Возможная связь между микробиотой кишечника и ИБС

КИШЕЧНЫЙ МИКРОБИОМ И ИШЕМИЧЕСКАЯ БОЛЕЗНЬ СЕРДЦА

Анализ микробиоты кишечника у больных ишемической болезнью сердца: возможная связь между микробиотой кишечника и ишемической болезнью сердца

Цель: недавние исследования показали, что метаболические нарушения, такие как ожирение и диабет 2 типа, связаны с микробиотой кишечника. Связь между атеросклерозом и микробиотой кишечника также привлекает повышенное внимание. Наша цель состояла в том, чтобы определить характерную тенденцию микробиоты кишечника при ишемической болезни сердца (ИБС).

Метод. В это исследование были включены 39 пациентов с ИБС, 30 контрольных пациентов без ИБС (Ctrl), соответствующих возрасту и полу, с факторами риска коронарных заболеваний и 50 здоровых добровольцев (HVs) без факторов риска коронарных заболеваний. Бактериальную ДНК экстрагировали из их фекальных проб и анализировали по полиморфизму длины концевых рестрикционных фрагментов.

Результат: характерное изменение микробиоты кишечника наблюдалось у пациентов с ИБС, где порядок Lactobacillales был увеличен (ИБС, Ctrl против HV; 13,6% ± 12,0%, 6,2% ± 7,7% против 4,1% ± 5,9%; p 0,001) и тип Bacteroidetes (Bacteroides＋Prevotella) был снижен (ИБС, Ctrl против HV; 35,5% ± 11,6%, 43,9% ± 11,2% против 47,4% ± 11,5%; p 0,001). Группа ИБС была чрезмерно представлена ​​в энтеротипе «другие» (III) по сравнению с группой Ctrl или HV (p 0,001, критерий хи-квадрат), хотя мы не могли отрицать возможность того, что некоторые препараты влияют на типы кишечной флоры.

Вывод: хотя у этого исследования были некоторые ограничения, мы продемонстрировали, что частота ИБС связана с изменением микробиоты кишечника. Проспективное исследование желательно для выяснения причинно-следственной связи между ИБС и микробиотой кишечника.

Введение

По оценкам, в желудочно-кишечном тракте человека содержится около 100 триллионов (10¹⁴) бактериальных клеток, включая 1000 видов бактерий. Этот большой набор генных продуктов выполняет широкий спектр биохимических и метаболических функций, дополняя физиологию организма-хозяина. Было обнаружено, что диета хозяина, образ жизни, гигиена, генетика хозяина, использование антибиотиков и бактериальный состав окружающей среды влияют на индивидуальный состав микробиоты кишечника^1,2). Несмотря на разнообразие среди людей, уникальный состав микробиоты кишечника оставался удивительно стабильным с течением времени, что позволяет предположить, что кишечные бактерии могут быть потенциальным фактором риска заболеваний человека³⁾.

Естественная способность кишечной микробиоты влиять на иммунитет хозяина является важной терапевтической мишенью для многих иммунных состояний слизистых оболочек и неслизистых, таких как воспалительные заболевания кишечника, метаболический синдром, аутоиммунные заболевания, диабет и хронические воспалительные заболевания⁴⁾. Микробиота кишечника активно регулирует иммунную систему хозяина, и недавние исследования показали, что определенные виды комменсальных бактерий вызывают накопление специфических популяций иммунных клеток, например, Foxp3+ регуляторных Т-клеток (Tregs)^5,6). Ранее мы продемонстрировали, что пероральные антитела к CD3 или витамин D3 могут ингибировать прогрессирование атеросклероза за счет увеличения Treg за счет модуляции кишечной иммунной системы у мышей^7,8), а у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) соотношение Treg и Treg / Teff (эффекторная Т-клетка – ред.) ниже по сравнению со здоровыми людьми⁹⁾. Таким образом, мы предположили, что состав микробиоты кишечника влияет на ИБС 10).

Недавние исследования показали, что ожирение связано с изменениями в относительной численности двух доминирующих бактериальных типов, Bacteroidetes и Firmicutes; Фирмикуты преобладают в кишечнике у людей с ожирением¹¹⁾. Turnbaugh et al. впервые продемонстрировали, что трансплантация фекальной микробиоты от мышей с ожирением беспроблемным мышам приводит к эффективной передаче фенотипа ожирения реципиентам, что предполагает, что изменение микробиоты может быть причиной фенотипа ожирения¹²⁾.

Ассоциация между атеросклерозом и микробиотой кишечника привлекает повышенное внимание^13,14). Недавнее исследование показало, что кишечный микробиотозависимый метаболит, триметиламин-N-оксид (TMAO), связан с частотой сердечно-сосудистых заболеваний. Было показано, что пероральные пищевые добавки с холином или L-карнитином, которые метаболизируются в ТМАО кишечной микробиотой и печеночными ферментами, повышают уровень атеросклеротических бляшек корня аорты на модели мышей с нулевым уровнем аполипопротеина E. Этот эффект не наблюдался у мышей без микробов или при лечении антибиотиками, что позволяет предположить, что кишечная микробиота необходима для метаболизма холина и атерогенеза ^15,16).

Цель

Нашей целью этого исследования было изучить связь между микробиотой кишечника и ИБС и определить характерные тенденции микробиоты кишечника при ИБС. Karlsson et al. выявили несколько композиционных и функциональных изменений в популяции кишечной микробиоты, которые могут быть связаны с симптоматическим атеросклерозом у пациентов, перенесших каротидную эндартерэктомию¹⁷⁾. Однако остается неясным, связана ли ИБС с изменениями состава кишечной микробиоты. Мы проанализировали микробиоту кишечника, полученную из образцов фекалий пациентов с ИБС, которые сравнили с таковыми из контрольной группы (Ctrls) и группы здоровых добровольцев (HV), используя анализ полиморфизма длины конечных рестрикционных фрагментов (T-RFLP). Анализ T-RFLP - один из наиболее хорошо зарекомендовавших себя и надежных методов на основе рибосомальной 16S РНК, особенно с учетом его высокой пропускной способности и воспроизводимости¹⁸⁾.

Методы

Набор пациентов и волонтеров

Мы сравнили состав кишечной микробиоты среди групп ИБС, Ctrl и HV в этом небольшом исследовании случай-контроль. Тридцать девять пациентов с ИБС и 30 пациентов с коронарными факторами риска были набраны из больницы Университета Кобе (Kobe University Hospital). Образцы крови собирали после ночного голодания. Образцы кала были собраны в больнице Университета Кобе в рамках больничной диеты. Пятьдесят HV без факторов риска коронарных заболеваний были набраны в медицинском центре Kenko Life Plaza, Hyogo Health Service Association. Образцы кала собирали дома при обычном питании.

Группа ИБС была определена как пациенты со стабильной стенокардией и перенесенным инфарктом миокарда, с сохраненной фракцией выброса левого желудочка (> 40%), которые перенесли чрескожное коронарное вмешательство или операцию по аортокоронарному шунтированию с интервалом не менее 6 месяцев; Были исключены пациенты с острым коронарным синдромом. Одно- или многососудистое заболевание относится к числу крупных коронарных сосудов, демонстрирующих стеноз > 75% при диагностической коронарографии.

Тридцать пациентов, у которых были факторы риска коронарных заболеваний, такие как гипертония, диабет и / или дислипидемия, но у которых не было коронарных или других сосудистых заболеваний, были набраны как соответствующие возрасту и полу Ctrls. Критериями включения в группу HV были отсутствие в анамнезе сосудистых заболеваний или лечения гипертонии, диабета или дислипидемии. Отсутствие в анамнезе коронарных или других сосудистых заболеваний определялось как отсутствие документированных сосудистых заболеваний, симптомов, указывающих на стенокардию, аномалий на электрокардиограмме, указывающих на старый инфаркт миокарда или стенокардии, или аномалий на рентгенограмме грудной клетки.

Пациенты с системными заболеваниями, в том числе заболеваниями печени, почек (уровень креатинина в сыворотке > 2,0 мг/дл), заболеваниями коллагена и злокачественными новообразованиями, были исключены из всех групп. Также были исключены пациенты, получавшие антибиотики. Диабет был определен как HbA1c > 6,5% (Национальная программа стандартизации гликогемоглобина) при использовании пероральных противодиабетических препаратов или терапии инсулином. Артериальная гипертензия определялась как артериальное давление > 140/90 мм рт. ст. или прием гипотензивных препаратов. Дислипидемия была определена как холестерин липопротеинов низкой плотности > 140 мг/дл, триглицериды > 150 мг/дл или использование антидислипидемических препаратов на основании рекомендаций Японского общества атеросклероза¹⁹⁾.

Это исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено Комитетом по этике Университета Кобе (№ 1318) и Kenko Life Plaza, Ассоциацией здравоохранения Хиого. Все субъекты дали устное и письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

T-RFLP

Полиморфизм длины терминального рестрикционного фрагмента

T-RFLP-анализы фекалий были выполнены лабораторией TechnoSuruga (Сидзуока, Япония). ДНК была извлечена из образцов фекалий, а затем амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции. Полученные ампликоны 16S рДНК обрабатывали ферментом рестрикции BslI (New England BioLabs). Подробности показаны в дополнительных методах.

Статистический анализ

Расстояния были рассчитаны для определения любого сходства между образцами и были представлены графически путем построения дендрограммы. Для установления типа дендрограммы был использован корреляционный анализ Пирсона и невзвешенный парно-групповой метод со средним арифметическим, который был рассчитан методом Gene Maths (Прикладная математика, Бельгия) (рис. 1B). Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение. Непрерывные параметрические данные сравнивали с использованием одностороннего теста ANOVA с последующим апостериорным анализом Тьюки. Непараметрические данные сравнивали с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим апостериорным анализом Данна. Категориальные переменные представлены с использованием частотного подсчета, а межгрупповые сравнения были проанализированы с помощью критериев хи-квадрат. Для статистической корреляции между двумя параметрами использовался корреляционный анализ Пирсона. Факторы с одномерным p <0,05 были введены в многомерный анализ. Возраст и пол были введены в многомерную модель в виде исключения. Все статистические анализы были двусторонними; p <0,05 считалось статистически значимым. Для статистического анализа использовали GraphPad Prism версии 6.0 (GraphPad Software; Сан-Диего, Калифорния, США) и Medcalc Software (версия 14.12; Мариакерк, Бельгия).

Рисунок 1. Распределение кишечной микробиоты и классификация энтеротипов в группах пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), в контрольной и здоровой группах добровольцев (A) Репрезентативные профили кишечной микробиоты. (B) Показана дендрограмма сходства. (C) Энтеротип «другие» (III) был обогащен в группе ИБС (p <0,001, критерий хи-квадрат). Паттерны полиморфизма длины концевых рестрикционных фрагментов анализировали с использованием корреляции Пирсона и невзвешенного парно-группового метода с алгоритмом среднего арифметического. Энтеротипы были определены следующим образом: I, > 30% Bacteroides; II, > 15% Prevotella; а остальные - как «другие» (III).

Полученные результаты

Исходные характеристики

Исходные характеристики, лекарственные препараты и лабораторные данные для групп ИБС (мульти- и однососудистая болезнь), Ctrl и HV представлены в таблице 1. Было трудно сопоставить клинический фон среди групп ИБС, Ctrl и HV, как показано в Таблице 1. В частности, фоновое лечение между тремя группами сильно отличалось, и это было ограничением данного исследования. Не было существенной разницы в индексе массы тела (ИМТ), процентной доле пациентов с гипертонией и диабетом между группами ИБС и Ctrl. Группа HV не получала лекарств. В группе ИБС не было выявлено достоверной разницы в клиническом фоне между мульти- и однососудистыми заболеваниями.

Таблица 1. Исходные характеристики и лабораторные данные исследуемой популяции

Переменные параметры	ИБС всего (n = 39)	Мульти-сосудистое заболевание (n = 28)	Одно-сосудистое заболевание (n = 11)	Ctrl (n = 30)	HV (n = 50)
Характеристики
Возраст (лет)	61.1 ± 9.4	59.5 ± 9.2	65.1 ± 9.7	62.1 ± 6.4	58.7 ± 7.3
Пол (мужчины,%)	85	86	82	77	78
ИМТ (кг/м2)	25.7 ± 4.1	25.9 ± 4.2	25.2 ± 4.2	25.6 ± 4.1	22.4 ± 2.4***
История курения (%)	71*	76	55	50	56
Текущее курение (%)	17*	21	9	7	32*
Дислипидемия (%)	95*	93	100	63	50
Гипертензия (%)	87	86	91	83	20***
Диабет (%)	38	46	18	40	2***
Медикаментозное лечение
Препараты против диабета (%) (включая инсулинотерапию)	38	46	18	37	0
Статины (%)	92***	89***	100***	40	0
ACE-I / ARB (%)	74*	75	73	47	0
β-адреноблокаторы(%)	54*	54	55	23	0
Блокатор кальциевых каналов (%)	56	54	64	37	0
PPI / Блокатор H2 (%)	95***	93**	100**	53	0
Антикоагулянт (%)	10***	7***	18	57	0
Антиагрегант (%)	100***	100***	100***	0	0
Лабораторные данные
AST (U/I)	25.5 ± 13.6	26.0 ± 14.1	24.3 ± 13.5	25.8 ± 11.3	20.6 ± 5.0
ALT (U/I)	26.5 ± 20.4	27.8 ± 21.8	23.4 ± 18.0	25.7 ± 14.5	20.3 ± 10.8
BUN (мг/дл)	16.4 ± 5.1	15.8 ± 3.6	17.9 ± 8.0	16.6 ± 4.0	13.8 ± 2.76*
Креатинин (мг/дл)	0.87 ± 0.27	0.83 ± 0.16	0.98 ± 0.34	0.94 ± 0.25	0.77 ± 0.14**
ХС-ЛПВП (мг/дл)	43.4 ± 9.3*	43.3 ± 9.74	43.9 ± 8.8	52.3 ± 12.9	64.6 ± 15.9***
ХС-ЛПНП (мг/дл)	90.4 ± 22.7*	90.9 ± 23.9	89.1 ± 21.4	108.5 ± 29.6	130.9 ± 27.7**
TG (мг/дл)	186.7 ± 126.5*	172.9 ± 119.0	221.7 ± 149.2*	124.8 ± 55.7	101.6 ± 61.2
HbA1c (NGSP%)	6.64 ± 1.56	6.66 ± 1.53	6.59 ± 1.77	6.36 ± 1.04	5.45 ± 0.40***
CRP (мг/дл)	0.11 ± 0.12	0.12 ± 0.13	0.06 ± 0.07	0.13 ± 0.22	0.10 ± 0.18

Результаты выражаются в виде среднего значения ± стандартное отклонение или %. Сравнения проводились с использованием теста Крускала-Уоллиса, одностороннего ANOVA-теста или критерия хи-квадрат с последующим апостериорным анализом. Для сравнения TG (триглицеридов) и CRP (С-реактивного белка) используется натуральное логарифмическое преобразование. Сравнение между всеми группами ИБС, Ctrl, HV и группами с мульти- и однососудистым заболеванием, Ctrl и HV проводилось отдельно. Не было значительных различий по каждому параметру между заболеванием нескольких и одного сосуда. Одно- или многососудистое заболевание в группе ИБС относится к числу крупных коронарных сосудов, демонстрирующих стеноз > 75% при диагностической коронарной ангиографии. Значения P показывают результат относительно контроля (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).

Аббревиатуры: ACE-I, ингибитор ангиотензинпревращающего фермента; ALT, аланинаминотрансфераза; ARB, блокатор рецепторов ангиотензина; AST, аспартатаминотрансфераза; ИМТ, индекс массы тела; BUN, азот мочевины крови; ИБС, ишемическая болезнь сердца; Ctrl, контроль; CRP, C-реактивный белок; Блокатор Н2, антагонист гистаминовых Н2-рецепторов; ХС-ЛПВП, холестерин липопротеинов высокой плотности; HV, здоровые волонтеры; ХС-ЛПВП, холестерин липопротеинов низкой плотности; NGSP, Национальная программа стандартизации гликогемоглобина; TG, триглицериды; PPI; ингибитор протонной помпы.

Распространение кишечной микробиоты и энтеротипов

Результаты сравнения T-RFLP распределения микробиоты кишечника среди групп ИБС, Ctrl и HV показаны на рис. 1A – C. T-RFLP с использованием фермента рестрикции BslI может классифицировать микробиоту кишечника на следующие 10 групп: Prevotella, Bacteroides, Lactobacillales, Bifidobacterium, Clostridium кластер IV, Clostridium субкластер XIVa, Clostridium кластер IX, Clostridium кластер XI, Clostridium кластер XVIII, и другие, объединяя таксономические единицы, принадлежащие к одной группе. Типичное распределение кишечной микробиоты показано на рис. 1А. Образцы были разделены на семь кластеров в соответствии с настройкой сходства. Кластеры 5 и 6 состояли в основном из пациентов с ИБС (5, 80%; 6, 63%), тогда как кластеры 2, 3, 4 и 7 преимущественно включали лиц с Ctrl или HV (2, 83%; 3, 80%; 4, 91%; и 7, 82%; рис. 1B). Arumugam et al. предположили, что микробиота кишечника человека может быть разделена на три энтеротипа: энтеротипы I, II и III с преобладанием Bacteroides, Prevotella и Ruminococcus соответственно²⁰⁾. Однако разные участники могут идентифицировать энтеротип III в зависимости от источника последовательностей; этот кластер может также характеризоваться низким уровнем Bacteroides и Prevotella, а не доминантным родом¹⁷⁾. Напротив, Ding et al. продемонстрировали, что микробиота кишечника человека может быть разделена на четыре типа сообществ; Bacteroides и Prevotella также были ключевой микробиотой кишечника, которую можно разделить на четыре типа²¹⁾. Согласно двум отчетам, описанным выше, мы определили энтеротип I как Bacteroides > 30%, энтеротип II как Prevotella > 15%, а остальные как энтеротип «другие» (III), используя этот T-RFLP анализ микробиоты кишечника^20,21). Данные показали, что пациенты с ИБС были чрезмерно представлены в энтеротипе «другие» (III) по сравнению с группой Ctrl или HV (p <0,001, критерий хи-квадрат; рис. 1C).

Отряд Lactobacillales

Мы обнаружили, что порядок Lactobacillales был значительно увеличен в группе ИБС по сравнению с группой Ctrl или HV (ИБС, Ctrl против HV; 13,6% ± 12,0%, 6,2% ± 7,7% против 4,1% ± 5,9%; p < 0,001, рис. 2А и В). Однако не было значительных различий в каких-либо других группах микробиоты кишечника между группами Ctrl и HV (рис. 2A). Хотя размер выборки был слишком мал для достижения полностью надежной оценки с помощью логистического регрессионного анализа, мы смогли показать, что это увеличение порядка Lactobacillales было независимым фактором от известных факторов риска, таких как диабет 2 типа, дислипидемия, курение в анамнезе и гипертония (Таблица 2А). Тем не менее, лекарственные препараты могут быть смешивающими (путающими) факторами наличия ИБС (Таблица 2B). Процент порядка Lactobacillales у пациентов с ИБС с поражением нескольких сосудов был значительно выше, чем у пациентов с ИБС с заболеванием одного сосуда, и имел тенденцию быть выше, чем у пациентов с ИБС с заболеванием одного сосуда, хотя не было значимой разницы между пациентами с ИБС с заболеванием одного сосуда и Ctrls (болезнь нескольких и одного сосуда по сравнению с Ctrl; 16,5% ± 12,6%, 6,3% ± 6,1%, 6,2% ± 7,7%; p = 0,002, рис. 2С и дополнительный рис. 1).

Рис. 2. Сравнение порядка Lactobacillales. (A) Процент каждой группы кишечной микробиоты сравнивали среди групп с ишемической болезнью сердца (ИБС), контрольной группы (Ctrl) и группы здоровых добровольцев (HV). Процент порядка Lactobacillales был увеличен (B) в группе ИБС (ИБС, Ctrl против HV) (C), особенно у пациентов с ИБС с заболеванием нескольких сосудов (заболевание нескольких и одного сосуда по сравнению с Ctrl). Закрашенные кружки обозначают группу ИБС; серые квадраты обозначают группу Ctrl, а открытые треугольники обозначают группу HV. Одно- или многососудистое заболевание относится к количеству крупных коронарных сосудов, демонстрирующих стеноз > 75% при диагностической коронарографии. Для расчета p-значений использовался тест Краскела-Уоллиса с последующим апостериорным анализом Данна (* p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001).

Таблица 2. Логистический регрессионный анализ наличия ишемической болезни сердца (ИБС) в группе ИБС и контрольной группе (n = 69).

(A) Переменные параметры	Одномерная регрессия		Многомерная регрессия
	OR (95%CI)	p значение	OR (95%CI)	p значение
Возраст	0.99 (0.93–1.05)	0.63	0.97 (0.90–1.04)	0.43
Пол	1.67 (0.50–5.63)	0.41	2.50 (0.64–9.73)	0.19
ИМТ (кг/м2)	1.01 (0.90–1.13)	0.88	Не выбрано
Сахарный диабет	0.94 (0.35–2.48)	0.90	Не выбрано
Гипертензия	1.36 (0.36–5.21)	0.65	Не выбрано
Дислипидемия	10.7 (2.15–53.32)	0.004**	9.64 (1.76–52.78)	0.009**
История курения	2.55 (0.93–6.91)	0.067	Не выбрано
CRP (мг/дл)	0.90 (0.33–2.39)	0.83	Не выбрано
Lactobacillales	(%) 1.08 (1.02–1.15)	0.009**	1.07 (1.00–1.13)	0.048*

(B) Переменные параметры	Одномерная регрессия		Многомерная регрессия
	OR (95%CI)	p значение	OR (95%CI)	p значение
PPI / Блокатор H2	16.2 (3.29–79.7)	<0.001***	121 (5.89–2480)	0.002**
Статины	18.0 (4.50–72.0)	<0.001***	21.6 (1.48–317)	0.025*
β-адреноблокаторы	3.83 (1.34–11.0)	0.013*	3.79 (0.31–46.9)	0.30
ACE-I / ARB	3.31 (1.20–9.15)	0.021*	0.86 (0.11–6.55)	0.89
Антикоагулянт	0.09 (0.03–0.31)	<0.001***	0.01 (0.0004–0.13)	<0.001***
Lactobacillales (%)	1.08 (1.02–1.15)	0.009**	1.00 (0.92–1.09)	0.97

Поскольку размер выборки был небольшим, мы разделили этот анализ на две модели; (A) переменные = известные факторы риска и лактобациллы (%) (B) переменные = лекарства и лактобациллы (%). Факторы с одномерным p <0,05 были введены в многомерный анализ (* p <0,05, ** p <0,01, *** p<0,001). (A) Возраст и пол были введены в многомерную модель как исключения. 

Тип Bacteroidetes (Bacteroides и Prevotella)

Распространенность типа Bacteroidetes (Bacteroides + Prevotella) была значительно снижена в группе ИБС по сравнению с группой Ctrl или HV (ИБС, Ctrl против HV; 35,5% ± 11,6%, 43,9% ± 11,2% против 47,4% ± 11,5%; p > 0.001, рис. 3А). Отношение Firmicutes / Bacteroidetes (соотношение F / B) было увеличено в группе ИБС по сравнению с группой Ctrl (ИБС, Ctrl против HV; 1,6 ± 1,0, 1,3 ± 2,0 против 1,1 ± 1,4; p <0,001, рис. 3B). Согласно анализу T-RFLP, тип Firmicutes включал Lactobacillales и Clostridium, тогда как тип Bacteroidetes включал Bacteroides и Prevotella.

Рис. 3. Сравнение типа Bacteroidetes и соотношения Firmicutes / Bacteroidetes (F / B). (A) Тип Bacteroidetes (Prevotella + Bacteroides) уменьшился; (B) соотношение F / B было увеличено в группе с ишемической болезнью сердца (ИБС). Для расчета p-значений использовали тест Краскела-Уоллиса с последующим апостериорным анализом Данна (* p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001). Тип Firmicutes = Lactobacillales + Clostridium. Тип Bacteroidetes = Bacteroides + Prevotella.

Ожирение и диабет 2 типа

Ранее сообщалось, что ожирение и диабет 2 типа связаны с микробиотой кишечника. Мы обнаружили положительную корреляцию между ИМТ и порядком Lactobacillales или отношением F/B и отрицательную корреляцию между ИМТ и типом Bacteroidetes (дополнительный рис. 2А–С). Мы также обнаружили отрицательную корреляцию между HbA1c и типом Bacteroidetes, но никакой значимой корреляции между HbA1c и порядком Lactobacillales или соотношением F/B обнаружено не было (дополнительный рис. 3А–С).

Медикаментозное лечение

Все пациенты получали лечение в соответствии с рекомендациями японского общества атеросклероза¹⁹⁾. Было трудно сопоставить фоновое лечение между группами ИБС и Ctrl и проанализировать эффект каждого препарата в группе ИБС, потому что почти все пациенты с ИБС лечились основными препаратами для вторичной профилактики. Многомерный логистический регрессионный анализ на наличие ИБС не смог показать, что процент порядка Lactobacillales является независимым фактором от лекарственных препаратов (Таблица 2B). Поэтому мы оценивали эффект каждого несопоставимого препарата (ACE-I / ARB, β-блокатор, статин, блокатор PPI / H2, антиагрегант или антикоагулянт) в группе Ctrl, сравнивая состав микробиоты кишечника у пациентов, получавших и не получавших каждый препарат. Поскольку антитромбоцитарная терапия применялась ко всем пациентам с ИБС, но не к пациентам с Ctrl, мы не могли оценить эффект антитромбоцитарной терапии в этом исследовании. Процент порядка Lactobacillales был выше в Ctrls, обработанных блокаторами PPI / H2 (обработанные или не обработанные; 9,23% ± 9,17% против 2,83% ± 3,47%; p = 0,008) или антикоагулянтами (обработанные или необработанные; 7,61 % ± 7,95% против 4,45% ± 7,28%; p = 0,048). Процент Prevotella был выше в Ctrls, обработанных β-блокатором (обработанные по сравнению с необработанными; 15,5% ± 16,1% против 4,94% ± 10,3%; p = 0,018). Процент Clostridium XI также был выше в Ctrls, обработанных β-блокатором (обработанные против необработанных; 0,55% ± 0,26% против 0,42% ± 0,83%; p = 0,027). Поскольку эти результаты показали, что лекарственные препараты следует рассматривать как мешающие факторы, мы впоследствии проанализировали взаимосвязь между микробиотой кишечника, особенно процентным содержанием порядка Lactobacillales, и тяжестью ИБС. Многомерный логистический регрессионный анализ наличия многососудистого заболевания показал, что процентное содержание порядка Lactobacillales может быть независимым фактором от лекарственных препаратов (дополнительная таблица). Мы обнаружили, что процент порядка Lactobacillales, как правило, был выше у пациентов с ИБС, особенно с многососудистым заболеванием, чем у Ctrls, даже после корректировки использования блокатора PPI / H2 (дополнительный рисунок 4A) или статинов (дополнительный рисунок 4B). Хотя увеличение порядка Lactobacillales, возможно, было связано с наличием самой ИБС, мы не могли отрицать, что лекарства могут повлиять на состав микробиоты кишечника из-за ограничений дизайна исследования.

Обсуждение

Мы проанализировали распределение микробиоты кишечника среди групп ИБС, Ctrl и HV (рис. 1). Репрезентативные данные показали, что состав микробиоты кишечника в группе ИБС в целом отличался от группы Ctrl или HV (рис. 1A). Дендрограмма сходства показала, что фекальные бактериальные сообщества различались в группе ИБС, по сравнению с группами Ctrl и HV (рис. 1B). Мы также обнаружили повышенную распространенность энтеротипа «другие» (III) у пациентов с ИБС (рис. 1C), что согласуется с предыдущим исследованием у пациентов, перенесших каротидную эндартерэктомию¹⁷⁾.

Сравнение каждой группы кишечной микробиоты показало, что порядок Lactobacillales увеличился, тогда как тип Bacteroidetes (род Bacteroides + Prevotella) уменьшился в группе ИБС (рис. 2 и 3). Порядок Lactobacillales является одним из основных компонентов микробиоты кишечника человека и относится к типу Firmicutes. Порядок Lactobacillales делится на несколько родов, включая Lactobacillus, Streptococcus и Enterococcus. Lactobacillus - это основной род в порядке Lactobacillales, обнаруженный в микробиоте кишечника человека. Предыдущее исследование с высокой пропускной способностью секвенирования также продемонстрировало увеличение количества видов Lactobacillus в фекалиях европейской женской когорты с диабетом 2-го типа²²⁾. Однако в этом исследовании мы не обнаружили корреляции между маркерами диабета и порядком Lactobacillales (дополнительный рис. 3А). Кроме того, все еще наблюдалось значительное увеличение порядка Lactobacillales в группе ИБС по сравнению с группой Ctrl только в популяции пациентов с диабетом 2 типа (данные не показаны).

Мы продемонстрировали снижение количества бактерий рода Bacteroidetes у больных ИБС. Тип Bacteroidetes состоит в основном из двух родов, Bacteroides и Prevotella, которые вносят свой вклад в классификацию энтеротипов. Bacteroides fragilis влияет на гомеостаз Т-клеток слизистой оболочки, способствуя регуляторной функции Т-клеток ²³⁾. Другие виды Bacteroides также могут устанавливать мутуалистические отношения с хозяином, процветая в кишечной среде, обогащенной полисахаридами растений, и обеспечивая биологические побочные продукты, необходимые для благополучия хозяина¹⁾. Роль Bacteroidetes в развитии ИБС должна быть оценена в дальнейших исследованиях.

Несколько предыдущих отчетов показали, что соотношение F / B было связано с ожирением. Хотя никакие предыдущие исследования T-RFLP не продемонстрировали связи между соотношением F / B и ИМТ, мы продемонстрировали прямую корреляцию (дополнительный рис. 2C), которая была совместима с результатами других исследований секвенирования. Поскольку не было различий в уровне ИМТ между группами ИБС и Ctrl, значительное увеличение соотношения F / B в группе ИБС, возможно, было отражено фактом наличия ИБС. За увеличением типа Firmicutes может последовать увеличение порядка Lactobacillales и уменьшение типа Bacteroidetes в этом исследовании.

Не было существенной разницы в сравнении микробиоты кишечника между группами Ctrl и HV, что указывало на то, что изменение микробиоты кишечника в группе ИБС не было связано с такими факторами риска коронарных заболеваний, как гипертония или диабет 2 типа. Хотя мы не смогли полностью исключить влияние конфликтующих факторов, таких как лекарства, мы продемонстрировали, что состав кишечной микробиоты у пациентов с ИБС различается. Требуется проспективное когортное исследование, чтобы определить, предшествуют ли кишечные микробные изменения развитию атеросклероза или ИБС, либо лекарства вызывают модуляцию микробиоты кишечника. Кроме того, мы надеемся, что в будущем будет выяснено биологическое значение кишечной микробиоты в патогенезе ИБС.

Это исследование имело некоторые ограничения, которые следует учитывать при интерпретации результатов. Во-первых, количество пациентов было небольшим; следовательно, для подтверждения этих наблюдений необходимы дополнительные более крупные испытания. Во-вторых, мы проанализировали образцы фекалий с помощью T-RFLP, но была бы желательна высокопроизводительная технология секвенирования ДНК, чтобы найти определенный род или вид кишечной микробиоты, вовлеченной в ИБС. Поэтому в настоящее время мы выполняем новый проект с использованием высокопроизводительного секвенирования ДНК. В-третьих, как упоминалось в итоговой сессии, было трудно сопоставить фоновое лечение между группами ИБС и Ctrl. Наконец, остается неясным, были ли эти различия реакцией на атеросклероз или они активно индуцировали атеросклероз.

Вывод

Мы впервые проанализировали состав микробиоты кишечника у пациентов с ИБС и продемонстрировали связь между составом микробиоты кишечника и ИБС. Требуется проспективное когортное исследование, чтобы определить, предшествуют ли кишечные микробные изменения развитию атеросклероза или нет.

Дополнительный материал к статье

→ Дополнительные методы (+ рисунки)

К разделу:

Кишечный микробиом и сердечно-сосудистые заболевания

(+ доп. статьи)

Литература

1. Wu GD, Chen J, Hoffmann C, Bittinger K, Chen YY, Keilbaugh SA, Bewtra M, Knights D, Walters WA, Knight R, Sinha R, Gilroy E, Gupta K, Baldassano R, Nessel L, Li H, Bushman FD, Lewis JD: Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science, 2011; 334: 105-108 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
2. De Filippo C, Cavalieri D, Di Paola M, Ramazzotti M, Poullet JB, Massart S, Collini S, Pieraccini G, Lionetti P: Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010; 107: 14691-14696 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
3. Faith JJ, Guruge JL, Charbonneau M, Subramanian S, Seedorf H, Goodman AL, Clemente JC, Knight R, Heath AC, Leibel RL, Rosenbaum M, Gordon JI: The long-term stability of the human gut microbiota. Science, 2013; 341:1237439. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
4. Ivanov II, Honda K: Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell host & microbe, 2012; 12: 496-508 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
5. Atarashi K, Tanoue T, Oshima K, Suda W, Nagano Y, Nishikawa H, Fukuda S, Saito T, Narushima S, Hase K, Kim S, Fritz JV, Wilmes P, Ueha S, Matsushima K, Ohno H, Olle B, Sakaguchi S, Taniguchi T, Morita H, Hattori M, Honda K: Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota. Nature, 2013; 500: 232-236 [PubMed] [Google Scholar]
6. Atarashi K, Tanoue T, Shima T, Imaoka A, Kuwahara T, Momose Y, Cheng G, Yamasaki S, Saito T, Ohba Y, Taniguchi T, Takeda K, Hori S, Ivanov II, Umesaki Y, Itoh K, Honda K: Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species. Science, 2011; 331: 337-341 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
7. Takeda M, Yamashita T, Sasaki N, Nakajima K, Kita T, Shinohara M, Ishida T, Hirata K: Oral administration of an active form of vitamin D3 (calcitriol) decreases atherosclerosis in mice by inducing regulatory T cells and immature dendritic cells with tolerogenic functions. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, 2010; 30: 2495-2503 [PubMed] [Google Scholar]
8. Sasaki N, Yamashita T, Takeda M, Shinohara M, Nakajima K, Tawa H, Usui T, Hirata K: Oral anti-CD3 antibody treatment induces regulatory T cells and inhibits the development of atherosclerosis in mice. Circulation, 2009; 120: 1996-2005 [PubMed] [Google Scholar]
9. Emoto T, Sasaki N, Yamashita T, Kasahara K, Yodoi K, Sasaki Y, Matsumoto T, Mizoguchi T, Hirata K: Regulatory/effector T-cell ratio is reduced in coronary artery disease. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society, 2014; 78: 2935-2941 [PubMed] [Google Scholar]
10. Yamashita T, Kasahara K, Emoto T, Matsumoto T, Mizoguchi T, Kitano N, Sasaki N, Hirata K: Intestinal Immunity and Gut Microbiota as Therapeutic Targets for Preventing Atherosclerotic Cardiovascular Diseases. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society, 2015; 79: 1882-1890 [PubMed] [Google Scholar]
11. Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI: Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature, 2006; 444: 1022-1023 [PubMed] [Google Scholar]
12. Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, Magrini V, Mardis ER, Gordon JI: An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature, 2006; 444: 1027-1031 [PubMed] [Google Scholar]
13. Vinje S, Stroes E, Nieuwdorp M, Hazen SL: The gut microbiome as novel cardio-metabolic target: the time has come! European heart journal, 2013; [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
14. Org E, Mehrabian M, Lusis AJ: Unraveling the environmental and genetic interactions in atherosclerosis: Central role of the gut microbiota. Atherosclerosis, 2015; 241: 387-399 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
15. Wang Z, Klipfell E, Bennett BJ, Koeth R, Levison BS, Dugar B, Feldstein AE, Britt EB, Fu X, Chung YM, Wu Y, Schauer P, Smith JD, Allayee H, Tang WH, DiDonato JA, Lusis AJ, Hazen SL: Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature, 2011; 472: 57-63 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
16. Koeth RA, Wang Z, Levison BS, Buffa JA, Org E, Sheehy BT, Britt EB, Fu X, Wu Y, Li L, Smith JD, DiDonato JA, Chen J, Li H, Wu GD, Lewis JD, Warrier M, Brown JM, Krauss RM, Tang WH, Bushman FD, Lusis AJ, Hazen SL: Intestinal microbiota metabolism of L-carnitine, a nutrient in red meat, promotes atherosclerosis. Nature medicine, 2013; 19: 576-585 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
17. Karlsson FH, Fak F, Nookaew I, Tremaroli V, Fagerberg B, Petranovic D, Backhed F, Nielsen J: Symptomatic atherosclerosis is associated with an altered gut metagenome. Nature communications, 2012; 3: 1245 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
18. Osborn AM, Moore ER, Timmis KN: An evaluation of terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis for the study of microbial community structure and dynamics. Environmental microbiology, 2000; 2: 39-50 [PubMed] [Google Scholar]
19. Teramoto T, Sasaki J, Ishibashi S, Birou S, Daida H, Dohi S, Egusa G, Hiro T, Hirobe K, Iida M, Kihara S, Kinoshita M, Maruyama C, Ohta T, Okamura T, Yamashita S, Yokode M, Yokote K: Coronary artery disease. Executive summary of the Japan Atherosclerosis Society (JAS) guidelines for the diagnosis and prevention of atherosclerotic cardiovascular diseases in Japan--2012 version. Journal of atherosclerosis and thrombosis, 2014; 21: 86-92 [PubMed] [Google Scholar]
20. Arumugam M, Raes J, Pelletier E, Le Paslier D, Yamada T, Mende DR, Fernandes GR, Tap J, Bruls T, Batto JM, Bertalan M, Borruel N, Casellas F, Fernandez L, Gautier L, Hansen T, Hattori M, Hayashi T, Kleerebezem M, Kurokawa K, Leclerc M, Levenez F, Manichanh C, Nielsen HB, Nielsen T, Pons N, Poulain J, Qin J, Sicheritz-Ponten T, Tims S, Torrents D, Ugarte E, Zoetendal EG, Wang J, Guarner F, Pedersen O, de Vos WM, Brunak S, Dore J, Meta HITC, Antolin M, Artiguenave F, Blottiere HM, Almeida M, Brechot C, Cara C, Chervaux C, Cultrone A, Delorme C, Denariaz G, Dervyn R, Foerstner KU, Friss C, van de Guchte M, Guedon E, Haimet F, Huber W, van Hylckama-Vlieg J, Jamet A, Juste C, Kaci G, Knol J, Lakhdari O, Layec S, Le Roux K, Maguin E, Merieux A, Melo Minardi R, M'Rini C, Muller J, Oozeer R, Parkhill J, Renault P, Rescigno M, Sanchez N, Sunagawa S, Torrejon A, Turner K, Vandemeulebrouck G, Varela E, Winogradsky Y, Zeller G, Weissenbach J, Ehrlich SD, Bork P: Enterotypes of the human gut microbiome. Nature, 2011; 473: 174-180 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
21. Ding T, Schloss PD: Dynamics and associations of microbial community types across the human body. Nature, 2014; 509: 357-360 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
22. Karlsson FH, Tremaroli V, Nookaew I, Bergstrom G, Behre CJ, Fagerberg B, Nielsen J, Backhed F: Gut metagenome in European women with normal, impaired and diabetic glucose control. Nature, 2013; 498: 99-103 [PubMed] [Google Scholar]
23. Mazmanian SK, Round JL, Kasper DL: A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease. Nature, 2008; 453: 620-625 [PubMed] [Google Scholar]

Будьте здоровы!