Бутират-продуцирующая микробиота защищает от РТПХ

Бутират и пропионат микробного происхождения защищают от реакции «трансплантат против хозяина»

Возможность диетического вмешательства для изменения микробного метаболизма кишечника у пациентов с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток

От редактора: Исследования взаимосвязи между микробиотой желудочно-кишечного тракта и результатами аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) фокусируются как на ранних осложнениях, преимущественно инфекции и острой реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ), так и на хронических реакциях.

В 2020 г. при исследовании (по дизайну «случай-контроль») потенциальной связи микробиома с хронической РТПХ после алло-ТГСК ученые обнаружили более низкие циркулирующие концентрации пропионата и бутирата - производных короткоцепочечных жирных кислот микробного происхождения (SCFAs) в образцах плазмы на 100-й день от пациентов, у которых развилась РТПХ, по сравнению с теми, у кого не было этого осложнения, в первоначальной когорте пациентов («случай-контроль»), перенесших трансплантацию, и в еще одной поперечной когорте из независимого центра трансплантации. В целом, полученные результаты позволили предположить, что кишечный микробиом может оказывать иммуномодулирующее действие у пациентов с алло-ТГСК, по крайней мере, частично из-за контроля системных концентраций SCFAs микробного происхождения. 

Новое исследование от 2023 г. (I фаза), о котором речь пойдет ниже, продолжает исследовать роль SCFAs, теперь уже в плане защиты от острой желудочно-кишечной РТПХ. При этом акцент сделан на бутирате (стимулировании бутират-продуцирующих бактерий), что не отменяет роль пропионата, уровень которого (также как и бутирата) повышался при стимулировании кишечной микробиоты путем потребления резистентного крахмала (RS). При этом лучший эффект в исследовании I фазы показал резистентный картофельный крахмал.

Примечание: Изложение результатов последнего исследования мы сделали в 3-х кратких частях. Полный материал об исследовании см. здесь: Riwes MM, et al. Feasibility of a dietary intervention to modify gut microbial metabolism in patients with hematopoietic stem cell transplantation. Nat Med. 2023 Nov;29(11):2805-2813. Также следует отметить, что стимуляция бутират-продуцирующих бактерий в толстом кишечнике может производиться не только пребиотическим, но и пробиотическим путем, например, с помощью бифидобактерий за счет "перекрестного питания".

ЧАСТЬ I. КРАТКО ОБ ИССЛЕДОВАНИИ

Исследователи из Медицинского колледжа Бэйлора и Мичиганского университета провели пилотное исследование фазы I, чтобы оценить возможность использования картофельного крахмала в качестве диетического вмешательства для изменения микробиома кишечника у пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга. Исследование, опубликованное в журнале Nature Medicine, является первой частью продолжающегося двухфазного клинического исследования, оценивающего влияние изменения микробиома на частоту реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ), основного осложнения, которое развивается примерно у половины пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга, и которая может привести к травмам и смерти.

«Кишечный микробиом - это сообщество микробов, которые мы все носим внутри организма, и его состав и продукты влияют на наше здоровье", - сказал старший автор и соавтор-корреспондент исследования доктор Паван Редди (Dr. Pavan Reddy), в настоящее время профессор и директор Комплексного онкологического центра Дэна Л. Дункана в Бейлоре, а ранее в Мичиганском университете. "Ранние исследования, проведенные нашей лабораторией и другими учеными, показали, что нормальный микробиом кишечника и его продукты изменяются после трансплантации костного мозга и что это изменение способствует обострению РТПХ. Можем ли мы изменить прогрессирование РТПХ, изменив микробиом?»

Предыдущие доклинические данные лаборатории Редди показали, что уровень бутирата (масляной кислоты), соединения, вырабатываемого здоровыми кишечными бактериями, когда они переваривают устойчивый (резистентный) картофельный крахмал (форма крахмала, которую люди не переваривают), значительно снижается в кишечнике мышей, страдающих РТПХ. Восстановление уровня бутирата за счет увеличения количества кишечных бактерий, продуцирующих бутират, снизило тяжесть экспериментальной острой РТПХ и смертность.

«Наличие большего количества бутирата в кишечнике полезно для лечения кишечника и, следовательно, полезно для облегчения РТПХ», — сказал Редди. «Предыдущие исследования также показали, что у здоровых людей картофельный крахмал также способствует увеличению количества бактерий, продуцирующих бутират, и уровня бутирата в кишечнике».

Эти результаты побудили исследователей выяснить, будет ли увеличение количества кишечных бактерий, продуцирующих бутират, и уровня кишечного бутирата у пациентов с трансплантацией костного мозга уменьшить или предотвратить прогрессирование РТПХ.

«В текущем исследовании мы начали с оценки того, было ли безопасно и практично для 10 пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга в Мичиганском университете, принимать пищевую добавку, приготовленную из резистентного картофельного крахмала, в течение более 100 дней и изменит ли это продукты жизнедеятельности кишечных бактерий, которые живут в желудке и кишечнике, таким образом, что это могло бы предотвратить РТПХ после трансплантации», — сказала первый автор и соавтор-корреспондент доктор Мэри Ривес (Dr. Mary Riwes), доцент кафедры медицинской онкологии, внутренних болезней и гематологии в онкологическом центре Рогеля Мичиганского университета.

Цель заключалась в том, чтобы за время исследования не менее 60% пациентов приняли бы 70% или более запланированных доз картофельного крахмала. «Наши результаты превзошли наши ожидания», — сказал доктор Редди. «Мы обнаружили, что более 80% пациентов приняли 84% доз без каких-либо негативных побочных эффектов, что позволяет предположить, что для большинства пациентов регулярно принимать пищевую добавку безопасно и возможно. Мы также обнаружили, что уровни бутирата в кале были значительно выше у участников, принимавших картофельный крахмал, чем у тех, кто этого не делал, что мы наблюдали как на мышах, так и на здоровых взрослых».

«В следующей части исследования, которое в настоящее время открыто в Мичиганском университете и вскоре откроется во втором центре Медицинского колледжа Бэйлора, мы определим, действительно ли прием картофельного крахмала приведет к снижению РТПХ после трансплантации», - сказала Ривес.

«Удивительно, что это первая демонстрация того, что простое и безопасное диетическое вмешательство влияет на микробиом кишечника и метаболиты у этих пациентов», — сказал Редди. «Из 10 пациентов в этом исследовании только у одного развилась РТПХ, в то время как обычно это заболевание развивается примерно у половины пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга. Мы включили больше пациентов в наше продолжающееся клиническое исследование фазы 2, чтобы оценить ценность картофельного крахмала в снижении заболеваемости РТПХ у пациентов, перенесших трансплантацию».

«Потенциально мы могли бы использовать пищевое вещество у пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга, в качестве простого в применении, недорогого и относительно безопасного подхода для предотвращения РТПХ, что является основным ограничением возможности спасения жизней после трансплантации костного мозга», — сказала Ривес.

ЧАСТЬ II. ПРЕДЫСТОРИЯ И ОБОСНОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

История трансплантации аллогенных стволовых клеток

Аллогенная трансплантация стволовых клеток (ТГСК) представляет собой метод интенсивного лечения, который часто представляет собой единственную лечебную терапию для пациентов с агрессивными гематологическими злокачественными новообразованиями или другими синдромами недостаточности костного мозга. По данным CIBMTR (Pasquini MC 2014), в 2013 году в США было выполнено более 8000 трансплантаций аллогенных стволовых клеток. Число проводимых аллогенных ТСК увеличивается благодаря улучшению отбора доноров, режимов кондиционирования и поддерживающего лечения. Несмотря на это, процедура продолжает вызывать высокую заболеваемость и смертность. Одним из основных факторов смертности, связанной с трансплантацией (Transplantation-related mortality, TRM), является реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ).

Болезнь «трансплантат против хозяина»

РТПХ развивается примерно у 40-50% пациентов, перенесших HLA-совместимую ТГСК, и у 50-70% реципиентов, получающих ТГСК от неродственного донора (Ferrara, et al 2009 г., Lee, et al 2007 г., Nash, et al 1996 г., Ratanatharathorn, et al 1998 г.) и оказывается фатальным для 15% реципиентов трансплантатов (Chen, et al 2015). Одной из причин такой высокой смертности является то, что однажды установленная РТПХ может быть резистентной к лечению первой линии кортикостероидами у более чем 50% пациентов (Deeg 2007). Выживаемость значительно снижается у пациентов с рефрактерностью к стероидам или у тех, у кого лечение продлевается (Gomez-Almaguer, et al 2008 г., Levine, et al 2010 г., MacMillan, et al 2010 г.). РТПХ представляет собой иммунологический феномен, при котором донорские лимфоциты реагируют на полиморфные HLA, присутствующие в тканях хозяина, путем атаки на эти ткани. Это приводит к клиническому синдрому, который можно описать как воспалительную реакцию, направленную преимущественно против антигенов хозяина в коже, кишечнике и печени (Ferrara, et al 2009). Взаимодействие между донорскими лимфоцитами и полиморфными HLA в этих тканях хозяина усиливается значительным повреждением тканей, которое происходит у реципиентов трансплантата в результате режима кондиционирования, см. Рисунок 1.

Рисунок 1. Патофизиология РТПХ. (Brennan, et al 2012)

В результате у пациентов появляются клинически значимые диарея и мукозит в дни и недели сразу после аллогенной ТСК.

Кишечный микробиом

Роль кишечного микробиома все чаще изучается при различных воспалительных состояниях. Существуют исследования, связывающие изменения в микробиоме с такими состояниями, как ожирение, атеросклероз, хроническое заболевание почек и воспалительные заболевания кишечника (Goldsmith and Sartor 2014). Учитывая частичное совпадение иммунной биологии острой РТПХ и других воспалительных состояний, в настоящее время исследуется роль кишечного микробиома при аллогенной ТГСК.

Экспериментальные данные

Было показано, что процесс аллогенной ТГСК приводит к изменению микробиома кишечника (Chen, et al 2015). Хотя изменения в составе микробиома могут иметь несколько последствий, одно из них приводит к изменениям в метаболической среде кишечника, что в результате влияет на поддержание гомеостаза слизистой оболочки кишечника (Chen, et al 2015). В частности, слизистая оболочка кишечника состоит из эпителиальных клеток кишечника (IECs), которые физически разделяют комменсальные бактерии и регулируют барьерную функцию кишечника (Peterson and Artis 2014). По предварительным данным нашей лаборатории, IECs используют жирные кислоты с короткой цепью (SCFAs) в качестве основного источника энергии (Mathewson, et al 2016). SCFAs производятся путем ферментации неперевариваемых углеводов анаэробными бактериями в толстой кишке (Goldsmith and Sartor 2014), рисунок 2.

Рисунок 2. Метаболизм резистентного крахмала кишечным микробиомом и его роль в гомеостазе кишечника.

Бутират является производным масляной кислоты (одной из основных SCFAs), дефицит которого связан с воспалительными заболеваниями кишечника (Goldsmith and Sartor, 2014).

Предыдущая работа на мышиной модели РТПХ продемонстрировала снижение уровня бутирата в IECs после аллогенной ТГСК. Кроме того, было отмечено снижение рецепторов к бутирату у IECs этих мышей. Кроме того, экзогенное введение бутирата привело к повышению уровня бутирата в IECs и улучшению целостности соединений кишечного эпителия (Mathewson, et al 2016), рисунок 3.

Рисунок 3. Электронно-микроскопические изображения соединений эпителиальных клеток кишечника, полученные через 7 дней после сингенной трансплантации стволовых клеток (сингенной ТГСК) (А), аллогенной ТГСК (B) и аллогенной ТГСК с обработкой бутиратом (C).

Кроме того, мыши, получавшие аллогенную ТГСК и получавшие экзогенный бутират, жили дольше по сравнению с мышами, получавшими плацебо, рисунок 4.

Рисунок 4. Влияние лечения бутиратом на выживаемость мышей, перенесших аллогенную трансплантацию. Обозначения: PBS - Фосфатно-солевой буфер; BALB/c - реципиент альбинос, выведенный в лаборатории штамм домовой мыши; B6 - донор, часто называемый "B6" (он же C57BL/6), является распространенным инбредным штаммом лабораторных мышей.

Также было продемонстрировано, что бутират действует как ингибитор деацетилазы гистонов (HDAC) (Chang, et al 2014). Недавно было показано, что ингибиторы HDAC снижают частоту клинической РТПХ за счет подавления антигенпрезентирующих клеток и повышения регуляции донорских Т-регуляторных клеток (Choi, et al, 2014).

Предварительные данные здоровых людей

Учитывая эту захватывающую доклиническую работу, мы заинтересованы в изучении кишечного микробиома и кишечной метаболической среды у пациентов, перенесших аллогенную ТГСК. Мы постулируем, что уровни бутирата у этих пациентов снижены, и мы заинтересованы в восстановлении этих уровней как в средстве поддержания гомеостаза слизистой оболочки кишечника. Прямое введение бутирата с пищей нецелесообразно, учитывая его плохие фармакологические свойства (например, короткий период полувыведения) и многограммовые дозы. необходимо для достижения терапевтических концентраций. Хотя повышения уровня бутирата можно добиться, пытаясь напрямую изменить микробиом с помощью вмешательств, которые изменяют концентрации бактерий, продуцирующих бутират (Atarashi, et al 2013) – «пробиотический подход», альтернативным методом было бы просто увеличить доставку неперевариваемых углеводов к существующему микробиому, или «пребиотический подход». Этот второй подход особенно привлекателен при рассмотрении популяции трансплантированных стволовых клеток с ослабленным иммунитетом, для которой перспектива прямого манипулирования микробиомом является важной проблемой безопасности. Диетическое вмешательство посредством обеспечения необходимого источника пищи может в конечном итоге обеспечить благоприятные условия для полезных комменсалов, продуцирующих SCFAs. В качестве первоначального доказательства концепции введение резистентного крахмала на основе кукурузы здоровым добровольцам уже показало его безопасность и эффективность в повышении уровня бутирата в фекалиях (рис. 5).

Рис.5. Изменения уровня бутирата в кале до и после употребления резистентного крахмала

Чтобы лучше оценить, какой из многих коммерчески доступных резистентных крахмалов может быть наиболее эффективным в повышении уровня бутирата в стуле за короткий период приема, мы провели аналогичные исследования с использованием нескольких источников крахмала: крахмала на основе картофеля; кукурузный крахмал (НМ260); инулинорастворимый крахмал растительного происхождения и арабиноксилан (ara/xyl). Проведя эти дополнительные исследования, мы смогли продемонстрировать, что картофельный крахмал наиболее эффективен для повышения уровня бутирата в фекалиях, как показано на рисунке 6. Поэтому мы решили продолжить использование этого картофельного крахмала для дальнейшего исследования.

Рис.6. Изменения уровня бутирата в кале после приема различных устойчивых крахмалов

Цели и задачи исследования

Мы планируем оценить осуществимость, безопасность и раннюю эффективность введения коммерчески доступной пищевой добавки, содержащей резистентный крахмал на основе картофеля, субъектам, подвергающимся аллогенной ТГСК. Вмешательство начнется непосредственно перед фазой кондиционирования и продолжится до 100-го дня. Наша гипотеза состоит в том, что кратковременное введение резистентного крахмала способно повысить уровень бутирата в кишечнике, что снизит уровень острой РТПХ. Мы достигнем этих целей посредством следующих задач:

1. Мониторинг продольных изменений микробиома кишечника до и после введения резистентного крахмала в условиях аллогенной ТГСК.
2. Мониторинг динамических изменений метаболической среды на фоне аллогенной ТГСК.
3. Оценка переносимости пищевой добавки в популяции аллогенной ТГСК.
4. Измерение влияния введения резистентного крахмала на уровень фекального бутирата.
5. Оценка влияния резистентного крахмала на частоту острой РТПХ на 100-й день.

История исследуемого агента и связанные с ним известные токсичности

Крахмал на основе картофеля, производимый компанией Bob’s Red Mill® (IND132208), представляет собой коммерчески доступный малоперевариваемый углевод. Он полностью растительного происхождения и не является генетически модифицированным. Он не содержит глютена. Он содержит около 50% медленно перевариваемого крахмала по массе, который переваривается в тонком кишечнике и медленно всасывается в виде глюкозы. Остальные 50% — это резистентный крахмал, который не переваривается в тонком кишечнике. Этот устойчивый крахмальный компонент попадает в толстую кишку, где ферментируется бактериями с попутным производством SCFAs. Он содержит 40 калорий на 12-граммовую порцию и не содержит дополнительных питательных веществ, витаминов или натрия (информация на этикетке).

Картофельный крахмал хорошо изучен в литературе по диетологии и питанию и доказал свою безопасность. (Cummings, et al 1996 г., Ek, et al 2014 г., Kaur, et al 2011 г., Raben, et al 1994 г., Slavin, et al 2013 г.). Кроме того, ранее его вводили здоровым добровольцам в Мичиганском университете в рамках проекта HUM00103995 – Связь структуры и функции кишечного микробиома. Это исследование не выявило никаких побочных эффектов у этих субъектов.

Обоснование (осуществимость)

Было показано, что короткоцепочечные жирные кислоты, такие как бутират, играют важную роль в гомеостазе эпителия кишечника. SCFAs обычно метаболизируются из неперевариваемых крахмалов здоровым кишечным микробиомом. Поскольку кишечный микробиом изменяется при ТГСК, мы предполагаем, что уровни SCFAs, а именно бутирата, могут снижаться. Ранее это было продемонстрировано на мышиной модели РТПХ (Mathewson, et al, 2016).

• Мы постулируем, что у пациентов, перенесших аллогенную ТГСК, в микробиоме кишечника происходят изменения, которые могут спровоцировать возникновение РТПХ.
• Эти изменения в микробиоме приведут к изменениям в метаболической среде кишечника, в частности к снижению уровня SCFAs.
• Снижение уровня SCFAs приведет к нарушению гомеостаза слизистой оболочки кишечника, что приведет к снижению эластичности кишечного эпителия.
• Это подвергает некоторых людей с повышенной склонностью к развитию более обширного повреждения тканей повышенному риску развития острой РТПХ.

Наше исследование направлено на изучение изменений в составе микробиома стула вскоре после ТГСК, как описано выше, а также на выполнение диетического вмешательства с использованием экзогенного источника резистентного крахмала, который способствует выработке бутирата хозяином. Во-первых, мы оценим, является ли это осуществимым и переносимым вмешательством в популяции пациентов со сложными заболеваниями. Во-вторых, благодаря частому мониторингу кишечного микробиома с помощью образцов стула субъектов как до, так и после трансплантации, мы сможем оценить динамические изменения кишечного микробиома и метаболома, которые происходят с течением времени в условиях ТГСК. В частности, мы также узнаем, какое влияние оказывает это диетическое вмешательство на уровень бутирата в стуле ТГСК-пациентов, которые получали диетическое вмешательство по сравнению с субъектами контрольной группы, которые не получали добавку. Наконец, мы оценим частоту возникновения острой РТПХ на 100-й день после ТГСК у пациентов, получавших это диетическое вмешательство.

Первоначально мы проведем «начальную» фазу, в которую войдут 10 поддающихся оценке взрослых субъектов, которым будет проведена соответствующая аллогенная ТСК полной интенсивности по поводу гематологического злокачественного новообразования. Все 10 субъектов получат картофельный крахмал производства Bob's Red Mill® (IND132208). Первоначально субъекты будут принимать по 20 г ежедневно в течение первых трех дней, после чего дозу увеличивают до 20 г два раза в день. Причина введения меньшей дозы в течение первых трех дней заключается в том, чтобы дать возможность субъектам и их кишечному микробиому адаптироваться к этому новому резистентному крахмалу, а также улучшить переносимость и вероятность того, что субъекты смогут продолжить исследование. Такая дозировка подтверждается опытом здоровых добровольцев в HUM00103995. Все субъекты начнут принимать картофельный крахмал за 7 дней до трансплантации (день - 7) и продолжат прием этой добавки в течение 100 дней после трансплантации (день +100). Зарегистрированные диетологи будут тесно сотрудничать с субъектами и исследователями, чтобы обеспечить наиболее приемлемый для них картофельный крахмал.

ЧАСТЬ III. ВЫДЕРЖКИ ИЗ ОПИСАНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ В ЖУРНАЛЕ NATURE MEDICINE

Взаимодействие между кишечным микробиомом и иммунными и неиммунными клетками хозяина оказывает решающее влияние на здоровье и болезни^1,2. Эти взаимодействия в решающей степени зависят от переработки питательных веществ и производства метаболитов кишечной микробиотой; однако доказательства того, что диетические вмешательства, модулирующие кишечный микробиом, могут облегчить течение клинических заболеваний, ограничены³. Новые данные свидетельствуют о том, что изменения в кишечной микробиоте и ее метаболитах играют важную роль в модуляции тяжести острой желудочно-кишечной (ЖКТ) реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК)^4,5,6,7. Аллогенная ТГСК является потенциально излечивающим методом лечения пациентов со злокачественными и доброкачественными гематологическими и наследственными заболеваниями^8,9. РТПХ является основной причиной безрецидивной смертности и основной причиной заболеваемости после аллогенной ТГСК¹⁰. Острая РТПХ возникает в результате аллогенного иммунного ответа, вызванного донорскими Т-клетками, и чаще всего поражает кожу хозяина, печень и желудочно-кишечный тракт^11,12. Недавние сообщения указывают на то, что изменения в структуре кишечного микробиома являются основным фактором, влияющим на тяжесть и исходы РТПХ^13,14,15,16. Однако данные о рациональной и проспективной модификации кишечного микробиома для снижения РТПХ человека ограничены, за исключением использования трансплантации фекальной микробиоты (FMT)¹⁷. Тем не менее, FMT сталкивается с проблемами, включая проблемы безопасности у пациентов с ослабленным иммунитетом, ограничения в масштабируемости для широкого внедрения и пока неясную эффективность¹⁸. Более безопасный и практичный подход к изменению кишечного микробиома — использование диетических пребиотиков¹⁹. Пребиотики (здесь) — это формы крахмала, которые противостоят разложению ферментами хозяина, но метаболизируются специфическими кишечными бактериями и изменяют состав метаболитов, полученных из микробиома^20,21,22. Однако неизвестно, может ли пребиотическое вмешательство у пациентов с аллогенной ТГСК рационально изменить микробиом кишечника для достижения терапевтического эффекта²³.

Тяжесть острой желудочно-кишечной РТПХ связана со сдвигом в сторону энтерококков или организмов микробиома полости рта вместо грамположительных облигатных анаэробных бактерий, обычно встречающихся в здоровом кишечнике, и снижением количества специфических микробных метаболитов, особенно короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК или англ. SCFAs), таких как бутират, вырабатываемый теми же грамположительными анэробами^{24,25,26,27,28}. КЦЖК (например, бутират, ацетат и пропионат) являются наиболее изученными микробными метаболитами²⁹. Они производятся в результате ферментации неперевариваемых углеводов кишечными анаэробными комменсальными бактериями, такими как виды Clostridia, и служат источником энергии для микробиоты кишечника и эпителиальных клеток кишечника хозяина (IECs)²⁹, а также необходимы для поддержания барьера слизистой оболочки кишечника^30,31. Экспериментальные данные показали, что бутират значительно снижался в IECs у мышей, страдающих РТПХ, в то время как восстановление уровня бутирата за счет увеличения кишечных бактерий, продуцирующих бутират, снижало тяжесть экспериментальной острой желудочно-кишечной РТПХ и смертность³². Введение определенных количеств резистентного картофельного крахмала (RPS) в качестве пребиотика нормальным здоровым людям-добровольцам способствовало увеличению количества бутирогенных бактерий и уровня бутирата в кишечнике в большей степени, чем другие протестированные коммерчески доступные препараты резистентного крахмала (RS)^33,34. Основываясь на этих данных, мы предположили, что введение определенного количества RPS пациентам с аллогенной ТГСК будет осуществимо и будет способствовать бутирогенной микробиоте, повышая уровни полезных метаболитов, таких как бутират, несмотря на использование нескольких препаратов, связанных с ТГСК, включая антибиотики.

Полученные результаты

Назначение RPS не только возможно, но и хорошо переносится пациентами. Мы провели одноцентровое проспективное одногрупповое продольное исследование в период с 26 апреля 2017 г. по 30 сентября 2018 г. в качестве первой части клинического исследования фазы 2 (NCT02763033). Мы набрали взрослых, которые проходили миелоаблативную аллогенную ТГСК с подбором родственного донора (MRD) по лейкоцитарному антигену человека (HLA). Участники исследования получали 20 г RPS перорально, произведенного Bob’s Red Mill и упакованного в исследовательской аптеке, ежедневно в течение первых 3 дней, а затем дважды в день, с -7-го дня по 100-й день после аллогенной ТГСК (рис. 1). Мы разработали введение RPS так, чтобы оно начиналось ежедневно, а затем увеличивалось до двух раз в день, чтобы пациенты могли привыкнуть к нему и с большей вероятностью переносить его, учитывая, что эти пациенты испытывают множество побочных эффектов со стороны желудочно-кишечного тракта в результате режима кондиционирования.

Рис. 1: Схема клинического исследования и продольного сбора биообразцов. Участники исследования получали 20 г RPS перорально ежедневно в течение первых 3 дней, а затем два раза в день, с -7-го дня до 100-го дня после аллогенной ТГСК. Образцы стула и крови собирали у участников исследования на исходном уровне перед кондиционированием (день -7), в надире (приблизительно 5–7 дни), на моментприживлении трансплантата (приблизительно 14 день) и на 100-м дне. По возможности образцы стула собирали еженедельно после аллогенной ТГСК. Образцы сравнивали с образцами, полученными от прошлых исторических контролей*, не получавших диетического вмешательства в те же моменты времени, что и при аллогенной ТГСК. После фазы обоснования (фаза 1) еще 50 человек будут включены в фазу 2 исследования для получения RPS по тому же графику, указанному выше, и десять человек будут включены в группу для приема изокалорического плацебо с нерезистентным крахмалом, которые будут служить в качестве одновременного контроля (5: 1 рандомизация). Образцы стула и крови будут собираться по тому же графику, что и на этапе обоснования.

*Исторический контроль - Когорта субъектов, обычно установленная более ранним исследованием и используемая как группа контроля для сравнения с экспериментальной группой.

Пациенты с аллогенной ТГСК часто страдают от связанных с лечением расстройств желудочно-кишечного тракта и РТПХ, что затрудняет диетическое вмешательство^35,36. Поэтому мы оценили, является ли строгое введение RPS в качестве диетического вмешательства клинически осуществимым и переносимым пациентами. В исследование были включены десять человек, которым вводили RPS (таблица 1). Мы поставили цель, чтобы 60% или более пациентов могли соблюдать 70% или более запланированных доз. Средний возраст составил 57 лет (диапазон: 52–62 года). Все участники получали стандартную профилактику РТПХ с помощью такролимуса и метотрексата. Все участники получали стандартную антибиотикопрофилактику левофлоксацином и стандартное лечение нейтропенической лихорадки внутривенным введением цефепима (90%) или внутривенным введением ванкомицина вместе с внутривенным введением азтреонама (10%). Все лечение антибиотиками проводилось для профилактики или выявления нейтропенической лихорадки с отрицательным результатом обследования и прекращалось после приживления трансплантата. Среднее общее количество дней нейтропении составило 7 (диапазон: 5–14 дней). Никакое другое антибактериальное лечение не применялось в течение всего периода исследования. У всех участников для профилактики вирусов использовался ацикловир, а для профилактики грибков — флуконазол. Ни одному из десяти пациентов во время исследования не требовалось лечение от вирусных или грибковых инфекций (дополнительная таблица 1).

Осуществимость соответствовала поставленной цели — 70% или более соблюдения запланированных дозировок у 60% или более пациентов; восемь из десяти пациентов (80%) получили 70% или более запланированных доз. Средняя процентная доза, полученная участниками, составила 84%. Никаких побочных эффектов или токсичности, связанных с RPS, не наблюдалось. Мы зарегистрировали все нежелательные явления со стороны желудочно-кишечного тракта, возникшие в когорте RPS и в группе исторического контроля в соответствии с Общими терминологическими критериями для нежелательных явлений (CTCAE) v.5. Лечащие врачи считали, что все эти нежелательные явления не связаны с RPS, но были ожидаемыми побочными эффектами пациентов, получавших кондиционирующую химиотерапию для аллогенной ТСК. Все удерживаемые дозы RPS в течение первых 15 дней после аллогенной ТГСК были обусловлены ожидаемой токсичностью, связанной с трансплантацией, мешающей пероральному приему, а не какой-либо токсичностью, связанной с исследованием. Тошнота и мукозит, вызванные кондиционированием, были основными аллогенными побочными эффектами ТГСК, влияющими на пероральный прием, когда от RPS приходилось воздерживаться. Только у одного пациента развилась острая РТПХ ЖКТ 1-й стадии, подтвержденная биопсией, с общей острой РТПХ II степени (10%), что демонстрирует очень низкую заболеваемость в этой небольшой когорте. Совет по мониторингу данных и безопасности программы трансплантации крови и костного мозга Мичиганского университета оценил осуществимость и рекомендовал зачисление на 2-й этап исследования.

В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что использование RPS в качестве диетического вмешательства во время аллогенной ТСК осуществимо, переносимо и безопасно.

Резистентный картофельный крахмал способствует увеличению уровня бутирата в кишечнике после аллогенной ТГСК

Образцы стула собирали у участников исследования на исходном уровне перед кондиционированием (день -7), надиром (приблизительно 5–7 дни), приживлением трансплантата (приблизительно 14 день) и 100-м днем (рис. 1) с использованием устройства для сбора, позволяющего анализировать микробиом и метаболом (контейнер OMNIgene, Genotek). Если пациенты могли сдавать образцы еженедельно, то сбор стула осуществлялся еженедельно. После обработки образцы хранили при температуре -80 °С. Средний процент образцов стула, собранных у каждого участника, составил 93%.

Чтобы определить, влияет ли регулярное и определенное количество RPS на микробиом хозяина и его метаболиты, несмотря на возможные регулярные изменения в рационе и стандартное обязательное применение антибиотиков после ТГСК, мы провели целевой метаболомный анализ продольно собранных образцов стула с помощью ВЭЖХ для количественного определения абсолютного количества бутирата (рис. 2a), ацетата и пропионата. Мы обнаружили, что уровень бутирата в стуле был значительно выше, когда участники принимали RPS по сравнению с теми, кто не принимал RPS на исходном уровне и когда RPS был отменен (медиана (интерквартильный размах) = 10,76 ммоль кг^-1 (7,62-19,05) против 3,06 (2,32-6,21), P < 0,0001, соответственно) (рис. 2b).

Рис. 2: Бутират кала с течением  времени у реципиентов аллогенной ТГСК. a, Анализ уровня бутирата в стуле в ммоль кг^-1 (ось y), измеренного в ходе аллогенной ТГСК, где время (ось x) в днях относительно аллогенной ТГСК. Желтые точки с черным контуром представляют уровни бутирата в моменты времени, когда участники принимали RPS; желтые точки без контура представляют уровни бутирата в моменты времени, когда участники не принимали RPS. b, Анализ по протоколу уровней бутирата в стуле в ммоль кг^-1 (ось y), когда участники принимали RPS по сравнению с тем, когда они не принимали (ось x). Для корректировки повторных измерений у одних и тех же людей использовалась модель смешанных случайных эффектов. Медианные значения для групп "без RPS " и "да RPS" составляют 3,06 ммоль кг^-1 и 10,76 ммоль кг^-1, соответственно. Значение ****P из модели смешанных случайных эффектов для коэффициента зависимости RPS от уровня бутирата в стуле составило 2×10^-13.

Доп. рис. 2*: Пропионат кала с течением времени у реципиентов аллогенной ТГСК

Доп. рис. 2**: Ацетат кала с течением времени у реципиентов аллогенной ТГСК

Учитывая изменения бутирата в стуле в ответ на RPS, мы задались целью оценить, коррелируют ли с ними изменения в микробиоте. Мы провели секвенирование ДНК микробиома кала по гену 16S рРНК, чтобы определить влияние на структуру микробного сообщества в исходном состоянии до проведения ТГСК, а затем сравнили его с изменениями в надир, приживление и на 100-й день, чтобы каждый пациент служил собственным контролем. Далее мы сравнили кишечные микробы реципиентов RPS с историческим контролем, подвергшимся аллогенной ТГСК в тех же последовательных временных точках. Пациенты исторического контроля были из того же центра, перенесли аллогенную ТГСК в период с 6 июля 2016 года по 23 июня 2017 года, были аналогично кондиционированы и получали аналогичную иммунопрофилактику и антибиотики. Поскольку альфа-разнообразие микробиома кишечника коррелирует с исходами ТГСК, мы сначала проанализировали общее альфа-разнообразие микроорганизмов в каждой временной точке по сравнению с исходным значением того же участника. Хотя статистически значимых результатов не получено из-за малого количества, в целом у реципиентов RPS альфа-разнообразие сохранялось или увеличивалось, в то время как в историческом контроле наблюдалось снижение микробного разнообразия в надир; однако к 3 месяцам после аллогенной ТГСК альфа-разнообразие увеличивалось.

Чтобы определить влияние RPS на микробы, являющиеся диетической бутиратной осью, мы проанализировали микроорганизмы, способные продуцировать бутират, на основе генетического и метагеномного исследования основных известных бутират-продуцирующих путей³⁷. Мы также проанализировали особый набор микробов, состоящий из трех видов бактерий, штаммы которых были связаны с деградацией RPS у здоровых молодых людей: Ruminococcus bromii, Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium pseudocatenulatum³⁴. В целом, статистически значимых изменений в этих продуцентах бутирата или деградантов RPS между когортами RPS и исторического контроля не наблюдалось. Однако мы наблюдали небольшую тенденцию к лучшей сохранности ранее зарегистрированных бактерий, продуцирующих бутират, в когорте, потреблявшей RPS, по сравнению с историческим контролем, но без изменений в вышеупомянутых RS-деструкторах.

В совокупности эти результаты, согласующиеся с предыдущими отчетами, показывают, что процесс аллогенной ТГСК нарушает микробиом кишечника, учитывая наблюдаемую тенденцию к уменьшению микробного разнообразия в надире и относительной численности продуцентов бутирата. Однако использование RPS в качестве диетического вмешательства в процессе аллогенной ТГСК привело к значительному увеличению полезных уровней бутирата в кишечнике как побочного продукта микробного метаболизма (рис. 2).

Анализы метаболитов плазмы крови при аллогенной ТГСК

Учитывая, что RPS ассоциируется с изменением уровня бутирата в кишечнике, мы изучили потенциальное влияние RPS на метаболиты плазмы крови, проведя целевой метаболомный анализ SCFAs и глобальный метаболомный анализ других метаболитов.

Образцы крови собирали по стандартным протоколам в пробирки с ЭДТА в исходном состоянии (день -7), надир (приблизительно дни 5-7), приживление (приблизительно день 14) и день 100 (рис. 1б). Образцы обрабатывались в течение 24 ч до плазмы и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). После обработки образцы хранились при температуре -80 °C. Сто процентов запланированных образцов крови были собраны у каждого участника во время выполнения протокола.

Мы провели продольную оценку потенциального влияния RPS на концентрацию SCFAs в плазме крови с помощью масс-спектрометрии (MS). Мы не обнаружили существенных различий в содержании бутирата, пропионата и ацетата во всех временных точках и между реципиентами RPS и историческим контролем после аллогенной ТГСК. Хотя бутират редко обнаруживается в плазме, но повышен в стуле пациентов, получавших RPS, мы также сравнили и соотнесли концентрации SCFAs в плазме и стуле у реципиентов RPS и обнаружили значительную корреляцию между концентрациями бутирата в стуле и плазме у реципиентов RPS…

Затем мы беспристрастно определили влияние RPS на все другие метаболиты плазмы (более 200 метаболитов), используя глобальный метаболомный анализ. Восемьдесят два метаболита показали дискретные пики. Основные изменения в глобальных метаболитах плазмы наблюдались в моменты времени после аллогенной ТГСК по сравнению с исходным уровнем у каждого из пациентов в группах реципиентов без RPS и с RPS. Значительные изменения в метаболитах плазмы в продольном направлении произошли при сравнении точек надира и времени приживления с исходным уровнем, но не на 100-й день, что согласуется с изменениями, наблюдаемыми в микробиоте.

В совокупности эти результаты показывают, что процесс аллогенной ТГСК изменяет метаболиты плазмы по сравнению с исходным уровнем и что эти изменения начинают разрешаться к 3 месяцам после аллогенной ТГСК; однако разрешение может быть ускорено, а нарушения смягчены в когорте RPS по сравнению с контролем. Таким образом, использование RPS в качестве диетического вмешательства во время аллогенной ТГСК может стабилизировать метаболические изменения в плазме крови после аллогенной ТГСК.

Наше исследование предоставляет предварительные данные, свидетельствующие о том, что диетическое вмешательство с использованием RPS изменило кишечный микробный метаболит SCFA, бутират, и было возможным и безопасным для реципиентов аллогенной ТГСК. Эти данные демонстрируют доказательство принципа RPS как возможного пребиотического вмешательства у реципиентов аллогенной ТГСК, которое может смягчать нарушение метаболитов, полученных из микробиома, и закладывает основу для дальнейшего изучения RPS и его воздействия на микробиом при заболеваниях человека.

Дополнительная информация

• Бутират и его преимущества для здоровья
• Бифидобактерии и бутират-продуцирующие бактерии
• Короткоцепочечные жирные кислоты и пробиотики
• Стимулирование синтеза SCFAs с помощью пробиотических бактерий
• Пребиотические углеводы, микробиота кишечника и здоровье

Литература

Будьте здоровы!