина ЛПВП могут поддержать гипотезу о том, что штамм действует, способствуя выведению холестерина и желчной кислоты, а не влияя на синтез холестерина в печени.

Настоящие результаты указывают на потенциал бифидобактериального йогурта в снижении общего холестерина в сыворотке, особенно у пациентов с умеренной гиперхолестеринемией (общий холестерин в сыворотке > 240 мг/дл). В Японии недавно была повышена граница начала медикаментозной терапии общего холестерина в сыворотке крови с 220 до 240 мг/дл. Клиническая важность этого йогурта, таким образом, заслуживает внимания, и планируется проведение исследований с большим количеством субъектов и на более длительные сроки в сочетании с инструкцией по питанию для дальнейшего разъяснения.

ВЫВОДЫ

Настоящее исследование показало, что по сравнению с традиционным йогуртом, ферментированным обычными молочнокислыми бактериями, бифидобактериальный йогурт, ферментированный пробиотическим штаммом Bifidobacterium longum BL1, и питьевой йогурт, ферментированный штаммом BL1 плюс обычные молочнокислые бактерии, были эффективны в улучшении липидов сыворотки крови у крыс и людей с исходным уровнем холестерина в сыворотке крови более 240 мг/дл соответственно. Таким образом, предполагается, что штамм B. longum BL1, обладающий высокой толерантностью к желудочному соку и желчным кислотам и проявляющий сильную гидролазную активность желчных солей, переживает прохождение через желудочно-кишечный тракт и функционирует в снижении уровня холестерина. Эти результаты указывают на потенциальное пробиотическое действие ферментированных бифидобактериями продуктов на снижение уровня холестерина в сыворотке крови.

См. дополнительно:

• Бифидобактерии, экзема и гиперхолестеринемия
• Колонизация и пробиотическая функция B. longum

Литература

1. Agerbӕk, M., L. U. Gerdes, and B. Richelsen. 1995. Hypocholesterolaemic effect of a new fermented milk product in healthy middle- aged men. Eur. J. Clin. Nutr. 49:346–352.
2. Aklain, A. S., S. Gonc, and S. Duzel. 1997. Influence of yogurt and acidophilus yogurt on serum cholesterol levels in mice. J. Dairy Sci. 80:2721–2725.
3. Anderson, K. M., W. P. Castelli, and D. Levy. 1987. Cholesterol and mortality. 30 years of follow-up from the Framingham study. J. Am. Med. Assoc. 257:2176.
4. Asaoka, T., H. Iwatsuka, and H. Minowa. 1996. Effect of “CHOLECUT,” a drink containing depolymerized sodium alginate, on serum cholesterol levels in healthy males. Jpn. J. Nutr. Assess. 13:460–464.
5. Beena, A., and V. Prasad. 1997. Effect of yoghurt and bifidus yoghurt fortified with skim milk powder, condensed whey and lactosehydrolysed condensed whey on serum cholesterol and triacylglycerol levels in rats. J. Dairy Res. 64:453–457.
6. Bottazzi, V., C. Zacconi, E. Gonzaga, and M. Paladino. 1986. Absorption of cholesterol by intestinal lactic acid bacteria. Ann. Microbiol. 36:1–5.
7. Danielson, A. D., E. R. Peo, K. M. Shahani, A. J. Lewis, P. J. Whalen, and M. A. Amer. 1989. Anticholesteremic property of Lactobacillus acidophilus yogurt fed to mature boars. J. Anim. Sci. 67:966–974.
8. De Roos, N. M., G. Schouten, and M. B. Katan. 1999. Yoghurt enriched with Lactobacillus acidophilus does not lower blood lipids in healthy men and women with normal to borderline high serum cholesterol levels. Eur. J. Clin. Nutr. 53: 277–280.
9. De Smet, I., P. De Boever, and W. Versteaete. 1998. Cholesterol lowering in pigs through enhanced bacterial bile salt hydrolase activity. British J. Nutr. 79: 185–194.
10. Frick, M. H., O. Elo, K. Haapa, O. P. Heinonen, P. Heinsalmi, P. Helo, J. K. Huttunen, P. Kaitaniemi, P. Koskinen, and V. Manninen. 1987. Helsinki Heart Study: Primary-prevention trial with gemfibrozil in middle-aged men with dyslipidemia. Safety of treatment, changes in risk factors, and incidence of coronary heart disease. N. Engl. J. Med. 317:1237–1245.
11. Friedewald, W. R., R. I. Levy, and D. S. Fredrickson. 1972. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin. Chem. 18:499–502.
12. Gilliland, S. E., C. R. Nelson, and C. Maxwell. 1985. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. Appl Environ. Micorbiol 49:377–381.
13. Gilliland, S. E., and D. K. Walker. 1990. Factor to consider when selecting a culture of Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans. J. Dairy Sci. 73:905–911.
14. Grundy, S. M. 1972. Treatment of hypercholesterolemia by interference with bile acid metabolism. Arch. Internal Med. 130:638– 648.
15. Harvenaar, R. and M. Minekus. 1996. Stimulated assimilation. Dairy Ind. Int. 61(9):17–23.
16. Hashimoto, H., K. Yamazaki, F. He, M. Kawase, M. Hosoda, and A. Hosono. 1999. Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus casei subsp. casei TMC 0409 strain observed in the rats fed cholesterol contained diets. Anim. Sci. J. 72:90–97.
17. Hepner, G., R. Fried, S. St. Jeor, L. Fusetti, and R. Morin. 1979. Hypercholesterolemic effect of yoghurt and milk. Am. J. Clin. Nutr. 32:19–24.
18. Hood, S. K., and E. A. Zottola. 1988. Effect of low pH on the ability of Lactobacillus acidophilus to survive and adhere to human intestinal cells. J. Food Sci. 53:1514–1516.
19. Hosono, A., and T. Tono-oka. 1995. Binding of cholesterol with lactic acid bacterial cells. Milchwissenschaft 50: 556–560. Itoh, T. 1992. Functional benefits from lactic acid bacteria used in cultured milk. Anim. Sci. Technol. 63:1276–1289.
20. Kawase. M., H. Hashimoto, M. Hosoda, H. Morita, and A. Hosono. 2000. Effect of administration of fermented milk containing whey protein concentrate to rats and healthy men on serum lipids and blood pressure. J. Dairy Sci. 83:255–263.
21. Kawase, M., H. Hashimoto, M. Hosoda, H. Morita, and A. Hosono. 2001. Effect of administration of fermented milk with Streptococcus thermophilus TMC1543 on serum lipid levels induced by a high-cholesterol diet in adult subjects. Milchwissenschaft 56:496–499.
22. Kiessling, G., J. Schneider, and G. Jahries. 2002. Long-term consumption of fermented dairy products over 6 months increases HDL cholesterol. Eur. J. Clin. Nutr. 56(9):843–849.
23. Law, M. R, N. J. Wald, T. Wu, A. Hackshaw, and A. Bailey. 1994. Systematic underestimation of association between serum cholesterol concentration and ischaemic heart disease in observational studies: data from the BUPA study. Br. Med. J. 308:363–366.
24. Lees, A. M., H. Y. Mork, R. S. Lees, A. M. McCluskey, and S.M. Grundy. 1977. Plant sterols as cholesterol-lowering agents: clinical trials in patients with hypercholesterolemia and studies of sterol balance. Atherosclerosis 28:325–338.
25. Mabuchi, H. 1999. Primary and secondary prevention of atherosclerotic disease by lipid-lowering therapies. Nippon Rinsho 57:2807–2814.
26. Mann, G. V., and A. Spoerry. 1974. Studies of a surfactant and cholesterolemia in the Massai. Am. J. Clin. Nutr. 27: 464–469.
27. Mitsuoka, T. 1978. Intestinal Bacteria and Health. Harcourt Brace Jovanovich Japan Inc., Tokyo. Rasic, J. L., and J. A. Kurmann. 1979. Yogurt. Scientific Grounds Technology, Manufacture and
28. Preparations. 2nd ed. Tech. Dairy Publ. House, Copenhagen, Denmark. Journal of Dairy Science Vol. 86, No. 7, 2003
29. Richelsen, B., K. Kristensen, and S. B. Pedersen. 1996. Long term (6 months) effect of a new fermented milk product on the level of plasma lipoproteins—a placebo-controlled and double blind study. Eur. J. Clin. Nutr. 50:811–815.
30. Ross, R. 1993. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for 1990s. Nature 362:801–809.
31. Salminen, S., and A. von Wright. 1993. Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker, Inc., New Yorker, NY. St-Onge, M. P., E. R. Farnworth, and P. J. H. Jones. 2000. Consumption of fermented and nonfermented dairy products: effects on cholesterol concentrations and metabolism. Am. J. Clin. Nutr. 71:674–681.
32. Tahri K., J. Crociani, J. Ballongue, and F. Scheider. 1995. Effects of the three strains of bifidobacteria on cholesterol. Lett. Appl. Microbiol. 21:149–151.
33. Taranto. M. P., M. Medici, G. Perdigon, A. P. Ruiz Holgado, and G. F. Valdez. 1998. Evidence for hypocholesterolemic effect of Lactobacillus reuteri in hypercholesterolemic mice. J. Dairy Sci. 81:2336–2340.
34. Thompson, L. U., D. J. Jenkins, M. A. Amer, R. Reichert, A. Jenkins, and J. Kamulsky. 1982. The effect of fermented and unfermented milks on serum cholesterol. Am. J. Clin. Nutr. 36:1106–1111.
35. 35.  Usman, and A. Hosono. 2000. Effect of administration of Lactobacillus gasseri on serum lipids and fecal steroids in hypercholestrolemic rats. J. Dairy Sci. 83:1705–1711.
36. Yamamoto, A., H. Horibe, H. Mabuchi, T. Kita, Y. Matsuzawa, Y. Saito, N. Nakaya, T. Fujioka, H. Tenba, A. Kawaguchi, H. Nakamura, and Y. Goto. 1999. Analysis of serum lipid levels in Japanese men and women according to body mass index. Increase in risk of atherosclerosis in postmenopausal women. Research Group on Serum Lipid Survey 1990 in Japan. Atherosclerosis 143:55–73.