Кислотоустойчивость пропионовокислых бактерий

ИССЛЕДОВАНИЕ КИСЛОТНОГО СТРЕССА У ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

1. Cохранение выживаемости пропионовокислых бактерий при низких значениях pH
2. Изменения в синтезе белка и морфологии во время кислотной адаптации P. freudenreichii

Cохранение выживаемости пропионовокислых бактерий при низких значениях pH

В статье приведены результаты исследования устойчивости пропионовокислых бактерий к кислотному стрессу. Объект исследований выбран в связи с тем, что пропионовокислые бактерии рассматриваются как перспективные пробиотики, положительное влияние которых на здоровье человека общепризнано. Они подавляют активность патогенных микроорганизмов, образуют витамины группы В и в большом количестве витамин В12, обладают антимутагенными свойствами, обеспечивают защиту от кишечных инфекций, некоторые штаммы вызывают торможение роста раковых клеток. Установлено, что наиболее высокой устойчивостью к кислотному стрессу обладают пропионовокислые бактерии P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2. Выживаемость данного штамма через 1,5 ч инкубации при рН 2 составляет 64%, а наименее устойчивого штамма P. freudenreichii subsp. shermanii AC-2503 ‒ 36%. Высокая жизнеспособность пропионовокислых бактерий при низких значениях рН объясняется системой антиокислительной защиты, которая характеризуется реакцией толерантности к кислоте, что обеспечивает им повышенную выживаемость при низкой кислотности.

Введение

Любое стрессовое воздействие приводит к изменению функционирования бактериальной клетки. Во-первых, смена благоприятных условий на неблагоприятные вызывает переход популяции к несбалансированному росту, когда в результате изменения физико-химических условий меняются скорость реакции биохимического синтеза и, как следствие, соотношение макромолекулярных компонентов в клетках [1].

Во-вторых, сложная система, состоящая из множества сенсорных компонентов, генных регуляторных сетей, воспринимает сигналы среды и реагирует на них, запуская те или иные механизмы физиологической адаптации [2, 3]. Оба процесса в итоге приводят к тому, что множество клеток популяции сталкиваются с необходимостью выбора стратегии выживания.

Одна стратегия стрессовых ответов направлена на нейтрализацию и избежание стрессового удара. Такие ответы уникальны для каждого стресса. Стрессовые ответы такого типа называют специфическими. К ним относят голодовый, окислительный, кислотный стрессы.

Если воздействие стресса не удается избежать, то это может привести к повреждению молекул (ДНК, белки, клеточные покровы), поэтому существует вторая стратегия, направленная на предотвращение и репарацию повреждений клетки, что делает ее устойчивой не только к данному стрессу, но и к другим. Она называется глобальным стрессовым ответом. Глобальный стрессовый ответ возникает при летальных воздействиях [4, 6, 7].

Известно, что кислотность среды является важным фактором, определяющим биохимическую активность пропионовокислых бактерий. Концентрация ионов водорода в окружающей среде действует на микроорганизмы прямо (путем непосредственного воздействия Н+) или косвенно ‒ через влияние на стабильность макромолекул, равновесие электрических зарядов.

Пропионовокислые бактерии предпочитают расти в нейтральном диапазоне рН, но необходимо отметить, что эти бактерии подвергаются кислотному стрессу в желудочно-кишечном тракте. Кислотный стресс определяется как комбинированный биологический эффект низкого значения рН и слабых органических кислот, являющихся продуктами ферментации – ацетата, пропионата. Органические кислоты в своей протонированной, т.е. незаряженной форме при низких значениях рН могут диффундировать через клеточную мембрану, затем диссоциируя внутри клетки, и снижать цитозольный рН.

Следует отметить, что вопросы кислотного шока пропионовокислых бактерий изучены недостаточно и для их практического использования необходимы детальные исследования.

Материалы и методы исследования

Целью данной работы является исследование устойчивости пропионовокислых бактерий к кислотному стрессу. Экспериментальная часть исследований проводилась в лаборатории кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» ВСГУТУ.

Объектами исследований служили чистые культуры пробиотических бактерий: Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii АC 2503, P. freundenreichii subsp. freu-denreichii АC 2500, P. cyclohexanicum Kusano AC 2559, P. cyclohexanicum Kusano AC 2560, полученных из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (г. Москва); P. Freundenreichii Ш85, P. Freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2, Propionibacterium freundenreichii subsp. freudenreichii 216 II, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика», P. fredenrichii subsp. shermanii KM 186, приобретенный из коллекции проф. Л.И. Воробьевой (МГУ).

Активизировали штаммы биотехнологическим методом, разработанным в Восточно-Сибирском государственном университете технологий и управления [5].

Питательной средой для наращивания биомассы пропионовокислых бактерий служила осветленная творожная сыворотка с добавлением ростовых факторов. После наращивания биомассы кислотность среды регулировали соляной кислотой.

Количественный учет клеток пропионовокислых бактерий проводили методом предельных разведений по ТУ 10-10-02-789-192-95 на среде ГМК.

---

Результаты исследования и их обсуждение

Среди штаммов пропионовокислых бактерий, полученных из различных источников, был проведен скрининг с целью изучения их устойчивости к кислой реакции среды и отбора наиболее перспективных штаммов. Полученные данные представлены в таблице.

Таблица Сводные данные кислотоустойчивости пробиотических микроорганизмов

Название штамма	Контроль рН=6 (КОЕ/см3)	Опыт (рН=2) КОЕ/см3
		продолжительность (ч)
		1,5	2,5	3,5
Propionibacterium freundenreichii subsp. freudenreichii AC-2500	2х1011	1х107	4х106	5х104
P.cyclohexanicum Kusano AC-2260	1х1011	3х106	2х106	3х104
P.cyclohexanicum Kusano AC-2259	2х1011	6х108	1х107	2х105
P. freudenreichii subsp. shermanii AC-2503	4х1011	1х106	3х104	1х103
P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 II	1x1011	2x107	2x106	3х104
P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2	5x1011	1x108	3x108	3х104
P. freundenreichii Ш85	1х1011	1х108	7х107	3х104
P. fredenrichii subsp. shermanii KM 186	2х1011	5x108	3x107	2x104

Анализ данных таблицы 1 свидетельствует о том, что пропионовокислые бактерии достаточно устойчивы к низким значениям рН. Наиболее высокой устойчивостью обладает штамм P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2, где через 2,5 ч инкубации при рН 2 количество жизнеспособных клеток составляет 10⁸ КОЕ в 1 см³ .

Следует отметить, что у пропионовокислых бактерий P. freundenreichii Ш85 и P. fredenrichii subsp. shermanii KM 186 количество жизнеспособных клеток ниже всего на один порядок, что также свидетельствует о хорошей выживаемости данных культур в кислой среде. Дальнейшая выдержка в течение 3,5 ч приводит к гибели культур.

Выживаемость наиболее и наименее устойчивых культур пропионовокислых бактерий при воздействии кислой реакции среды представлена на рисунке.

Рисунок ‒ Выживаемость пропионовокислых бактерий при рН 2

Из рисунка видно, что с увеличением времени инкубации происходит заметное снижение количества жизнеспособных клеток. Через 1 ч инкубации при рН 2 выживаемость пропионовокислых бактерий P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2 составляет 83%, тогда как у пропионовокислых бактерий P. freudenreichii subsp. shermanii AC-2503 сохраняется 56% количества жизнеспособных клеток.

Вероятно, у пропионовокислых бактерий имеется система антиокислительной защиты, обладающая индуцибельным гомеостазом в отношении рН. Они характеризуются реакцией толерантности к кислоте (РТК), что обеспечивает им повышенную выживаемость при низкой кислотности. При низких значениях рН синтезируются белки кислотного шока, которые вовлекаются в защиту макромолекул. При этом аварийные системы рН гомеостаза стремятся поддерживать внутриклеточный рН не ниже 5,0.

Выводы

Установлено, что сохранение выживаемости на более высоком уровне наблюдается у пропионовокислых бактерий P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2, которые являются более устойчивыми к кислотному стрессу. При этом через 2,5 ч инкубации у пропионовокислых бактерий P. freundenreichii subsp. freudenreichii 216 В-2 оставалось 64% жизнеспособных клеток, а выживаемость P. freudenreichii subsp. shermanii AC-2503 составила 36%.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что пропионовокислые бактерии обладают адаптивными системами к кислотному стрессу и могут выживать в желудочно-кишечном тракте человека в зонах с кислой реакцией среды.

Источник: I.S. Khamagaeva, Dr. Sc. Engineering, Prof., et al. The study of the acid stress of the propionic acid bacteria | Вестник ВСГУТУ / 2015 / № 6

Библиография Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Новикова Т.М. и др. Антистрессовое перекрестное действие внеклеточных метаболитов бактерий, архий и дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. ‒ 2013. - Т. 49, № 4 - С. 333‒344; 2) Магданова Л.А., Голясная Н.В. Гетерогенность как адаптивное свойство бактериальной популяции // Микробиология. - 2013. ‒ Т. 82, № 1. - С. 3‒13; 3) Бирюкова Е.Н., Аринбасарова А.Ю., Меденцев А.Г. Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к этанолу // Микробиология. - 2007. ‒ Т. 76, № 2; 4) Бирюкова Е.Н., Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю. и др. Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к тепловому стрессу // Микробиология. - 2007. ‒ Т. 76, № 2. - С. 184‒190; 5) Хамагаева И.С., Качанина Л.М., Тумурова С.М. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий: монография. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. - 172 с; 6) Bjedov I., Tenaillon O., Gerard B. et al. Stress – Induced mutagenesis in bacteria // Science. - Vol. 300. 5624. ‒ P. 1404‒1409; 7) Kivisaar M. Stationary phase mutagenesis mechanisms that accelerate adaptation of microbiai  populations under environmental stress // Environ. Microbiol. ‒ 2003. ‒ Vol. 5. ‒ P. 814‒827.

---

Изменения в синтезе белка и морфологии во время кислотной адаптации Propionibacterium freudenreichii

---

Выживание бактерий в меняющихся условиях окружающей среды зависит от их способности адаптироваться к абиотическим стрессам.

Микроорганизмы, используемые в пищевой технологии, испытывают кислотный стресс во время процессов ферментации. Точно так же пробиотические бактерии должны пережить кислотный стресс, возникающий в желудке, чтобы достичь кишечника и сыграть полезную роль. Пропионибактерии используются как в качестве заквасок для сыра, так и в качестве пробиотиков в питании человека. Таким образом, адаптация к низкому уровню pH ограничивает их эффективность. Поэтому была исследована адаптация к кислотному стрессу у пробиотического штамма SI41 Propionibacterium freudenreichii. Реакция кислотоустойчивости (ATR) наблюдалась в химически определенной среде. Временное воздействие pH 5 обеспечивало защиту от воздействия кислоты при pH 2. Было показано, что для оптимального ATR необходим неосинтез белка, поскольку хлорамфеникол снижает приобретенную толерантность к кислоте.

Прим. ред.: Для определения необходимости неосинтеза специфических защитных белков у P. freudenreichii SI 41 ATR клетки обрабатывали ингибитором синтеза белка хлорамфениколом до и во время адаптации при рН 5,0. В этом случае заметная смертность наблюдалась во время последующего воздействия кислоты при pH 2,0. Действительно, 43% адаптированных клеток пережили сильное воздействие кислоты, а 100% выжили после адаптации в отсутствие антибиотика. Однако эти клетки проявляли пониженную толерантность к кислотному стрессу, а выживаемость все равно была выше, чем у неадаптированных бактерий. Таким образом, ингибирование неосинтеза белка предотвращало ATR, по крайней мере частично, что указывает на роль стрессовых белков, индуцированных кислотой, в кислотной адаптации.

Важные изменения в генетической экспрессии наблюдались при двумерном электрофорезе во время адаптации. Среди полипептидов с повышенным уровнем экспрессии белка-биотинкарбоксиносителя (BCCP) и ферменты, участвующие в синтезе и репарации ДНК, были идентифицированы во время ранней реакции на стресс, тогда как универсальные шаперонины GroEL и GroES соответствовали более поздней реакции. Положительный эффект ATR был очевиден как на физиологическом, так и на морфологическом уровне. Это исследование представляет собой первый шаг к пониманию очень эффективного ATR, описанного у P. freudenreichii.

Бактерии периодически подвергаются абиотическим стрессам в различных средах. В этом контексте выживание предполагает восприятие изменений параметров окружающей среды, таких как температура, pH или присутствие токсичных соединений, и быструю адаптацию, чтобы проявить большую толерантность. Бактерии развили ряд индуцируемых реакций, включая белки стресса, приводящие к толерантности, что подразумевает сложную регуляцию экспрессии генов (41).

Кислотный стресс имеет особое значение для бактерий, используемых в пищевых технологиях. Действительно, разнообразные пищевые продукты в процессе ферментации подкисляются молочнокислыми бактериями. В частности, пробиотические микроорганизмы обычно поставляются в виде кисломолочных продуктов и страдают от лактокислотного стресса. Следовательно, пробиотики, включая штаммы Bifidobacterium и Lactobacillus, подвергаются серьезной смертности во время обработки и хранения таких продуктов. По этой причине в качестве переносчиков этих бактерий были предложены менее подкисленные продукты, такие как сыры (8). Пробиотики подвергаются дополнительному воздействию сильного кислотного стресса при достижении просвета желудка, где присутствует соляная кислота. Таким образом, ясно, что способность эффективно адаптироваться к кислотному стрессу является непременным условием для пробиотического микроорганизма, чтобы он мог достичь кишечника и оказать ожидаемый положительный эффект (10).

Что касается других стрессов, сублетальная кислая среда может вызвать у бактерий адаптивную реакцию и обеспечить защиту от последующего воздействия летального кислого pH - механизм, известный как реакция кислотной толерантности (ATR). ATR хорошо документирован для ряда патогенных бактерий желудочно-кишечного тракта или пищевого происхождения, таких как Escherichia coli (36), Salmonella enterica серовар Typhimurium (7), Aeromonas Hydrophila (18), Vibrio parahaemolyticus (45), Helicobacter pylori (27), Listeria monocytogenes (4) и Enterococcus faecalis (6), а также оральный кариесогенный организм Streptococcus mutans (12). Действительно, адаптация и выживание при низком pH могут быть важными факторами патогенности желудочно-кишечных бактерий и вызывают серьезную озабоченность с точки зрения безопасности и здоровья пищевых продуктов. Напротив, о механизмах кислотоустойчивости полезных микроорганизмов, используемых в молочной промышленности, известно меньше, за исключением Lactococcus Lactis (13) и Lactobacillus acidophilus (21).

Пропионибактерии — грамположительные, неподвижные, анаэробные и аэротолерантные бактерии, продуцирующие пропионовую кислоту, уксусную кислоту и углекислый газ как продукты ферментации сахаров и молочной кислоты. Таким образом, они используются для промышленного ферментативного производства пропионовой кислоты (30). Молочные пропионибактерии, такие как Propionibacterium freudenreichii, традиционно используются в качестве заквасок в технологии сыра. Их также считают пробиотиками из-за их способности подавлять рост нежелательной флоры (23), стимулировать рост бифидобактерий (3) и благотворно изменять ферментативную активность в кишечнике (25). Вполне вероятно, что кислотоустойчивость молочных пропионибактерий способствует их потенциалу в качестве как заквасок, так и пробиотиков.

Было показано, что чувствительность к кислоте сильно зависит от вида и штамма изученных пропионибактерий (34). В предыдущем отчете мы описали способность штамма P. freudenreichii, выделенного из сыра швейцарского типа, развивать ATR в сложной среде (17). Здесь мы исследовали механизмы ATR в пробиотическом штамме того же вида. Хотя химически определенная среда радикально отличается от условий, встречающихся in situ, она позволяет проводить физиологические и молекулярные исследования в воспроизводимых и контролируемых условиях. Таким образом, мы разработали такую среду для молочных пропионибактерий и продемонстрировали, что рост и ATR (данное исследование) аналогичны тем, что наблюдались в богатой среде (17). Это позволило нам изучить изменения в синтезе белка, чтобы выяснить механизм ATR. Определяли индуцированные кислотой полипептиды, контролировали относительную скорость их синтеза в зависимости от времени и идентифицировали пять белков с помощью N-концевого секвенирования. Кроме того, с помощью сканирующей электронной микроскопии наблюдались изменения в морфологии клеток во время кислотной адаптации и сильного кислотного воздействия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микроорганизмы и условия роста.

Штамм SI41 P. freudenreichii subsp. shermanii, используемый в этом исследовании, был любезно предоставлен компанией Standa Industrie (Кан, Франция) и является частью пробиотического препарата Propiofidus. Этот штамм обычно культивировали в среде с лактатом дрожжевого экстракта (YEL) (24) и хранили в течение длительного времени при -80°C в той же среде, дополненной 10% глицерина. Однако для этого исследования мы разработали химически определенную среду MDP, способствующую включению радиоактивно меченных аминокислот. Среда MDP содержала (на литр дистиллированной воды) 12,8 г лактата натрия, 0,6 г KH₂PO₄, 0,4 г ацетата калия, 50 мг MgSO₄O • 7H₂O, 5 мг MnSO₄ • 4H₂O, 2,5 мг FeSO₄ • 7H₂O, 2,5 мг. CuSO₄, 2,5 мг NaCl, 0,25 мг ацетата кобальта, 15 мкг ZnSO₄, 1 мкг H₃BO₃, 1 мкг Na₂MoO₄, 50 мкг тиамина, 100 мкг пиридоксала, 50 мкг пантотената кальция, 50 мкг рибофлавина, 100 мкг никотинамида, 10 мкг п-аминобензойной кислоты, 4 мкг биотина, 20 мкг фолиевой кислоты и 2 мкг цианокобаламина. Аминокислоты поставлялись в следующих концентрациях (на литр): 50 мг L-Ala, 160 мг L-Arg, 150 мг L-Asn, 250 мг L-Asp, 140 мг L-Cys, 80 мг Gly, 190 мг L-Glu, 150 мг L-Gln, 100 мг L-His, 180 мг L-Ile, 300 мг L-Leu, 220 мг L-Lys, 60 мг DL-Met, 460 мг L-Pro, 170 мг L-Phe, 180 мг L-Ser, 150 мг L-Thr, 50 мг L-Trp, 60 мг L-Tyr и 480 мг DL-Val. Также было добавлено по пять миллиграммов каждого из оснований аденина, гуанина, урацила и ксантина. Перед стерилизацией фильтром (диаметр пор 0,45 мкм; Millipore, Бедфорд, Массачусетс) pH среды доводили до 7,0 с помощью NaOH. Рост осуществляли при 30°C без встряхивания и контролировали спектрофотометрически при 650 нм, а также подсчетом КОЕ.

Кислотная адаптация и экстремальный кислотный вызов. Клетки в лог-фазе получали следующим образом. Стартовую культуру (10 мл в среде MDP) разводили в 1 000 раз в свежей среде MDP. Во время экспоненциального роста эту прекультуру снова разводили в 1 000 раз в 100 мл свежей среды. Когда культура достигала плотности клеток 5 x 10⁸ клеток на мл (оптическая плотность при 650 нм [OD650] = 0,5), бактерии собирали центрифугированием (6 000 x g 30°C, 5 мин). Для кислотной адаптации клетки восстанавливали в равном объеме среды MDP, отрегулированной до pH 5,0, и инкубировали при 30°C в течение 60 мин.

Адаптированные и неадаптированные клетки собирали центрифугированием и восстанавливали в равном объеме среды MDP при pH 2,0. Количество жизнеспособных клеток определяли через 30 мин после воздействия кислоты. Образцы разводили в пептонной воде (0,1% пептического перевара мяса; Biokar Diagnostics, Beauvais, France), pH 7,0, содержащей 0,9% NaCl, и заливали в среду YEL, содержащую 1,5% агара, для максимального восстановления. Количество КОЕ определяли через 6 дней анаэробной инкубации при 30°C.

Обработка хлорамфениколом. MIC хлорамфеникола составлял 4 мкг/мл, и хлорамфеникол использовали в концентрации 40 мкг/мл, при которой наступал бактериостаз и не наблюдалось летального эффекта для P. freudenreichii. Его добавляли в культуру за 60 минут до адаптации и во время адаптации при pH 5,0 и кислотного вызова при pH 2,0.

Радиоактивное мечение и выделение цельноклеточного белка. Лог-фазные клетки, выращенные в среде MDP, маркировали в соответствии с описанием Flahaut et al. (6). Бактерии собирали центрифугированием (6 000 x g, 30°C, 5 мин) и восстанавливали в равном объеме среды MDP, лишенной цистеина и метионина, при pH 7,0 (контрольные клетки) или pH 5,0 (адаптированные клетки). Подвыборку бактериальной суспензии объемом 1 мл метили 500 мкКи (микрокюри) смеси для мечения белков [35S]метионин/цистеин (ICN Pharmaceuticals, Орсе, Франция) в течение 30 минут при 30°C. Включение останавливали быстрой промывкой бактерий в 1 мл стоп-раствора (50 мМ трис-HCl [pH 7,5], 150 мМ NaCl, 1 мМ метионина, 1 мМ цистеина, 1 мг хлорамфеникола на мл, 0,4 мМ фенилметилсульфонилфторида [PMSF]). Промытые клетки затем извлекали в раствор для протопластизации (25 мМ Трис-HCl [pH 7,5], 0,5 М сахарозы, 5 мг лизоцима на мл, 1 мг хлорамфеникола на мл, 0,4 мМ PMSF) и инкубировали в течение 5 мин при 37°C. перед центрифугированием (6000 x g, 30°С, 5 мин). Осадок клеток извлекали в 200 мкл лизирующего раствора, состоящего из 50 мМ трис-HCl [pH 7,5], 0,3% додецилсульфата натрия (SDS), 200 мМ дитиотреитола (DTT) и 0,4 мМ PMSF, и немедленно обрабатывали ультразвуком на льду* с помощью ультразвукового аппарата Vibra Cell (Bioblock Scientific, Илькирх, Франция), оснащенного конусообразным микронаконечником (три импульса по 1 минуте с интервалом в 1 минуту, выходная мощность 2,5) (*Прим. ред.: Водяная баня со льдом используется, чтобы избежать разложения белка из-за нагрева образца при обработке ультразвуком). Лизат доводили до 95°С в течение 10 мин для улучшения растворимости белка, а нерастворимые вещества удаляли центрифугированием (10 000 x g, 10 мин, комнатная температура). Добавляли четыре объема ледяного ацетона, белки осаждали в течение 30 мин на льду перед центрифугированием (12 000 x g, 10 мин, 4°С) и затем сушили на воздухе.

Двумерный электрофорез. Предварительные эксперименты, проведенные с градиентами pH от 3 до 10, показали, что большинство полипептидов P. freudenreichii фокусируются в диапазоне pH от 4 до 7. По этой причине в этом исследовании использовались сухие полоски с pH от 4 до 7 (Amersham Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеция). Высушенные на воздухе белковые осадки растворяли в растворе образца, содержащем 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 25 мМ DTT, 4% 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфоната (CHAPS) и 2% IPG-Буфера (Amersham Pharmacia Biotech). Поверхностно-активное вещество CHAPS и хаотропный агент тиомочевина использовались во время изоэлектрической фокусировки для улучшения растворимости белка и перехода во второе измерение (33). Равные количества радиоактивности (106 dpm) были загружены в гель в первом измерении. Изоэлектрическое фокусирование осуществляли, как описано Gorg et al. (11) с использованием сухих полосок Immobiline на системе электрофореза Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech). Полоски уравновешивали в присутствии DTT, а затем йодацетамида, прежде чем поместить их на верхнюю часть геля второго измерения. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) (12,5% полиакриламида) проводили по методу Леммли (19) в пластинчатых гелях (16×16×0,1 см) (Protean II; Bio-Rad, Hercules, Калифорния). Для анализа небольших белков второе измерение некоторых двумерных гелей осуществляли с помощью прерывистого электрофореза в SDS-PAGE в трис-трициновом буфере по методу Шаггера и фон Ягова (38). Эта электрофоретическая система состояла из разделительного геля, спейсерного геля и накопительного геля в концентрациях 16, 10 и 4% соответственно. Радиоактивность в высушенных гелях определяли с помощью Storm Phosphorimager (Amersham Pharmacia Biotech). Анализ изображений, сопоставление гелей и количественное определение радиоактивности в отдельных пятнах проводили с помощью программного обеспечения Melanie II (Bio-Rad). Молекулярные массы калибровали путем совместной миграции низкомолекулярных маркеров (94,0, 67,0, 43,0, 30,0, 20,1 и 14,4 кДа) и пептидных маркеров (16949, 14404, 10700, 8159, 6214 и 2512 Да) с бактериальными белками. Аналогично, изоэлектрические точки калибровали с помощью широкого набора pI (на таких гелях разрешались изоэлектрические точки 4,55, 5,20, 5,85, 6,55 и 6,85). Все маркеры были получены от Amersham Pharmacia Biotech. Относительные скорости синтеза определяли путем расчета отношения радиоактивности пятна к радиоактивности всего геля. Результаты представляют собой средние значения определений, полученных не менее чем в трех независимых экспериментах, со стандартным отклонением менее 15%.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности. Клетки из культуры объемом 200 мл в среде MDP подвергали лизису, а белки экстрагировали с помощью SDS, как описано выше. Содержание белка в экстракте определяли по методу Лоури (22) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Аликвоты по 200 мг общего количества белков осаждали ацетоном и разделяли методом двумерного электрофореза. Полученные двумерные гели переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) (Hyperbond; Beckman Instruments, Inc., Фуллертон, Калифорния) методом погружного электроблоттинга в 10 мм 3-[циклогексиламино]-1-пропансульфоновой кислоты (CAPS) по методу Мацудайры (26). Белки визуализировали окрашиванием Кумасси синим R-250 по методу Прайора и др. (32). Пятна вырезали из мембраны и наносили на автоматический секвенатор белка Beckman/Porton LF3000 (Beckman Instruments), как описано производителем. Поиск гомологий последовательностей проводили с помощью программы FASTA (31).

Электронная микроскопия. Клетки P. freudenreichii были помещены путем щадящей фильтрации на мембраны с диаметром пор 0,2 мкм (мембранные фильтры Isopore; Millipore).Мембраны фиксировали в течение 48 ч 2% (мас./об.) глутаровым альдегидом в 0,1 М какодилатном буфере натрия [рН 6,8] и промывали в том же буфере. Образцы обезвоживали этанолом (10, 25, 50, 75, 95, и, наконец, 100%), высушивали до критической точки методом CO₂ и покрывали золотом. Клетки исследовали и фотографировали с помощью сканирующего электронного микроскопа Philips XL 20, работающего при 10 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Реакция кислотоустойчивости (ATR) P. freudenreichii SI 41 в среде MDP. Пропионибактерии являются полиауксотрофными бактериями, которые обычно культивируются на сложных средах с добавлением дрожжевого экстракта, таких как среда YEL. Для лучшего понимания адаптации к стрессу мы разработали среду MDP и сравнили ее со средой YEL. На этой среде штамм SI41 демонстрировал характеристики роста, несколько отличающиеся от тех, что наблюдались на комплексной среде. Время генерации составляло 6 ч, а конечная OD - 2, что соответствовало плотности клеток 5x10⁸ КОЕ/мл, в то время как в среде YEL время генерации составляло 5 ч, а конечная OD - 2,5, что соответствовало 10⁹ КОЕ/мл. Таким образом, среда MDP удовлетворяла требованиям P. freudenreichii к питательным веществам и использовалась в данных экспериментах.

Рис. 1. ATR в P. freudenreichii SI41 и эффект ингибирования синтеза белка. Клетки в лог-фазе собирали и подвергали кислотной адаптации при рН5 с обработкой хлорамфениколом (В) или без нее (А). Жизнеспособность определяли через 30 мин после последующего экстремального кислотного вызова при pH2. В качестве контроля неадаптированные клетки подвергали такому же вызову (C). Результаты выражены в процентах жизнеспособных клеток в конце испытания. Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение для трехкратных экспериментов.

Затем ATR исследовали для пробиотического штамма SI41, выращенного в среде. Клетки были подвергнуты испытанию во время экспоненциального роста в среде MDP. (pH таких культур обычно находится в диапазоне от 6,5 до 7,0). При переходе к pH 2,0 они подвергались серьезной гибели (рис. 1). Действительно, через 30 минут после этого воздействия было обнаружено только 4,3% жизнеспособных пропионибактерий. В отличие от этого, когда идентичные культуры подвергались сублетальному воздействию рН 5,0 в течение 60 минут до вызова (до перехода к pH 2,0), они выживали рН 2,0 без значительной потери жизнеспособности. Более того, такой же защитный эффект предварительной обработки кислотой наблюдался при выращивании SI41 и в богатой среде YEL (данные не показаны). Это явно свидетельствует о наличии ATR для штамма P. freudenreichii SI 41, выращенного на обеих средах.

Для определения потребности в неосинтезе специфических защитных белков у P. freudenreichii SI 41 ATR клетки обрабатывали ингибитором синтеза белка хлорамфениколом до и во время адаптации при pH 5,0. В этом случае наблюдалась заметная смертность при последующем кислотном вызове при pH 2,0. Действительно, 43% адаптированных клеток пережили экстремальный кислотный вызов, в то время как 100% выжили после адаптации в отсутствие антибиотика (Однако эти клетки (43%) демонстрировали пониженную толерантность к кислотному стрессу, а выживаемость все равно была выше, чем у неадаптированных бактерий). Таким образом, ингибирование неосинтеза белков предотвращало ATR, по крайней мере частично, что позволяет предположить роль белков, вызывающих кислотный стресс, в кислотной адаптации.

Рис. 2. Анализ морфологических изменений P. freudenreichii SI41 при кислотном стрессе. Необработанные клетки (A), клетки, подвергшиеся экстремальному кислотному стрессу при pH 2 (B), и клетки, адаптированные к кислоте при pH 5 (C), были проанализированы с помощью сканирующей электронной микроскопии. Для сравнения также были проанализированы клетки, подвергшиеся кислотной адаптации (pH 5), а затем экстремальному кислотному вызову (pH 2) (D).

Морфологические изменения P. freudenreichii при воздействии кислотного стресса. Сканирующие электронные микрофотографии выявили характерную морфологию молочных пропионибактерий для клеток, выращенных при рН 7,0: наблюдались плеоморфные палочки, расположенные в виде “китайских иероглифов”, а средняя длина отдельных клеток (рассчитанная по меньшей мере из 100 измерений для каждого наблюдения) составляла 1,22 мкм (рис. 2А). Напротив, клетки, инкубированные при рН 2,0, показали значительные изменения в морфологии. Форма палочки была утрачена, и бактерии приобрели сегментированный вид, при котором отдельные сегменты были короче (в среднем 0,48 мкм). Кроме того, были обнаружены пузырёк-подобные структуры на поверхности значительного числа бактериальных клеток (рис. 2B). При воздействии рН 5,0 наблюдалось меньше морфологических нарушений. Форма палочки в целом сохранялась, а деформации клеточной поверхности почти отсутствовали (рис. 2С). Кроме того, наблюдалось удлинение некоторых клеток, и средний размер бактерий тогда составлял 1,57 мкм. Более того, при воздействии рН 2,0 бактерии, адаптированные при рН 5,0, не проявляли изменений, сравнимых с теми, которым подверглись неадаптированные бактерии (рис. 2D).

Изменения в синтезе белков при ATR. После того как были показаны требования ATR-специфических полипептидов для максимальной защиты, мы изучили скорость синтеза белка во время кислотной адаптации. После импульсного мечения мы проанализировали двумерным электрофорезом цельноклеточные белковые экстракты штамма SI41. Сравнивали электрофореграммы контрольных клеток, растущих при pH 7,0, и клеток, прошедших кислотную адаптацию (рис. 3). Импульсное мечение проводили в течение четырех последовательных 15-минутных периодов в течение 60 мин кислотной адаптации.

На авторадиограммах контрольных гелей был обнаружен синтез 433 дискретных клеточных белков в диапазоне молекулярных масс от 14 до 130 кДа и pI от 4 до 7 (рис. 3А). В течение первых 15 мин кислотной адаптации было обнаружено 17 индукций синтеза белка (из 46 индуцированных полипептидов, наблюдаемых на этих гелях). Это относится к белкам кислотного стресса (ASPs) 7, 14, 34 и 45 (рис. 3В). Среди этих ранних индукций некоторые сохранялись на протяжении всего эксперимента (см. ASP 45 на рис. 3 и ASP 47 на рис. 4 и 5), в то время как другие (ASP 14 и 22) вернулись к исходному уровню (рис. 3C, 3D и 5). Некоторые стрессовые белки, такие как ASP 8, индуцировались только в конце адаптации (рис. 3D и 5), в то время как другие были лишь транзиторно сверхэкспрессированы (ASP 11, 35 и 39). Наиболее значительные изменения коснулись ASPs 1, 2 и 25, которые показали максимальные коэффициенты индукции 4,8, 3,9 и 3,8, соответственно. Коэффициенты индукции других кислотно-индуцированных полипептидов были слабее: от 1,5 до 3,5. Наконец, выдерживание бактерий при pH 5,0 в течение 60 мин приводило к остановке синтеза большинства полипептидов, экспрессируемых в растущих клетках. Действительно, между 45 и 60 мин обработки было мечено только 303 полипептида, и большинство из них практически не обнаруживались на авторадиограммах (рис. 3E). Напротив, некоторые ASPs все еще экспрессировались с неизменно высокой относительной скоростью синтеза (ASP 5, 8 и 15).

Ранее были описаны стресс-индуцированные полипептиды с молекулярной массой менее 14 кДа. Таким образом, мы искали белки, индуцированные кислотой, используя прерывистый SDS-PAGE в качестве второго измерения. Как видно на рис. 4, эти гели были способны эффективно разделять полипептиды в диапазоне от 2,5 до 14,4 кДа. В этих гелях было обнаружено пять дополнительных ASPs (ASPs с 47 по 51). ASPs 50 и 51, в частности, не обнаруживаются на контрольных гелях и соответствуют неосинтезированным белкам в ответ на умеренный кислотный стресс.

Факторы индукции изменялись в зависимости от времени, как показано на рис. 5. Это дает дополнительные доказательства ранней, преходящей, поздней или постоянной природы белков, индуцируемых кислотой. Как показано на электрофореграммах, большинство клеточных белков были подавлены, в то время как некоторые остались неизмененными (два примера проиллюстрированы на рис. 3 и 5).

Анализ ASPs. Из обнаруженных ASPs пять принадлежали к разным классам по степени индукции и были хорошо различимы на гелях, окрашенных Кумасси синим. Затем они были подвергнуты N-концевому секвенированию. Были проверены базы данных и выявлены гомологии с известными белками. Результаты идентификации пяти белков представлены в таблице 1.

Таблица 1. Секвенированные белки кислотного шока P. Freudenreichii

Характеристика ASPs P. freudenreichii				Наиболее близкая характеристика белка
ASP no.	N-концевая последовательность	pIa	Молекулярная масса (кДа)α	Белок	Микро-организм	% иден-тичности	Номер записи в базе данныхb
8	AKEIEFDEE	4,5	67	GroEL	B. subtilis	78	owl/D1092
49	ATDIKXLEDRVL	4,6	11	GroES	M. bovis	60	sw/P15020
5	QIPEPISLXXDS	4,4	79	RecR	B. subtilis	67	owl/P24277
11	NERDSNER	5,4	64	RepB	L. lactis	88	owl/U90222
47	MKLKVTV	4,9	12	BCCP	P.freudenreichii	100	owl/P02904

Было показано, что ASP 8 гомологичен белку-шаперону GroEL из Bacillus subtilis (42), а также демонстрирует гомологии с 60-кДа шаперонинами из различных видов бактерий. Аналогично, ASP 49 показал гомологии с шаперонином GroES из Mycobacterium bovis (46) и с рядом 10-кДа шаперонинов как бактериального, так и эукариотического происхождения. Более того, ASP 8 и 49 имели молекулярные массы (67 и 11 кДа, соответственно) и изоэлектрические точки (4,5 и 4,6, соответственно), согласующиеся с данными, полученными для системы GroE из B. subtilis (39) и E. coli (43).

ASP 5 обнаружил гомологии с белком RecR, участвующим в репарации ДНК и генетической рекомбинации в B. subtilis (1), а ASP 11 был гомологичен кодируемому плазмидой L. lactis белку репликации RepB (40).

ASP 47 показал 100% идентичность с белком-переносчиком карбоксила биотина (BCCP), биотином, содержащим субъединицу карбоксильного носителя 1,3S, содержащуюся в транскарбоксилазе P. freudenreichii (28).

ОБСУЖДЕНИЕ

У P. freudenreichii мы продемонстрировали очень эффективный механизм ATR как в богатых, так и в химически определенных средах. ATR у адаптированных клеток обеспечивает защиту при pH до 2,0 без смертности, в отличие от неадаптированных клеток. Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе этого явления, в этой работе мы оценили изменения в морфологии и синтезе белка во время развития ATR.

Рис. 3. Двумерный анализ экспрессии белков во время кислотной адаптации у P. freudenreichii SI41. Синтез белка отслеживали в течение 60 мин адаптации к рН 5. Клетки импульсно мечены между 0 и 15 мин (B), 15 и 30 мин (C), 30 и 45 мин (D) или 45 и 60 мин (E) адаптации. В качестве контроля необработанные клетки мечены при pH 7 в течение 15 мин (A). Экстракты белков целых клеток анализировали методом двумерного электрофореза с последующей авторадиографией. Стрелками отмечены полипептиды, демонстрирующие повышенную относительную скорость синтеза во время кислотной адаптации по сравнению с неадаптированными клетками. Также показаны два полипептида с неизменной (○) и пониженной (□) относительной скоростью синтеза.

Рис. 4. Двумерный анализ экспрессии малых полипептидов в процессе кислотной адаптации у P. freudenreichii SI41. Белковые экстракты готовили, как описано в легенде к рис. 3, и проводили двумерный электрофорез в прерывистых Трис-Трициновых гелях во втором измерении. Стрелками отмечены полипептиды, скорость синтеза которых при кислотной адаптации (B) увеличивается по сравнению с неадаптированными клетками (А).

Было показано, что клетки P. freudenreichii, подвергшиеся воздействию экстремальной кислотной среды, претерпевают резкие изменения в морфологии, а их жизнеспособность снижается. В отличие от этого, у адаптированных бактерий целостность клеток сохранялась, а жизнеспособность не страдала. Это указывает на то, что бактерии, предварительно подвергшиеся воздействию сублетальной среды, могут адаптироваться и сохранять нормальную форму во время испытания. Стресс-индуцированные морфологические изменения у неспорообразующих бактерий были описаны ранее. Усадка клеток E. coli, возникающая в результате индукции морфогена bolA, принадлежащего к регулятору rpoS, запускается при переходе в стационарную фазу и различных стрессах, включая низкий pH (37). Аналогичным образом изменения морфологии клеток грамположительного организма E. faecalis вызваны стресс-индуцированными изменениями транскрипции многих генов (9).

Сообщалось, что ATR связана с сопутствующей модификацией синтеза белка. Однако ингибирование синтеза ASPs не отменяло ATR во всех исследованиях. Ингибирование неосинтеза белка хлорамфениколом отменяло ATR у L. monocytogenes (4), у A. hydrophila (18) и у энтеробактерий S. enterica serovar Typhimurium и E. coli (7, 36). В отличие от этого, он не оказывает влияния на кислотную адаптацию у L. lactis subsp. lactis (13) и E. faecalis (5). У L. acidophilus блокирование синтеза белка снижало ATR во время адаптации при рН 5, но не влияло на ATR, развивающуюся при рН 4,2 (21). У P. freudenreichii мы показали, что хлорамфеникол снижал ATR, что указывает на важную роль ASPs. Однако это снижение не было полным, что позволяет предположить, что в этой Propionibacterium сосуществуют как индуцибельная предсуществующая система, так и механизм, зависящий от синтеза белка de novo, и что они вместе обеспечивают максимальную защиту от экстремального кислотного стресса, как это было предложено для L. acidophilus (21).

Анализ ASPs показал, что в ходе ATR у P. freudenreichii индуцируются белки общего стрессового ответа, свидетельствующие о повреждении макромолекул. Действительно, ASPs 8 и 49 показали гомологию с высококонсервативными шаперонинами GroEL и GroES. Эти белки теплового шока также индуцируются при кислотном стрессе у E. coli (16), L. lactis (13) и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (20). Сходные уровни и кинетика индукции этих шаперонинов согласуются с предыдущим сообщением о том, что они принадлежат к одному оперону, находящемуся под контролем регуляторного агента CIRCE (controlling inverted repeat for chaperone expression) у B. subtilis (14). ASPs 5 и 11 показали гомологии с белками, участвующими в синтезе или репарации ДНК (RecR и RepB). Было показано, что эти белки, принадлежащие к регулону SOS, индуцируются мутагенными агентами, голоданием и переходом в стационарную фазу (44). Действительно, большинство стрессов, вызывающих остановку роста, могут быть ответственны за окислительный стресс, по крайней мере у E. coli (29).

ASP 47 был однозначно идентифицирован как BCCP P. freudenreichii (28). Этот 12-кДа полипептид является частью мультимерной (30 субъединиц) транскарбоксилазы, отвечающей за декарбоксилирование метилмалонил-коэнзима А и карбоксилирование пирувата - метаболическую реакцию, специфичную для пропионибактерий (15). Примечательно, что этот белок-переносчик карбоксилов лабилен в кислых условиях (28). Глутаматные, лизиновые и аргининовые декарбоксилазы являются ключевыми участниками гомеостаза рН в энтеробактериях (2). Поскольку глутамат является наиболее распространенной внутриклеточной свободной аминокислотой у P. freudenreichii (35), а BCCP - очень распространенный полипептид, необходимо исследовать такую важную роль биотинсодержащего белка-переносчика карбоксилов в адаптационном ответе P. freudenreichii на кислую среду.

В заключение следует отметить, что была разработана химически определенная среда и адаптирован метод двумерного электрофореза для мониторинга синтеза белков в P. freudenreichii. Это позволило провести кинетическое исследование как общих, так и специфических стрессовых белков в процессе кислотной адаптации этой бактерии. Настоящая работа представляет собой первое представление о механизмах, приводящих к эффективной кислотной толерантности у молочных пропионибактерий. Более того, она позволит провести протеомное исследование других стрессов, что должно привести к характеристике стрессовых регуляторов у P. freudenreichii.

Рис. 5. Изменения факторов индукции в ходе кислотной адаптации. Для каждого кислотно-индуцируемого полипептида определяли коэффициент индукции (определяемый как отношение между относительными скоростями синтеза в адаптированных и контрольных клетках) на 15, 30, 45 и 60 мин адаптации. Результаты представлены для ASPs 5 (♦), 8 (●), 11 (▲) и 47 (■), а также для неизмененных (○) и репрессированных (□) полипептидов, указанных на рис. 3.

Литература

1. Alonso, J. C., K. Shirahige, and N. Ogasawara. 1990. Molecular cloning, genetic characterization, and DNA sequence analysis of the recM region of Bacillus subtilis. Nucleic Acids Res. 18:6771–6777.
2. Bearson, S., B. Bearson, and J. W. Foster. 1997. Acid stress responses in enterobacteria. FEMS Microbiol. Lett. 147:173–180.
3. Bougle, D., N. Roland, F. Lebeurrier, and P. Arhan. 1999. Effect of propionibacteria supplementation on fecal bifidobacteria and segmental colonic transit time in healthy human subjects. Scand. J. Gastroenterol. 34:144–148.
4. Davis, J. M., P. J. Coote, and C. P. O’Byrne. 1996. Acid tolerance in Listeria monocytogenes: the adaptive acid tolerance response (ATR) and growth-phase-dependent acid resistance. Microbiology 142:2975–2982.
5. Flahaut, S. 1996. Incidences physiologiques et biochimiques de differents stress chez Enterococcus faecalis ATCC 19433. Ph.D. thesis. University of Caen, Caen, France.
6. Flahaut, S., A. Hartke, J. C. Giard, A. Benachour, P. Boutibonnes, and Y. Auffray. 1996. Relationship between stress response toward bile salts, acid and heat treatment in Enterococcus faecalis. FEMS Microbiol. Lett. 138:49–54.
7. Foster, J. W. 1993. The acid tolerance response of Salmonella typhimurium involves transient synthesis of key acid shock proteins. J. Bacteriol. 175: 1981–1987.
8. Gardiner, G., R. P. Ross, J. K. Collins, G. Fitzgerald, and C. Stanton. 1998. Development of a probiotic cheddar cheese containing human-derived Lactobacillus paracasei strains. Appl. Environ. Microbiol. 64:2192–2199.
9. Giard, J. C., A. Rince, H. Capiaux, Y. Auffray, and A. Hartke. 2000. Inactivation of the stress- and starvation-inducible gls24 operon has a pleiotrophic effect on cell morphology, stress sensitivity, and gene expression in Enterococcus faecalis. J. Bacteriol. 182:4512–4520.
10. Goldin, B. R., and S. L. Gorbach. 1992. Probiotics for humans, p. 355–376. In R. Fuller (ed.), Probiotics, the scientific basis. Chapman & Hall, London, United Kingdom.
11. Go¨rg, A., W. Postel, and S. Gunther. 1988. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 9: 531–546.
12. Hamilton, I. R., and N. D. Buckley. 1991. Adaptation by Streptococcus mutans to acid tolerance. Oral Microbiol. Immunol. 6:65–71.
13. Hartke, A., S. Bouch´e, J. C. Giard, A. Benachour, P. Boutibonnes, and Y. Auffray. 1996. The lactic acid stress response of Lactococcus lactis subsp. lactis. Curr. Microbiol. 33:194–199.
14. Hecker, M., W. Schumann, and U. Volker. 1996. Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 19:417–428.
15. Hettinga, D. H., and G. W. Reinbold. 1972. The propionic acid bacteria—a review. II. Metabolism. J. Milk Food Technol. 35:358–372.
16. Heyde, M., and R. Portalier. 1990. Acid shock proteins of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 57:19–26.
17. Jan, G., A. Rouault, and J. L. Maubois. 2000. Acid stress susceptibility and acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Lait 80: 325–336.
18. Karem, K. L., J. W. Foster, and A. K. Bej. 1994. Adaptive acid tolerance response (ATR) in Aeromonas hydrophila. Microbiology 140:1731–1736.
19. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680–685.
20. Lim, E. M., S. D. Ehrlich, and E. Maguin. 2000. Identification of stress-inducible proteins in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Electrophoresis 21:2557–2561.
21. Lorca, G. L., R. R. Raya, M. P. Taranto, and G. F. De Valdez. 1998. Adaptative acid tolerance response in Lactobacillus acidophilus. Biotechnol. Lett. 20:239–241.
22. Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr, and R. J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265–275.
23. Lyon, W. J., J. K. Sethi, and B. A. Glatz. 1993. Inhibition of psychrotrophic organisms by propionicin PLG-1, a bacteriocin produced by Propionibacterium thoenii. J. Dairy Sci. 76:1506–1513.
24. Malik, A. C., G. W. Reinbold, and E. R. Vedamuthu. 1968. An evaluation of the taxonomy of Propionibacterium. Can. J. Microbiol. 14:1185–1191.
25. Mantere-Alhonene, S. 1995. Propionibacteria used as probiotics—a review. Lait 75:447–452.
26. Matsudaira, P. 1987. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. J. Biol. Chem. 262: 10035–10038.
27. Mooney, C., D. J. Munster, P. F. Bagshaw, and R. A. Allardyce. 1990. Helicobacter pylori acid resistance. Lancet 335:1232.
28. Murtif, V. L., C. R. Bahler, and D. Samols. 1985. Cloning and expression of the 1.3S biotin-containing subunit of transcarboxylase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5617–5621.
29. Nystrom, T. 1999. Starvation, cessation of growth and bacterial aging. Curr. Opin. Microbiol. 2:214–219.
30. Ozadali, F., B. A. Glatz, and C. E. Glatz. 1996. Fed-batch fermentation with and without on-line extraction for propionic and acetic acid production by Propionibacterium acidipropionici. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:710–716.
31. Pearson, W. R., and D. J. Lipman. 1988. Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444–2448.
32. Pryor, J. L., W. Xu, and D. W. Hamilton. 1992. Immunodetection after complete destaining of Coomassie blue-stained proteins on Immobilon-PVDF. Anal. Biochem. 202:100–104.
33. Rabilloud, T. 1998. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 19:758–760.
34. Rehberger, J. L., and B. A. Glatz. 1998. Response of cultures of Propionibacterium to acid and low pH: tolerance and inhibition. J. Food Prot. 61:211–216.
35. Rolin, D. B., F. Girard, J. D. de Certaines, and P. Boyaval. 1995. ¹³C-NMR study of lactate metabolism in Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:210–217.
36. Rowbury, R. J., and M. Goodson. 1993. PhoE porin of Escherichia coli and phosphate reversal of acid damage and killing and of acid induction of the CadA gene product. J. Appl. Bacteriol. 74:652–661.
37. Santos, J. M., P. Freire, M. Vicente, and C. M. Arraiano. 1999. The stationary-phase morphogene bolA from Escherichia coli is induced by stress during early stages of growth. Mol. Microbiol. 32:789–798.
38. Scha¨gger, H., and G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166:368–379.
39. Schmidt, A., M. Schiesswohl, U. Vo¨lker, M. Hecker, and W. Schumann. 1992. Cloning, sequencing, mapping, and transcriptional analysis of the groESL operon from Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 174:3993–3999.
40. Schouler, C., F. Clier, A. L. Lerayer, S. D. Ehrlich, and M.-C. Chopin. 1998. A type IC restriction-modification system in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 180:407–411.
41. Segal, G., and E. Z. Ron. 1998. Regulation of heat-shock response in bacteria. Ann. N. Y. Acad. Sci. 851:147–151.
42. Tozawa, Y., H. Yoshikawa, F. Kawamura, M. Itaya, and H. Takahashi. 1992. Isolation and characterization of the groES and groEL genes of Bacillus subtilis Marburg. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:1995–2002.
43. VanBogelen, R. A., P. Sankar, R. L. Clark, J. A. Bogan, and F. C. Neidhardt. 1992. The gene-protein database of Escherichia coli: edition 5. Electrophoresis 13:1014–1054.
44. Villarroya, M., I. Perez-Roger, F. Macian, and M. E. Armengod. 1998. Stationary phase induction of dnaN and recF, two genes of Escherichia coli involved in DNA replication and repair. EMBO J. 17:1829–1837.
45. Wong, H.-C., P.-Y. Peng, J.-M. Han, C.-Y. Chang, and S.-L. Lan. 1998. Effect of mild acid treatment on the survival, enteropathogenicity, and protein production in Vibrio parahaemolyticus. Infect. Immun. 66:3066–3071.
46. Yamaguchi, R., K. Matsuo, A. Yamazaki, S. Nagai, K. Terasaka, and T. Yamada. 1988. Immunogenic protein MPB57 from Mycobacterium bovis BCG: molecular cloning, nucleotide sequence and expression. FEBS Lett. 240:115–117.

См. дополнительно:

• Сыр Эмменталь усиливает стрессоустойчивость пропионибактерий P. freudenreichii

• Устойчивость пропионовокислых бактерий к поваренной соли

Будьте здоровы!