Кишечная микробиота, болезнь Гиршпрунга и Гиршпрунг-ассоциированный энтероколит

Болезнь Гиршпрунга и кишечный микробиом

Кишечная микробиота, болезнь Гиршпрунга и Гиршпрунг-ассоциированный энтероколит

Резюме

Гиршпрунг-ассоциированный энтероколит (ГАЭК или англ. HAEC) является наиболее распространенным и серьезным осложнением болезни Гиршпрунга (БГ), имеющим летальность 1-10%. Несмотря на многие предполагаемые этиологии, патологические механизмы, лежащие в основе ГАЭК, все еще неясны. Специфические бактериальные или вирусные инфекции относятся к числу ключевых факторов, которые следует учитывать. Изучение кишечной флоры, связанной с ГАЭК, было ограничено тем фактом, что 85% кишечной микробиоты не могут быть культивированы. Разработки современных платформ секвенирования следующего поколения и методологии метагеномики позволили с большой точностью изучить и охарактеризовать кишечную микробиоту у детей с болезнью Гиршпрунга. В данной статье рассматривается прогресс в изучении болезни Гиршпрунга и кишечной микробиоты у пациентов с энтероколитом и без него.

Введение в болезнь Гиршпрунга

Болезнь Гиршпрунга (БГ), также известная как врожденный мегаколон или аганглионоз, была впервые описана и названа Харальдом Гиршпрунгом (Harald Hirschsprung) в 1886 году. Болезнь Гиршпрунга - это расстройство развития кишечной нервной системы, которое поражает приблизительно 1 из 5000 живорожденных младенцев. Это заболевание характеризуется отсутствием ганглиозных клеток в миентериальных и подслизистых сплетениях дистального отдела кишечника, что приводит к отсутствию перистальтики и функциональной кишечной непроходимости. В большинстве случаев аганглионоз вовлекает прямую кишку или ректосигмоид (участок толстой кишки в месте перехода сигмовидной ободочной кишки в прямую – ред.), но он может распространяться на различные длины, и в 5-10% случаев может вовлекать всю толстую кишку или даже значительное количество тонкой кишки. Основным методом лечения болезни Гиршпрунга является хирургическое вмешательство, включающее резекцию аганглионарной кишки и реконструкцию [1]. Гиршпрунг-ассоциированный энтероколит (ГАЭК) проявляется воспалением кишечника, которое клинически характеризуется лихорадкой, вздутием живота, диареей и сепсисом. Смертность от ГАЭК по-прежнему достигает 1-10% [2,3]. Несмотря на многие предложенные этиологии, биологические механизмы, лежащие в основе ГАЭК, плохо изучены [4]. ГАЭК имеет значительную заболеваемость и потенциальную смертность в популяции пациентов и остается наиболее распространенной причиной смерти у детей с БГ. ГАЭК имеет зарегистрированную частоту встречаемости 17% или даже более 40% в течение послеоперационного курса после процедуры вытягивания. Этот показатель может достигать 55% у пациентов с тотальным аганглионозом толстой кишки [5-8].

Рис. 1. Изменения в кишечнике при болезни Гиршпрунга и Гиршпрунг-ассоциированном энтероколите на мышиной модели (адаптировано из Jaan-Olle Andressoo et al. Gfra1 Underexpression Causes Hirschsprung’s Disease and Associated Enterocolitis in Mice / Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. Volume 7, Issue 3, 2019)

В настоящее время патогенез ГАЭК до сих пор остается неясным. Недавние исследования показали, что повреждение слизистого барьера кишечника, аномальные иммунные реакции в кишечном тракте и инфекции, вызванные специфическими патогенами, могут играть решающую роль в патогенезе ГАЭК [9]. Кишечные патогены могут проникать в кровоток через поврежденный слизистый барьер кишечника и затем индуцировать водопадоподобную воспалительную реакцию [10]. Кроме того, гистологические и иммунологические исследования показывают, что персистирующее воспаление и снижение иммунной функции присутствуют в кишечном тракте детей с рецидивирующим ГАЭК [11]. В соответствии с патогенезом воспалительных заболеваний кишечника кишечная флора также может играть ключевую роль в патогенезе и развитии ГАЭК [12,13].

Поиск микробного виновника

До сих пор конкретные патогены, участвующие в развитии ГАЭК, не были обнаружены. Несколько исследований показали, что не только увеличение Clostridium difficile и ротавируса, но и снижение бифидобактерий и лактобацилл может играть определенную роль в патогенезе ГАЭК. В 1982 году Thomas et al., впервые сообщили о повышении уровня токсина C. difficile в 4 случаях среди 6 пациентов с ГАЭК [14]. В 1986 году Thomas et al. установлено, что 54% младенцев с ГАЭК были положительны на цитопатический токсин в стуле. С. difficile был выделен у 18% и 30% пациентов из групп только с БГ и без БГ соответственно. Напротив, C. difficile был выделен из 77% младенцев в группе ГАЭК. Thomas et al. также было замечено, что лечение ванкомицином было полезно для 63% пациентов с ГАЭК. В согласии с этим наблюдением Parsons et al. также сообщалось о большем количестве C. difficile и более высоком уровне токсина в кишечном содержимом новорожденных с ГАЭК [15]. Однако Rietra and Slaterus [16] подчеркнули, что C. difficile и секретируемый токсин также были обнаружены в образцах 90% здоровых новорожденных. Эти результаты позволили предположить, что патогенный вид C. difficile не может быть единственным решающим детерминантом ГАЭК. В 1990 году Wilson-Storey et al. выявлен ротавирус в образцах от 77% детей с ГАЭК, что свидетельствует о решающей роли ротавируса в патогенезе ГАЭК [17]. Они также предположили, что ГАЭК определяется множеством факторов, включая инфекции и секрецию IgA. Поскольку человеческий кишечный секреторный иммуноглобулин (SIgA) является важным компонентом иммунной защиты от инфекции, нарушение секреции IgA может привести к вторичной ротавирусной инфекции.

Однако из-за сложности кишечной микробиоты исследования, связанные с патогенезом, столкнулись с многочисленными проблемами. Как правило, регулярное микроскопическое исследование не позволяет определить состояние кишечной флоры и точно определить вид и количество бактерий. Кроме того, на методологию легко влияют субъективные факторы. Хотя как разнообразие микробиоты, так и относительное обилие могут быть определены с помощью метода подсчета колоний, в настоящее время широко признано, что специфический отбор кишечных бактерий не может быть осуществлен в питательной среде. Кроме того, мы не можем подготовить свежие образцы и обеспечить строго анаэробную среду во время обработки образцов, учитывая, что не более 15% кишечных видов бактерий могут быть культивированы [18]. Поэтому эти два метода все еще недостаточны для всестороннего анализа кишечного микробиома.

В 2009 году исследование, основанное на ПЦР в реальном времени, показало более низкий уровень бифидобактерий и лактобацилл в кале детей с ГАЭК по сравнению с пациентами с БГ без энтероколита. Кроме того, количество этих бактерий у пациентов с БГ без энтероколита было сходным с таковым у здоровых детей соответствующего возраста. Эти данные свидетельствуют о том, что низкие уровни бифидобактерий и лактобацилл могут быть непосредственно коррелированы с возникновением ГАЭК [19].

В 2010 году в исследовании микробиоты ГАЭК был внедрен новый метод - анализ рестрикции амплифицированной рибосомной ДНК (ARDRA). Де Филиппотуа и его коллеги проанализировали 15 образцов стула 3-летнего пациента с ГАЭК, которые были взяты во время эпизодов ГАЭК и фаз ремиссии. Они обнаружили, что частота ГАЭК коррелировала со специфическим характером распределения кишечных бактерий и зависела от приема антибиотиков [20]. Авторы также предположили, что omics-технология, как эффективный инструмент, может быть использована для анализа повторяющихся эпизодов ГАЭК.

Обещания современных методов секвенирования

Недавнее развитие высокопроизводительных методов секвенирования обеспечивает новый подход к изучению микрофлоры кишечника [21,22]. Высокопроизводительное секвенирование, также известное как технология «секвенирования следующего поколения», концептуально представляет собой метод «секвенирования синтезом» с возможностью одновременного определения последовательностей большого количества ДНК с общей длиной считывания от десятков до сотен пар оснований. Например, один запуск на машине Illumina MiSeq производит почти 25 миллионов последовательностей с длиной считывания 2×300 bp. В обычном методе бактериальный изолят культивируют с последующей вставкой ДНК или кДНК в клонирующий вектор и секвенированием. Однако для высокопроизводительного секвенирования общая бактериальная ДНК (метагеномный подход) или РНК (метатранскриптомный подход) могут быть непосредственно извлечены из образца окружающей среды и секвенированы, избегая этапов культивирования и клонирования. Эти результаты секвенирования не только содержат информацию о некультивируемых микроорганизмах, но и отражают объективную структуру сообщества в реальном времени и дают представление о функциональных возможностях сообщества [23-27]. Таким образом, с помощью высокопроизводительного секвенирования исследователи получили прямой и минимально искаженный доступ к физиологически активным микробным сообществам и создали огромный объем информации о генетическом разнообразии и молекулярной экологии кишечной флоры. В настоящее время в исследованиях желудочно-кишечного тракта широко применяется высокопроизводительное секвенирование в сочетании с метагеномной методологией. Метагеномная методология особенно продуктивна при изучении младенцев и новорожденных из-за относительной простоты неонатальной микробиоты [28-31]. Первоначально сообщалось, что в кишечнике новорожденного в первые несколько недель после рождения находится менее 20 родов бактерий [32-34]. Современные данные согласуются с величиной этой оценки [28-31]. Например, только 16 полных или почти полных бактериальных геномов были собраны из 9 образцов кала, взятых у недоношенного ребенка на третьей неделе жизни [29]. Упрощенная природа неонатальной микробиоты очень благоприятна для метагеномного анализа. Следовательно, всестороннее и точное понимание этиологии ГАЭК представляется вполне достижимым с помощью исследований, основанных на секвенировании следующего поколения.

От одного микроорганизма к микробным сообществам в ГАЭК

В 2012 году в Университете Вайоминга (США) была сконструирована и успешно эксплуатируется модель мышиного БГ и ГАЭК. Эта модель была основана на линии нокаута эндотелинового рецептора типа В (Ednrb^−/−). Впервые секвенирование следующего поколения (454 пиросеквенирование) было использовано для оценки кишечной флоры в модели ГАЭК с использованием образцов толстой кишки Ednrb^−/− мышей через 7, 20 и 24 дня жизни. В кишечном тракте Ednrb^−/− мышей наблюдалось увеличение представителей типа Bacteroidetes и уменьшение Firmicutes по сравнению с животными дикого типа. Более того, эта вариабельность микробного состава зависела от возраста, что указывает на корреляцию между особенностями микрофлоры кишечника в раннем постнатальном периоде и патогенезом ГАЭК [35].

Наша группа использовала высокопроизводительное секвенирование Illumina-MiSeq для изучения кишечной микрофлоры в клинических образцах пациентов с ГАЭК [36]. Исследуемая когорта состояла из 4 пациентов: 2 с ГАЭК (2 мальчика в возрасте 2 и 6 месяцев) и 2 пациентов с БГ (1 девочка в возрасте 7 месяцев и 1 мальчик в возрасте 12 месяцев). Всего было собрано 13 образцов для дальнейшего изучения [36]. Результаты секвенирования генов 16S рРНК показали, что наибольшая доля (46%) среди кишечной флоры у новорожденных с БГ приходится на бактериоидеты (Bacteroidetes), за которыми следуют протеобактерии (Proteobacteria) (21%). Напротив, протеобактерии занимали наибольшую долю, 55% у пациентов с ГАЭК, за ними следовали Firmicutes (18%). Заметная разница наблюдалась между пациентами с ГАЭК и БГ на уровне рода. Энтеробактерии (Enterobacter) были наиболее распространенным родом у пациентов с ГАЭК (56%), за ними следовали роды Enterococcus (13%), Acinetobacter (6%) и Eukaryota (4%). Наибольший удельный вес в кишечном тракте новорожденных с БГ имели Bacteroides (47%), за ними следовали Enterobacteriaceae (24%) и Fusobacterium (4%). Было обнаружено, что семь родов являются уникальными для пациентов с ГАЭК, а 11-исключительно для пациентов с БГ. Эти результаты показали, что существует значительная разница в кишечной микробиоте между пациентами с ГАЭК и БГ. Таким образом, колонизация специфическим типом кишечной микробиоты может быть ответственна за развитие ГАЭК. Кроме того, не было обнаружено существенных различий в кишечной флоре дистального аганглионарного отдела кишечника и проксимального ганглионарного отдела кишечника, что указывает на то, что наличие или отсутствие ганглиозных клеток не является основным определяющим фактором в составе кишечной микробиоты. Микробное сообщество кишечника различалось у разных больных, что соответствовало транзиторной динамике микробиоты в пищеварительном тракте от новорожденных до двухлетних детей и взрослых. Однако из-за ограниченного количества образцов была использована только конструкция поперечного сечения исследования, в будущем необходимо провести продольное исследование с большим количеством образцов.

Вывод

ГАЭК является наиболее распространенным осложнением у пациентов с БГ и характеризуется повышенной смертностью и снижением качества жизни. Недавно было показано, что бактерии и вирусы участвуют в патогенезе ГЭК. Инфекция и колонизация специфическими кишечными бактериями могут быть вредны для кишечного барьера, микроокружения и иммунных реакций, приводя к рецидивирующему ГАЭК. Метагеномика, метатранскриптомика и таксономическое профилирование 16S рРНК дают исчерпывающие и точные данные, описывающие свойства кишечного микробиома. Таким образом, эта технология может быть использована в клинических исследованиях ГАЭК. Специфические кишечные микробиомы и временной ход развития кишечной микробиоты должны быть определены в разном возрасте у пациентов с ГАЭК. В свою очередь, определение роли кишечного микробиома в патогенезе ГАЭК может обеспечить новый терапевтический подход в лечении ГАЭК.

Дополнительно см.: 

Морозов Д.А., Пименова Е.С., Королёв Г.А. Гиршпрунг-ассоциированный энтероколит у детей. Вопросы практической педиатрии. 2019; 14(2): 35–42.(PDF).

Литература

1. Kenny SE, Tam PK, Garcia-Barcelo M (2010) Hirschsprung's disease. Semin Pediatr Surg 19: 194-200.
2. Pini Prato A, Rossi V, Avanzini S, Mattioli G, Disma N, et al. (2011) Hirschsprung's disease: what about mortality? Pediatr Surg Int 27: 473-478.
3. Suita S, Taguchi T, Ieiri S, Nakatsuji T (2005) Hirschsprung's disease in Japan: analysis of 3852 patients based on a nationwide survey in 30 years. J Pediatr Surg 40: 197-201.
4. Langer JC (2013) Hirschsprung disease. Curr Opin Pediatr 25: 368-374.
5. Elhalaby EA, Teitelbaum DH, Coran AG, Heidelberger KP (1995) Enterocolitis associated with Hirschsprung's disease: a clinical histopathological correlative study. J Pediatr Surg 30: 1023-1026.
6. Rescorla FJ, Morrison AM, Engles D, West KW, Grosfeld JL (1992) Hirschsprung's disease. Evaluation of mortality and long-term function in 260 cases. Arch Surg 127: 934-941.
7. Elhalaby EA, Coran AG, Blane CE, Hirschl RB, Teitelbaum DH (1995) Enterocolitis associated with Hirschsprung's disease: a clinicalradiological characterization based on 168 patients. J Pediatr Surg 30: 76-83.
8. Vieten D, Spicer R (2004) Enterocolitis complicating Hirschsprung's disease. Semin Pediatr Surg 13: 263-272.
9. Austin KM (2012) The pathogenesis of Hirschsprung's disease-associated enterocolitis. Semin Pediatr Surg 21: 319-327.
10. Frykman PK, Short SS (2012) Hirschsprung-associated enterocolitis: prevention and therapy. Semin Pediatr Surg 21: 328-335.
11. Moore SW, Sidler D, Zaahl MG (2008) The ITGB2 immunomodulatory gene (CD18), enterocolitis, and Hirschsprung's disease. J Pediatr Surg 43: 1439-1444.
12. Strober W, Fuss I, Mannon P (2007) The fundamental basis of inflammatory bowel disease. J Clin Invest 117: 514-521.
13. Thomas DF, Fernie DS, Malone M, Bayston R, Spitz L (1982) Association between Clostridium difficile and enterocolitis in Hirschsprung's disease. Lancet 1: 78-79.
14. Thomas DF, Fernie DS, Bayston R, Spitz L, Nixon HH (1986) Enterocolitis in Hirschsprung's disease: a controlled study of the etiologic role of Clostridium difficile. J Pediatr Surg 21: 22-25.
15. Parsons SJ, Fenton E, Dargaville P (2005) Clostridium difficile associated severe enterocolitis: a feature of Hirschsprung's disease in a neonate presenting late. J Paediatr Child Health 41: 689-690.
16. Rietra PJ, Slaterus KW, Zanen HC, Meuwissen SG (1978) Clostridial toxin in faeces of healthy infants. Lancet 2: 319.
17. Wilson-Storey D, Scobie WG, McGenity KG (1990) Microbiological studies of the enterocolitis of Hirschsprung's disease. Arch Dis Child 65: 1338-1339.
18. Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, et al. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308: 1635-1638.
19. Shen DH, Shi CR, Chen JJ, Yu SY, Wu Y, et al. (2009) Detection of intestinal bifidobacteria and lactobacilli in patients with Hirschsprung's disease associated enterocolitis. World J Pediatr 5: 201-205.
20. De Filippo C, Pini-Prato A, Mattioli G, Avanzini S, Rapuzzi G, et al. (2010) Genomics approach to the analysis of bacterial communities dynamics in Hirschsprung's disease-associated enterocolitis: a pilot study. Pediatr Surg Int 26: 465-471.
21. Karlsson F, Tremaroli V, Nielsen J, Bäckhed F (2013) Assessing the human gut microbiota in metabolic diseases. Diabetes 62: 3341-3349.
22. Dave M, Higgins PD, Middha S, Rioux KP (2012) The human gut microbiome: current knowledge, challenges, and future directions. Transl Res 160: 246-257.
23. Gevers D, Pop M, Schloss PD, Huttenhower C (2012) Bioinformatics for the Human Microbiome Project. PLoS Comput Biol 8: e1002779.
24. Hooper LV, Gordon JI (2001) Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science 292: 1115-1118.
25. Bäckhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, Peterson DA, Gordon JI (2005) Hostbacterial mutualism in the human intestine. Science 307: 1915-1920.
26. Turnbaugh PJ, Ley RE, Hamady M, Fraser-Liggett CM, Knight R, et al. (2007) The human microbiome project. Nature 449: 804-810.
27. Proctor LM (2011) The Human Microbiome Project in 2011 and beyond. Cell Host Microbe 10: 287-291.
28. Morowitz MJ, Denef VJ, Costello EK, Thomas BC, Poroyko V, et al. (2011) Strain-resolved community genomic analysis of gut microbial colonization in a premature infant. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 1128-1133.
29. Brown CT, Sharon I, Thomas BC, Castelle CJ, Morowitz MJ, et al. (2013) Genome resolved analysis of a premature infant gut microbial community reveals a Varibaculum cambriense genome and a shift towards fermentation-based metabolism during the third week of life. Microbiome 1: 30.
30. Costello EK, Carlisle EM, Bik EM, Morowitz MJ, Relman DA (2013) Microbiome assembly across multiple body sites in low-birthweight infants. MBio 4: e00782-00713.
31. Sharon I, Morowitz MJ, Thomas BC, Costello EK, Relman DA, et al. (2013) Time series community genomics analysis reveals rapid shifts in bacterial species, strains, and phage during infant gut colonization. Genome Res 23: 111-120.
32. Millar MR, Linton CJ, Cade A, Glancy D, Hall M, et al. (1996) Application of 16S rRNA gene PCR to study bowel flora of preterm infants with and without necrotizing enterocolitis. J Clin Microbiol 34: 2506-2510.
33. de la Cochetiere MF, Piloquet H, des Robert C, Darmaun D, Galmiche JP, et al. (2004) Early intestinal bacterial colonization and necrotizing enterocolitis in premature infants: the putative role of Clostridium. Pediatr Res 56: 366-370.
34. Mshvildadze M, Neu J, Shuster J, Theriaque D, Li N, et al. (2010) Intestinal microbial ecology in premature infants assessed with nonculture-based techniques. J Pediatr 156: 20-25.
35. Ward NL, Pieretti A, Dowd SE, Cox SB, Goldstein AM (2012) Intestinal aganglionosis is associated with early and sustained disruption of the colonic microbiome. Neurogastroenterol Motil 24: 874-874e400.
36. Yan Z, Poroyko V, Gu S, Zhang Z, Pan L, et al. (2014) Characterization of the intestinal microbiome of Hirschsprung's disease with and without enterocolitis. Biochem Biophys Res Commun 445: 269-274.