Антифунгальные (фунгистатические) свойства молочных пропионибактерий

Противогрибковые свойства молочных пропионовокислых бактерий

Аннотация

Сегодня мировое сельское хозяйство сталкивается с серьезными проблемами. Население планеты быстро растет, и нам необходимо удовлетворять растущие потребности в продовольствии с помощью новых стратегий, включая экологически устойчивые методы. Производство должно быть расширено за счет оптимизации использования ресурсов и улучшения методов хранения и распределения. Кроме того, требования потребителей сократить количество искусственных консервантов требуют инновационного исследовательского мышления.

Использование микроорганизмов в качестве биоконсервантов имеет множество преимуществ. Они часто происходят из среды, схожей с той, где они будут использоваться, что делает их присутствие естественным. Такие бактерии, как молочнокислые и молочнокислые пропионибактерии, производят слабые органические кислоты с хорошей консервирующей способностью и ряд других антимикробных соединений. Молочные пропионибактерии обладают дополнительными преимуществами, такими как высокая выработка витамина B12 и фолиевой кислоты. Некоторые штаммы также производят экзополисахариды, полезные для улучшения текстуры молочных продуктов.

Данная работа посвящена противогрибковым свойствам молочных пропионибактерий. Важная часть их противогрибковой способности обусловлена выработкой органических кислот. Было исследовано действие этих кислот при различном pH и различных концентрациях против восьми грибов, вызывающих порчу. Обнаружен pH-зависимый эффект ингибирования роста, причем наиболее чувствительным видом грибов является Penicillium roqueforti. Кроме того, молочные пропионибактерии продуцируют ряд других соединений, обладающих противогрибковой активностью. Идентификацию 3-фенилмолочной кислоты и нескольких противогрибковых пептидов, присутствующих в ростовой среде, проводили после разделения на колонке твердофазной экстракции и ВЭЖХ. Противогрибковая активность контролировалась путем скрининга против Aspergillus fumigatus. Было продемонстрировано сильное усиление противогрибковой активности молочных пропионибактерий в сочетании с глицерином. Добавление 500 мМ глицерина к верхнему слою в анализе наложения полностью снижало рост некоторых грибов, вызывющих порчу. Противогрибковый штамм Propionibacterium jensenii был объединен с Lactobacillus fermentum в биоконсервирующей культуре, используемой для влажного консервирования зерна. Добавление глицерина в систему в некоторых случаях увеличивало производство пропионовой кислоты, и было обнаружено более раннее снижение pH. Однако эта комбинация бактерий не смогла снизить рост Penicillium roqueforti.

1. Введение

Микроорганизмы всегда играли важную роль в нашей жизни, иногда в хорошем смысле. Древний процесс спонтанной ферментации позволил создать вкусный способ сохранения продуктов питания и кормов, а также дал нам возможность хранить продукты питания и корма в течение года. Молочнокислые бактерии (МКБ) могут обеспечить нас разнообразными вкусными продуктами, такими как сыр, йогурт, маринованные овощи и ферментированная колбаса (Hansen, 2002). Бактерии также можно использовать для производства органических растворителей, витаминов и ферментов (Demain & Adrio, 2008). Способность подавлять другие микроорганизмы расширяет сферу применения некоторых бактерий, включая предотвращение патогенов в кишечнике убойных животных (Younts-Dahl et al., 2004).

Дрожжи ежедневно используются для производства хлеба и напитков, в то время как микроорганизмы, такие как плесневые грибки, также нашли широкое применение. Самым известным примером, должно быть, является открытие сэром Александром Флемингом, удостоенным Нобелевской премии в 1928 году, что плесневый грибок Penicillium способен подавлять рост бактериальной культуры путем выработки антибиотического соединения (Brown, 2004). Более недавним применением является производство кворна (Quorn), питательного заменителя мяса, получаемого из мицелия плесневого грибка Fusarium venenatum (Denny et al., 2008).

К сожалению, микроорганизмы могут оказывать различные негативные эффекты. Бактериальные инфекции вызывают такие состояния, как отит, цистит и диарея (Danielsson & Kjellander, 1993). Вирусы могут вызывать детские заболевания, такие как ветряная оспа и корь, а также тяжелые заболевания, такие как гепатит и спид (Danielsson & Kjellander, 1993). Дрожжевые инфекции слизистых оболочек человека довольно распространены, в то время как нитевидные (нитчатые) грибы реже участвуют в заболеваниях человека (Danielsson & Kjellander, 1993). С другой стороны, при порче продуктов питания и комбикормов широко представлены нитевидные грибы. При подходящей температуре и наличии достаточного количества воды эти грибы могут быстро испортить большое количество пищевых продуктов. Их рост может привести к порче как из-за неприятного запаха, вкуса и внешнего вида, так и из-за микотоксинов. Микотоксины - это вторичные метаболиты, продуцируемые определенными нитевидными грибами, и многие из них высокотоксичны (Magan & Aldred, 2007).

---

Краткая справка от редактора: Грибы могут быть одноклеточными или многоклеточными и, в зависимости от организма, могут принимать различные морфологические формы, основанные на способе деления и роста клеток. В целом грибы растут как дрожжи или нитевидные (нитчатые) грибы. Дрожжи делятся либо почкованием, либо делением, в то время как плесени растут за счет апикального удлинения своих нитей, известных как гифы (единственное число = гифа). Рост гиф может происходить как с разделением клеточной стенки на отсеки, так и без него, что называется септацией. Продолжение роста приводит к образованию сложной сети гиф, называемой мицелием.

---

Все более критичное отношение потребителей к использованию большого количества химических веществ в качестве консервантов побудило к поиску простой, нетоксичной и удобной в использовании альтернативы. Одним из важных примеров является использование микроорганизмов в качестве биологических консервантов, также называемое биоконсервацией/биоконтролем (Ross et al., 2002).

Во время роста определенных типов бактерий образуются органические кислоты, например молочная, уксусная и пропионовая кислоты. Они эффективны при снижении рН, что может быть эффективным способом подавления других микроорганизмов (Adams & Moss, 2000).

Существует несколько видов бактерий и дрожжей, которые могут выступать в качестве консервантов, но в данной статье основное внимание уделяется молочным пропионибактериям. На данный момент их наиболее известное применение, вероятно, в качестве заквасочных культур в швейцарском сыре, для придания ему особого орехового вкуса и характерных дырочек. Еще одним интересным применением является использование молочных пропионибактерий в качестве натуральных консервантов в продуктах питания и кормах. Они применялись в качестве защитных культур при производстве хлеба (Soumalainen & Mäyrä-Mäkinen, 1999), молочных продуктов (Ekinci & Gurel, 2008) и кормов для животных в виде кукурузного силоса (Rowghani et al., 2008), но сегодня их использование для консервирования зерна ограничено.

Поскольку молочные пропионибактерии десятилетиями безопасно использовались в качестве заквасочных культур, их возможное использование в качестве микроорганизмов для биоконтроля не должно наталкиваться на какие-либо серьезные препятствия в законодательстве или с точки зрения безопасности потребителей (Meile et al., 2008).

1.1. Цели

В данной работе исследовалась гипотеза о том, что молочные пропионибактерии могут быть использованы в качестве природных консервантов/биоконтрольных организмов в системах хранения кормов. Конкретные задачи заключались в следующем:

1. Исследовать ингибирующий эффект органических кислот, продуцируемых молочными пропионибактериями.
2. Сравнить рост и противогрибковые эффекты молочных пропионибактерий на различных субстратах.
3. Выявить противогрибковые соединения, продуцируемые молочными пропионибактериями.
4. Изучить возможность улучшения противогрибкового эффекта молочных пропионибактерий в сочетании с глицерином.
5. Оценить молочные пропионибактерии как часть культуры биоконсервации при хранении влажного зерна.

2. Сельское хозяйство в условиях перемен

Из-за большого роста населения Швеции, начавшегося в начале XIX века, сильно возросли требования к сельскому хозяйству для производства достаточного количества продовольствия. Однако, вопреки распространенному мнению, не индустриализация и не введение искусственных удобрений спасли Швецию от сильного голода. Шведские фермеры смогли решить эту проблему или, по крайней мере, избежать худшего сценария, благодаря таким изменениям, как переход на пастбищное содержание скота (Einarsson, 1996). Раньше зимний корм (сено и сушеные листья) поступал исключительно с естественных лугов и деревьев. Благодаря Карлу Линнею использование бобовых растений произвело революцию в циркуляции питательных веществ в пахотных землях (Einarsson, 1996). Бобовые обладают способностью использовать азот из воздуха для своего роста, а также обогащать почву, например, для последующих зерновых культур. Неожиданно фермеры получили повышенный выход корма для животных, а также возможность обрабатывать свои поля непрерывно, избегая необходимости пахать каждый второй или третий год.

Только после Второй мировой войны искусственные удобрения и пестициды совершили великий прорыв (Jonsson, 1994).

2.1. От мелкого фермерства к крупной промышленности

Внедрение искусственных удобрений и пестицидов повысило производительность труда, но движущей силой дальнейшего развития сельского хозяйства стало другое требование. Как и в большинстве других сфер производства, главной целью индустриализации сельского хозяйства было сокращение использования человеческого труда. Внедрение химических средств производства, таких как искусственные удобрения и пестициды, освободило фермеров от необходимости балансировать рециркуляцию питательных веществ в 1930-1940-х годах (Einarsson, 1996). Вместо того чтобы зависеть от полноценной функционирующей производственной цепочки, когда животные производят навоз, которым можно удобрять поля, или использовать зернобобовые растения, фермеры теперь могли сосредоточиться на одном виде деятельности: разведении животных или растениеводстве. Корма для животных можно было купить у земледельцев, а удобрения были коммерчески доступны. К сожалению, это развитие имело заранее определенные последствия: поскольку новые технологии и химические добавки экономили трудозатраты, цены на сельскохозяйственную продукцию упали, поэтому фермеры были более или менее вынуждены идти в ногу с развитием событий.

2.2. Устойчивое развитие

Первоначальная причина быстрых изменений в сельском хозяйстве была той же, что и причина всей промышленной эволюции: удобство и трудосберегающие аспекты перехода от мышечной работы к крупномасштабному механизированному производству (Einarsson, 1996). Однако после 50 лет растущего использования химических удобрений и пестицидов все больше и больше людей понимают, что эта тенденция не может продолжаться. Общее количество гектарных доз химических пестицидов, проданных в Швеции в 2008 году, составило 5,1 миллиона, что на 16 % больше, чем в 2007 году. По отношению к общей площади пахотных земель количество проданных гектар-доз за 1990-е годы выросло с 1,10 до 1,69. В течение нескольких лет последовала тенденция к снижению, но в 2003 году произошел значительный сдвиг в сторону роста (Bengtsson & Persson, 2009). Одним из объяснений может быть более интенсивное использование пахотных земель и сокращение пустующих полей. Другим может быть снижение порога приемлемости грибковой порчи из-за ожидаемого роста цен на зерно. В любом случае, эта тенденция к увеличению вызывает беспокойство и требует серьезного отношения.

Учитывая тот факт, что 80% шведских пахотных земель, используемых под растениеводство, используется для производства кормов для животных, для устойчивого будущего может потребоваться изменение нашей структуры потребления (Rudquist & Lundgren, 1996). Простое математическое упражнение показывает дисбаланс в сегодняшнем распределении ресурсов. Та же площадь, которая необходима для производства достаточного количества животного белка, чтобы прокормить одного человека в течение 80 дней, будет производить достаточно растительного белка (соевых бобов), чтобы прокормить того же человека в течение 2 200 дней (Käck-Brolund, 1991)!

Еще один аспект неэкологичного обращения с ресурсами - загрязнение окружающей среды транспортом, связанным с производством продуктов питания и кормов. Доля транспортных расходов, включаемых в ежедневные цены на продукты питания, постоянно увеличивается, конечно, в том числе и за счет окружающей среды.

Недавно Rockström et al. (2009) предложили планетарные границы для девяти процессов, которые срочно требуют внимания. Одним из тех, где мы уже превысили допустимый предел, является азотный цикл. Другими являются изменения в землепользовании, когда необходимо замедлить превращение неиспользуемых земель в сельскохозяйственные угодья, и, конечно, любое химическое загрязнение. Все эти процессы так или иначе зависят от сельскохозяйственной отрасли. Преобразование земель очевидно, а химическое загрязнение является результатом многих видов процессов, где выбросы парниковых газов от транспорта составляют лишь малую часть. Вклад азота, выделяемого современным сельским хозяйством, значителен. Производство удобрений для производства продуктов питания и выращивание зернобобовых растений стало важной и основной причиной превышения лимита загрязнения азотными газами. Ежегодно около 120 миллионов тонн газообразного азота из атмосферы преобразуются в химически активные формы, главным образом в результате этих процессов (Rockström et al., 2009).

Подводя итог, можно сказать, что нам необходимо изменить подход к управлению природными ресурсами и просто отношение к нашей планете, если мы хотим сохранить устойчивую экосистему для будущих поколений. Утверждение о том, что частью решения проблемы является внедрение органического сельского хозяйства, является спорным. В органическом сельском хозяйстве не допускается использование неорганических удобрений и химических пестицидов. Преимуществом этого, конечно, является ограничение загрязнения окружающей среды. С другой стороны, органическое сельское хозяйство приводит к снижению урожайности, поэтому для того, чтобы прокормить то же количество людей, необходимо использовать большую площадь земли. Вопрос о переводе мирового сельского хозяйства на органическое ведение разделяет экспертов и заинтересованные группы на два разных лагеря. Одним из самых острых конфликтов является вопрос о том, увеличивает ли производство коммерческих удобрений выбросы парниковых газов (Andersson et al., 2009). В этом контексте актуальным является вопрос о том, как избыточный азот, образующийся при выращивании животных и в городской среде (сточные воды), может быть использован в качестве удобрений при выращивании сельскохозяйственных культур. Важно найти устойчивую сельскохозяйственную систему с более высокой степенью циркуляции питательных веществ и энергии, чем сегодня. Кроме того, чтобы удовлетворить спрос на продовольствие со стороны растущего населения планеты, нам, возможно, придется дополнить свой рацион продуктами из растительного царства.

2.3. Продукты питания и комбикорма

Люди разработали передовую систему производства, обработки и приготовления пищи. У нас есть законодательство, контролирующее каждый этап производственного процесса. В развитых странах значительная часть всех произведенных продуктов питания выбрасывается либо уже в супермаркете, либо потребителями из-за слишком строгих рекомендаций властей в сочетании с незнанием свойств хранения (SIWI, 2008).

Наши сельскохозяйственные животные живут более простой жизнью. Корма и вода поставляются фермером и, надеемся, сбалансированы по питательным веществам. Производство кормов для животных также сопряжено со многими ограничениями и возлагает на производителя большую ответственность в отношении требований к безопасности и питательности.

Устойчивое будущее в производстве и потреблении продуктов питания и кормов требует более общих знаний о хранении пищевых продуктов и ответственности за последствия сегодняшнего неэкономного образа жизни.

2.3.1. Производство и потребление

В конце 2009 года в сельском хозяйстве или пищевой промышленности Швеции работало около 3 % оплачиваемой рабочей силы (Rahm, 2010). Это означает, что только 90 000 человек отвечают за производство продуктов питания и кормов для 9 миллионов жителей Швеции. Требования к продуктам питания больше не ограничиваются только объемом и вкусом. Сегодня мы также хотим знать, что наша пища производится без негативного влияния на разнообразие животных и растений, на здоровье наших морей и озонового слоя. Она также не должна содержать всевозможных токсинов и добавок, способных вызвать заболевания.

В кормопроизводстве ожидания примерно те же, даже если требования предъявляются не потребителями. Нам необходимо увеличить производство продовольствия и кормов в мире, но не за счет будущего нашей планеты. Один из способов удовлетворения этой потребности - более эффективное использование имеющихся ресурсов. Сегодня слишком большая часть всех продуктов питания и кормов выбрасывается. Улучшение планирования и повышение осведомленности приведут к изменению такого поведения.

Контроль использования корма зависит от ограничения его разливов (просыпей) и обеспечения надежного хранения.

2.3.2. Хранение и порча

Во время хранения может произойти несколько событий, которые сделают продукт несъедобным. Влажные продукты могут высохнуть, а жирные - прогоркнуть. Однако основной проблемой для испорченных продуктов питания и кормов является порча микроорганизмами (показано на рис. 1).

Рисунок 1. Твердый сыр, зараженный Penicillium roqueforti, и хлеб, естественно испорченный плесенью Penicillium.

Ни один продукт питания или корм не является стерильным на стадии потребления. Микроорганизмы, вызывающие порчу, попадают в продукт либо из сырья, либо случайно на каком-то этапе производственного процесса. Многие микроорганизмы, непреднамеренно попавшие в продукт, безвредны и не вызывают никаких проблем своим присутствием. Проблемы начинаются, если вредные микроорганизмы получают возможность расти. Наиболее важными регулирующими факторами являются доступ к питательным веществам, достаточная активность воды (a_w), подходящий уровень pH и подходящая температура (Adams & Moss, 2000). Во многих пищевых продуктах присутствие антимикробных компонентов также ограничивает рост. Специи и пигменты могут как улучшать органолептические свойства, так и препятствовать росту микроорганизмов, вызывающих порчу (Adams & Moss, 2000).

Чтобы увеличить срок годности, необходимо ограничить один или несколько критических факторов. Доступ к питательным веществам трудно ограничить, если мы хотим, чтобы продукты оставались пригодными для употребления в пищу или в качестве корма. Активность воды, pH и температура - более легко контролируемые факторы. Для продуктов питания мы разработали надежную систему контроля температуры с появлением холодильника. Хранение кормов зависит от контроля других факторов, поскольку контроль температуры в таких крупных хранилищах невозможен. Наиболее распространенным способом сохранения фуражного зерна в Швеции на сегодняшний день является сушка горячим воздухом с использованием ископаемого топлива и электроэнергии (Jonsson & Pettersson, 1999). При этом достигается достаточно низкая активность воды, что обеспечивает безопасность хранения. Однако в связи с ростом цен на энергоносители и потребностями в более экологичной обработке растет интерес к альтернативным методам, таким как биоконсервация.

3. Микробная технология

Число областей применения микробных технологий постоянно растет. Общее мнение о том, что микроорганизмы в основном имеют вредоносную природу, возможно, изменилось бы, если бы хотя бы часть всех возможных применений стала более известной.

Микроорганизмы могут производить несколько полезных продуктов, помимо повседневного хлеба, сыра, йогурта и напитков. В 1950-х годах был обнаружен полисахарид с ценными свойствами, производимый бактерией Xanthomonas campestris (Glazer & Nikaido, 2007). В настоящее время полисахарид ксантановая камедь используется в качестве добавки в различных продуктах питания, кормах, фармацевтических и косметических препаратах. Структура ксантановой камеди делает ее полезной в качестве эмульгатора и стабилизатора при замораживании-оттаивании. Еще одно полезное вещество, производимое микроорганизмами, - этанол. Известно, что дрожжи, такие как Saccharomyces, и бактерии, такие как Clostridium и Thermoanaerobium, производят этанол (Glazer & Nikaido, 2007). Производство этанола, конечно, выгодно для индустрии алкогольных напитков, но растущий поиск неограниченного источника транспортного топлива, не зависящего от нефтехимии, делает производство этанола еще более интересным.

Генетическая модификация микроорганизмов открыла еще более широкий спектр возможных применений. Использование генетически модифицированных микроорганизмов в фармацевтической промышленности, вероятно, не самое спорное применение. Производство инсулина и гормона роста человека (hgh) из генетически модифицированной кишечной палочки (Escherichia coli) произвело революцию в лечении пациентов с диабетом и нарушениями роста (Glazer & Nikaido, 2007). Однако когда речь заходит о переносе микробных генов в растения для достижения устойчивости к холоду, жаре, соли или пестицидам, реакция общественности в Европе обычно не столь благожелательна.

Еще одна область, где деятельность микроорганизмов может быть очень полезной, - это растущая проблема загрязнения воды и почвы. На станциях очистки сточных вод сложное сообщество организмов (бактерии, грибы, водоросли, простейшие и т.д.) используется для уменьшения количества патогенных микроорганизмов, а также органических соединений в воде (Glazer & Nikaido, 2007). Определение биоремедиации таково: "спонтанный или управляемый процесс, в котором биологический (особенно микробиологический) катализ воздействует на загрязняющие вещества и тем самым исправляет или устраняет загрязнение окружающей среды" (Glazer & Nikaido, 2007). Применение данному процессу можно найти в загрязненных почвах, грунтовых водах или маслянистом шламе нефтеперерабатывающих заводов.

3.1. Улучшение качества пищевых продуктов и кормов путем ферментации

Микроорганизмы, растущие анаэробным путем, могут повысить качество и продлить срок годности пищевых продуктов или кормов с помощью процесса ферментации. Ферментация - это анаэробный процесс с внутренне сбалансированными окислительно-восстановительными реакциями (Buckel, 1999), часто приводящий к образованию кислоты, что приводит к повышению стабильности. Большинство процессов ферментации инициируются бактериями, но есть также продукты, которые, как говорят, ферментируются грибами, иногда в аэробной среде, хотя использование термина ферментация в этом случае по определению неверно.

Если микроорганизмом являются дрожжи, сырье часто богато углеводами (Adams & Moss, 2000). Примерами продуктов, ферментированных дрожжами, являются пиво, вино и хлеб. Некоторые ферментированные продукты производятся путем инокуляции нитевидных грибов (плесени). В восточных странах, таких как Индонезия и Китай, широко распространено потребление ферментированных продуктов, приготовленных с использованием плесени. Темпе - это общий термин для зерновых или бобовых, ферментированных в результате роста нитевидного гриба, но обычно относится к сое, ферментированной видами Rhizopus, предпочтительно Rhizopus oligosporus (Nout & Kiers, 2005). Однако зерна злаков также успешно используются в качестве сырья (Feng et al., 2005). Другим продуктом, получаемым путем плесневой ферментации, является соевый соус. Характеристики соевого соуса частично обусловлены видами Aspergillus (A. oryzae, A. sojae и A. niger), но для получения полноценного продукта из соевого соуса также требуются другие микроорганизмы. Спиртовое брожение дрожжами Zygosaccharomyces rouxii и молочнокислое брожение молочнокислыми бактериями Tetragenococcus halopHila также используются для получения соевого соуса с характерным вкусом и ароматизацией (Nout, 2007).

Самое большое количество ферментированных продуктов основано на молочнокислом брожении. Они охватывают большинство областей пищевой промышленности: от йогурта, кефира и сыра до ферментированных овощей, таких как квашеная капуста, оливки и соленые огурцы, колбас, таких как салями, и даже ферментированной рыбы, которая является основой многих азиатских соусов и паст (Adams & Moss, 2000).

3.2. Биоконсервация

Процессы биоконсервации и ферментации имеют ряд общих свойств. Обе концепции связаны с микроорганизмами и их способностью производить вещества, улучшающие качество продукта. В процессе ферментации основное внимание уделяется получению приятного вкуса, запаха и текстуры и одновременному продлению срока хранения. Хотя аналогичные действия могут происходить и при биоконсервации, в данной работе основное внимание уделяется сохранению качества.

Биоконсервация осуществляется с помощью микроорганизмов, естественно присутствующих в продукте, или микроорганизмов, близкородственных естественным, без намерения повлиять на органолептические ощущения.

Традиционно для биоконсервации используются микроорганизмы, продуцирующие целый ряд противомикробных соединений, особенно полезными являются молочнокислые бактерии (МКБ). Из-за широкого спектра потенциальных применений и долгой истории безопасного использования как в продуктах питания, так и в кормах, возник интерес к выявлению активных метаболитов в МКБ. Помимо очевидного эффекта вырабатываемой молочной и уксусной кислоты, было обнаружено множество соединений, способных ингибировать другие микроорганизмы. Малые пептиды и 3-фенилмолочная кислота (Ghalfi et al., 2010; Ström et al., 2002), белковые соединения (Magnusson & Schnürer, 2001) и бактериоцины (Hata et al., 2010; Tiwari & Srivastava, 2008; Kumari & Prakash Garg, 2007) проявили противомикробную активность.

3.2.1. Способ действия

Способ действия всех этих различных соединений еще не до конца изучен. Что касается влияния органических кислот на микроорганизмы, вызывающие порчу, то ингибирующая способность зависит от значения pH. В разбавленных растворах pH напрямую зависит от концентрации ионов водорода. Выделение ионов водорода из кислоты зависит от ее силы. Кислоты, вырабатываемые ферментирующими бактериями, представляют собой слабые органические кислоты (уксусная, молочная и пропионовая). Эти кислоты лишь частично высвобождают свои ионы водорода в диапазоне pH продуктов (Stratford, 1999), т.е. они частично диссоциированы. В растворе устанавливается равновесие между диссоциированными и недиссоциированными молекулами слабых кислот:

[HA] ⇆ [H⁺] + [A^-]

где H - протон, а A - кислота.

Это равновесие зависит от pH; высокий pH приводит к повышению концентрации диссоциированной формы, а низкий pH увеличивает концентрацию недиссоциированной формы. При определенном значении pH каждая слабая кислота существует с равными пропорциями диссоциированных и недиссоциированных молекул. Это значение pH соответствует значению pKa кислоты. Используя уравнение Гендерсона-Хассельбаха, можно рассчитать концентрацию диссоциированных (или недиссоциированных) молекул кислоты при определенном pH.

pH = рКа + log ([A^-] / [HA]), (уравнение Henderson-Hasselbach)

Способность оставаться в недиссоциированном состоянии является важным свойством, позволяющим слабым кислотам подавлять рост микробов. Сильная кислота полностью диссоциирует в диапазоне pH большинства пищевых продуктов. Это делает их более эффективными в снижении рН окружающей среды, но с менее специфическим воздействием на целевой организм. Для слабых кислот недиссоциированные молекулы представляют собой мощную ингибирующую способность роста. Поскольку недиссоциированные молекулы доминируют при значениях рН ниже рКа и быстро уменьшаются в концентрации выше рКа, слабая кислота с высоким значением рКа является наиболее эффективной при относительно высоком рН.

Плазматическая мембрана большинства микроорганизмов ограничивает проникновение заряженных молекул. Однако недиссоциированные молекулы могут легко диффундировать, по крайней мере, если они липофильны (Стратфорд, 1999). Внутри микроорганизмы стремятся к нейтральному уровню pH. Это необходимо для защиты структурных белков клетки, ферментов, нуклеиновых кислот и фосфолипидов (Davidson, 2001). Когда недиссоциированная молекула кислоты попадает в нейтральную внутриклеточную среду, она диссоциирует в заряженную форму; один протон и одна отрицательно заряженная молекула. Это подкисляет микробную клетку, и стремление поддерживать нейтральный уровень pH приводит к активному транспорту нежелательных молекул. Связанная с мембраной H⁺-АТФаза может откачивать протоны, но для этого требуется энергия в виде аденозин-5’-трифосфата (АТФ). Уже на этом этапе рост будет ослаблен из-за потери энергии. Если насос H⁺-ФТФазы не способен восстановить внутренний pH, жизненно важные структуры и функции внутри микробной клетки будут разрушены, что в конечном итоге приведет к коллапсу клетки (Stratford, 1999).

Организмы-мишени, конечно, очень разные, что заставляет их по-разному реагировать на слабые кислоты. Считается, что действие молочной кислоты и, возможно, других органических кислот осуществляется по какому-то другому механизму, поскольку не наблюдается корреляции между снижением внутреннего pH и степенью ингибирования молочной кислоты (Freese et al., 1973).

Бактериоцины, продуцируемые МКБ, приводят к образованию пор в мембране организмов-мишеней, вызывая утечку и разрушение трансмембранного потенциала (Todorov, 2009; Moll et al., 1996). Бактериоцин дисгалактин также нарушает мембрану и, кроме того, ингибирует поглощение глюкозы (Swe et al., 2009).

4. Молочные пропионибактерии

Ученые Э. Фройденрайх и О. Орла-Йенсен выделили первую пропионовокислую бактерию из эмментальского сыра в 1906 году (Jan et al., 2007). В ранних исследованиях пропионовокислые бактерии выделялись исключительно из сыра, молока и молочных продуктов. Сейчас известно, что естественной средой их обитания может быть также пищеварительный тракт жвачных животных (Rinta-Koski et al., 2001; Jarvis et al., 1998). Усовершенствованные методы выделения позволили выделять молочные пропионибактерии также из почвы и силоса (Rossi et al., 1999).

Кожные пропионибактерии, включенные в род Propionibacterium в 1970-х годах, отличаются от молочных пропионибактерий (Vorobjeva, 1999). Как следует из названия, они встречаются на коже человека, а также в ранах, костном мозге, содержимом желудка и крови. Первоначально кожные пропионибактерии были помещены в род Corynebacterium, но перенос был мотивирован тем, что они являются анаэробами (коринебактерии в основном аэробные), производят пропионовую кислоту в качестве основного метаболита, а состав их клеточной стенки более схож с молочными пропионибактериями, чем с коринебактериями (Vorobjeva, 1999). Однако существует ряд особенностей, разделяющих эти две ветви пропионибактерий (табл. 1). Молочные пропионибактерии также называют классическими пропионибактериями, поскольку они первыми были включены в род Propionibacterium. Этот род относится к семейству Propionibacteriacea, подклассу Actinobacteria, вместе с такими родами, как Luteococcus, Friedmanniella, Tessaracoccus и Propionimicrobium. Филогенетическое родство между пропионибактериями отличается от классификации на молочные и кожные виды. Propionibacterium freudenreichii филогенетически наиболее близка к единственному классическому виду, не выделенному из молочных продуктов, т.е. к P. cyclohexanicum. Другие классические виды сгруппированы вместе с кожными видами, такими как P. acnes, P. avidum и P. granulosum, в филогенетическом дереве, основанном на последовательностях 16S рДНК (Stackebrandt et al., 2006).

Таблица 1. Различия между молочными и кожными пропионибактериями

Характеристики	Молочные пропионибактерии	Кожные пропионибактерии
Дыхание	Микроаэрофильные или факультативные	Анаэробные
Патогенность	-	+
Цвет колонии	Кремовый, желтый, оранжевый, красный, коричневый	Розоватый
ДНК (G+C мол.%)	65-68	58-64
Гидролиз эскулина	-a	+
Ликвидация желатина	+b	-c
Оптимум роста (°C)	30-32	36-37

a) Propionibacterium avidum позитивные. b) Propionibacterium granulosum и Propionibacterium lympHopHilum негативные. c) Propionibacterium cyclohexanicum позитивные

4.1. Характеристика

Пропионибактерии - это грамположительные, неправильной формы, не образующие спор, неподвижные, каталазоположительные палочки (Vorobjeva, 1999). Под микроскопом пропионибактерии часто видны в характерном расположении: в форме буквы V или Y или в виде китайских иероглифов. В зависимости от стадии роста и условий окружающей среды их морфология и размер могут сильно варьировать (Jan et al., 2007). Основными метаболитами являются пропионовая, уксусная кислоты и углекислый газ, но также образуются янтарная, муравьиная кислоты и витамин B12 (Vorobjeva, 1999). К молочным пропионибактериям относятся следующие виды:

• Propionibacterium freudenreichii
• Propionibacterium jensenii
• Propionibacterium thoenii
• Propionibacterium acidipropionici
• Propionibacterium cyclohexanicum

Отличить эти виды не всегда просто, но некоторые видовые характеристики можно выявить:

• P. freudenreichii → Наиболее широко распространенный вид, используется в качестве заквасочной культуры в сырах швейцарского типа; самая высокая термоустойчивость; негемолитический; колонии обычно белые или бежевые; подвиды freudenreichii и shermanii, могут быть разделены по ферментации лактозы (freudenreichii -, shermanii +).
• P. jensenii → Довольно разнообразны, штаммы первоначально описывались как отдельные виды; как аэробные, так и анаэробные; ß-гемолитические; колонии от кремового до желтого цвета; некоторые штаммы продуцируют внеклеточную слизь.
• P. thoenii → ß-гемолитический; самый медленно растущий вид; колонии желтые, оранжевые, красные или коричневые.
• P. acidipropionici → Слабая или отрицательная каталазная реакция; растет аэробно; колонии бежевые или оранжевые; некоторые штаммы выделяют внеклеточную слизь.
• P. cyclohexanicum → Отрицательная каталазная реакция; вырабатывают молочную кислоту; очень кислотоустойчивы; колонии белые или кремовые.

На рисунке 2 показаны три штамма каждого из первых четырех видов молочных пропионибактерий на SL-агаре.

Рисунок 2. Три штамма каждого вида молочных пропионибактерий на каждой агаровой чашке а) P. freudenreichii, б) P. acidipropionici, в) P. jensenii, г) P. thoenii

4.1.1. Условия роста

Молочные пропионибактерии могут использовать множество различных источников углерода, например, глюкозу, фруктозу и глицерин, но предпочтительным субстратом является лактат (Jan et al., 2007). Подходящая среда содержит 1% лактата натрия, 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,5% KH₂PO₄. Это обеспечит хороший рост, но в зависимости от цели культивирования другие среды могут быть более подходящими. Оценка пяти видов штаммов молочных пропионибактерий на трех различных субстратах показала различия как в противогрибковой активности, так и в производстве метаболитов (I). Среду с лактатом натрия (SL), как описано выше, сравнивали с коммерческой средой де Ман-Рогоза-Шарпа (MRS) и модифицированной версией MRS, в которой был удален ацетат (MRS-AC). Источником углерода в SL является лактат, а в обеих версиях MRS - глюкоза. Рост наблюдался на всех трех средах, но производство кислот различалось в зависимости от источника углерода. P. thoenii показал слабый рост, но, кроме того, все штаммы продуцировали наибольшее количество пропионовой и уксусной кислот на среде SL. Штаммы также инокулировали на агаровые чашки с теми же средами, и после роста их покрывали мягким агаром, содержащим споры плесени или дрожжевые клетки, для измерения ингибирующей способности. В этом анализе ингибирование пропионибактериями, выращенными на SL, было наименее эффективным. Некоторые пропионибактерии, выращенные на SL, оказывали влияние только на плесень Aspergillus fumigatus. Ингибирование грибов на MRS и MRS-AC было заметно для всех индикаторных грибов, но различалось по силе, и не удалось выбрать лучшую среду (рис. 3). Начальный pH всех трех сред был около 6. После роста пропионибактерий рН сильно снижался в чашках с MRS и MRS-AC, но совсем не снижался на SL, вероятно, из-за более высокой буферной способности среды SL. При pH 6 только 6,9% пропионовой кислоты и 5,4% уксусной кислоты присутствуют в недиссоциированной форме, т.е. в форме, обладающей антимикробным действием.

Рисунок 3. Типовые штаммы молочнокислых пропионибактерий на различных средах. P. thoenii 20276 против A. fumigatus на (a) MRS и (b) MRS без ацетата, а P. jensenii 20535 против A. fumigatus на (c) MRS и (d) MRS без ацетата.

Само значение pH также является фактором, влияющим на рост пропионибактерий. Оптимальный диапазон для роста составляет от 8,5 до 5,1 (Jan et al., 2007). В зависимости от желаемого конечного продукта оптимальные условия могут сильно различаться. Для достижения максимального выхода экзополисахаридов из P. acidipropionici оптимальный pH должен быть сужен до 5,3-6,5 (Gorret et al., 2001).

Температурный оптимум для молочных пропионибактерий обычно составляет около 30°C, но рост возможен в диапазоне от 15°C до 40°C, в зависимости от штамма и других условий роста (Jan et al., 2007). Исследование 10 изолятов P. freudenreichii subsp. shermanii показало, что для разных штаммов одного подвида могут быть выявлены четкие различия в термотолерантности (Anastasiou et al., 2006).

Наиболее кислото- и термоустойчивый молочный вид, P. cyclohexanicum, может вызывать порчу достаточно стабильных в других отношениях пищевых продуктов, таких как фруктовые соки. Предварительная обработка при умеренно высокой температуре приводила к повышению выживаемости клеток после обработки при 85°C, 90°C или 95°C. Однако в апельсиновом соке клетки, которые не были предварительно обработаны, выживали в той же степени, что и предварительно обработанные клетки (Walker & Phillips, 2007).

Для производства пропионовой кислоты и витамина B12 требуются разные условия. Для максимального выхода пропионовой кислоты требуется полностью анаэробная среда при 37°C, в то время как для производства витамина B12 оптимальными условиями являются аэробные условия при 40°C (Quesada-Chanto et al., 1994).

Как сообщалось ранее (I), различные источники углерода приводят к различным концентрациям пропионовой кислоты. Сравнение между лактатом, глицерином и сахарной патокой показало, что лактат приводит к самой высокой конечной концентрации пропионовой кислоты (Coral et al., 2008). Однако если целью было получение чистой пропионовой кислоты, без уксусной кислоты в качестве побочного продукта, глицерин был предпочтительным субстратом. Кроме того, выращивание на сахарной патоке дало самый высокий выход биомассы (Coral et al., 2008).

Состав атмосферы также влияет на производство метаболитов. Три штамма P. freudenreichii subsp. shermanii выращивали на воздухе и сравнивали с ростом под давлением N₂. Производство уксусной кислоты и углекислого газа было выше, но производство пропионовой кислоты было ниже при выращивании в воздухе по сравнению с N₂-атмосферой (Benjelloun et al., 2007).

Возможность использования молочных пропионибактерий в пробиотических продуктах требует толерантности к желчным солям. Leverrier et al. (2003) показали, что предварительная обработка умеренными концентрациями желчных солей, а также термическое или детергентное воздействие значительно повышают выживаемость при других летальных концентрациях желчных солей. Напротив, предварительная обработка кислотой, по-видимому, сенсибилизировала клетки к действию желчных солей.

4.1.2. Метаболизм

Во время роста пропионибактерий на лактате молярное соотношение метаболитов составляет:

3 лактат → 2 пропионат + 1 ацетат + 1 CO₂ + 1 H₂O,  (Piveteau, 1999)

В реальности такой результат встречается редко, поскольку на относительные концентрации влияет множество факторов. При наличии другого источника углерода баланс будет иным. Рост на таких сахарах, как глюкоза, лактоза или галактоза, дает гораздо больший выход энергии, чем лактат, и приводит к увеличению скорости роста и биомассы. Однако относительное количество пропионовой и уксусной кислоты больше при лактатной ферментации (Piveteau, 1999). Если в одном и том же субстрате имеются и лактат, и сахара, лактат является предпочтительным субстратом для пропионибактерий (Piveteau, 1999).

Пропионовокислое брожение встречается не только в роде Propionibacterium, но и во многих других родах, таких как Clostridium, Bacillus, Pseudomonas и Bacteroides (Kim et al., 2010; Salazar et al., 2009).

Молочные пропионибактерии в различной степени аэротолерантны. В настоящее время установлено, что некоторые пропионибактерии могут быть адаптированы к росту в аэробных условиях (Vorobjeva, 1999). Детали этого пути до конца не изучены, но переход от анаэробного к аэробному культивированию привел к явному метаболическому переключению. Пропионовая кислота полностью разложилась, а выработка уксусной кислоты усилилась, что сопровождалось образованием яблочной кислоты (Ye et al., 1999).

Выращивание на глицерине также приводит к выходу кислоты, отличному от того, который наблюдается при ферментации лактата. Сравнительные исследования показали, что глицерин является превосходным субстратом для производства пропионовой кислоты (Himmi et al., 2000; Barbirato et al., 1997). При использовании глицерина, меченного ¹³С, была подтверждена гомо-пропионовая ферментация из глицерина (III). Анализ методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) после выращивания на глицерине (50% 1,3-меченый и 50% 2-меченый)* выявил только меченую пропионовую кислоту, никаких других соединений обнаружить не удалось (*пояснение. ред.: в качестве источника углерода использовали смесь ¹³С_1,3-глицерина и ¹³С₂-глицерина в соотношении 1:1)

Наряду с пропионовой кислотой, витамин B12, вероятно, является наиболее важным метаболитом пропионибактерий. Он вырабатывается в больших количествах по сравнению с уровнем большинства других микроорганизмов и необходим как самим пропионибактериям, так и человеку. Изучение синтеза в молочных пропионибактериях выявило короткую лаг-фазу параллельно с ростом. Вначале рост зависит от внешних источников витаминов. Синтез витамина В12 активируется только при получении достаточного количества энергии (Vorobjeva, 1999). Производство витамина B12 необходимо для ключевой реакции пропионовокислого брожения у пропионибактерий - изомеризации сукцинил-КоА в метилмалонил-КоА (Vorobjeva, 1999). Кроме того, было обнаружено, что пропионибактерии вырабатывают витамин B9, известный как фолиевая кислота (Hugenholtz et al., 2002). Хотя значение фолиевой кислоты для пропионибактерий еще недостаточно изучено, ее польза для человека очевидна. Фолиевая кислота, как и витамин B12, необходима для гематопоэза (производства клеток крови), и беременным женщинам рекомендуется повышенное потребление фолиевой кислоты для предотвращения дефектов нервной трубки плода.

Молочные пропионибактерии также являются признанными продуцентами бактериоцинов и других антимикробных соединений в процессе ферментации. Примерами бактериоцинов являются дженсениин G (Ekinci & Barefoot, 2006), пропионицин PLG-1 (Lyon et al., 1993), пропионицин T1 (Faye et al., 2000) и тоеницин 447 (Van der Merwe et al, 2004), продуцируемые штаммами P. thoenii, пропионин F (Brede et al., 2004) и некоторые неназванные бактериоцины из P. freudenreichii (Gwiazdowska & Trojanowska, 2006).

В настоящей работе было продемонстрировано получение 3-фенилмолочной кислоты с противогрибковым потенциалом из молочных пропионибактерий (II). Кроме того, были обнаружены два противогрибковых циклических дипептида и семь противогрибковых линейных пептидов. Дальнейшие исследования подтвердили, что пептиды получены из питательной среды (SL). Одним из компонентов этой среды является триптон, который содержит панкреатический перевар β-казеина. Три из идентифицированных линейных пептидов имели последовательности, обнаруженные в казеине, так что они, вероятно, произошли из этого источника. Определение концентрации циклического дипептида цикло(Phe-Pro) показало одинаковое количество в среде SL до и после роста P. jensenii (14,7 мкг/мл и 15,7 мкг/мл соответственно), поэтому было предположено, что он также происходит из среды (II).

4.1.3. Родственные виды

Молочные пропионибактерии имеют некоторые общие черты с бактериями из других родов. Ранее уже упоминалось о филогенетическом родстве с Corynebacterium. Некоторые отличительные признаки легко отделяют их от пропионибактерий: аэротолерантность, содержание G+C в ДНК и цвет колоний (Vorobjeva, 1999).

Род, наиболее близкий к молочным пропионибактериям, как с точки зрения физиологического сходства, так и их существования в сходных условиях, - это Lactobacillus. Молочные пропионибактерии и лактобациллы содержатся в молочных продуктах, а также в природе на траве или почве. Они оба хорошо растут анаэробно на сходных субстратах и образуют очень похожие колонии, если только пропионибактерии не принадлежат к одному из окрашенных видов. Даже в этом случае, поскольку лактобактерии растут намного быстрее, они обычно вытесняют пропионибактерии.

На одном и том же субстрате единственный надежный способ разделить разные бактерии - это, вероятно, молекулярные методы. Амплификация отдельных колоний с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) с последующим секвенированием нуклеотидов даст надежный ответ (Rossi et al., 1999). Выделение этих видов из одной культуры возможно при использовании достаточно селективных субстратов. В данной диссертации показано, что штаммы P. jensenii и Lactobacillus fermentum могут быть разделены на селективных субстратах после совместного культивирования в мини-силосах (мини-бункерах) для влажного консервирования зерна. Использование среды Рогоза для подсчета L. fermentum позволило добиться селективного роста, так как P. jensenii не смог расти на этой среде, вероятно, из-за высокой концентрации ацетата и низкого pH. Найти селективный субстрат для пропионибактерий оказалось сложнее. Решением в данной работе стало формирование устойчивости к антибиотикам путем повторных отборов на рифампицин- и стрептомицин-содержащем агаре. Использование SL-агара с рифампицином и стрептомицином позволило подсчитать даже P. jensenii на селективной среде. На рисунке 4 показан рост на SL-агаре без антибиотиков после длительной инкубации.

Рисунок 4. Рост L. fermentum T14 (белые колонии) и P. jensenii MP28RS02 (желтые колонии) на SL-агаре после длительной инкубации (две недели).

4.2. Применение

Прежде чем использовать микроорганизмы в любой области, связанной с продуктами питания или кормами, необходимо ответить на ряд вопросов:

1. Безопасен ли микроорганизм для человека и окружающей среды?
2. Можно ли культивировать и хранить микроорганизм с сохранением его жизнеспособности и желаемых характеристик?
3. Можно ли проводить полномасштабный эксперимент без ущерба для результатов?

Для решения первого вопроса необходимо провести тщательное исследование. Как можно раньше в процессе разработки необходимо оценить выбранные микроорганизмы на предмет выработки токсинов, опасности воздействия на человека, животных и окружающую среду, а также устойчивости к терапевтическим антибиотикам (Melin et al., 2007). Перед продолжением исследований также необходимо оценить экономическую целесообразность конечного продукта (Gautam & Sharma, 2009). В Европейском союзе (ЕС) Европейское управление по безопасности пищевых продуктов (EFSA) ввело список микроорганизмов, прошедших оценку безопасности для использования в пищевых продуктах и кормах, который называется "Квалифицированная презумпция безопасности" (QPS) (European Food Safety Authority, 2007). Прежде чем попасть в список QPS, микроорганизм проходит тщательную экспертизу по вышеупомянутым характеристикам и не требует дополнительной оценки со стороны EFSA, если выбран для применения (European Food Safety Authority, 2007). На сегодняшний день статус QPS получили две молочные пропионибактерии - P. freudenreichii и P. acidipropionici. Для использования микроорганизмов в кормах в ЕС уже принято очень подробное законодательство (Wessels et al., 2004). Правила использования микроорганизмов в продуктах питания по-прежнему являются предметом озабоченности каждой отдельной страны ЕС, причем они сильно варьируются - от строгих официальных требований до полного отсутствия законодательства в отношении стартовых культур (Wessels et al., 2004). В любом случае, пока другие виды молочных пропионибактерий не получат статус QPS, их применение может быть изучено, исходя из их близкого родства с P. freudenreichii и P. acidipropionici, что, вероятно, сделает их включение в QPS несколько более быстрым. Melin et al. (2007) рекомендуют искать предполагаемые организмы для биоконсервации в группах, где уже существуют одобренные виды.

Второй вопрос в приведенном выше списке касается особенностей культуры и хранения микроорганизма. Следует оценить способ действия, а также влияние как на намеченные, так и на непредусмотренные цели. Для многих микроорганизмов, предназначенных для биоконсервации, наиболее сильный эффект обусловлен выработкой слабых органических кислот. Активность сильно зависит от концентрации, pH и организма-мишени. В настоящей работе (I) были исследованы три наиболее важные органические кислоты в биоконсервации (молочная, уксусная и пропионовая кислота) и их воздействие на восемь различных грибов, вызывающих порчу, при различных значениях pH и различных концентрациях (I). Главным открытием стал неожиданный результат: Penicillium roqueforti оказался наиболее чувствительным протестированным видом. Это гриб, который обычно считается очень толерантным к pH и устойчивым к кислотам (Pitt & Hocking, 2009). Неудивительно, что существовала большая разница в ингибирующем действии органических кислот при различных значениях pH. При pH 3 концентрации кислоты 20 мМ или ниже обычно было достаточно для полного ингибирования, тогда как при pH 7 концентрации 500 мМ редко было достаточно для видимого ингибирования. Среди протестированных кислот пропионовая кислота была явно самой мощной. Из-за высокого значения pKa пропионовая кислота имеет более высокую долю недиссоциированных молекул при более высоком pH. Оценка продукции кислоты и противогрибковой активности пяти типов штаммов молочных пропионибактерий в накладном анализе показала, что P. acidipropionici, P. thoenii и P. jensenii являются самыми сильными грибковыми ингибиторами. Поскольку P. jensenii был лучшим производителем пропионовой кислоты среди них, штаммы этого вида должны быть возможными кандидатами для биоконсервации.

Влияние глицерина на противогрибковую активность было оценено в последующем исследовании (III).  Глицерин - это нетоксичное, почти безвкусное вещество без запаха, которое уже используется в качестве пищевой добавки и которое легко получить в больших количествах благодаря его появлению в качестве побочного продукта при производстве биодизеля, что является растущей отраслью промышленности (Behr et al., 2008). Кроме того, некоторые лактобациллы используют глицерин для производства 3-гидроксипропиональдегида, известного также как реутерин, мощного противомикробного вещества (Vollenweider & Lacroix, 2003). Превращение глицерина с помощью глицеролдегидратазы зависит от коэнзима В12, а генетическая организация генов дегидратазы сходна у всех организмов (Daniel et al., 1999). Сходство между молочными пропионибактериями и лактобациллами привело к более тщательному изучению комбинации молочных пропионибактерий и глицерина.

Рисунок 5. Ингибирование гриба A. fumigatus бактерией P. jensenii на различных субстратах с добавлением и без добавления глицерина.

Первоначальный эксперимент с добавлением глицерина к агару в анализах с SL, MRS и MRS-AC показал значительно улучшенную противогрибковую активность (рис. 5, неопубликованные результаты). В следующем исследовании использовали только SL (III). Поскольку предыдущие результаты показали противогрибковую активность без глицерина на других средах, SL была бы наиболее подходящей средой для изучения эффекта глицерина. Добавление глицерина к противогрибковым анализам значительно усиливало эффект в зависимости от дозы. Добавление всего 50 мМ глицерина в верхний слой агара дало видимый эффект ингибирования грибковых процессов для некоторых пропионибактерий и некоторых индикаторных грибов. Наиболее чувствительным из грибов-индикаторов была плесень Penicillium commune, в то время как дрожжи Rhodotorula mucilaginosa проявляли слабую реакцию даже при концентрации глицерина 500 мМ/л. Попытка найти последовательности генов, эквивалентные тем, которые отвечают за выработку реутерина у лактобацилл, путем гибридизации хромосомной ДНК не увенчалась успехом. При ЯМР-анализе с глицерином, меченным ¹³С, не было обнаружено никакого соединения, кроме пропионовой кислоты. Таким образом, наиболее вероятно, что гомоферментативное образование пропионовой кислоты, которая быстро снижает рН и приводит к сильной активности органических кислот, является механизмом, лежащим в основе усиленного эффекта ингибирования грибков, наблюдаемого после добавления глицерина.

Прежде чем проводить дальнейшие исследования, было бы также неплохо убедиться, что микроорганизм может быть получен подходящим способом, и исследовать выживаемость после хранения (Schoug et al., 2008). При внесении микроорганизма в пищу или комбикорм также важно убедиться в отсутствии негативного воздействия на продукт. Органолептические свойства и срок годности должны быть неизменными или даже улучшенными.

Мини-силос, содержащий влажное пшеничное зерно с культурой биоконсервации и глицерином

Штамм P. jensenii был выбран для мелкомасштабного эксперимента в сочетании с L. fermentum в качестве биоконсервирующей культуры в мини-силосах влажного зерна (рис. 6). Также оценивалось добавление глицерина. Обе бактерии росли быстрее и имели более высокую плотность при более высоком содержании влаги (приблизительно 30%). Это привело к образованию большего количества органических кислот и, как следствие, к снижению pH. Добавление глицерина ускорило выработку кислоты в начале эксперимента, но через шесть недель концентрация кислоты стала равна концентрации в мини-силосах без глицерина. Неожиданным результатом стало то, что производство пропионовой кислоты в мини-силосах с низким содержанием влаги (около 25%) было начато всего через четыре недели. В соответствующих мини-силосах без глицерина пропионовую кислоту не удалось обнаружить даже после шести недель инкубации. Даже если не будет обнаружено существенного влияния на рост добавленного целевого организма, Penicillium roqueforti, оправдано продолжение исследований системы с другими бактериальными комбинациями и другими концентрациями глицерина.

Перед регистрацией и применением системы биоконсервации в предполагаемой отрасли требуется последний шаг. Система должна быть протестирована в полном масштабе, а также с учетом всех ожидаемых факторов окружающей среды, предпочтительно на месте будущего использования.

4.2.1. Применение в пищевой промышленности

Молочные пропионибактерии естественным образом обитают в молочной среде, поэтому их применение в такой среде, как сыр, не должно встретить особых препятствий. Попытка предотвратить порчу сыра Карейш дрожжами с помощью смешанной культуры Propionibacterium thoenii и двух различных лактобактерий дала многообещающие результаты. Эти комбинации продлили срок хранения, и сыр мог храниться в течение 30 дней без дрожжевой порчи. Кроме того, были улучшены такие характеристики, как вкус и текстура (El-Shafei et al., 2008).

---

Примечание редактора: Сыр Карейш (Кариш или Кариеш) — один из самых популярных сортов мягкого сыра, потребляемых в Египте, особенно в сельской местности, благодаря высокому содержанию белка, низкому содержанию жира и разумной цене. Сыр изготавливался из обезжиренного буйволиного молока, обогащенного 1%, 2%, 3%, 4% и 5% кунжутной шелухи. Он содержит большинство компонентов обезжиренного молока, включая 16,70 % белка, 3,98 % сахара, 72,50 % воды и 0,1 % жира, однако имеет ограниченный срок хранения - 7-11 дней при погружении в сыворотку. Это может быть связано с санитарными проблемами при производстве.

---

В другом исследовании метаболиты из культуры P. thoenii использовались в качестве консервирующей добавки. Использование в мягком сыре Домиати дало такие же положительные результаты: увеличение срока годности и улучшение органолептических свойств (Tawfik et al., 2004). Комбинация P. jensenii и Lactobacillus paracasei подвида paracasei оказывала ингибирующее действие на дрожжевую порчу на поверхности сыра и в йогурте. Ни в одной из систем не было обнаружено увеличения количества дрожжевых клеток, а текстура йогурта была улучшена (Miescher Schwenninger & Meile, 2004).

Использование P. jensenii и P. thoenii в качестве единственных микроорганизмов в заквасочной культуре для йогурта было менее успешным из-за медленного роста пропионибактерий. Однако в сочетании с коммерческой закваской для йогурта пропионибактерии оказали некоторое положительное влияние. Не было выявлено никакого негативного влияния на физические или химические свойства продуктов, а количество бактерий из заквасочной культуры оставалось неизменным (Ekinci & Gurel, 2008).

В хлебе на закваске комбинация P. freudenreichii подвида shermanii и Lactobacillus rhamnosus оказалась эффективной в подавлении роста дрожжей и видов Bacillus (Soumalainen & Mäyrä-Mäkinen, 1999).

Добавление молочных пропионибактерий в молочно-кислую закваску для ферментации овощей продемонстрировало широкий спектр положительных эффектов, таких как ингибирование нежелательных микроорганизмов, увеличение содержания витамина В12 и фолиевой кислоты, а в некоторых случаях также улучшение органолептических свойств (Babuchowski et al., 1999).

Оценка эффекта сытости молочных напитков, ферментированных P. freudenreichii и Lactobacillus acidophilus, показала, что у испытуемых значительно увеличился эффект сытости после употребления продукта по сравнению с плацебо (Ruijschop et al., 2008).

4.2.2. Применение в кормах

Также была проведена оценка использования молочных пропионибактерий в кормах, как в качестве биоконсервирующей культуры, так и непосредственно в кормах.

Совместная культура P. acidipropionici и Lactobacillus plantarum была внесена в различные зерновые силосы для оценки аэробной стабильности. P. acidipropionici также использовали отдельно, и результаты показали, что чистая культура пропионибактерий была эффективной и улучшала аэробную стабильность пшеничного, соргового и кукурузного силоса. В сочетании с L. plantarum не было обнаружено никакого влияния на аэробную стабильность (Filya et al., 2004).

Коммерческую стартовую культуру для кукурузного силоса, содержащую P. acidipropionici и L. plantarum, оценивали при различных уровнях инокуляции. Инокуляция с 1,5 x 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ)/г, что вдвое меньше рекомендуемого уровня, привела к наиболее эффективной ферментации, так как дала самую высокую концентрацию кислоты. Другим положительным эффектом было снижение себестоимости из-за более низких уровнях инокуляции (Rowghani et al., 2008).

Еще одним применением молочных пропионибактерий является использование чистых культур в качестве пищевой добавки к корму. Прямое скармливание телятам культуры P. jensenii оказало положительное влияние на прирост живой массы телят (Adams et al., 2008).

Прямое скармливание культуры пропионибактерий (P169) дойным коровам в начале лактации не оказало влияния на надои молока, но привело к увеличению эффективности кормления, при этом подопытные коровы потребляли меньше корма при том же уровне надоев (Weiss et al., 2008). Та же пропионибактерия (P169) увеличивала надои молока и вызывала сложные гормональные и метаболические изменения, результаты которых зависели от дозы и индивидуальной коровы (Aleman et al., 2007).

5. Выводы

Противогрибковые (конкретно - фунгистатические) свойства молочных пропионибактерий могут повысить их применимость в качестве биоконсервантов. В этой работе были исследованы различные аспекты их антифунгальной активности. Слабые органические кислоты ответственны за большую часть подавления грибков. Этот эффект сильно зависит от pH. При низком pH большая часть кислоты присутствует в виде недиссоциированных молекул, следовательно, ингибирующая активность слабой кислоты возрастает с уменьшением pH. Пропионовая кислота является наиболее сильным ингибитором.

Penicillium roqueforti был грибом, наиболее чувствительным к молочной, уксусной и пропионовой кислоте (I). Противогрибковая активность пяти молочных пропионибактерий зависела от субстрата и демонстрировала видовую изменчивость: Propionibacterium thoenii была наиболее эффективной в ингибировании грибков, но Propionibacterium jensenii продуцировала наибольшее количество кислот (I).

Помимо пропионовой кислоты, молочные пропионибактерии производят и другие противогрибковые соединения. Активные соединения молочных пропионибактерий идентифицировали путем разделения на колонке твердофазной экстракции и последующего фракционирования ВЭЖХ. (II). P. jensenii продуцировал противогрибковое соединение 3-фенилмолочную кислоту. В ростовой среде (SL) также было идентифицировано несколько противогрибковых пептидов.

Добавление глицерина значительно усиливало противогрибковую активность молочных пропионибактерий в дозозависимой манере (III). После роста молочных пропионибактерий на глицерине не было обнаружено ни одного соединения, кроме пропионовой кислоты. Однако при росте на глицерине метаболизм переключился на гомопропионовую продукцию, при этом уксусная кислота в отработанной среде не обнаруживалась.

Молочные пропионибактерии и лактобактерии потенциально могут быть полезной комбинацией для биоконсервации влажного зерна. Рост P. jensenii MP28RS02 и Lactobacillus fermentum T14 во влажном зерне пшеницы (содержание влаги 32%) привел к образованию молочной, уксусной и пропионовой кислоты и снижению pH с 6,2 до 4,1 через шесть недель. Добавление 1 % глицерина усилило потенциальную консервирующую способность при еще более низком pH (4,0) и более раннем образовании кислот.

5.1. Перспективы на будущее

Растущее население мира представляет собой серьезную проблему. Чтобы удовлетворить потребность в увеличении производства продуктов питания, нам необходимо сконцентрировать наши усилия в начале производственной цепочки. Потребуется более эффективная промышленность, которая также будет стремиться к обеспечению устойчивой окружающей среды. Сельскохозяйственные исследования, направленные на максимальное использование ресурсов, сельскохозяйственных культур и методов, дающих максимальную урожайность, а также разработку эффективных способов хранения, переработки и распределения продукции, имеют важное значение для будущего. Нам также необходимо сосредоточиться на эффективных решениях для стабильного хранения продуктов питания и кормов, что приведет к более высокому коэффициенту использования и уменьшению отходов, а также к удовлетворению потребностей потребителей, которые становятся все более заинтересованными и более информированными о пищевых добавках.

Потребности в биологических консервантах могут быть удовлетворены за счет использования микроорганизмов, представляющих здоровую альтернативу химикатам за счет производства стабилизирующих хранение соединений и веществ, повышающих пищевую ценность.

Молочные пропионибактерии - организмы, у которых впереди большое будущее. Они обладают целым рядом положительных свойств, и, вероятно, еще более широкий спектр преимуществ ждет своего открытия. Экспериментальное использование молочных пропионибактерий в качестве биоконсервирующих культур дает многообещающие результаты.

Дополнительная информация

• Противогрибковая активность пропионибактерий и лактобацилл
• Антибиотикорезистентность, антагонистическая активность и биосовместимость ПКБ
• Силосование кормов и пропионибактерии

Литература

1. Adams, M.C., Luo, J., Rayward, D., King, S., Gibson, R. & Moghaddam, G.H. (2008). Selection of a novel direct-fed microbial to enhance weight gain in intensively reared calves. Animal Feed Science and Technology 145, 41-52.
2. Adams, M.R. & Moss, M.O. (2000). FoodMicrobiology. Second edition. Cambridge, UK: The Royal Society of Chemistry.
3. Aleman, M.M., Stein, D.R., Allen, D.T., Perry, E., Lehloenya, K.V., Rehberger, T.G., Mertz, K.J., Jones, D.A. & Spicer, L.J. (2007). Effects of feeding two levels of propionibacteria to dairy cows on plasma hormones and metabolites. Journal of dairy research 74(2), 146- 153.
4. Anastasiou, R., Leverrier, P., Krestas, I., Rouault, A., Kalantzopoulos, G., Boyaval, P., Tsakalidou, E. & Jan, G. (2006). Changes in protein synthesis during thermal adaption of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. International Journal of Food Microbiology 108(3), 301- 314.
5. Andersson, R., Andrén, O., Bergström, L., Kirchmann, H., Kätterer, T., Arvidsson, T., Kyllmar, K., Torstensson, G. & Stenström, J. (2009). Argumentationen för ekoodling är osaklig. Svenska Dagbladet. Stockholm
6. Babuchowski, A., Laniewska-Moroz, L. & Warminska-Radyko, I. (1999). Propionibacteria in fermented vegetables. Lait79, 113-124.
7. Barbirato, F., Chedaille, D. & Bories, A. (1997). Propionic acid fermentation from glycerol: comparison with conventional substrates. Applied Microbiology and Biotechnology 47(4), 441-446.
8. Behr, A., Eilting, J., Irawadi, K., Leschinski, J. & Lindner, F. (2008). Improved utilisation of renewable resources: New important derivates of glycerol. Green Chemistry 10(1), 13-30.
9. Bengtsson, M. & Persson, D. (2009). Växtskyddsmedelijordbruket2008. Statistiska centralbyrån. (Statistiska meddelanden)
10. Benjelloun, H., Rabe Ravelona, M. & J-M., L. (2007). Characterization of growth and metabolism of commercial strains of propionic acid bacteria by pressure measurement. Engineering in Life Science 7(2), 143-148.
11. Brede, D.A., Faye, T., Johnsborg, O., Ödegård, I., Nes, I.F. & Holo, H. (2004). Molecular and genetic characterization of propionicin F, a bacteriocin from Propionibacterium freudenreichii. Applied and Environmental Microbiology 70(12), 7303-7310.
12. Brown, K. (2004). Penicillin man - Alexander Fleming and the antibiotic revolution. Gloucestershire: Sutton Publishing Limited.
13. Buckel, W. (1999). Anaerobic energy metabolism. In: Lengeler, J.W.,etal. (Eds.) Biologyoftheprokaryotes.Stuttgart: Blackwell science Ltd.
14. Coral, J., Karp, S.G., Porto de Souza Vandenberghe, L., Parada, J.L., Pandey, A. & Soccol, C.R. (2008). Batch fermentation model in propionic acid production by Propionibacterium acidipropionici in different carbon sources. Applied Biochemistry and Biotechnology 151(2), 333-341.
15. Daniel, R., Bobik, T.A. & Gottschalk, G. (1999). Biochemistry of coenzyme B12-dependent glycerol and diol dehydratases and organization of the encoding genes. FEMS Microbiology Reviews 22, 553-566.
16. Danielsson, D. & Kjellander, J. (1993). Kliniskmikrobiologi. Fifth edition. Falköping: Almqvist and Wiksell Medicine.
17. Davidson, P.M. (2001). Chemical preservatives and natural antimicrobial compounds. In: Doyle, M.P., et al. (Eds.) Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. Washington D.C.: ASM Press. pp. 593- 627.
18. Demain, A.L. & Adrio, J.L. (2008). Contributions of microorganisms to industrial biology. Molecular Biotechnology 38(1), 41-55.
19. Denny, A., Aisbitt, B. & Lunn, J. (2008). Mycoprotein and health. British Nutrition Foundation - Nutrition bulletin 33, 298-310.
20. Einarsson, P. (1996). Från soldrift till olja- och tillbaka igen? In: Lundgren, L. (Ed.) Maten och miljön: Råvaror, resurser, recept. Stockholm: Naturskyddsföreningen.87.
21. Ekinci, F.Y. & Barefoot, S.F. (2006). Fed-batch enhancement of jenseniin G, a bacteriocin produced by Propionibacterium thoenii (jensenii) P126. Food Microbiology 23, 325-330.
22. Ekinci, F.Y. & Gurel, M. (2008). Effect of using propionic acid bacteria as an adjunct culture in yogurt production. JournalofDairyScience91, 892-899.
23. El-Shafei, K., Abd El-Gawad, M.A.M., Dabiza, N., Sharaf, O.M. & Effat, B.A. (2008). A mixed culture of Propionibacterium thoenii P-127, Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus plantarum as protective cultures in kareish cheese. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences 58(4), 433-441.
24. European Food Safety Authority (2007). Introduction of a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for assessment of selected microorganisms referred to EFSA. The EFSA Journal 587, 1-16.
25. Faye, T., Langsrud, T., Nes, I.F. & Holo, H. (2000). Biochemical and Genetic Characterization of Propionicin T1, a New Bacteriocin from Propionibacterium thoenii. Applied and Environmental Microbiology 66(10), 4230-4236.
26. Feng, X.M., Eriksson, A.R.B. & Johan, S. (2005). Growth of lactic acid bacteria and Rhizopus oligosporus during barley tempeh fermentation. International Journal of Food Microbiology 104, 249-256.
27. Filya, I., Sucu, E. & Karabulut, A. (2004). The effect of Propionibacterium acidipropionici, with or without Lactobacillus plantarum, on the fermentation and aerobic stability of wheat, sorghum and maize silages. Journal of applied microbiology 97, 818-826.
28. Freese, E., Sheu, C.W. & Galliers, E. (1973). Function of lipopHilic acids as antimicrobial food additives. Nature241(2), 321-325.
29. Gautam, N. & Sharma, N. (2009). Bacteriocin: safest approach to preserve food products. Indian Journal of Microbiology 49, 204-211.
30. Ghalfi, H., Benkerroum, N., Ongena, M., Bensaid, M. & Thonart, P. (2010). Production of three anti-listerial peptides by Lactobacillus curvatus in MRS broth. Food Research Journal 43, 33-39.
31. Glazer, A.N. & Nikaido, H. (2007). Microbial biotechnology, Fundamentals of applied microbiology. Second edition. New York: Cambridge University Press.
32. Gorret, N., Maubois, J.L., Engasser, J.M. & Ghoul, M. (2001). Study of the effects of temperature, pH and yeast extract on growth and exopolysaccharides production by Propionibacterium acidi-propionici on milk microfiltrate using a response surface methodology. Journal of Applied Microbiology 90, 788-796.
33. Gwiazdowska, D. & Trojanowska, K. (2006). Antimicrobial activity and stability of partially purified bacteriocins produced by Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichiiand ssp. shermanii. Lait 86, 141-154.
34. Hansen, E.B. (2002). Commercial bacterial starter cultures for fermented foods of the future. International Journal of Food Microbiology 78, 119- 131.
35. Hata, T., Tanaka, R. & Ohomomo, S. (2010). Isolation and characterization of plantaricin ASM1: A new bacteriocin produced by Lactobacillus plantarumA-1. International Journal of Food Microbiology 137, 94-99.
36. Himmi, E.H., Bories, A., Boussaid, A. & Hassani, L. (2000). Propionic acid fermentation of glycerol and glucose by Propionibacterium acidipropionici and Propionibacteriumfreudenreichiissp. shermani. Applied Microbiologyand Biotechnology 53, 435-440.
37. Hugenholtz, J., Hunik, J., Santos, H. & Smid, E. (2002). Nutraceutical production by propionibacteria. Lait82, 103-112.
38. Jan, G., Lan, A. & Leverrier, P. (2007). Dairy propionibacteria as probiotics. In: Saarela, M. (Ed.) Functionaldairyproducts.Woodhead Publishing 2. pp. 165-194.
39. Jarvis, G.N., Strömpl, C., Moore, E.R.B. & Thiele, J.H. (1998). Isolation and characterisation of obligately anaerobic, lipolytic bacteria from the rumen of red deer. Systematic and Applied Microbiology 21, 135- 143.
40. Jonsson, N. & Pettersson, H. (1999). Utvärdering av olika konserveringsmetoder för spannmål: baserad på analyser av hygienisk kvalitet. Uppsala: Jordbrukstekniska institutet. (JTI-rapport. Lantbruk & industri, 263)
41. Jonsson, U. (1994). Från hästkärra till skördetröska: jordbruk och jordbruksarbete under 1900-talet. Stockholm: Ordfront (Bryta, bygga, bo, svensk historia underifrån)
42. Kim, M.D., Song, M., Jo, M., Shin, S.G., Khim, J.H. & Hwang, S. (2010). Growth condition and bacterial community for maximum hydrolysis of suspended organic materials in anaerobic digestion of food waste-recycling wastewater. Applied Microbiology and Biotechnology 85(5), 1611-1618.
43. Kumari, A. & Prakash Garg, A. (2007). A bacteriocin from lactococcus lactic CCSUB94 isolated from milk and milk products. Research Journal of Microbiology 2(4), 375-380.
44. Käck-Brolund, I. (1991). Sambandet mat och miljö har ett pris. Stockholm: Konsumentgillesförbundet.
45. Leverrier, P., Dimova, D., Picheraeu, V., Auffray, Y., Boyaval, P. & Jan, G. (2003). Susceptibility and adaptive response to bile salts in Propionibacterium freudenreichii: PHysiological and proteomic analysis. Applied and Environmental Microbiology 69(7), 3809-3818.
46. Lyon, W.J., Sethi, J.K. & Glatz, B.A. (1993). Inhibition of PsychotropHic Organisms by Propionicin PLG-1, a Bacteriocin Produced by Propionibacterium thoenii. Journal of Dairy Science 76, 1506-1513.
47. Magan, N. & Aldred, D. (2007). Why do fungi produce mycotoxins? In: Jan, D., et al. (Eds.) Food Mycology, A Multifaceted Approach to Fungi and Food.Taylor and Francis group.
48. Magnusson, J. & Schnürer, J. (2001). Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformisstrain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound. Applied and Environmental Microbiology 67(1), 1-5.
49. Meile, L., Le Blay, G. & Thierry, A. (2008). Safety assessment of dairy microorganisms: Propionibacteriumand Bifidobacterium. International Journal of Food Microbiology 126, 316-320.
50. Melin, P., Sundh, I., Håkansson, S. & Schnürer, J. (2007). Biological preservation of plant derived animal feed with antifungal microorganisms: safety and formulation aspects. Biotechnology Letters 29, 1147-1154.
51. Miescher Schwenninger, S. & Meile, L. (2004). A mixed culture of Propionibacterium jensenii and Lactobacillus paracasei subsp. paracasei inhibits food spoilage yeasts. Systematic and Applied Microbiology27, 229-237.
52. Moll, G., Ubbink-kok, T., Hildeng-Hauge, H., Nissen-Meyer, J., Nes, I.F., Konings, W.N. & Driessen, A.J.M. (1996). Lactococcin G is a potassium ion-conducting, two-component bacteriocin. Journal of Bacteriology 178(3), 600-605.
53. Nout, M.J.R. (2007). The colonizing fungus as a food provider. In: Jan, D., et al. (Eds.) Food Mycology, A Multifaceted Approach to Fungi and Food. Taylor and Francis group.
54. Nout, M.J.R. & Kiers, J.L. (2005). Tempe fermentation, innovation and functionality: update into the third millennium. Journal of Applied Microbiology 98, 789-805.
55. Pitt, J.I. & Hocking, A.D. (2009). Fungiandfoodspoilage. Third edition. New York: Springer.
56. Piveteau, P. (1999). Metabolism of lactate and sugars by dairy propionibacteria: A review. Lait79, 23-41.
57. Quesada-Chanto, A., S-Afschar & A. Wagner, F. (1994). Optimization of a Propionibacterium acidipropionici continuous culture utilizing sucrose. Applied Microbiology and Biotechnology 42, 16-21.
58. Rahm, F. (2010). Kortperiodisksysselsättningsstatistik4:ekvartalet2009. Statistiska centralbyrån. (Statistiska meddelanden)
59. Rinta-Koski, M., Beasley, S., Montonen, L. & Mantere-Alhonen, S. (2001). Propionibacteria isolated from rumen used as possible probiotics together with bifidobacteria. Milchwissenschaft56(1), 11-13.
60. Rockström, J., Steffen, W., Noone, K., Persson, Å., Chapin, F.S., Lambin, E.F., Lenton, T.M., Scheffer, M., Folke, C., Schnellnhuber, H.J., Nykvist, B., de Wit, C.A., Hugher, T., van der Leeuw, S., Rodhe, H., Sörlin, S., Snyder, P.K., Costanza, R., Svedin, U., Falkenmark, M., Karlberg, L., Corell, R.W., Fabry, V.J., Hansen, J., Walker, B., Liverman, D., Richardson, K., Crutzen, P. & Foley, J.A. (2009). A safe operating space for humanity. Nature461(24), 472-475.
61. Ross, R.P., Morgan, S. & Hill, C. (2002). Preservation and fermentation: past, present and future. International Journal of Food Microbiology 79, 3-16.
62. Rossi, F., Torriani, S. & Dellaglio, F. (1999). Genus- and Species-Specific PCR-Based Detection of Dairy Propionibacteria in Environmental Samples by Using Primers Targeted to the Genes Encoding 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology 65(9), 4241-4244.
63. Rowghani, E., Zamiri, M.J., Khorvash, M. & Abdollahipanah, A. (2008). The effects of Lactobacillus plantarum and Propionibacterium acidipropionicion corn silage fermentation, ruminal degradability and nutrient digestibility in sheep. Iranian Journal of Veterinary Research 9(4), 308-315.
64. Rudquist, G. & Lundgren, L. (1996). Naturskyddsföreningen, maten och miljön. In: Lundgren, L. (Ed.) Maten och miljön: råvaror, resuser, recept Stockholm: Naturskyddsföreningen.87.
65. Ruijschop, R.M.A.J., Boelrijk, A.E.M. & te Giffel, M.C. (2008). Satiety effects of a dairy beverage fermented with propionic acid bacteria. International Dairy Journal 18, 945-950.
66. Salazar, N., Ruas-Madiedo, P., Kolida, S., Collins, M., Rastall, R., Gibson, G. & de los Reyes-Gavilán, C.G. (2009). Exopolysaccharides produced by Bifidobacterium longum IPLA E44 and Bifidobacterium anmalis subsp. lactis IPLA R1 modify the composition and metabolic activity of human faecal microbiota in pH-controlled batch cultures. International Journal of Food Microbiology 135(3), 260-267.
67. Schoug, Å., Fischer, J., Heipieper, H.J., Schnürer, J. & Håkansson, S. (2008). Impact of fermentation pH and temperature on freeze- drying survival and membrane lipid composition of Lactobacillus coryniformis Si3. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 35, 175-181.
68. SIWI (2008). 50 Percent of Food is Wasted Causing Water, Food and Hunger Crisis, Says SIWI, FAO and IWMI [online]. Stockholm Stockholm international water institute Available from: http://www.siwi.org/sa/node.asp?node=343  [Accessed  2010-03-31].
69. Soumalainen, T.H. & Mäyrä-Mäkinen, A.M. (1999). Propionic acid bacteria as protective cultures in fermented milks and breads. Lait 79, 165-174.
70. Stackebrandt, E., Cummins, C.S. & Johnsson, J.L. (2006). Bacteria: Family Propionibacteriaceae, the genus Propionibacterium. In: Dworkin, M., et al. (Eds.) The Procaryotes. Springer Science.Vol 3.
71. Stratford, M. (1999). Traditional preservatives- Organic acids. In: Robinson, R.K. (Ed.) Encyclopedia of Food Microbiology. London: Academic Press. pp. 1729-1737.
72. Ström, K., Sjögren, J., Broberg, A. & Schnürer, J. (2002). Lactobacillus plantarumMiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-PHe-L-Pro) and cyclo(L-PHe-trans-4-OH-L-Pro) and 3- pHenyllactic acid. Applied and Environmental Microbiology 68(9), 4322- 4327.
73. Swe, P.M., Cook, G.M., Tagg, J.R. & Jack, R.W. (2009). Mode of action of dysgalacticin: a large heat-labile bacteriocin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 63, 679-686.
74. Tawfik, N.F., Sharaf, O.M., Effat, B.A. & Mahanna, N.S. (2004). Preserving Domiati cheese using metabolites of Propionibacterium thoenii P-127. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences 13/54(3), 269-272.
75. Tiwari, S.K. & Srivastava, S. (2008). Characterization of a bacteriocin from Lactobacillus plantarum strain LR/14. Food Biotechnology 22, 247-261.
76. Todorov, S.D. (2009). Bacteriocins from Lactobacillus plantarum - production, genetic organization and mode of action. Brazilian Journal of Microbiology 40, 209-221.
77. Walker, M. & PHillips, C.A. (2007). The growth of Propionibacterium cyclohexanicumin fruit juices and its survival following elevated temperature treatments. Food Microbiology 24, 313-318.
78. Van der Merwe, I.R., Bauer, R., Britz, T.J. & Dicks, L.M.T. (2004). Characterization of thoeniicin 447, a bacteriocin isolated from Propionibacterium thoenii strain 447. International Journal of Food Microbiology 92, 153-160.
79. Weiss, W.P., Wyatt, D.J. & McKelvey, T.R. (2008). Effect of feeding propionibacteria on milk porduction by early lactation dairy cows. Journal of Dairy Science 91(2), 646-652.
80. Wessels, S., Axelsson, L., Bech Hansen, E., De Vuyst, L., Laulund, S., Lähteenmäki, L., Lindgren, S., Mollet, B., Salminen, S. & von Wright, A. (2004). The lactic acid bacteria, the food chain, and their regulation. Trends in Food Science and Technology 15(10), 498- 505.
81. Vollenweider, S. & Lacroix, C. (2003). 3-Hydroxypropionaldehyde: applications and perspectives of biotechnological production. Applied Microbilogy and Biotechnology
82. Vorobjeva, L.I. (1999). Propionibacteria. Kluwer Academic Publishers.
83. Ye, K., Shijo, M., Miyano, K. & Shimizu, K. (1999). Metabolic pathway of Propionibacterium growing with oxygen: Enzymes, 13C NMR analysis, and its application for vitamin B12 production with periodic fermentation. Biotechnology Progress 15, 201-207.
84. Younts-Dahl, S.M., Galyean, M.L., Loneragan, G.H., Elam, N.A. & Brashears, M.M. (2004). Dietary supplementation with Lactobacillus- and Propionibacterium-based direct-fed microbials and prevalence of Escherichia coli O157 in beef feedlot cattle and on hides at harvest. Journal of Food Protection 67(5), 889-893.