Микроэлемент селен помогает забеременеть

ФЕРТИЛЬНОСТЬ ЖЕНЩИН СВЯЗАНА С ДЕТОКСИКАЦИОННЫМ ЭЛЕМЕНТОМ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ – СЕЛЕНОМ

РЕПРОДУКТИВНАЯ ФУНКЦИЯ ЖЕНЩИНЫ ВО МНОГОМ ЗАВИСИТ ОТ СЕЛЕНОВОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА - ВАЖНОГО ФАКТОРА ЗАЩИТЫ ОТ БЕСПЛОДИЯ

 СОДЕРЖАНИЕ:

• Резюме
• Вступление
• Материалы и методы
• Сбор образцов для анализа XRF
• Сбор образцов для анализа ICP-MS
• Гистология и подготовка ткани для анализа XRF
• Классификация фолликулов
• Рентгеновская флуоресцентная визуализация
• ICP-MS гранулезных и текальных клеток и желтого тела
• Анализ микромассивов (микрочипов)
• Экстракция РНК и синтез кДНК
• Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR) в реальном времени
• Статистический анализ
• Иммуногистохимия
• Экстракция белка и вестерн-иммуноблоттинг
• ЭКО и Кучевые Клетки Человека
• Выделение РНК из клеток кумулюса человека и ОТ-ПЦР в реальном времени
• Результаты
• Рентгенография фолликулов крупного рогатого скота
• Рис. 1.  Распределение Zn, Fe и Se в срезе яичника крупного рогатого скота по изображению μ-XRF.
• Рис. 2. Локализация Zn, Fe и Se в крупных антральных фолликулах.
• Количественное определение Se с использованием ICP-MS
• Анализ данных микрочипов
• ПЦР гранулезной кДНК
• Иммуногистохимическая локализация VIMP в срезах яичников
• Обнаружение GPX1 в различных типах фолликулярных клеток
• GPX1 в кучевых клетках из ооцитов человека
• Рис. 3. Средние уровни мРНК селенопротеина.
• Рис. 4. Иммуноокрашивание VIMP в крупных фолликулах.
• Рис. 5. Вестерн-иммуноблоттинг GPX1 в клетках гранулезы из мелких и крупных здоровых фолликулов.
• Рис. 6. Экспрессия GPX1 в кучевых клетках (клетках кумулюса)
• Обсуждение
• Экспрессия GPX1 зависит от состояния питания
• Селенопротеины, такие как GPX, могут бороться с окислительным стрессом во время развития фолликулов
• Экспрессия GPX кажется уникальной для крупных фолликулов
• VIMP может играть роль в развитии фолликулов КРС
• Выводы
• Дополнительная информация
• Литература

Рентгеновская флуоресцентная визуализация и другие анализы идентифицируют селен и GPX1 как важные для репродуктивной функции женщины

 

РЕЗЮМЕ

Глутатионпероксидаза 1 (GPx1) - является наиболее распространенным селензависимым ферментом (тетрамерной формы) из семейства глутатионпероксидаз, и обнаружена в цитоплазме практически всех тканей млекопитающих, субстратом GPx1 является как пероксид водорода, так и многие органические гидропероксиды.

Protein GPX1 - Структура Глутатионпероксидазы 1

Исследования статуса селена (Se) показывают, что Se необходим для фертильности, но насколько точно неизвестно. Мы стремились показать, что селен играет важную роль в репродуктивной функции крупного рогатого скота. Распределение элементов в яичнике крупного рогатого скота (n = 45 срезов) было идентифицировано с помощью рентгеновской флуоресцентной (XRF) визуализации. Se был последовательно локализован в слое гранулезных клеток крупных (> 10 мм) здоровых фолликулов. Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) выявила десятикратное повышение Se в стенке фолликула крупного рогатого скота по сравнению с желтым телом. Анализ экспрессии генов селенопротеинов GPX1, GPX3, VIMP и SELM в клетках гранулезы крупного рогатого скота показал, что только GPX1 был значительно повышен в больших здоровых фолликулах по сравнению с маленькими здоровыми или атретическими фолликулами (P < 0,05). Вестерн-иммуноблоттинг идентифицировал белок GPX1 в гранулезных клетках крупного рогатого скота здоровых фолликулов, но не малых здоровых фолликулов. Чтобы оценить, важен ли GPX1 в человеческих фолликулах, были собраны кучевые клетки у женщин, перенесших ЭКО / ИКСИ с однократным переносом эмбрионов. Ооциты и эмбрионы культивировали и переносили независимо у 30 пациентов, которым проводился плановый однократный перенос эмбрионов. Экспрессия гена GPX1 была достоверно выше в кучевых клетках человека из кучево-ооцитарных комплексов, дающих беременность (Р < 0,05). Мы представляем первое рентгеновское изображение яичников млекопитающих, показывающее, что Se последовательно локализуется в гранулезных клетках крупных здоровых фолликулов. Мы пришли к выводу, что Se и селенопротеины повышены в больших здоровых фолликулах и могут играть важную роль в качестве антиоксиданта во время позднего фолликулярного развития.

Вступление

Селен (Se) является микроэлементом и незаменимым компонентом селенопротеинов, играющих важную роль в таких биологических функциях, как: антиоксидантная защита; образование гормонов щитовидной железы; иммунный ответ; синтез ДНК; фертильность; и, размножение [1,2]. Селенопротеины включают Se ко-трансляционно как остаток селеноцистеина, который действует как очень эффективный окислительно-восстановительный катализатор [3], защищая клетки от активных форм кислорода (АФК или англ. ROS) [4,5]. ROS, такие как анион супероксидного радикала (O₂^-) и перекись водорода (H₂O₂) вырабатываются как побочные продукты нормального клеточного метаболизма и могут самопроизвольно реагировать с ДНК, РНК, белком и липидами [6]. Окислительный стресс возникает, когда уровень АФК подавляет антиоксидантную защиту клетки [7]. Хорошо охарактеризованные селенопротеины включают семейства: глутатионпероксидаз; тиоредоксинредуктазы; иодтиронин-дейодиназы. Существенная роль селенопротеинов в деградации перекиси водорода, поддержании клеточного окислительно-восстановительного статуса, регуляции транскрипции и деиодинации тиреоидных гормонов очевидна, но еще предстоит выяснить несколько дополнительных неизвестных биохимических путей [8].

Информации относительно важности Se в женской репродукции очень мало [3]. Тем не менее, снижение рождаемости, возможно, связано с дефицитом Se, даже если целевой орган для действия Se в настоящее время неясен [1,9]. Se был связан с функцией в эпидемиологических исследованиях, но биохимический путь не был идентифицирован. Было продемонстрировано, что ограничение питательных веществ и/или уровень Se в рационе матери влияют на пролиферацию клеток в фолликулах, кровеносных сосудах и стромальных тканях в яичниках плода овец [10], а дефицит Se дополнительно приводит к дегенерации яичников и атрезии фолликулов у крыс [11]. Есть много факторов, которые контролируют рост ооцитов и созревание фолликулов, в том числе: дисбаланс питания; гормональные нарушения; и, физические условия микроокружения, из которых окислительный стресс является важным компонентом [4]. Считается, что повышенные уровни АФК, которые нарушают баланс оксидантов и антиоксидантов в перитонеальной жидкости, приводят к бесплодию у женщин, где другие этиологические факторы не идентифицированы [12].

Функция яичников была широко изучена у крупного рогатого скота. Фолликулы обычно классифицируются в соответствии с их стадией роста как: первичные фолликулы, содержащие ооцит, окруженный одним слоем уплощенных прегранулозных клеток; после активации как первичные фолликулы, с одним слоем кубовидных гранулезных клеток; как преантральные фолликулы с увеличивающимися слоями гранулезных клеток; и, после образования заполненного фолликулярной жидкостью антрального слоя и специализированного фекального слоя, как антральные фолликулы. На антральных стадиях ооцит окружен специализированными клетками, называемыми кучевыми клетками (или кумулюсные клетки). Гранулезные клетки поддерживают рост ооцита, а в позднем фолликулярном развитии выделяют эстрогены, которые необходимы для нормальной репродуктивной функции. Большинство яичниковых фолликулов не созревают до овуляции, а скорее подвергаются атрезии [7]; это характеризуется в первую очередь апоптозом гранулезных клеток. В настоящем исследовании термины «маленький» и «большой» используются для описания антральных фолликулов размером менее 4 мм и более 10 мм соответственно.

Изменения в женском яичнике в течении месячного цикла

Во время фолликулярной волны роста, увеличение уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ или англ. FSH - Follicle-stimulating hormone) вызывает дальнейший рост и дифференцировку когорты фолликулов диаметром более 4 мм. Из этой когорты только один фолликул будет выбран в качестве доминирующего фолликула и продолжит расти за пределы 8 мм. Доминирующий фолликул может овулировать, тогда как все остальные фолликулы подвергаются атрезии [13,14]. Следовательно, когорты фолликулов требуют повышенных концентраций ФСГ, в то время как доминантный фолликул, напротив, имеет более высокую чувствительность к ФСГ, что подтверждается его усиленным ростом и синтезом эстрадиола в среде с низким уровнем ФСГ [15]. В этот момент доминантный фолликул требует частой стимуляции лютеинизирующим гормоном (ЛГ) для продолжения дифференцировки, ведущей к овуляции [16], после чего остатки стенки фолликула трансформируются в желтое тело. Понимание механизмов, с помощью которых один фолликул выбирается для доминирования, и понимание клеточных механизмов, которые позволяют переходить от ФСГ- к ЛГ-зависимой стадии развития в доминирующем фолликуле, имеет важное значение, поскольку состояние яичников, приводящее к ановуляции,  является одной из основных причин бесплодия как у крупного рогатого скота, так и у человека [17,18,19].

Новые технологии, такие как трехмерная ультрасонография и магнитно-резонансная томография, ультразвуковая биомикроскопия и методы на основе синхротрона, могут улучшить для нас картину функции яичников в реальном времени до околоклеточного уровня [20]. Использование синхротронного света в медицинской визуализации редко используется для изображения ткани яичников любого вида, и механизмы распределения Se у млекопитающих не были всесторонне исследованы, за исключением исследования роли глутатионпероксидазы 4 (GPX4) в созревании сперматозоидов у мышей [21,22,23]. Способность зондировать in situ биоаккумуляцию микроэлементов в определенной структуре яичников или типе клеток может обеспечить беспрецедентное понимание биохимии этого органа. Поэтому мы провели рентгенофлуоресцентную визуализацию (англ. XRF-анализ) яичников крупного рогатого скота и сосредоточились на Se. С помощью дополнительных исследований мы выявили основной селенопротеин в яичниках и определили возможную роль этого селенопротеина.

Материалы и методы

Сбор образцов для анализа XRF

Яичники были получены из скотобойни T & R Pastoral, Мюррей Бридж, Южная Австралия. Яичники были собраны у небеременных телок одомашненного подвида Bos Taurus (n = 32) и попарно собраны в ледяной сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) и доставлены во льду в лабораторию. Для рентгенофлуоресцентной визуализации срезы были разрезаны продольно пополам, заморожены и сохранены в OCT компаунде (ProSciTech, Thuringowa, QLD, Австралия) при -80°C до секционирования.

Сбор образцов для анализа ICP-MS

Пара яичников была взята от небеременной телки на скотобойне T&R Pastoral, Murray Bridge, Южная Австралия и впоследствии рассечена для получения образцов ткани, представляющих желтое тело и фолликулярную стенку (гранулезы и текальные клетки (тека клетки)). Первый яичник иссекали для получения трех репрезентативных образцов желтого тела (стадия III). Второй яичник иссекали для получения клеток тека / гранулезы из всех его фолликулов, причем первый образец содержал слои тека / гранулезы из одного 9 мм фолликула, а второй образец содержал объединенные слои клеток тека / гранулезы из четырех оставшихся фолликулов: 6 мм, 7 мм, 7 мм и 10 мм. Образцы взвешивали, регистрировали влажный вес, а затем высушивали сублимацией в течение шести часов, после чего регистрировали сухой вес.

Гистология и подготовка ткани для анализа XRF

Каждый OCT-встроенный яичник был разрезан на толщину 30 мкм для XRF-анализа и на смежные срезы 6 мкм для H&E-окрашивания. Секционирование проводили на криостате Leica CM1800 (Adeal Pty. Ltd., Altona North, Vic, Австралия). Каждая секция XRF была перенесена на тонкую пленку Ultralene (SPEX SamplePrep, Нью-Джерси, США), прикрепленную к фотографической слайд-рамке 24 × 36 мм с помощью пинцета из нержавеющей стали и синтетической кисти типа Filbert. Затем ткань сушили в эксикаторе в вакууме в течение ночи и хранили в эксикаторе до анализа. Срезы, предназначенные для окрашивания H&E, устанавливали на предметные стекла, обработанные 0,01% поли L-орнитин гидробромидом (Sigma-Aldrich Pty. Ltd., Касл-Хилл, Новый Южный Уэльс, Австралия), и хранили при -20°C до использования.

Классификация фолликулов

Окрашенные H&E срезы фолликулов наблюдали с помощью световой микроскопии и оценивали как здоровые или атретические на основании морфологии гранулезной оболочки и процента пикнотических ядер, как описано ранее [24,25].

Рентгеновская флуоресцентная визуализация

Распределение элементов по выбранным 30 мкм срезам яичников крупного рогатого скота отображали на рентгенограмме XFM в австралийском синхротроне, Clayton, VIC, Австралия. Падающий пучок рентгеновских лучей с энергией 15,75 кэВ (килоэлектронвольт) был выбран для того, чтобы вызвать ионизацию K-оболочки элементов с атомными номерами ниже 37 (Z ≤ Rb), обеспечивая при этом адекватное отделение пиков Рэлея и Комптона от интересующей элементной флуоресценции, то есть Se.  Падающий пучок фокусировался на пятно ~2 мкм (тонкое сканирование) или ~6 мкм [грубое сканирование (полная ширина при половинном максимуме)] с использованием пары зеркал Киркпатрика-Баэза, и образцы были отсканированы «на лету» через рентгеновский фокус. Полученный XRF был получен в режиме событий с использованием 384-канального детектора Maia XRF с малой задержкой (расположенного в геометрии обратного рассеяния), и полные спектры XRF были использованы для восстановления элементных карт образца с использованием виртуального размера пикселя 2 или 6 мкм (точное и грубое сканирование соответственно).

Эффективное время задержки на пиксель для тонкого и грубого сканирования составило 7,81 мс или 2,44 мс соответственно, и наибольшее сканирование, изображенное в этой рукописи, имело размер 1291 × 1579 пикселей. Одноэлементные фольгированные Mn- и Pt-пленки (Micromatter, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) были отсканированы в той же геометрии и использовались в качестве справочных материалов для установления количественного содержания элементов.  Деконволюция данных Maia была выполнена с использованием GeoPIXE v6.5h (CSIRO, Австралия), который включает матрицу линейного преобразования для выполнения спектральной деконволюции [26]. Спектры были откалиброваны с использованием измерений металлической фольги и поправок, сделанных для самопоглощения в образце, поглощения в воздухе и эффективного отклика детектора [27]. Обнаруженные рентгеновские фотоны из каждого пикселя были связаны с выходом флуоресценции расчетной модели для предполагаемого состава и толщины образца. Состав и толщина пленки Ultralene были известны из спецификаций производителя, а состав и средняя плотность, типичные для высушенного органического материала (C₂₂H₁₀N₂O₄ и 1,42 г см^-3 соответственно), использовались для моделирования ткани. Эффекты поглощения для XRF от элемента с наименьшим атомным номером, относящегося к этому исследованию (Ca Kα), были незначительными для этого типа образца.

ICP-MS гранулезных и текальных клеток и желтого тела

Три образца вместе с двумя образцами стандартной говяжей печени NIST 1577b (Гейтерсберг, Мэриленд, США) были взяты в лабораторию Земли и Воды CSIRO (Glen Osmond, SA, Австралия) для кислотного расщепления с помощью микроволнового излучения. Вкратце, образцы подвергали холодному перевариванию в течение ночи в 7 мл концентрированной азотной кислоте (Fisher Scientific AR Grade 70%, VIC, Австралия) и в 3 мл концентрированной H₂O₂ (Chem Supply AR Grade 30%, SA, Австралия). Все растворы подвергались стандартизированному 105-минутному перевариванию в лабораторной микроволновой печи, при этом температура постепенно увеличивалась до 180°C, а затем поддерживалась при этой температуре для обеспечения полного переваривания. После адекватного охлаждения полученные дайджесты разбавляли до 50 мл с использованием MilliQ-воды. Затем дайджесты аккуратно пропускали через раствор прибора ICPMS (Agilent 7500cs with Octopole Reaction System, Mulgrave, VIC, Австралия) с обнаружением второго по распространенности изотопа Se, а именно 78Se, избегая помех от 40Ar2. Калибровочные стандарты, составленные из многоэлементного раствора, были проведены до образцов крупного рогатого скота, и результирующая кривая дала коэффициент корреляции 0,9993 для 78Se. Концентрации были указаны в мг / кг относительно сухого веса материала.

Анализ микромассивов (микрочипов)

Ранее собранные данные микрочипов [28], депонированных в GEO (Омнибусе Экспрессии Генов) под инвентарными номерами GSE39589 и GSE49505, были исследованы для сравнения значений средней интенсивности для экспрессии 19 различных селенопротеинов как в текальных, так и в гранулезных клетках малых здоровых, больших здоровых и малых атретических яичников крупного рогатого скота (дополнительный набор данных 2). На основании анализа данных XRF стало очевидно, что представляющие интерес виды Se локализованы в клетках гранулезы и имеют заметно более высокие концентрации в крупных здоровых фолликулах. Дополнительная таблица 1 содержит сводную информацию о селенопротеинах, рассмотренных для дальнейшего анализа, с подробной легендой, указывающей наиболее вероятных кандидатов для видов, изображенных с помощью XRF.

Краткий список потенциальных белков Se, регулируемых в гранулезных клетках здоровых крупных фолликулов, был определен из анализа микрочипов как: GPX1, GPX3, SEP15, VIMP, SELK, SELT, SELM и SEPHS2. Список был дополнительно сужен за счет исключения тех селенопротеинов, для которых up-регуляция (повышение) была незначительной (указано курсивом) в обеих группах (SEP15) или незначительной в одной группе и умеренной (отмечено подчеркиванием) в другой (SELK, SELT и SEPHS2), оставляя : GPX1, GPX3, VIMP и SELM.

Экстракция РНК и синтез кДНК

Общая РНК была выделена из клеток гранулезы с использованием реагента «Тризол» в соответствии с инструкциями производителя. Количество общей РНК определяли спектрофотометрически (поглощение при 260 Нм; 1000v 3.3 спектрофотометр, NanoDrop Technologies Inc., Уилмингтон, Делавэр, США).  Два микрограмма РНК обрабатывали ДНКазой (DNA-free, Ambion, Supplied by Applied Biosystems, Мельбурн, VIC, Австралия). Комплементарную ДНК (кДНК, 20 мкл) синтезировали в соответствии с инструкциями производителя, используя 500 нг случайных гексамеров (GeneWorks, Adelaide, SA, Австралия), смесь 10 нМоль dNTP, 20U RNaseOUT и 200U Superscript III RT (Life Technologies, Mulgrave, VIC, Австралия). РНК, случайные гексамеры и dNTPs (дезоксинуклеотидтрифосфаты) предварительно инкубировали при 65°C в течение 5 мин перед добавлением к реакционной смеси, включающей 4 мкл 5-кратного буфера первой цепи, 1 мкл 0,1М дитиотреитола, 4U ингибитор РНКазы (RNaseOUT) (Life Technologies) и фермент, с последующей инкубацией при 50°С в течение 60 мин, а затем при 70°С в течение 15 мин для инактивации ферментов перед полимеразной цепной реакцией (ПЦР или англ. PCR).

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR) в реальном времени

Для идентификации видов Se, визуализированных в гранулезе с помощью XRF, количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией ОТ-ПЦР (или англ.RT-PCR) в реальном времени для GPX1, GPX3, VIMP и SELM проводили на клетках гранулезы, полученных из маленьких здоровых (n = 5), маленьких атретических (n = 5) и крупных здоровых (n = 5) фолликулов. Все праймеры были разработаны с использованием программного обеспечения «Primer Express» (Life Technologies) (дополнительная таблица 2). Экспрессия для каждого гена была нормализована до экспрессии гена 18S рРНК, и наши результаты выражены как фмоль мРНК на нмоль 18S рРНК.  ПЦР проводили с использованием Corbett Rotor Gene 6000 (Qiagen, Hilden, Germany) с 2 мкл разведенной кДНК в SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Каждый прогон выполняли с водяными заготовками и РНК с обратной транскрипцией в качестве отрицательного контроля. Образцы амплифицировали в двух экземплярах с начальной денатурацией при 95°С в течение 10 мин, затем последовало 40 циклов 2-ступенчатой амплификации при 95°С в течение 15 С и 60°С в течение 60 С. Концентрацию каждой мишени получали из значения КТ (Ct) и стандартной кривой (эффективность амплификации > 0,9) и нормировали к концентрации 18S рибосомной РНК в каждом образце (рассчитывали по КТ и стандартной кривой для 18S). Для каждой реакции ПЦР проводили анализ кривой расплава для подтверждения правильности амплификации продукта на основе исходного гель-электрофореза и секвенирования ДНК.

Статистический анализ

Все статистические расчеты были выполнены с использованием SPSS версии 20 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США). Для данных ICP-MS результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для сравнения уровня экспрессии генов между гранулезными клеточными группами использовался односторонний анализ ANOVA Крускала-Уоллиса и специальные тесты Манна-Уитни.

Иммуногистохимия

Части ранее собранных коровьих яичников использовали для локализации с использованием метода непрямой иммунофлюоресценции. Замороженные участки ткани высушивали под вакуумом в течение 5 мин, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 5 мин и трижды промывали в течение 5 мин в гипертоническом забуференном физиологическом натрий-фосфатном  растворе (PBS) (10 Мm фосфат натрия / калия с 0,274 М NaCl и mМ KCl, рН 7,2) перед обработкой блокирующим раствором (10% нормальная ослиная сыворотка [D-9663; Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA] в разбавителе антител, содержащем 0,55 М NaCl и 10 mМ фосфата натрия, рН 7,1) в течение 30 мин при комнатной температуре. В качестве первичных антител использовали поликлональный кроличий анти-человеческий VIMP (разведение 1:100; NBP1- 89558; Novus Biologicals, распространяемый Sapphire Bioscience Pty. Ltd., Waterloo, NSW, Australia) в сочетании с крысиным антимышиным Perlecan A7L6 (разведение 1:100; Millipore Pty. Ltd., Kilsyth, VIC, Australia). Срезы яичников инкубировали с первичными антителами в течение ночи при комнатной температуре. После трех промывок PBS срезы яичников инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с FITC-конъюгированным ослиным анти-крысиным AffiniPure (#712-096-153) и биотин-SP-конъюгированным ослиным анти-кроличьим IgG AffiniPure (#711-065-152) ) и после трех промывок PBS, затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с Cy3-конъюгированным стрептавидином (# 016-160-084). Все вторичные антитела и конъюгированные стрептавидины были приобретены в Jackson ImmunoResearch Laboratories (распространяется Abacus ALS Australia, Brisbane, QLD, Australia) и использовались в разведениях 1:100. Наконец, срезы обрабатывали раствором ядерного красителя 4',6-диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорида (DAPI) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) для идентификации ядер клеток. Покровные стекла были прикреплены с помощью монтажной среды для флуоресценции (S3023; Dako, Carpinteria, CA, USA) и сфотографированы с помощью микроскопа Olympus BX50 (Olympus, Токио, Япония) с насадкой для эпифлуоресценции и цифровой камерой Spot RT (диагностические инструменты, Sterling Heights, Мичиган, США).

Экстракция белка и вестерн-иммуноблоттинг

После сбора (ранее описанного) фолликулы иссекали из каждого яичника и измеряли диаметр. Небольшой кусочек стенки фолликула, приблизительно 1 мм³, удаляли и фиксировали в 2,5% глутаральдегиде в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,25) для последующей классификации состояния здоровья фолликула [29]. ​​Клетки гранулезы удаляли из оставшейся части фолликулов. Cолевой раствор Хэнка HBSS без Mg²⁺ и Ca²⁺, содержащий клетки гранулезы, центрифугировали при 500×g в течение 7 минут при 4°C, среду удаляли аспирацией и клетки дважды промывали в PBS pH 7,4, а затем замораживали при -80°C.

После фиксации в течение ночи части стенки фолликула каждого фолликула промывали несколько раз 0,1 M PBS, рН 7,25, после фиксации в 2% (v/v) водном тетроксиде осмия в течение 1 ч при 4°C и заделывали в эпоксидную смолу, как описано ранее [30]. Для светового микроскопического исследования эпоксидные срезы толщиной 0,5 мкм были разрезаны с использованием стеклянного ножа и ультрамикротома Richert-Jung Ultracut E (Leica Microsystems Pty Ltd., VIC, Австралия), окрашенных 1% (w/v) водным метиленовым синим и исследовали с помощью микроскопа Olympus BX50 (Olympus Australia Pty Ltd., МТ Уэверли, Виктория, Австралия). Здоровые и атретические фолликулы идентифицировали, как описано ранее [24,31], где здоровые фолликулы имели менее 5% клеток апоптотической гранулезы, а атретические фолликулы имели более 5% клеток апоптотической гранулезы. Только гранулезные клетки из здоровых фолликулов были исследованы на экспрессию GPX1.

Для вестерн-блоттинга использовали девять образцов клеток гранулезы (маленькие здоровые фолликулы, n = 4, 3-5 мм и большие здоровые фолликулы, n = 5, 13,5 мм ± 0,8 мм) от девяти различных животных. Общий белок экстрагировали из образцов с использованием буфера RIPA [1 % NP-40, 1% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,15 M хлорида натрия, 50 mM Трис-соляной кислоты и 1 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA)], содержащего 1 мкл коктейля ингибиторов протеаз (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) на 100 мкл. Клетки в буфере RIPA разрушали с помощью импульса в течение 5 с при 3500 об / мин, используя гомогенизатор MO BIO Powerlyzer 24 (MO BIO, Carlsbad, Ca, USA). Гомогенаты центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут, чтобы осадить нерастворимый материал, и супернатанты отбирали для анализа. Белки определяли количественно с использованием метода Брэдфорда (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) и 20 мкг белка для каждого образца разделяли на 4-15% градиенте SDS-PAGE-геле и затем переносили в течение ночи при 4°C на поливинилиденфторидную (PVDF) трансферную мембрану (Amersham Hybond TM-P, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) при постоянном напряжении (33 В). Все промывки и инкубации мембран проводили при комнатной температуре. Мембрану PVDF трижды промывали в течение 5 минут трисбуферизованным солевым раствором, содержащим 0,1% Твин-20 (TBS-T; 50 мМ Трис, 100 мМ хлорид натрия, рН 7,5, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Неспецифическое связывание ингибировали путем инкубации с 10% обезжиренного молока в TBS-T в течение 1 часа. Для обнаружения GPX, мембраны затем инкубировали с кроличьим анти-GPX1-антителом (ab22604, Abcam, Cambridge, UK) в течение 2 часов при разведении 1 на 1000 в 10% обезжиренном молоке / TBS-T. После инкубации мембраны снова промывали и затем инкубировали (в течение 1 часа) с козьим анти-кроличьим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, разведенным 1:10 000 в 10% солевом растворе обезжиренного молока / трис-буфере и Tween (TBS-T), затем промывали пять раз (3 × 30 с, 1 × 5 минут и 1 × 10 минут мытья) с TBS-T. Для обнаружения актина мембраны инкубировали в течение 2 ч с моноклональным анти-β-актин-пероксидазным антителом (A3854, Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), разведенным 1:20 000 в 10% обезжиренном молоке / TBS-T. Затем мембраны промывали пять раз (3 × 30 с, 1 × 5 минут и 1 × 10 минут при комнатной температуре) в трис-буферном солевом растворе с 0,5% Твин-20 и 0,1% SDS. Наконец, все мембраны инкубировали с реагентом для определения блоттинга ECL ClarityTM Western в течение 5 минут и подвергали воздействию Amersham HyperfilmTM ECL (GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания) для обнаружения белка методом хемилюминесценции.

ЭКО и Кучевые Клетки Человека

Детали сбора клеток кумулюса человека были такими же, как и ранее, за исключением того, что выделение РНК было другим [32]. Этическое разрешение на использование образцов человека было получено в Комитете по этике исследований женской и детской больницы, Аделаида, Австралия и Научно-консультативного комитета Repromed, Аделаида, Австралия. Письменное согласие на использование клеток кумулюса для исследований было получено от тридцати пациентов, перенесших процедуру ЭКО / ИКСИ с однократным переносом эмбрионов (SET) с использованием их собственных гамет в Репромед, Далвич, Южная Австралия. Пациентки с клиническими проявлениями синдрома поликистозных яичников в данное исследование не включались. Всех пациенток стимулировали с использованием длительного протокола подавления, включающего введение аналога гонадотропин-рилизинг-гормона (Nafarelin (Synarel), Organon, Австралия), подтвержденного уровнем эстрогена в крови ниже 0,2 нМ / л. Рекомбинантный ФСГ (Gonal-F, Сероно, Сидней, Австралия или Puregon, Органон, Сидней, Австралия) вводили в течение 9-12 дней под контролем ультразвука, пока ведущий фолликул не достигал размера 18 мм. Затем пациентам вводили 5000 МЕ хорионического гонадотропина человека (Прегнил, Органон, Сидней, Австралия) через 36 часов. Кумулюс-ооцитные комплексы из фолликулов размером более 14 мм собирали с использованием трансвагинального ультразвука и иглы 17-го калибра.

Культивирование проводили при 37°C, 6% CO₂, 5% O₂, 89% N₂, в увлажненной атмосфере, при этом манипуляции проводили при 37°C, 6% CO₂. Кумулюс-ооцитные комплексы промывали в среде GFERTplus с добавлением глюкозы (2,5 мМ глюкозы) и хранили в 1 мл той же среды в течение 3 ч после сбора ооцитов как для ЭКО, так и для ИКСИ-осеменения. Наружные слои клеток кумулюса (кучевых клеток) обрезали иглой 30 калибра и собирали индивидуально перед осеменением и хранили при -80°С. Ооциты, подвергающиеся ИКСИ, подвергали воздействию гиалуронидазы 75 мЕ (Hyalase®, Aventis Pharma Pty Ltd, Lane Cove, Австралия) в GFERT с добавлением глюкозы, а затем проводили ИКСИ в среде G1.3 plus и культивировали отдельно в каплях 10 мкл той же среды под маслом для 16-18 ч. Ооциты, перенесшие ЭКО, имели внутренние слои кумулюса, оставшиеся неповрежденными, и их совместно инкубировали с 1000 подвижных сперматозоидов в 10 мкл капель среды GFERT-plus с добавлением глюкозы под маслом в течение 17-19 часов. Все ооциты культивировали индивидуально, оплодотворение оценивали через 16-19 ч после осеменения, и эмбрионы с двумя пронуклеусами продолжали культивировать индивидуально в 10 мкл капель среды G1.3 Plus под маслом в течение следующих 48 часов. Эти эмбрионы затем тщательно промывали в среде G2.3 Plus и культивировали еще 48 часов, а затем переносили в свежую среду G2.3 для последних 24 часов культивирования.

Перенос эмбрионов осуществляли на 2/3-й день или 4/5-й день для расширенной культуры. Для отбора эмбрионов для переноса использовали стандартизированные морфологические оценки качества эмбрионов на 2-й день, и во всех случаях переносили один эмбрион самого высокого морфологического качества. На 2-й день после стадии оплодотворения оценка морфологии была основана на количестве клеток, степени фрагментации и наличии многоядерных клеток. Клиническая беременность определялась наличием сердцебиения плода через 6 недель после переноса эмбрионов. Результаты родов были получены от акушера, ответственного за уход за пациентом. Акушеры указали даты родов, вес при рождении, пол и наличие каких-либо вмешательств или осложнений со стороны матери или новорожденного.

Выделение РНК из клеток кумулюса человека и ОТ-ПЦР в реальном времени

Все реагенты для выделения РНК, синтеза кДНК и ПЦР в реальном времени были приобретены у Life Technologies (Уэверли, Вик, Австралия), если не указано иное. РНК кумулюсных клеток экстрагировали с использованием Тризола в соответствии с инструкциями изготовителя с включением 7,5 мкг гликолевой кислоты во время осаждения в течение ночи при -20°С. Тотальную РНК элюировали в 20 мкл буфера для элюции, затем обрабатывали 2 ед. ДНКазы I в течение 30 мин при 37°С для удаления геномной ДНК. Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из 30–300 нг общей РНК с использованием случайных гексамерных праймеров (Geneworks, Adelaide, Australia) и обратной транскриптазы Superscript III. Тесты экспрессии генов Taqman, содержащие специально разработанные праймеры и FAM-меченный зонд, были приобретены для генов человека MRPL19 (# Hs00608519_m1) и GPX1 (# Hs00608519_m1). ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в двух экземплярах для каждого образца на Corbett Rotor Gene 6000 (Corbett Life Science, Qiagen). В каждой реакции добавляли кДНК (эквивалентную 5 нг общей РНК), 0,2 мкл анализа Taqman и 5 мкл мастер-смеси Taqman с добавлением H₂O до конечного объема 10 мкл. Условия циклирования ПЦР составляли 95°С в течение 10 мин, после чего следовали 40 циклов амплификации при 95°С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин. Контроли включали пропуск матрицы кДНК или фермента RT в завершенных реакционных смесях; каждый из них не показывал признаков амплификации продукта. Экспрессия GPX1 была нормализована к гену MRPL19 путем вычисления отношения 2-ΔCt. Значения, полученные для беременных и небеременных групп, сравнивали статистически с помощью двустороннего T-критерия Стьюдента, предполагая равную дисперсию в SPSS v 20.

Результаты

Рентгенография фолликулов крупного рогатого скота

Пилотное исследование, в ходе которого были собраны изображения элементного распределения XRF для всего разреза одного яичника, привело к гипотезе, что Se активно мобилизовался в область клеток тека / гранулезы крупных фолликулов (рис. 1). Рентгенофлуоресцентная визуализация была впоследствии использована для получения изображения ключевых структурных особенностей в поперечных срезах яичников крупного рогатого скота 45 различных животных, включая: гранулезу и текальные клетки исходных, первичных, преантральных и антральных фолликулов, включая здоровые фолликулы и те, которые подвергаются атрезии; желтое тело на разных стадиях развития [стадии от I (ранние) до IV (регрессивные)] [33]; corpus albicans (регрессирующая форма желтого тела); артериолы; сосуды; и, капилляры. Качественные тренды распределения элементов были определены для Fe, Zn и Se, причем все яичники демонстрировали сильные сигналы и отчетливые локализации первых двух элементов. Zn постоянно присутствовал во всей ткани яичника, но повышался вокруг артериол и капилляров, тогда как Fe был сконцентрирован в желтом телеце и кровеносных сосудах (неопубликованные наблюдения).

Рис. 1.  Распределение Zn, Fe и Se в срезе яичника крупного рогатого скота по изображению μ-XRF. Сравнение с соседней свежезамороженной тканью (а) показывает, что области высокой интенсивности Zn (b, розовый) соответствуют артериолам и капиллярам; высокое Fe (с, розовый) соответствует желтым телам; и высокий Se (d, розовый) локализуется в гранулезных клеточных слоях двух крупнейших здоровых фолликулов. Максимальные значения пикселей для Zn, Fe и Se составляют 63,7, 329 и 3,61 ppm соответственно. Знак ∇ указывает на атретический фолликул; * указывает на здоровый антральный фолликул; ----- указывает на желтое тело; ← указывает на сосудистую систему. Шкала: 4 мм.

---

Было обнаружено, что Se локализован в слое гранулезных крупных здоровых клеток фолликулов (Рис. 2b), с регулярностью и интенсивностью, которая не наблюдались у мелких (< 4 мм), мелких-средних (4 - 8 мм), средних-крупных (8-10 мм) или, наоборот, крупных атретических аналогов (Рис. 2d). Сигналы Se в больших фолликулах наблюдались у 100% здоровых (n = 10), тогда как только 30% атретических фолликулов (n = 10) показали Se. Сигнал Se не наблюдался в больших регрессирующих фолликулах (n = 2) (дополнительный набор данных 1).

Рис. 2. Локализация Zn, Fe и Se в крупных антральных фолликулах. (а) H&E окрашенный серийный срез здорового фолликула диаметром 15 мм. (b) Соответствующее изображение RGB было сгенерировано из карт распределения элементов XRF и показывает распределение Zn (зеленый), Fe (красный) и Se (синий). Размер виртуального пикселя для этого тонкого сканирования составлял 2 мкм с эффективным временем задержки на пиксель 7,81 мс. Максимальные значения пикселей для Zn, Fe и Se составляют 22,4, 189 и 5,19 ppm соответственно. (c) H&E окрашенный серийный срез атретического фолликула 11 мм. (d) Соответствующее изображение RGB было сгенерировано из карт распределения элементов XRF и показывает распределение Zn (зеленый) и Fe (красный). Se не был обнаружен. Максимальные значения пикселей для Zn и Fe составляют 87 и 343 ppm соответственно. Размер виртуального пикселя для этого тонкого сканирования составлял 5 мкм с эффективным временем задержки на пиксель 2,44 мс. * указывает на сосудистую сеть; ----- указывает на разделение между гранулезным слоем и текальным слоем; gc обозначает гранулезные клетки. Масштабная линейка: 500 мкм.

Количественное определение Se с использованием ICP-MS

Для подтверждения повышенных уровней Se, наблюдаемых с помощью рентгеновской визуализации, у небеременной телки отбирали пару неплодородных яичников и затем препарировали с получением образцов, представляющих желтое тело (n = 3) и стенку фолликула (гранулезу и текальные клетки) (n = 2). В качестве стандарта концентрации использовали говяжью печень Национального института стандартов и технологий (NIST) (1577b). Одни только клетки гранулезы могли обеспечить недостаточную массу для пищеварения, и, таким образом, была рассечена вся стенка фолликула (слои теки и гранулезы). Все образцы были высушены вымораживанием (сублимацией) и подвергнуты кислотному расщеплению при СВЧ-воздействии до растворенной фазы ICP-MS. Было обнаружено, что концентрация Se, определенная в печени NIST (1577b), составляет 0,8 ± 0,03 ppm, что находится в пределах диапазона сертификации. Средняя концентрация Se для образцов Corpus lutea («желтого тела») составила 2,6 ± 1,3 ppm по сравнению со средней экспериментально определенной концентрацией для стенки фолликула 26 ± 5,0 ppm. Этот результат поддерживает качественное наблюдение XRF, что большие здоровые фолликулы содержат богатый Se компонент в отличие от желтых тел, для которых этот элемент не был обнаружен.

Анализ данных микрочипов

Ранее собранные данные микрочипов, депонированные в Омнибусе Экспрессии Генов (GEO) под регистрационными номерами GSE39589 и GSE49505,28 были исследованы для идентификации кандидатов селенопротеинов (дополнительный набор данных 2), которые могли бы объяснить высокие уровни Se, наблюдаемые в экспериментах XRF и ICPMS. Мы определили четыре потенциальных кандидата, которые были дифференциально выражены между малыми и большими здоровыми фолликулами, а также малыми атретическими и большими здоровыми фолликулами: GPX1, GPX3, VIMP и SELM (дополнительная таблица 1).

ПЦР гранулезной кДНК

Количественная ОТ-ПЦР для GPX1, GPX3, VIMP и SELM в клетках гранулезы из маленьких здоровых (n = 5) и атретических (n = 5) и крупных здоровых (n = 5) фолликулов показала только значительную активацию GPX1 у крупных здоровых фолликулы по сравнению с маленькими здоровыми или атретическими фолликулами (P <0,05) (рис. 3).

Иммуногистохимическая локализация VIMP в срезах яичников

Иммуногистохимия селенопротеина VIMP (VCP-interacting membrane selenoprotein) в крупных фолликулах групного рогатого скота показала, что он экспрессируется в слое гранулезных клеток крупных здоровых фолликулов (Рис. 4b) и в меньшей степени в слое гранулезных клеток крупных атретических фолликулов (Рис. 4d). Кроме того, VIMP также экспрессируется в слое текальных клеток крупных здоровых фолликулов.

Обнаружение GPX1 в различных типах фолликулярных клеток

На Рис.5 изображен вестерн-иммуноблоттинг белков клеток гранулезы. Рис. 5a и b показывают, что ни один из образцов клеток малых фолликулярных гранулез не имел измеримых уровней GPX1, в то время как три из пяти образцов больших фолликулов были положительными в отношении GPX1.

GPX1 в кучевых клетках из ооцитов человека

Было обнаружено, что экспрессия GPX1 значительно выше в клетках кумулюса, выделенных из комплексов кумулюсных ооцитов человеческих фолликулов, где ооцит (яйцеклетка) дал успешную беременность (рис. 6).

Рис. 3. Средние уровни мРНК селенопротеина. Средние уровни ± SEM (a) GPX1, (b) GPX3, (c) VIMP и (d) мРНК SELM относительно рибосомальной РНК 18S в клетках гранулезы, полученных из маленьких здоровых, маленьких атретических и крупных здоровых фолликулов (n = 5 фолликулов на группа). * обозначает статистически значимое различие между группами (P <0,05).

Рис. 4. Иммуноокрашивание VIMP в крупных фолликулах. (а) H&E серийного разреза большого здорового фолликула диаметром 15 мм. Квадрат показывает площадь, показанную в (b). Масштабная линейка: 250 мкм. (b) VIMP (красный) локализуется в слое гранулярных клеток (g) и слое текальных клеток (t). an указывает на антральную полость. Базальная пластинка (------), разделяющая два клеточных слоя, окрашивается на перлекан (зеленый). Ядра контрастируют с DAPI (синий). Масштабная линейка: 100 мкм. (c) H&E непрерывного последовательного разреза в большом 17 мм атретическом фолликуле. Квадрат идентифицирует область, показанную в (d). Масштабная линейка: 500 мкм. (d) VIMP (красный) локализуется в слое гранулярных клеток (g) и слое текальных клеток (t). Базальная пластинка (------), разделяющая два клеточных слоя, окрашивается на перлекан (зеленый). Масштабная линейка: 100 мкм.

Рис. 5. Вестерн-иммуноблоттинг GPX1 в клетках гранулезы из мелких и крупных здоровых фолликулов. Каждая полоса маркирует экстракты клеток гранулезы из отдельных фолликулов. (а) Экспрессия GPX1 (отмечена стрелкой, 20 кДа) в клетках гранулезы мелких здоровых фолликулов (n = 4, 3-5 мм). (b) экспрессия GPX1 (отмечена стрелкой, 20 кДа) в клетках гранулезы крупных здоровых фолликулов (n = 5, 13,5 мм ± 0,8 мм). (c) Соответствующая экспрессия актина (отмечена стрелкой, 37 кДа) в том же пятне, что и (a). (d) Экспрессия актина (отмечена стрелкой, 37 кДа) в том же пятне, что и (b).

Рис. 6. Экспрессия GPX1 в кучевых клетках (клетках кумулюса), выделенных из кумулюс-ооцитных комплексов ооцитов в программе ЭКО / ИКСИ, которая при переносе эмбриона либо приводила (n = 12), либо не приводила (n = 18) к беременности. * обозначает статистически значимое различие между группами (P <0,05).

Обсуждение

Экспрессия GPX1 зависит от состояния питания

Здесь мы представляем первую рентгенограмму яичников млекопитающих, показывающую, что Se постоянно локализован в клетках гранулезы крупных здоровых фолликулов. Последующие эксперименты, включая количественную ОТ-ПЦР в реальном времени и вестерн-иммуноблоттинг, идентифицируют источник Se как селенопротеин GPX1, повсеместный гомотетрамерный цитозольный фермент, экспрессируемый многими типами клеток у млекопитающих [3,34]. Экспрессия GPX1 была исследована в кучевых клетках, выделенных из кучево-ооцитарных комплексов ооцитов, подвергшихся ЭКО/ИКСИ, и обнаружена повышенной там, где ооциты дали успешную беременность.

GPX1 обильно содержится в печени и эритроцитах, причем его концентрация зависит от состояния питания Se. Он также является одним из наиболее высокочувствительных селенопротеинов, который изменяется с состоянием Se. Уровни мРНК и белка резко снижаются в условиях низкого уровня Se [35]. Однако следует отметить, что предыдущие исследования показали, что степень регуляции GPX1 варьируется от органа к органу при дефиците Se [36]. Помимо статуса Se, на экспрессию GPX1 влияют и другие факторы, включая окислительный стресс. Синтез GPX1, GPX3 и тиоредоксинредуктазы 1 (TR1) также регулируется в процессе синтеза тиреоидных гормонов, обеспечивая тироцитам значительную защиту от пероксидативного повреждения [3].

Селенопротеины, такие как GPX, могут бороться с окислительным стрессом во время развития фолликулов

Хотя роль Se в регуляции функции яичников у плода неясна [10], во взрослых яичниках было продемонстрировано, что прием Se может модулировать пролиферацию гранулезных клеток и синтез эстрадиола-17β in vitro [9,10,37]. Кроме того, его эффект может быть опосредованным, по крайней мере частично, посредством ингибирования оксида азота. Было показано, что культивирование преантральных фолликулов в присутствии селенита натрия повышает активность GPX и снижает уровни АФК, тем самым улучшая скорость развития фолликулов мыши in vitro [4]. Что касается тека, существуют данные, свидетельствующие о том, что антиоксиданты, такие как витамин Е и эбселен способны индуцировать апоптоз в клетках яичника крысы [38]. Это открытие может иметь важное клиническое значение для синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), состояния, связанного с чрезмерным ростом и активностью клеток кисты яичка [38]. Это состояние влияет на 5-10% женщин репродуктивного возраста, и появляются свидетельства того, что у женщин с СПКЯ на низком уровне часто наблюдается хроническое воспаление с возможным эффектом усиления окислительного стресса [39]. Недавнее исследование турецких женщин с СПКЯ показало, что уровни Se в плазме этих женщины были значительно ниже контрольных групп, что свидетельствует о том, что Se может играть роль в патогенезе этого состояния. Однако эти результаты следует противопоставить гораздо более ранним исследованиям, в которых предполагалось, что ингибирование окислительного стресса подавляет апоптоз гранулезных клеток в культивируемых фолликулах, что указывает на то, что воздействие антиоксидантов на апоптоз зависит от типа клеток [38,41]. Изучение потенциальной связи между фолликулостимулирующим гормоном ФСГ и глутатионом показало, во-первых, что наступлению апоптоза в преовуляторных фолликулах предшествует повышение фолликулярного АФК и, во-вторых, что лечение ФСГ повышает содержание фолликулярного глутатиона и подавляет уровни АФК [7]. Эти исследования дают веские основания для обоснования дальнейших исследований добавок селена у женщин, страдающих бесплодием.

Экспрессия GPX кажется уникальной для крупных фолликулов

Связь присутствия Se с размером фолликула и состоянием здоровья указывает на важную биологическую роль, наиболее вероятной функцией которой является то, что селенопротеины обеспечивают защиту от окислительного стресса и неизбежной атрезии или повреждения ДНК в ооците. В частности, самые высокие уровни Se и GPX1 наблюдались в клетках гранулезы крупных фолликулов, которые, как известно, экспрессируют более высокие уровни цитохрома P450s (расщепление боковой цепи холестерина и ароматазы) [42], что позволяет крупным доминантным фолликулам синтезировать прогестерон и эстрадиол-17β. Ферменты цитохрома P450 вырабатывают супероксидные анионы свободных радикалов и H₂O₂ как часть их механизмов [43], и, следовательно, их активация может представлять собой окислительный стресс, что требует экспрессии GPX для противодействия этому. Пытаясь охарактеризовать регуляцию апоптотической гибели клеток гранулезы в доминантных фолликулах крупного рогатого скота во время первой волны развития фолликула, исследователи пришли к выводу, что экспрессия GPX была самой высокой на 8-й день по сравнению с 4-м и 6-м днем ​​in vivo [44]. Однако в работе нет конкретного упоминания о форме идентифицированного GPX, что заставляет нас неохотно проводить сравнения с результатами нашей собственной количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Другие авторы сообщают, что GPX1 имеет самый высокий уровень экспрессии в клетках гранулезы самого эстрогенного фолликула до появления доминантного фолликула, а затем после появления доминантного фолликула имеет более высокие уровни, чем у подчиненных фолликулов [15]. Еще одно исследование, в котором использовались комбинация микрочипов и количественного ПЦР-анализа в реальном времени в попытке идентифицировать дифференциально экспрессируемые гены между самыми большими и вторыми по величине фолликулами, обнаружило активацию GPX3 в доминантном фолликуле, но не сообщала об уровнях GPX1 [45]. Эти экспериментальные наблюдения привели некоторых исследователей к гипотезе о том, что ферменты фолликулярного окислительного стресса экспрессируются в зависимости от стадии, поскольку экспрессия мРНК других ферментов антиоксидантного стресса в клетках гранулезы крупного рогатого скота была увеличена в атретических доминантных фолликулах по сравнению со здоровыми доминантными фолликулами  [44-45]. Тот факт, что экспрессия GPX1 была так сильно связана с крупными фолликулами в наших экспериментах, говорит о том, что этот антиоксидант может быть вовлечен в сигнальный процесс, ведущий к доминированию, или что он просто очищает АФК, которые в противном случае ускоряли бы атрезию в конкурирующих фолликулах, или что он защищает ооциты от повышения уровня АФК, связанного с увеличением стероидогенеза в созревающих фолликулах. Последнее подтверждается нашими результатами, показывающими повышенные уровни GPX1 в кучевых клетках, связанных с ооцитами с большей способностью вызывать беременность.

VIMP может играть роль в развитии фолликулов КРС

Человеческий селенопротеин VIMP (VCP-Interacting Membrane Selenoprotein или VCP-взаимодействующий мембранный селенопротеин) / SelS (селенопротеин S) локализуется на мембране эндоплазматического ретикулума (ER) и участвует в процессе ER-ассоциированной деградации (ERAD). Данные показывают, что селеноцистеин позволяет селенопротеину S (SelS, VIMP) поддерживать активность при окислительном стрессе.

Иммуноокрашивание для селенопротеина VIMP показало, что он в основном локализован в клетках гранулезы крупных здоровых и атретических фолликулов, а также экспрессируется в текальных слоях. Это не противоречит низким уровням экспрессии, наблюдаемым в экспериментах с ПЦР, но предполагает, что этот селенопротеин обеспечивает небольшой вклад в сильную специфическую флуоресценцию гранулезных клеток, которую мы наблюдаем при визуализации XRF. Выравнивание последовательности антител VIMP с Bos taurus GPX1 показывает только 2% идентичности последовательности, исключая возможность того, что это антитело перекрестно реагирует с более распространенными членами семейства GPX. Взятые вместе с нашими результатами экспрессии генов в результате количественной ОТ-ПЦР в реальном времени, мы заключаем, что VIMP не локализован исключительно на гранулезе крупных фолликулов (различия в экспрессии генного сигнала между маленькими здоровыми, маленькими атретическими и крупными здоровыми гранулезами были не были значительными), и при этом он недостаточно выражен по сравнению с GPX1. Это говорит о том, что другие селенопротеины присутствуют на фоновых уровнях по всей ткани яичника, но только GPX1 находится в достаточно высоких концентрациях, чтобы их можно было наблюдать с помощью рентгеновской визуализации. Кроме того, экспрессия VIMP не сильно зависит от стадии фолликулярного развития.

Вычислительный анализ вторичной структуры показывает, что VIMP представляет собой единую трансмембранную спираль, а электронно-микроскопическое иммуноокрашивание показывает, что этот вид представляет собой мембранный белок плазмы и эндоплазматического ретикулума (ER) [46,47]. Было предложено участвовать в удалении неправильно свернутых белков из просвета ER для деградации [48] и защищать клетки от окислительного повреждения [49] и стресс-индуцированного апоптоза ER [50]. Дальнейшие экспериментальные результаты приводят к заключению, что селеноцистеиновая часть белка может снижать восприимчивость липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) к окислению [49]. Отрицательная ассоциация была обнаружена между VIMP и бактериальной липополисахарид-индуцированной продукцией АФК, что указывает на то, что VIMP играет важную роль в воздействии на воспалительный ответ [51]. В недавней попытке определить его ферментативную функцию был сделан вывод, что VIMP является главным образом тиоредоксин-зависимой редуктазой, способной восстанавливать H₂O₂, но не является эффективной пероксидазой широкого спектра действия [52].

Выводы

Селеновый статус нужен не только маме :)

Рентгеновская визуализация позволила нам установить возможные связи между клеточным специфическим накоплением Se и репродуктивными эффектами специфических селенопротеинов в ткани яичников крупного рогатого скота [22].

Представленные результаты демонстрируют экспрессию GPX1 (и VIMP) в клетках гранулезы крупных здоровых фолликулов. Учитывая, что аналогичное распределение GPX1 не наблюдалось в меньших фолликулах, наши результаты показывают, что этот селенопротеин играет роль в достижении доминирования фолликула, таким образом подтверждая результаты экспрессии генов в других исследованиях.

Тот факт, что многие авторы показали заметное снижение экспрессии гена GPX1 в условиях снижения содержания Se в рационе, приводит к выводу о том, что расстройства яичников могут быть в определенной степени улучшены с помощью добавления Se. Наши результаты могут быть использованы для руководства эпидемиологическими исследованиями в отношении диетического потребления Se, экспрессии GPX1 in vivo и частоты возникновения нарушений овуляции.

Дополнительная информация:

• Роль селена в репродуктивной функции мужчин и женщин. Связь концентрации селена с фертильностью
• Микроэлементы во время беременности и их влияние на развитие ребенка
• Современный взгляд на роль селена в физиологии и патологии  щитовидной железы
• Мужская фертильность и витамин B12

Сопутствующая информация:

• Пробиотики и СПКЯ - перспективы лечения подростков с ожирением
• Пробиотики при беременности и после родов

Источник: M.J. Ceko, et al. X-Ray fluorescence imaging and other analyses identify selenium and GPX1 as important in female reproductive function. Metallomics, 2014, 00, 1-3 | 11

Литература:

Будьте здоровы!