Адаптация P. freudenreichii к тепловым и окислительным стрессам

Адаптация пропионовокислых бактерий к распылительной сушке

Использование преимуществ бактериальной адаптации для оптимизации промышленного производства сухих Пропионибактерий P. freudenreichii

СОДЕРЖАНИЕ:

• Предисловие
• Введение
• Материалы и методы
• Штаммы и предварительная культура
• Оптимизация устойчивости P. freudenreichii к тепловым и окислительным процессам
• Условия роста и адаптации при проектировании эксперимента
• Таблица 1. Схема эксперимента для трех независимых переменных и их уровень
• Стрессовые вызовы
• Идентификация и количественное определение совместимых растворенных веществ, накопленных P. freudenreichii CIRM-BIA 129
• Извлечение накопленных совместимых растворенных веществ
• ЯМР (ядерный магнитный резонанс) анализы
• Распылительная сушка и хранение порошка
• Анализ методом случайной амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD)
• Восстановление высушенных P. freudenreichii в сыроподобной молочной среде
• Культура с высушенными P. freudenreichii в сыроподобной молочной среде
• Количественная оценка органических кислот
• Статистический анализ
• Результаты
• Оптимизация стрессоустойчивости P. freudenreichii с помощью экспериментального дизайна
• Рисунок 1. Адаптация и композиции питательных сред модулируют стрессоустойчивость P. freudenreichii
• Таблица 2. Оценка коэффициентов различных переменных и их взаимодействия по жизнеспособности P. freudenreichii при тепловом воздействии. NS: не имеет значения
• Таблица 3. Оценка коэффициентов различных переменных и их взаимодействия по жизнеспособности P. freudenreichii при окислительном стимулировании. NA: несущественно
• Жизнеспособность P. freudenreichii после распылительной сушки и хранения
• Рисунок 2. Добавление глюкозы в питательную среду и термоадаптация улучшают жизнеспособность P. freudenreichii при распылительной сушке и хранении
• Рисунок 3. RAPD-анализ культур P. freudenreichii до и после адаптации и сушки P. freudenreichii
• Накопление совместимых растворенных веществ зависит от среды роста P. freudenreichii и условий адаптации
• Рисунок 4. P. freudenreichii совместимые растворенные вещества модулируются адаптациями
• Рисунок 5. Порошки, содержащие P. freudenreichii, использовали для ферментации сыроподобной среды
• 3.4.2. Судьба сахаридов и органических кислот
• Дискуссия
• Добавление глюкозы и термическая адаптация вызывают перекрестную защиту P. freudenreichii
• Сочетание адсорбции глюкозы и термоадаптации повышает жизнеспособность P. freudenreichii при распылительной сушке и хранении
• Комбинация добавления глюкозы и термоадаптации приводит к накоплению совместимых растворов и повышает устойчивость P. freudenreichii к распылительной сушке
• Сочетание добавления глюкозы и тепловой адаптации приводит к получению эффективного пропионового стартера
• Выводы
• Литература

Предисловие

Propionibacterium freudenreichii - это полезная «молочная» пропионовокислая бактерия (ПКБ), которая используется как пробиотик и как сырная закваска. Крупномасштабное производство P. freudenreichii необходимо для удовлетворения растущего спроса потребителей. Производство, сушка и хранение должны быть оптимизированы, чтобы гарантировать высокую жизнеспособность P.freudenreichii в порошках. По сравнению с сушкой вымораживанием (лиофильная, сублимационная) распылительная сушка представляет собой наиболее производительный и эффективный, но в то же время самый напряженный процесс, накладывающий серьезные окислительные и термические ограничения.

---

 Прим. ред. - Краткое описание распылительной сушки

В распылительной сушилке жидкий исходный продукт распыляется на капли и контактирует с горячим газом, который вызывает испарение влаги из капель, оставляя высушенные частицы. Частицы затем отделяют от осушающего газа в циклоне или рукавном фильтре. Распылительная сушка является наиболее широко используемым промышленным процессом для формирования сухих частиц. Она очень хорошо подходит для непрерывного производства сухих веществ таких как порошок, гранулы или агломераты из жидких кормов. Исходные продукты включают растворы, эмульсии и перекачиваемые суспензии.

---

Целью нашего исследования было предоставить инструменты для оптимизации промышленного производства P. freudenreichii в сухой форме. Бактериальная адаптация является хорошо известным защитным механизмом и может использоваться для улучшения устойчивости бактерий к технологическим стрессам. Тем не менее, выбор типа бактериальной адаптации должен учитывать производственные ограничения. В этом исследовании мы объединили (I) модуляцию состава ростовой среды, (II) тепловую адаптацию и (III) осмоадаптацию, чтобы повысить толерантность P. freudenreichii. к технологическим нагрузкам, включая термические и окислительные ограничения, используя экспериментальную методику. Мы также исследовали оптимальные условия роста и адаптации путем мониторинга внутриклеточного накопления совместимых растворенных веществ. Добавление глюкозы в сочетании с тепловой адаптацией вызывает накопление трегалозы и глицина бетаина, что дополнительно обеспечивает высокую устойчивость к распылительной сушке и хранению. Эта работа открывает новые перспективы для высококачественного и быстрого производства живых пропионибактерий в промышленном масштабе.

1. Введение

Диета играет ключевую роль в поддержании физиологии и здоровья, оказывая заметное влияние на формирование структуры и деятельности микробиоты кишечника. Дисбиоз, т.е. нарушение гомеостаза микробиоты кишечника, связан с воспалительными, аллергическими и атопическими расстройствами [1,2,3]. За последние десятилетия диета европейских стран изменилась из-за изменений в образе жизни, и это совпало с увеличением частоты воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) и синдрома раздраженного кишечника (СРК). Это является проблемой общественного здравоохранения [4,5], и для улучшения здоровья пять европейских стран в своих диетических рекомендация рекомендуют употреблять йогурты или пробиотики [6]. Пробиотики определяются как «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью хозяина» [7]. Различные виды Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus и Saccharomyces были исследованы на их пробиотические свойства [8]. Пробиотики могут оказывать положительное влияние на воспалительные заболевания кишечника. В качестве примера можно привести смесь пробиотических бактерий с индуцированной или длительной ремиссией у пациентов, страдающих язвенным колитом [9]. Воздействие ключевых иммуномодулирующих пробиотических или симбиотических бактерий может предотвратить атопию и аллергию [10,11]. Ранняя колонизация кишечника такими бактериями снижает восприимчивость к некротизирующему энтероколиту у недоношенных детей с дисбиотической микробиотой [12].

Пропионибактерии и бифидобактерии были идентифицированы как защитные и ранние колонизирующие пробиотические симбионты [12,13]. Кроме того, было показано, что грудное вскармливание или кормление ребенка смесью, содержащей такие пробиотические бактерии, предотвращает заболевания, связанные с дисбактериозом [14,15]. Микробиота кишечника может быть модулирована потреблением отдельных штаммов P. freudenreichii [16,17,18,19]. Кроме того, некоторые штаммы этого вида могут модулировать иммунный ответ слизистой оболочки, индуцируя противовоспалительные цитокины в эпителиальных и иммунных клетках человека [20,21]. Пропионибактерии общепризнанны безопасными (GRAS) и обладают квалифицированной презумпцией безопасности (QPS) [22]. Эта бактерия используется при производстве швейцарских сыров и для производства пищевых и антимикробных молекул [23]. Во время брожения Propionibacterium. freudenreichii производит полезные короткоцепочечные жирные кислоты пропионат и ацетат в качестве конечных продуктов. ПКБ также высвобождают витамины B9 (фолат) и B12 (кобаламин) вместе с бифидогенными соединениями: DHNA (1,4-дигидрокси-2-нафтоевая кислота) и ACNQ (2-амино-3-карбокси-1,4-нафтохинон). Считается, что DHNA и ACNQ ответственны за полезную модуляцию кишечной микробиоты [23].

Бактерии P. freudenreichii следует употреблять живыми, для достижения оптимального положительного эффекта. Закваски и пробиотики обычно производятся в форме порошка. Порошки позволяют продлить срок годности и облегчают хранение бактерий. Распылительная сушка является наиболее эффективным процессом сушки с меньшим энергопотреблением и более высокой производительностью, чем сушка вымораживанием [24]. Кроме того, это непрерывный и быстрый процесс, так как испарение воды ускоряется за счет увеличения поверхности контакта воздуха / продукта путем разбрызгивания мелких капель. Однако бактерии все еще страдают от тепловых и окислительных стрессов во время процесса распылительной сушки, который нуждается в оптимизации [24].

Способность бактерий к адаптации обычно используется для того, чтобы вызывать гомо- или гетерозащиту, называемую перекрестной защитой. Хорошо известно, что осмоадаптация повышает устойчивость P. freudenreichii к стрессам, связанным с жарой, кислотой и желчью [25, 26, 27]. Соответственно, рост в гиперосмотических условиях увеличивает жизнеспособность Lactobacillus paracasei и P. freudenreichii во время сушки распылением [26,28]. Во время осмоадаптации бактерии накапливают совместимые растворенные вещества, которые поддерживают резкое повышение давления и обеспечивают рост и деление клеток. Совместимые растворенные вещества могут быть импортированы из питательной среды или синтезированы de novo [29]. Например, P. freudenreichii способен накапливать глицин-бетаин, глутамат и трегалозу для осмоадаптивных целей. Лактоза, присутствующая в гиперконцентрированной сладкой сыворотке, приводит к накоплению трегалозы и повышению жизнеспособности P. freudenreichii во время теплового воздействия и во время сушки распылением [26]. Добавление соли в среду значительно снижает скорость роста [30], что создает проблему для отраслей промышленности при производстве стартера и пробиотиков. Добавление лактозы в питательную среду также имеет решающее значение, так как некоторые потребители отказываются от ее использования из-за непереносимости лактозы.

В этом исследовании осмотическая адаптация индуцировалась в конце стационарной фазы, чтобы избежать снижения роста. Была выбрана глюкоза, пищевой углевод, гораздо более доступный, чем, например, трегалоза. Сообщалось, что тепловая адаптация повышает жизнеспособность Lactobacillus paracasei во время распылительной сушки [28] и жизнеспособность Lactobacillus plantarum во время хранения [31]. Таким образом, в этой работе мы культивировали P. freudenreichii в питательной среде с различными концентрациями добавленной глюкозы, вызвали нагрев и / или осмотическую адаптацию (и) после начала стационарной фазы и определяли индуцированную защиту от распылительной сушки и хранения. Мы оптимизировали условия роста и адаптации P. freudenreichii с помощью экспериментальной конструкции, чтобы улучшить жизнеспособность клеток при распылительной сушке. Мы количественно оценили совместимые растворы, чтобы лучше понять перекрестные защиты P. freudenreichii. Далее мы проверили пусковые возможности P. freudenreichii после адаптации и сушки. Эта работа открывает новые возможности для оптимизации промышленного производства сухих P. freudenreichii.

2. Материалы и методы

2.1. Штаммы и предварительная культура

Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA 129 (эквивалент ITG P20) был предоставлен CNIEL. Lactobacillus delbrueckii CIRM-BIA 209 и Streptococcus thermophilus CIRM-BIA 67 были предоставлены Центром биологических ресурсов CIRM-BIA (Международный центр микробиологических исследований - Bactéries d’Intérêt Alimentaire, CIRM-BIA, INRA, Ренн, Франция). P. freudenreichii, L. delbrueckii и S. thermophilus хранили, поддерживали и регулярно культивировали в среде лактата дрожжевого экстракта (YEL) при 30°C, в среде Man Rogosa и Sharp (MRS) при 37°C и в питательной среде BHI при 43°С соответственно без перемешивания [32,33].

2.2. Оптимизация устойчивости P. freudenreichii к тепловым и окислительным процессам

2.2.1. Условия роста и адаптации при проектировании эксперимента

Программное обеспечение JMP от SAS использовалось для изучения влияния добавления глюкозы, тепловой адаптации и осмоадаптации на устойчивость P. freudenreichii к тепловому и окислительному стрессу. Точнее, глюкозу добавляли в среду YEL с концентрациями в диапазоне от 0 до 30 г•л^-1. P. freudenreichii выращивали при 30°C в течение от 32 до 46 ч при осторожном перемешивании (40 об / мин) для снижения скорости роста [34,35]. В начале стационарной фазы NaCl добавляли в культуры в концентрации от 0 до 0,9М в течение 2 часов. Затем культуры нагревали при 42°С в течение 0, 1 или 2 часов. Адаптация была определена экспериментальным проектом (Таблица 1).

Таблица 1. Схема эксперимента для трех независимых переменных и их уровень.

	Дизайн Матрица			Рабочая Матрица
Образцы	Концентрация NaCl	Концентрация глюкозы	Время тепловой адаптации	Концентрация NaCl (г•л-1)	Концентрация глюкозы (г•л-1)	Время тепловой адаптации (ч)
1	−1	−1	−1	0	0	0
2	−1	−1	0	0	0	1
3	−1	−1	1	0	0	2
4	−1	0	−1	0	15	0
5	−1	0	0	0	15	1
6	−1	0	1	0	15	2
7	−1	1	−1	0	30	0
8	−1	1	0	0	30	1
9	−1	1	1	0	30	2
10	0	−1	−1	25	0	0
11	0	−1	0	25	0	1
12	0	−1	1	25	0	2
13	0	0	−1	25	15	0
14	0	0	0	25	15	1
15	0	0	0	25	15	1
16	0	0	0	25	15	1
17	0	0	1	25	15	2
18	0	1	−1	25	30	0
19	0	1	0	25	30	1
20	0	1	1	25	30	2
21	1	−1	−1	50	0	0
22	1	−1	0	50	0	1
23	1	−1	1	50	0	2
24	1	0	−1	50	15	0
25	1	0	0	50	15	1
26	1	0	1	50	15	2
27	1	1	−1	50	30	0
28	1	1	0	50	30	1
29	1	1	1	50	30	2

2.2.2. Стрессовые вызовы

Тепло и окислительные проблемы были применены к культурам после адаптации, как описано ранее [25]. Тепловую стимуляцию проводили, помещая 2 мл (в 15-мл пробирку Falcon) культур P. freudenreichii в водяную баню при 60°C на 10 минут. Окислительное стимулирование осуществляли путем добавления 1,25 mМ перекиси водорода (Labogros, France) к 2 мл культуры в течение 1 часа при 30°C. Подсчет КОЕ проводился на необработанных бактериях и после испытаний, чтобы рассчитать процент выживаемости. Испытанные образцы представлены в таблице 1, и испытания были выполнены в двух экземплярах.

Статистический анализ был проведен для описания влияния концентрации глюкозы, тепловой адаптации и осмоадаптации на жизнеспособность P. freudenreichii во время тепловых и окислительных испытаний. Программный JUMP использовался для подгонки модели второго порядка к независимой переменной. Только переменные со значимостью выше 95% (р <0,05) были включены в окончательные модели. Поверхностный отклик был нарисован, чтобы проиллюстрировать основное и интерактивное влияние независимых переменных на выживаемость в условиях жары и окисления. Эти проблемы имитировали напряженный процесс распылительной сушки.

2.3. Идентификация и количественное определение совместимых растворенных веществ, накопленных P. freudenreichii CIRM-BIA 129

2.3.1. Извлечение накопленных совместимых растворенных веществ

P. freudenreichii CIRM-BIA 129 культивировали в среде YEL, содержащей 15 г•л^-1 глюкозы, добавленной с тепловой адаптацией в течение 1 часа при 42°C (YEL + 15 г глюкозы + 42°C, 1 час) и YEL с 30 г•л^-1 глюкозы, добавленной с тепловой адаптацией 2 ч при 42°C (YEL + 30 г глюкозы + 42°C, 2 ч). Затем клетки собирали центрифугированием (8000 g 10 мин) и дважды промывали раствором NaCl с той же осмоляльностью, что и культуральная среда. Затем клетки ресуспендировали в 2 мл дистиллированной воды, затем добавляли 8 мл абсолютного этанола. Суспензию гомогенизировали и центрифугировали (8000 g, 10 мин) для удаления фрагментов клеток. Надосадочный экстракт выпаривали в течение 7 ч на роторном испарителе. Высушенные экстракты затем растворяли в оксиде дейтерия (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), как описано ранее [25].

2.3.2. ЯМР (ядерный магнитный резонанс) анализы

Все ¹Н (водород) и ¹³С (углерод) спектры ЯМР регистрировали при 298 К на спектрометре Bruker Advance 500, оснащенном 5-миллиметровым трехрезонансным криозондом TCI (PRISM core facility, Ренн, Франция). Спектры 1H были получены с шириной спектра 6 кГц, точками данных 32 К и общим временем повторения 6,73с. Спектры ¹³C были получены с использованием протонной силовой развязывающей последовательности с углом поворота 30°, шириной спектра 30 кГц, точками данных 64 и общим временем повторения 3,08с. Данные обрабатывались с помощью программного обеспечения Topspin (Bruker Biospin, Wissembourg, France). Перед применением преобразования Фурье свободные индукционные распады спектров ¹Н обрабатывали с экспоненциальным уширением 0,3 Гц.

Образцы солюбилизировали в натриевой соли D2O. 3-(триметилсилил) пропионовой-2,2,3,3-d4 кислоты (TSP-d4) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), служившей внутренним эталоном для химических сдвигов ¹H и ¹³C.

Относительную концентрацию трегалозы, глутамата, пролина и глицина бетаина в образцах определяли путем интегрирования их сигналов ¹H. Результаты выражены в виде относительных единиц ЯМР (RU), сообщаемых к одной единице оптической плотности (эквивалентно 1 мл культуры при ОП 1).

2.4. Распылительная сушка и хранение порошка

P. freudenreichii культивировали, как ранее, либо в среде YEL, либо в среде YEL, содержащей глюкозу, с тепловой адаптацией в течение 1 или 2 ч при 42°C. (YEL + 15 г глюкозы + 42°C, 1 час и YEL + 30 г глюкозы + 42°C, 2 часа). 20% (w/w) мальтодекстрина (DE = 6-8) добавляли к культурам в начале стационарной фазы или после термоадаптации. Эти различные смеси (≈2 л) встряхивали в течение 10 мин перед подачей в сушилку перистальтическим насосом (520S, Watson-Marlow, France).

Для распыления использовалось двухжидкостное сопло диаметром 0,8 мм. Температура воздуха на входе была установлена ​​на уровне 160°C. Температуру воздуха на выходе контролировали при 60 ± 2°С, регулируя скорость подачи. Жизнеспособность бактерий оценивали путем нумерации на чашках с агаром YEL до и после распылительной сушки, как описано ранее [36]. Порошки собирали и запечатывали в стерилизованные полистирольные флаконы (Gosselin, France), хранили при контролируемой температуре 4, 20 или 37°C и держали вдали от света в течение 145 дней. Один грамм порошка солюбилизировали в 9 г стерильной воды и жизнеспособность бактерий проверяли путем нумерации на чашках с агаром YEL, инкубированных при 30°C.

2.5. Анализ методом случайной амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD)

RAPD проводили с использованием двух праймеров RAPD (праймер 1: AAGAGCCCGT и праймер 2: AACGCGCAAC), как описано ранее [37,38]. Смесь для ПЦР (2 µL или 2 мкл) состояла из Taq-буфера с MgCl2 (Q-Biogene / EPTQA100), dNTP (2 mМ / µL, Q-Biogene / NTPMX050), случайного праймера 100 mМ / µL, RAPD Analysis Kit GE Healthcare), Taq ДНК-полимеразы (2,5 ед / µL), 1 мкл экстрагированной ДНК (25 ngL / µL) и стерильной воды QSP 25 µL. Амплификацию ДНК проводили в термоцикле C10000TM (Bio-Rad), используя следующие условия: 94°С в течение 2 мин; 40 циклов: 94°С в течение 1 мин, 42°С в течение 20 с и 72°С в течение 2 мин; и последний этап удлинения при 72°С в течение 10 мин. Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза (100 В, 1 ч) на 1% агарозном геле (w/v) в 0,5 × TBE буфере.

2.6. Восстановление высушенных P. freudenreichii в сыроподобной молочной среде

2.6.1. Культура с высушенными P. freudenreichii в сыроподобной молочной среде

Ультрафильтрат коровьего молока получали ультрафильтрацией молока (отсечка 8 кДа), как описано ранее [37]. Два основных молочнокислых стартера, Lactobacillus delbrueckii CIRM-BIA 209 и Streptococcus thermophilus CIRM-BIA 67, были совместно культивированы при 43 °C в течение 12 ч в ультрафильтрате молока, содержащем 5 г•л^-1 пептона казеина. Культуры центрифугировали с целью удаления молочнокислых бактерий. Супернатанты собирали, рН корректировали до 7, используя раствор NaOH 5 М, затем супернатанты подвергали стерилизации на фильтре (Top filter PES, 0,45 мкм, Nalgene Company, NY, USA). Затем 1,5 г высушенного ранее порошка P. freudenreichii инокулировали в 400 мл этого предварительно обработанного ультрафильтрата молока (названного позже сыроподобной средой). Контроль осуществляли с использованием свежей жидкой культуры P. freudenreichii, реализованной в сыроподобной среде с добавлением 1,5 г мальтодекстрина. Культуры инкубировали при 24°С в течение 14 дней, чтобы имитировать условия роста в теплой комнате во время приготовления сыра Эмменталь [38]. Кривые роста определяли по нумерации КОЕ на чашках с агаром YEL.

2.6.2. Количественная оценка органических кислот

Супернатанты различных культур собирали центрифугированием во время экспоненциальной фазы, начала стационарной фазы и после 14 дней роста. Культуральные супернатанты разбавляли наполовину 0,02 М H₂SO₄ и центрифугировали при 8000 g в течение 30 минут при 4°C для удаления осадка белка перед стерилизацией на фильтре и анализом. Органические кислоты и сахар разделяли с использованием ионообменной колонки Minex A-6 (Dionex, Саннивейл, Калифорния, США) при 55°C с 0,01 М H₂SO₄ в качестве элюента при скорости потока 1 мл мин ^-1. Были использованы как УФ (210 нм), так и рефрактометрические детекторы. Соответствующие стандарты лактозы, ацетата, пропионата и лактата были использованы, как описано ранее [39].

2.7. Статистический анализ

Данные были из трех образцов. Все результаты представлены в виде средних значений со стандартным отклонением. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне р <0,05. Расчеты проводились с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (Prism 7 для Windows, Редмонд, Вашингтон, США).

3. Результаты

3.1. Оптимизация стрессоустойчивости P. freudenreichii с помощью экспериментального дизайна

Мы проанализировали показатели выживаемости P. freudenreichii при тепловом и окислительном воздействии, чтобы оценить влияние индивидуальных и интерактивных коэффициентов на толерантность P. freudenreichii к тепловому воздействию (Таблица 2) и окислительному воздействию (Таблица 3). Добавление соли после начала стационарной фазы оказало негативное влияние на выживаемость P. freudenreichii во время тепловых и окислительных испытаний (рис. 1) (оценочный коэффициент: –7% и –10%, в таблице 2 и таблице 3, соответственно), тогда как добавление глюкозы и тепловая адаптация оказали положительное влияние на выживаемость P. freudenreichii во время этих испытаний (рис. 1). Действительно, добавление глюкозы увеличивало жизнеспособность P. freudenreichii во время теплового воздействия (оценочный коэффициент: + 24%) больше, чем тепловая адаптация (оценочный коэффициент: + 9%). Во время окислительного воздействия тепловая адаптация оказала более сильное воздействие, чем добавление глюкозы (оценочный коэффициент: + 19% и + 10% соответственно). Наилучшая выживаемость во время обоих испытаний была достигнута, когда P. freudenreichii выращивали в присутствии 30 г•л^-1 глюкозы и адаптировали к теплу (42°С, 2 часа) в начале стационарной фазы (рис. 1).

Рисунок 1. Адаптация и композиции питательных сред модулируют стрессоустойчивость P. freudenreichii

Влияние добавления глюкозы, тепловой адаптации и осмоадаптации было проверено на стрессоустойчивости P. freudenreichii CIRM-BIA 129 после экспериментального проектирования (дизайна). P. freudenreichii культивировали в среде YEL с 0,15 или 30 г•л^-1 глюкозы до начала стационарной фазы. Культуры затем подвергали осмоадаптации (0,25 или 50 г•л^-1 NaCl) в течение 2 часов, а затем адаптировали нагреванием при 42°С в течение 0,1 или 2 часов. Культуры подвергали тепловому воздействию (A, C, E, 60°C в течение 10 минут) или окислительному воздействию (B, D, F, 1,15 mМ H₂O₂ в течение 1 часа), как описано в материалах и методах. Жизнеспособность P. freudenreichii после испытаний определяли путем подсчета КОЕ до и после испытаний. Результаты выражены в процентах выживаемости и представлены рядом с кривыми iso-ответа.

Таблица 2. Оценка коэффициентов различных переменных и их взаимодействия по жизнеспособности P. freudenreichii при тепловом воздействии. NS: не имеет значения.

	Оценка	Prob. >|t|
Constant	23	<0.0001
Концентрация NaCl (0.50)	−7	0.0077
Концентрация глюкозы (0,30)	24	<0.0001
Время тепловой адаптации (0,2)	9	0.0011
Концентрация NaCl × концентрация глюкозы	−13	0.0003
Концентрация NaCl × время тепловой адаптации	NS	0.0638
Концентрация глюкозы × время тепловой адаптации	7	0.0429

Таблица 3. Оценка коэффициентов различных переменных и их взаимодействия по жизнеспособности P. freudenreichii при окислительном стимулировании. NA: несущественно.

	Оценка	Prob. >|t|
Constant	29	<0.0001
Концентрация NaCl (0.50)	−10	0.0067
Концентрация глюкозы (0,30)	10	0.0068
Время тепловой адаптации (0,2)	19	<0.0001
Концентрация NaCl × концентрация глюкозы	NA	0.2329
Концентрация NaCl × время тепловой адаптации	−14	0.0021
Концентрация глюкозы × время тепловой адаптации	NA

3.2. Жизнеспособность P. freudenreichii после распылительной сушки и хранения

Контрольные культуры (YEL) в наилучших условиях, определенных экспериментальной схемой (YEL + 30 г глюкозы +42°C, 2 ч) и в промежуточных условиях толерантности (YEL + 15 г глюкозы +42°C, 1 ч), подвергали распылительной сушке. P. freudenreichii, выращенный в YEL с 15 г глюкозы и адаптированный к нагреванию в течение 1 ч при 42°C, выживал лучше при сушке распылением, чем неадаптированные клетки (74% и 30% выживания соответственно) (рис. 2А). Более высокая концентрация глюкозы в культуральной среде с более длительной термической адаптацией дополнительно увеличивала выживаемость во время распылительной сушки (96,4%). Добавление глюкозы и / или термическая адаптация оказали положительное влияние на жизнеспособность P. freudenreichii во время распылительной сушки. Во время хранения при 4 и 20°C P. freudenreichii, выращенный с глюкозой, а затем адаптированный к нагреванию, показал повышенную жизнеспособность (рис. 2B, C). Самая высокая концентрация глюкозы и самая длительная тепловая адаптация, самая низкая гибель P. freudenreichii произошла при хранении при 4 и 20°C. Во время хранения при 37°С эти адаптации не оказали влияния на гибель клеток (рисунок 2D). В качестве контроля качества колонии P. freudenreichii выделяли до и после адаптации и распылительной сушки перед анализом RAPD (). На рис. 3 показано, что профили RAPD были идентичны в трех условиях: исходная культура, высушенная распылением после адаптации (YEL + 15 г глюкозы + 42°C, 1 ч) и высушенная распылением после адаптации (YEL + 30 г глюкозы + 42°C, 2 ч).

Рисунок 2. Добавление глюкозы в питательную среду и термоадаптация улучшают жизнеспособность P. freudenreichii при распылительной сушке и хранении.

P. freudenreichii CIRM-BIA 129 культивировали в YEL (YEL + 0 г глюкоза + 42°C, 0 ч), в среде YEL, содержащей 15 г•л^-1 глюкозы, и адаптировали к нагреванию при 42°C в течение 1 ч (YEL + 15 г глюкозы + 42°C, 1 ч) или среде YEL, содержащей 30 г•л^-1 глюкозы и адаптировали к нагреванию при 42°C в течение 2 ч (YEL + 15 г глюкозы + 42°C, 2 ч) до начало стационарной фазы. Мальтодекстрин добавляли в культуры с конечной концентрацией 20% (w/w) для увеличения сухого экстракта. Затем культуры высушивали распылением (A) и выживаемость P. freudenreichii определяли количественно по КОЕ, как описано в материалах и методах. Результаты выражены в процентах выживаемости. Различные полученные порошки хранили при 4 °C (B), 20 °C (C) и 37 °C (D) в течение 145 дней. Жизнеспособность P. freudenreichii определяли путем подсчета КОЕ во время хранения. Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение для трехкратных экспериментов. Достоверные различия отмечены разными буквами над столбцами (Р > 0,05).

Рисунок 3. RAPD-анализ культур P. freudenreichii до и после адаптации и сушки P. freudenreichii.

Колонии выделяли из исходной культуры и из порошков после адаптации и распылительной сушки. RAPD проводили с использованием двух праймеров RAPD (слева: праймер 1: AAGAGCCCGT и справа: праймер 2: AACGCGCAAC), как описано в разделе «Материалы и методы». Амплифицированные продукты разделяли электрофорезом (100 В, 1 ч) на 1% агарозных гелях. Первая и последняя строки соответствуют 1 kb цепи ДНК.

3.3. Накопление совместимых растворенных веществ зависит от среды роста P. freudenreichii и условий адаптации

Мы использовали ЯМР в качестве стандарта, используемого в микробной физиологии для накопления совместимых растворенных веществ в результате осмоадаптации [26,40,41,42]. Накопленные совместимые растворенные вещества анализировали методом ЯМР, как описано [43,44,45,46]. Как показано на рисунке 4A-D), спектры, соответствующие глицину бетаину (желтый), трегалозе (фиолетовый), глутамату (зеленый) и пролину (красный), позволили нам идентифицировать и количественно определить эти соединения в цитоплазматическом водно-спиртовом экстракте (синий). P. freudenreichii CIRM-BIA 129 был способен накапливать глицин бетаин, трегалозу, глутамат и пролин во время роста и адаптации (рис. 4E). В контрольной среде (YEL) P. freudenreichii накапливал большие количества глутамата (66,7%) и в меньшей степени пролина (24,2%) и небольшие количества глицина бетаина (9,1%). Эта среда является изотонической с осмоляльностью 0,308 (osmol - осмоля). Добавление 15 г глюкозы в эту культуральную среду (0,433 осмоля), а также термоадаптация в течение 1 ч резко повлияли на накопление совместимых растворенных веществ. Во-первых, они уменьшили общее количество накопленного совместимого раствора. Во-вторых, они изменили пропорции накопленных совместимых растворов. По сравнению с контрольной средой, глицин бетаин и трегалоза накапливались в большем количестве (49,4% и 306% соответственно), с меньшим количеством пролина (13,0%) и глутамата (7,0%). Более высокая концентрация глюкозы (30 г•л^-1: 0,455 осмоля) в среде YEL и более длительная тепловая адаптация (2 часа) дополнительно увеличивали количество совместимых растворенных веществ, накопленных P. freudenreichii, но с профилем, аналогичным профилю P. freudenreichii, выращенного с 15 г глюкозы и термоадаптированного в течение 1 ч. Действительно, в этом случае P. freudenreichiia накапливал трегалозу (40%) и глицин-бетаин (42,5%) в больших количествах с меньшими количествами пролина (10%) и глутамата (10%).

Рисунок 4. P. freudenreichii совместимые растворенные вещества модулируются адаптациями

P. freudenreichii CIRM-BIA 129 культивировали в YEL (YEL + 0 г глюкоза + 42°C, 0 ч), в среде YEL, содержащей 15 г•л^-1 глюкозы, и адаптировали к нагреванию при 42°C в течение 1 часа (YEL + 15 г глюкозы + 42°C, 1 час) или среде YEL, содержащей 30 г•л^-1 глюкозы и адаптировали к нагреванию при 42°C в течение 2 часов (YEL + 30 г глюкозы + 42°C, 2 часа) до начало стационарной фазы. Цитоплазматический экстракт готовили, как описано в материалах и методах. Сигналы, используемые для идентификации (A, B, C-ЯМР) и для количественного определения (C, D, H-ЯМР) растворенных веществ, показаны цветными звездочками. Показанные спектры соответствуют глицину бетаину (желтый), трегалозе (фиолетовый), глутамату (зеленый), пролину (красный) и цитоплазматическому водно-спиртовому экстракту (синий). Показанные примеры соответствуют контрольным условиям роста (культура YEL, A, C) и адаптированным условиям (YEL + 30 г глюкозы + 42°C, 2 ч, B, D). Спектры, соответствующие всем условиям, показаны на дополнительном рисунке. Накопление совместимых растворов выражается в относительных единицах (E).

Рисунок 5. Порошки, содержащие P. freudenreichii, использовали для ферментации сыроподобной среды.

Полученные ранее порошки инокулировали в сыроподобной среде. Рост P. freudenreichii контролировали подсчетом КОЕ в чашках с агаром YEL (A) и подкислением (B). Потребление лактата и лактозы, а также выработку пропионата и ацетата количественно определяли с помощью ВЭЖХ (С-Е), как описано в материалах и методах. Свежая предкультура: инокуляция P. freudenreichii, выращенная в среде YEL. (YEL + 15 г глюкозы + 42°C, 1 час): инокуляция порошками, содержащими P. freudenreichii, культивируемыми в YEL, с 15 г•л^-1 глюкозы и адаптированной к нагреванию при 42°C в течение 1 часа перед распылительной сушкой. (YEL + 30 г глюкозы + 42°C, 1 час): инокуляция порошками, содержащими P. freudenreichii, культивируемыми в YEL, с 30 г•л^-1 глюкозы и адаптированной к нагреванию при 42°C в течение 1 часа перед распылительной сушкой.

3.4.2. Судьба сахаридов и органических кислот

Использование лактозы и лактата, а также производство пропионата и ацетата, основных конечных продуктов пропионовой ферментации, контролировали, как описано в материалах и методах. Использование лактозы было примерно одинаковым между высушенной и свежей предкультурой P. freudenreichii (рис. 5C – E). Высушенные P. freudenreichii потребляют лактат и продуцируют пропионат и ацетат менее быстро, чем свежая предкультура. Конечное потребление лактата и лактозы и конечное производство ацетата и пропионата незначительно отличались между свежей предкультурой и высушенными P. freudenreichii. Конечная концентрация пропионата была в два раза выше конечной концентрации ацетата. Интересно, что в случае сухих пропионибактерий лактоза потреблялась сразу после начала роста, в то время как лактат оставался неизменным до потребления после 100 ч роста. В случае свежих предкультур, как лактоза, так и лактат использовались во всей культуре.

4. Дискуссия

4.1. Добавление глюкозы и термическая адаптация вызывают перекрестную защиту P. freudenreichii

Добавление глюкозы и тепловая адаптация улучшили устойчивость P. freudenreichii к окислительным и тепловым проблемам (рис. 1). Уже было описано, что тепловая адаптация увеличивает термотолерантность P. freudenreichii, Enterococcus faecalis и Escherichia coli [44,47,48]. Добавление глюкозы во время роста также улучшало жизнеспособность P. freudenreichii во время жары и окислительного стресса. Ранее было показано, что рост гиперконцентрированной сладкой сыворотки, среды, богатой сахаридной лактозой, индуцирует ​​перекрестную защиту параллельно с накоплением трегалозы [26,36]. Мы показали здесь, что добавление моносахаридной глюкозы в сочетании с термоадаптацией также вызывает перекрестную защиту и накопление трегалозы и глицина бетаина. Известно, что глюкоза является строительным блоком трегалозы для широкого круга микроорганизмов [49]. Дизайн эксперимента подчеркивал положительный эффект взаимодействия между добавлением глюкозы и тепловой адаптацией. Условием, обеспечивающим наилучшую выживаемость при окислительных и тепловых нагрузках, была среда YEL, содержащая 30 г•л^-1 глюкозы, и адаптация к нагреванию в течение 2 ч при 42°C (рис. 1). После добавления глюкозы и термической адаптации мы также тестировали добавление NaCl после роста и впоследствии наблюдали снижение толерантности. Рост в присутствии NaCl может вызывать толерантность, а добавление NaCl после роста - нет.

4.2. Сочетание адсорбции глюкозы и термоадаптации повышает жизнеспособность P. freudenreichii при распылительной сушке и хранении

Добавление глюкозы в питательную среду и тепловая адаптация в начале стационарной фазы увеличивали выживаемость P. freudenreichii после высыхания (рис. 2А). Увеличение концентрации глюкозы и / или продолжительности тепловой адаптации привело к более высокой выживаемости, как и предсказывалось экспериментальным планом. Уже сообщалось, что тепловая адаптация улучшает выживаемость Lactobacillus paracasei и Candida во время сушки распылением [28,51]. При хранении при 4 и 20°C высушенные P. freudenreichii, выращенные с глюкозой и адаптированные к нагреванию, показали лучшую выживаемость, чем контроль (рис. 2B, C). Другими словами, более высокая концентрация глюкозы и более длительная тепловая адаптация увеличивали выживаемость при хранении, как и при сушке распылением. Аналогичным образом, было отмечено, что тепловая адаптация повышает жизнеспособность L. plantarum во время хранения [31]. Добавление сахарозы может увеличить выживаемость Lactobacillus sakei во время хранения после распылительной сушки [52]. Однако влияние сахаридов на жизнеспособность бактерий во время хранения еще не известно.

4.3. Комбинация добавления глюкозы и термоадаптации приводит к накоплению совместимых растворов и повышает устойчивость P. freudenreichii к распылительной сушке

Контрольные культуры накапливали большое количество совместимых растворов глутамата и пролина. Это можно объяснить культурным перемешиванием и наличием кислорода. Действительно, такое накопление не наблюдалось в той же среде YEL при отсутствии перемешивания (данные не показаны). В этом исследовании пролин накапливался в трех разных условиях. Эта аминокислота накапливается Brevibacterium flavum в присутствии растворенного кислорода и биосинтезируется из глутамата [53]. В присутствии глюкозы и при тепловой адаптации P. freudenreichii накапливал большое количество глицина бетаина и трегалозы. Известно, что глицин бетаин играет роль во время термозащиты [54,55]. Накопление трегалозы хорошо известно во время тепловой адаптации у дрожжей [56, 57], а P. freudenreichii, как известно, накапливает трегалозу [41]. Повышенная концентрация глюкозы в ростовой среде приводила к увеличению накопления трегалозы, как описано ранее [41]. Сообщается, что лактоза приводит к более высокому накоплению трегалозы P. freudenreichii, чем глюкоза [26,41]. Добавление глюкозы в сочетании с тепловой адаптацией увеличивает накопление трегалозы Saccharomyces cerevisiae [57]. Когда культура P. freudenreichii была выращена с высокой концентрацией глюкозы и была адаптирована к теплу, ее накопление трегалозы и устойчивость к тепловым воздействиям возрастали. Соответственно, накопление трегалозы является определяющим фактором термостойкости для S. cerevisiae и P. freudenreichii [26,58].

4.4. Сочетание добавления глюкозы и тепловой адаптации приводит к получению эффективного пропионового стартера

Культура P. freudenreichii в сыроподобной среде проявляла аналогичные параметры роста, как инокулированная в виде свежей культуры, так и в виде порошка, полученного из адаптированной культуры. По сравнению с контрольной свежей культурой, высушенная P. freudenreichii подкисляла больше и быстрее сыроподобную молочную среду. Концентрация лактата снижалась позже в культурах, инокулированных порошками, содержащими адаптированные P. freudenreichii, которые задерживали выработку пропионата и ацетата. Во всех культурах бактерии P. freudenreichii потребляли как лактат, так и лактозу, и продуцировали ацетат и пропионат в соотношении 2:1, что характерно для пропионовой ферментации согласно уравнению Фитца [59]. Количество лактозы, лактата, пропионата и ацетата было одинаковым для всех культур в конце ферментации. Однако культура P. freudenreichii использовала как лактозу, так и лактат сразу же после начала роста в случае свежих культур. Напротив, в случае высушенных бактерий, P. freudenreichii в начале роста преимущественно использовали лактозу, в соответствии с более быстрым подкислением. Бактерии P. freudenreichii, выращенные в присутствии глюкозы и адаптированные к нагреванию, проявляют повышенную устойчивость к распылительной сушке и повышенную способность к подкислению. Таким образом, такие порошки, содержащие адаптированную культуру P. freudenreichii, могут быть использованы в качестве эффективных сырных заквасок.

5. Выводы

В заключение, мы модулировали состав питательной среды и использовали термическую адаптацию для увеличения жизнеспособности P. freudenreichii во время сушки распылением и при хранении. В присутствии глюкозы P. freudenreichii накапливал трегалозу и глицин-бетаин, независимо от осмотического давления. По сравнению с осмотической адаптацией термическая адаптация легче реализуется в промышленности и позволяет быстрее производить P. freudenreichii с высокой жизнеспособностью во время распылительной сушки и хранения. Таким образом, эта работа открывает новые возможности для промышленного производства пропионовых заквасок.

Литература:

К разделу: Некоторые технологии получения бактериальных концентратов

Источник: Floriane Gaucher, Valérie Gagnaire, Houem Rabah, Marie-Bernadette Maillard, Sylvie Bonnassie, Sandrine Pottier, Pierre Marchand, Gwénaël Jan, Philippe Blanc, Romain Jeantet Taking Advantage of Bacterial Adaptation in Order to Optimize Industrial Production of Dry Propionibacterium freudenreichii. Microorganisms 2019, 7(10), 477;

1. Moco, S.; Candela, M.; Chuang, E.; Draper, C.; Cominetti, O.; Montoliu, I.; Barron, D.; Kussmann, M.; Brigidi, P.; Gionchetti, P.; et al. Systems biology approaches for inflammatory bowel disease: Emphasis on gut microbial metabolism. Inflamm. Bowel Dis.2014, 20, 2104–2114. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
2. Soularue, E.; Lepage, P.; Colombel, J.F.; Coutzac, C.; Faleck, D.; Marthey, L.; Collins, M.; Chaput, N.; Robert, C.; Carbonnel, F. Enterocolitis due to immune checkpoint inhibitors: A systematic review. Gut 2018, 67, 2056–2067. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
3. Skonieczna-Żydecka, K.; Marlicz, W.; Misera, A.; Koulaouzidis, A.; Łoniewski, I. Microbiome—the missing link in the Ggt-brain axis: Focus on its role in gastrointestinal and mental health. JCM 2018, 7, 521. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
4. David, L.A.; Maurice, C.F.; Carmody, R.N.; Gootenberg, D.B.; Button, J.E.; Wolfe, B.E.; Ling, A.V.; Devlin, A.S.; Varma, Y.; Fischbach, M.A.; et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature 2014, 505, 559–563. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
5. Plé, C.; Breton, J.; Richoux, R.; Nurdin, M.; Deutsch, S.-M.; Falentin, H.; Hervé, C.; Chuat, V.; Lemée, R.; Maguin, E.; et al. Combining selected immunomodulatory Propionibacterium freudenreichii and Lactobacillus delbrueckii strains: Reverse engineering development of an anti-inflammatory cheese. Mol. Nutr. Food Res. 2016, 60, 935–948. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
6. Ebner, S.; Smug, L.N.; Kneifel, W.; Salminen, S.J.; Sanders, M.E. Probiotics in dietary guidelines and clinical recommendations outside the European Union. WJG 2014, 20, 16095–16100. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
7. FAO/WHO Evaluation of Health and Nutritional Properties of Powder Milk and Live Lactic Acid Bacteria. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Expert Consultation Report 2001. Available online: http://www.fao.org/3/a-a0512e.pdf (accessed on 22 October 2019).
8. Fung, W.-Y.; Lye, H.-S.; Lim, T.-J.; Kuan, C.-Y.; Liong, M.-T. Roles of probiotic on gut health. In Probiotics; Liong, M.-T., Ed.; Springer: Berlin/Heidelberg, Germany, 2011; Volume 21, pp. 139–165. ISBN 978-3-642-20837-9. [Google Scholar]
9. Ganji-Arjenaki, M.; Rafieian-Kopaei, M. Probiotics are a good choice in remission of inflammatory bowel diseases: A meta analysis and systematic review. J. Cell. Physiol.2018, 233, 2091–2103. [Google Scholar] [CrossRef]
10. Butel, M.-J.; Waligora-Dupriet, A.-J.; Wydau-Dematteis, S. The developing gut microbiota and its consequences for health. J. Dev. Orig. Health Dis. 2018, 9, 590–597. [Google Scholar] [CrossRef]
11. Fujimura, K.E.; Sitarik, A.R.; Havstad, S.; Lin, D.L.; Levan, S.; Fadrosh, D.; Panzer, A.R.; LaMere, B.; Rackaityte, E.; Lukacs, N.W.; et al. Neonatal gut microbiota associates with childhood multisensitized atopy and T cell differentiation. Nat. Med. 2016, 22, 1187–1191. [Google Scholar] [CrossRef]
12. Colliou, N.; Ge, Y.; Sahay, B.; Gong, M.; Zadeh, M.; Owen, J.L.; Neu, J.; Farmerie, W.G.; Alonzo, F.; Liu, K.; et al. Commensal Propionibacterium strain UF1 mitigates intestinal inflammation via Th17 cell regulation. J. Clin. Investig. 2017, 127, 3970–3986. [Google Scholar] [CrossRef]
13. Chang, H.-Y.; Chen, J.-H.; Chang, J.-H.; Lin, H.-C.; Lin, C.-Y.; Peng, C.-C. Multiple strains probiotics appear to be the most effective probiotics in the prevention of necrotizing enterocolitis and mortality: An updated meta-analysis. PLoS ONE 2017, 12, e0171579. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
14. Milani, C.; Duranti, S.; Bottacini, F.; Casey, E.; Turroni, F.; Mahony, J.; Belzer, C.; Delgado Palacio, S.; Arboleya Montes, S.; Mancabelli, L.; et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2017, 81, e00036-17. [Google Scholar] [CrossRef]
15. Repa, A.; Thanhaeuser, M.; Endress, D.; Weber, M.; Kreissl, A.; Binder, C.; Berger, A.; Haiden, N. Probiotics (Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum) prevent NEC in VLBW infants fed breast milk but not in formula. Pediatr. Res. 2015, 77, 381–388. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
16. Bouglé, N.D.; Roland, F. Lebeurrier Effect of Propionibacteria supplementation on fecal Bifidobacteria and segmental colonic transit time in healthy human subjects. Scand. J. Gastroenterol. 1999, 34, 144–148. [Google Scholar]
17. Mitsuyama, K.; Masuda, J.; Yamasaki, H.; Kitazaki, S.; Koga, H.; Uchida, M.; Sata, M. Treatment of Ulcerative Colitis with Milk Whey Culture with Propionibacterium freudenreichii 2007. J. Intest. Microbiol. 2007, 21, 143–147. [Google Scholar]
18. Hojo, K.; Yoda, N.; Tsuchita, H.; Ohtsu, T.; Seki, K.; Taketomo, N.; Murayama, T.; Iino, H. Effect of ingested culture of Propionibacterium freudenreichii ET-3 on fecal microflora and stool frequency in healthy females. Biosci. Microflora 2002, 21, 115–120. [Google Scholar] [CrossRef]
19. Seki, K.; Nakao, H.; Umino, H.; Isshiki, H.; Yoda, N.; Tachihara, R.; Ohuchi, T.; Saruta, H.; Suzuki, K.; Mitsuoka, T. Effects of Fermented Milk Whey Containing Novel Bifidogenic Growth Stimulator Produced by Propionibacterium on Fecal Bacteria, Putrefactive Metabolite, Defecation Frequency and Fecal Properties in Senile Volunteers Needed Serious Nursing-Care Taking Enteral Nutrition by Tube Feeding 2004. J. Intest. Microbiol.2004, 18, 107–115. [Google Scholar]
20. Rabah, H.; Ménard, O.; Gaucher, F.; do Carmo, F.L.R.; Dupont, D.; Jan, G. Cheese matrix protects the immunomodulatory surface protein SlpB of Propionibacterium freudenreichiiduring in vitro digestion. Food Res. Int. 2018, 106, 712–721. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
21. Foligne, B.; Deutsch, S.-M.; Breton, J.; Cousin, F.J.; Dewulf, J.; Samson, M.; Pot, B.; Jan, G. Promising immunomodulatory effects of selected strains of dairy propionibacteria as evidenced in vitro and in vivo. Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76, 8259–8264. [Google Scholar] [CrossRef]
22. European Food Safety Authority (EFSA). The Maintenance of the List of QPS Microorganisms Intentionally Added to Food or Feed-Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards 2008. Available online: https://www.efsa.europa.eu/fr/efsajournal/pub/923 (accessed on 22 October 2019).
23. Rabah, H.; Rosa do Carmo, F.; Jan, G. Dairy propionibacteria: Versatile probiotics. Microorganisms 2017, 5, 24. [Google Scholar] [CrossRef]
24. Huang, S.; Vignolles, M.-L.; Chen, X.D.; Le Loir, Y.; Jan, G.; Schuck, P.; Jeantet, R. Spray drying of probiotics and other food-grade bacteria: A review. Trends Food Sci. Technol.2017, 63, 1–17. [Google Scholar] [CrossRef]
25. Gaucher, F.; Bonnassie, S.; Rabah, H.; Leverrier, P.; Pottier, S.; Jardin, J.; Briard-Bion, V.; Marchand, P.; Jeantet, R.; Blanc, P.; et al. Benefits and drawbacks of osmotic adjustment in Propionibacterium freudenreichii. J. Proteom. 2019, 204, 103400. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
26. Huang, S.; Rabah, H.; Jardin, J.; Briard-Bion, V.; Parayre, S.; Maillard, M.-B.; Le Loir, Y.; Chen, X.D.; Schuck, P.; Jeantet, R.; et al. Hyperconcentrated sweet whey, a new culture medium that enhances Propionibacterium freudenreichii stress tolerance. Appl. Environ. Microbiol. 2016, 82, 4641–4651. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
27. Jan, G.; Rouault, A.; Maubois, J.-L. Acid stress susceptibility and acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Lait 2000, 80, 325–336. [Google Scholar] [CrossRef]
28. Desmond, C.; Stanton, C.; Fitzgerald, G.F.; Collins, K.; Paul Ross, R. Environmental adaptation of probiotic lactobacilli towards improvement of performance during spray drying. Int. Dairy J. 2001, 11, 801–808. [Google Scholar] [CrossRef]
29. Csonka, L.N.; Hanson, A.D. Prokaryotic Osmoregulation: Genetics and Physiology. Annu. Rev. Microbiol. 1991, 45, 569–606. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
30. Boyaval, P.; Deborde, C.; Corre, C.; Blanco, C.; Bégué, É. Stress and osmoprotection in propionibacteria. Lait 1999, 79, 59–69. [Google Scholar] [CrossRef]
31. Paéz, R.; Lavari, L.; Vinderola, G.; Audero, G.; Cuatrin, A.; Zaritzky, N.; Reinheimer, J. Effect of heat treatment and spray drying on lactobacilli viability and resistance to simulated gastrointestinal digestion. Food Res. Int. 2012, 48, 748–754. [Google Scholar] [CrossRef]
32. Malik, A.C.; Reinbold, G.W.; Vedamuthu, E.R. An evaluation of the taxonomy of Propionibacterium. Can. J. Microbiol. 1968, 14, 1185–1191. [Google Scholar] [CrossRef]
33. De Man, J.C.; Rogosa, M.; Sharpe, M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 1960, 23, 130–135. [Google Scholar] [CrossRef]
34. Demirtas, M.U.; Kolhatkar, A.; Kilbane, J.J. Effect of aeration and agitation on growth rate of Thermus thermophilus in batch mode. J. Biosci. Bioeng. 2003, 95, 113–117. [Google Scholar] [CrossRef]
35. Arnaud, J.-P.; Lacroix, C.; Choplin, L. Effect of agitation rate on cell release rate and metabolism during continuous fermentation with entrapped growing: Lactobacillus caseisubsp. casei. Biotechnol. Tech. 1992, 6, 265–270. [Google Scholar] [CrossRef]
36. Huang, S.; Cauty, C.; Dolivet, A.; Le Loir, Y.; Chen, X.D.; Schuck, P.; Jan, G.; Jeantet, R. Double use of highly concentrated sweet whey to improve the biomass production and viability of spray-dried probiotic bacteria. J. Funct. Foods 2016, 23, 453–463. [Google Scholar] [CrossRef]
37. Cousin, F.J.; Louesdon, S.; Maillard, M.-B.; Parayre, S.; Falentin, H.; Deutsch, S.-M.; Boudry, G.; Jan, G. The first dairy product exclusively fermented by Propionibacterium freudenreichii: A new vector to study probiotic potentialities in vivo. Food Microbiol. 2012, 32, 135–146. [Google Scholar] [CrossRef]
38. Gagnaire, V.; Jardin, J.; Rabah, H.; Briard-Bion, V.; Jan, G. Emmental cheese environment enhances Propionibacterium freudenreichii stress tolerance. PLoS ONE2015, 10, e0135780. [Google Scholar] [CrossRef]
39. Aburjaile, F.F.; Rohmer, M.; Parrinello, H.; Maillard, M.-B.; Beaucher, E.; Henry, G.; Nicolas, A.; Madec, M.-N.; Thierry, A.; Parayre, S.; et al. Adaptation of Propionibacterium freudenreichii to long-term survival under gradual nutritional shortage. BMC Genom.2016, 17, 1007. [Google Scholar] [CrossRef]
40. Kets, E.; Teunissen, P.; de Bont, J. Effect of compatible solutes on survival of lactic acid bacteria subjected to drying. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62, 259–261. [Google Scholar]
41. Cardoso, F.S.; Castro, R.F.; Borges, N.; Santos, H. Biochemical and genetic characterization of the pathways for trehalose metabolism in Propionibacterium freudenreichii, and their role in stress response. Microbiology 2007, 153, 270–280. [Google Scholar] [CrossRef]
42. Dalmasso, M.; Aubert, J.; Even, S.; Falentin, H.; Maillard, M.-B.; Parayre, S.; Loux, V.; Tanskanen, J.; Thierry, A. Accumulation of intracellular glycogen and trehalose by Propionibacterium freudenreichii under conditions mimicking cheese ripening in the cold. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 6357–6364. [Google Scholar] [CrossRef]
43. Behrends, V.; Bundy, J.G.; Williams, H.D. Differences in strategies to combat osmotic stress in Burkholderia cenocepacia elucidated by NMR-based metabolic profiling: B. cenocepacia osmotic stress tolerance. Lett. Appl. Microbiol. 2011, 52, 619–625. [Google Scholar] [CrossRef]
44. Pleitner, A.; Zhai, Y.; Winter, R.; Ruan, L.; McMullen, L.M.; Gänzle, M.G. Compatible solutes contribute to heat resistance and ribosome stability in Escherichia coli AW1.7. Biochim. Biophys. Acta (BBA)-Proteins Proteom. 2012, 1824, 1351–1357. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
45. Vaidya, S.; Dev, K.; Sourirajan, A. Distinct osmoadaptation strategies in the strict halophilic and halotolerant bacteria isolated from Lunsu salt water body of north west Himalayas. Curr. Microbiol. 2018, 75, 888–895. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
46. Weinisch, L.; Kirchner, I.; Grimm, M.; Kühner, S.; Pierik, A.J.; Rosselló-Móra, R.; Filker, S. Glycine betaine and ectoine are the major compatible solutes used by four different halophilic heterotrophic ciliates. Microb. Ecol. 2019, 77, 317–331. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
47. Leverrier, P.; Vissers, J.P.C.; Rouault, A.; Boyaval, P.; Jan, G. Mass spectrometry proteomic analysis of stress adaptation reveals both common and distinct response pathways in Propionibacterium freudenreichii. Arch. Microbiol. 2004, 181, 215–230. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
48. Flahaut, S.; Hartke, A.; Giard, J.; Benachour, A.; Boutibonnes, P.; Auffray, Y. Relationship between stress response towards bile salts, acid and heat treatment in Enterococcus faecalis. FEMS Microbiol. Lett. 1996, 138, 49–54. [Google Scholar] [CrossRef]
49. Streeter, J.G.; Gomez, M.L. Three enzymes for trehalose synthesis in Bradyrhizobiumcultured bacteria and in bacteroids from soybean nodules. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 4250–4255. [Google Scholar] [CrossRef]
50. Teixido, N.; Canamas, T.P.; Usall, J.; Torres, R.; Magan, N.; Vinas, I. Accumulation of the compatible solutes, glycine-betaine and ectoine, in osmotic stress adaptation and heat shock cross-protection in the biocontrol agent Pantoea agglomerans CPA-2. Lett. Appl. Microbiol. 2005, 41, 248–252. [Google Scholar] [CrossRef]
51. Cañamás, T.P.; Viñas, I.; Usall, J.; Magan, N.; Solsona, C.; Teixidó, N. Impact of mild heat treatments on induction of thermotolerance in the biocontrol yeast Candida sake CPA-1 and viability after spray-drying. J. Appl. Microbiol. 2008, 104, 767–775. [Google Scholar] [CrossRef]
52. Ferreira, V.; Soares, V.; Santos, C.; Silva, J.; Gibbs, P.A.; Teixeira, P. Survival of Lactobacillus sakei during heating, drying and storage in the dried state when growth has occurred in the presence of sucrose or monosodium glutamate. Biotechnol. Lett. 2005, 27, 249–252. [Google Scholar] [CrossRef]
53. Akashi, K.; Shibai, H.; Hirose, Y. Effect of oxygen supply on l -lysine, l -threonine and l -isoleucine fermentations. Agric. Biol. Chem. 1979, 43, 2087–2092. [Google Scholar] [CrossRef]
54. Ghazi, A.; Demont-Caulet, N.; Richarme, G.; Caldas, T. Thermoprotection by glycine betaine and choline. Microbiology 1999, 145, 2543–2548. [Google Scholar]
55. Holtmann, G.; Bremer, E. Thermoprotection of Bacillus subtilis by exogenously provided glycine betaine and structurally related compatible solutes: Involvement of Opu transporters. J. Bacteriol. 2004, 186, 1683–1693. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
56. Singer, M.A.; Lindquist, S. Thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae: The Yin and Yang of trehalose. Trends Biotechnol. 1998, 16, 460–468. [Google Scholar] [CrossRef]
57. Hottiger, T.; Schmutz, P.; Wiemken, A. Heat-induced accumulation and futile cycling of trehalose in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 1987, 169, 5518–5522. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
58. Hazell, B.; Nevalainen, H.; Attfield, P. Evidence that the Saccharomyces cerevisiae CIF1 (GGS1/TPS1) gene modulates heat shock response positively. FEBS Lett. 1995, 377, 457–460. [Google Scholar] [PubMed]
59. Fitz, A. Ueber Spaltpilzgährungen. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1878, 11, 1890–1899. [Google Scholar] [CrossRef]

Будьте здоровы!