Фаготерапия в области гастроэнтерологии

Фаготерапия при желудочно-кишечных заболеваниях

Резюме

Микробиота желудочно-кишечного тракта играет ключевую роль в регуляции патогенеза ряда желудочно-кишечных заболеваний. В частности, вирусная фракция, состоящая в основном из бактериофагов, оказывает влияние на гомеостаз, оказывая селективное давление на бактериальные сообщества, обитающие в тракте. Воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта в основном индуцируются бактериями и усилились из-за появления устойчивых к антибиотикам штаммов. В отсутствие эффективных методов лечения фаготерапия была предложена в качестве клинической альтернативы для восстановления кишечного эубиоза, благодаря ее иммуномодулирующему и бактерицидному эффекту в отношении бактериальных патогенов, таких как Clostridioides difficile при язвенном колите и инвазивная адгезивная кишечная палочка при болезни Крона. Кроме того, генетически модифицированные умеренные фаги могут быть использованы для подавления транскрипции факторов бактериальной вирулентности. В этом обзоре мы остановимся на последних достижениях исследований в этой области, а также на клинических испытаниях, основанных на фаготерапии в области гастроэнтерологии.

1. Введение

В человеческом теле обитает сложный консорциум микроорганизмов, состоящий из вирусов, бактерий, архей, грибов и простейших. Эти сообщества выполняют важные функции, которые сильно влияют на наше здоровье, в том числе укрепляют нашу иммунную систему, обеспечивают защиту от патогенов или даже помогают нам переваривать пищу [1,2]. В вирусной фракции, образующей микробиом, называемой виромом, преобладают бактериофаги [3]. Обычно называемые фагами, это вирусы, которые инфицируют бактерии и играют решающую роль в формировании бактериальных сообществ в большинстве сред. Интересно, что фаги являются наиболее многочисленными существами на Земле, представляющими основной источник биоразнообразия [4]. Как правило, фаги могут реплицироваться посредством литических, лизогенных, хронических или псевдолизогенных циклов. Как только вирион узнает клетку-хозяин, белок, связывающий рецептор фага, запускает встраивание собственного генома в клетку. Для литических или вирулентных фагов репликация генома фага сопровождается его сборкой в ​​фаговые частицы и лизисом хозяина для высвобождения потомства. Лизогенные циклы возникают, когда геном фага интегрируется в хромосому хозяина. Интегрированные геномы фагов называются профагами, а бактерии, которые их содержат, - лизогенами [4]. Встраивая свой геном в бактерию, эти умеренные фаги могут вызывать изменение фенотипа клетки-хозяина, обеспечивая преимущества за счет переноса генов, который улучшает вирулентность хозяина и устойчивость к иммунной защите, процесс, называемый лизогенной конверсией. В дополнение к этим классическим циклам в качестве альтернативных путей были предложены хронический цикл и псевдолизогения. При хроническом цикле фаг реплицируется, и вирионы производятся, не убивая своего хозяина. Псевдолизогенез - это стадия, на которой геном фага не размножается (как в литическом пути), не реплицируется синхронно и стабильно в течение клеточного цикла (как в лизогенном пути), но остается внутри хозяина как эписома, независимая из генома хозяина [5].

После их открытия столетие назад фаги с самого начала использовались в качестве терапевтических инструментов. Несмотря на успех первых испытаний, проведенных Феликсом д'Эрелем в 1921 году на пациентах с дизентерией [6], фаговая терапия вызвала большие споры и не получила широкого признания. Параллельно с этим открытие антибиотиков в 1930-х годах еще больше уменьшило энтузиазм в отношении фаготерапии в западных странах, снизившись до нескольких стран Восточной Европы. Кроме того, отсутствие законодательного регулирования, связанное со слабым интересом фармацевтической промышленности, приводит к тому, что в Европе и США не так много коммерческих фаговых препаратов для клинического использования. Однако Институт бактериофагов, микробиологии и вирусологии Элиава (Грузия), основанный в 1923 г., считается ведущей организацией в области исследования фагов, производства фаговых препаратов и их практического применения. К сожалению, эти методы лечения еще не регламентированы в западных странах, хотя в настоящее время они используются в качестве сострадательного лечения. Интересно, что клинические испытания растут во всем мире, и в дополнение к сострадательному использованию фагов обнадеживающие результаты способствуют развитию фаготерапии как реальной альтернативы борьбе с патогенными бактериями [7]. Регулирование использования фагов в качестве терапии включает строго литические фаги против возбудителя-мишени [8]. Таким образом, умеренные фаги обычно не рекомендуются из-за потенциального приобретения патогенных признаков или детерминант устойчивости к антибиотикам посредством горизонтального переноса генов [9]. Однако достижения в области генной инженерии предполагают возможное терапевтическое использование генетически модифицированных умеренных фагов для подавления транскрипции факторов бактериальной вирулентности [10].

В последнее десятилетие, благодаря достижениям в метагеномике и большей общественной осведомленности о значении кишечной микробиоты для благополучия человека, интерес к исследованиям кишечного фагома (фагового компонента вирома) вызвали интерес [3]. Было замечено, что сосуществование бактерий и резидентных фагов способствует сохранению гомеостаза в организме [11]. Кишечные фаги играют важную роль в формировании микробиома, а также взаимодействуют с иммунной системой человека, создавая баланс между здоровьем и болезнью. При дисбактериозе изменение микробиоты может привести к патофизиологическим процессам, таким как воспаление и активация иммунной системы. Дисбиоз желудочно-кишечного тракта приводит, главным образом, к болезни Крона (БК) и язвенному колиту (ЯК), хроническим рецидивирующим воспалительным заболеваниям кишечника, опосредованным нерегулируемыми иммунными ответами на резидентную микробиоту [12]. Это многофакторные заболевания, обусловленные генетическими факторами и факторами риска окружающей среды, включая микроорганизмы, обитающие в кишечнике [13]. В условиях дисбактериоза изменяется микробиом, что приводит к уменьшению количества симбиотических видов и / или увеличению количества патогенных [14]. Существующие подходы к регулированию кишечного микробиома включают диетические изменения и антибиотики [15]. Однако лечение антибиотиками становится менее эффективным из-за появления бактерий с множественной лекарственной устойчивостью. Текущая ситуация требует срочного внедрения новых терапевтических стратегий против инфекционных заболеваний, что сделало фаговую терапию интересной альтернативой. В гастроэнтерологии фаги в основном исследуются как многообещающие инструменты при инфекционных заболеваниях, включая холеру, и тестируются против колита Clostridioides difficile и искоренения адгезивной инвазивной кишечной палочки (AIEC) при БК [16,17]. Цель этого обзора - проанализировать последние научные достижения в области фаговой терапии в области гастроэнтерологии, подчеркнув ее важность как терапевтического инструмента [18].

2. Роль фагов в желудочно-кишечном тракте человека

Вирусный компонент микробиома человека мало изучен по сравнению с бактериальным [19]. Кишечный виром человека соответствует популяции вирусов, связанных с кишечным микробным сообществом. В связи с высоким преобладанием бактерий в кишечнике кишечный виром в основном заселяется фагами [3]. Классически анализ на основе секвенирования предполагал, что кишечный виром в основном состоит из фагов с одноцепочечной ДНК (оцДНК), в основном из семейства Microviridae, и фагов с двухцепочечной ДНК (дцДНК) порядка Caudovirales (особенно из семейств Myoviridae, Podoviridae и Siphoviridae). В 2014 году метагеномные исследования идентифицировали геном дцДНК-фага, названный крассфагом - crAssphage (crAss - кросс-сборка), как основную фракцию микробиоты кишечника. В настоящее время crAss-подобные фаги выявляются примерно у 50% людей в конкретных популяциях человека и составляют до 90% от общей вирусной ДНК-нагрузки в кале, поскольку это самый распространенный вид фагов в кишечнике [20].

2.1. Фаги и дисбактериоз кишечника

Большинство фагов в кишечнике человека являются умеренными, что говорит о том, что кишечный микробиом довольно стабилен в желудочно-кишечном тракте. Эта идея привела к созданию глобального кишечного фагома, показывающего корреляцию между фагами и состоянием здоровья, а также его роль в поддержании структуры и функции кишечного микробиома [21]. Эта стабильность позволяет поддерживать другие микроорганизмы кишечной микробиоты [22]. Интересно, что распространенность здорового кишечного фагома была обнаружена значительно измененной у пациентов с ЯК и БК. Богатство бактериофагов, измеряемое количеством таксонов в образце, было выше у пациентов, перенесших эти заболевания, в то время как бактериальное богатство одновременно уменьшалось [13].

Воспаленный кишечник связан с SOS-реакцией, регулируемой увеличением числа резидентных кишечных патогенных бактерий, потерей разнообразия фагов и индукцией профагов. Некоторые условия окружающей среды вызывают реакцию на бактериальный стресс SOS, например ультрафиолетовое излучение, лекарственные препараты или антибиотики [23]. В качестве наглядного примера можно привести то, что большинство перорально вводимых антибиотиков изменяют микробиоту кишечника, способствуя дисбактериозу (Рис.1) [24].

Рисунок 1. Антибиотик-ассоциированный дисбактериоз кишечника.

Фаги могут вносить свой вклад в качестве векторов для горизонтального переноса генов. Высокая индукция профагов во время воспаления способствует горизонтальному механизму переноса генов среди его бактериальных хозяев, что увеличивает скорость генетической рекомбинации и диверсификации. Этот процесс активно формирует эволюцию бактерий, модифицирующих факторы вирулентности и устойчивости к антибиотикам. Кроме того, гены фагов могут косвенно увеличивать продукцию бактериальных токсинов, что влияет на адгезию, колонизацию и инвазию иммунного ответа [24].

2.2. Фаги как иммуномодуляторы

Еще одна интересная характеристика фагов - их способность регулировать иммунные ответы [25]. Иммунная система взаимодействует с микробиотой, поддерживая невоспалительный гомеостаз, основанный на множестве механизмов, таких как физический барьер слизистой оболочки и секреция антимикробных соединений. Кишечные фаги могут активно удалять инвазивные бактерии, но также могут снижать местные иммунные и воспалительные реакции, поддерживая иммунный гомеостаз [24].

Наиболее непосредственное воздействие фагов на иммунную систему возможно во время сепсиса, когда литическая активность фагов может снизить бактериальную нагрузку. И наоборот, бактериальный мусор, вызванный фагами, также может привести к сепсису. Иммуномодулирующие свойства фагов могут приводить к частичной буферизации вызванной бактериями воспалительной реакции или бактериального лизиса [26]. Опосредованный клеточными фагами лизис, по-видимому, участвует в производстве патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP). Если имеется повышенная кишечная проницаемость, PAMPs могут перемещаться и активировать иммунные ответы [27]. Фаги способны стимулировать бактериальный фагоцитоз макрофагами посредством опсонизации, делая их более доступными для иммунной системы [26].

Слизистая оболочка кишечника формирует взаимодействие между фагами и их бактериальными хозяевами. Фаговые сообщества устанавливают контакт со слизистым барьером, генерируя фагопосредованный иммунитет [28]. Согласно этой модели, врожденный иммунитет защищает комменсальные микроорганизмы в верхних слоях слизи через лизогенез, а приобретенный иммунитет убивает инвазивные патогены в самых глубоких слоях слизи через лизис [29]. Чтобы служить эффективным противомикробным средством для хозяина, адгезивные фаги должны уменьшать бактериальную колонизацию слизи. Некоторые фаги экспрессируют белки, демонстрирующие складки лектина типа C и домены иммуноглобулинового типа, препятствуя O-гликозилированному муцину MUC2 в толстой кишке [30]. Например, внешний капсидный белок фага Т4 предпочтительно связывается с О-глюкановыми цепями в муцинах, увеличивая долю фагов в слизистом слое и играя защитную роль против проникающих в слизь бактерий. Поэтому модификация гликозилирования слизистой оболочки может влиять на обилие определенных фагов, что имеет последствия среди специфических бактериальных групп [31]. С другой стороны, патоген, который нарушает врожденный иммунный ответ, будет устранен приобретенной иммунной системой. IG-тип складки бактериофагов обнаруживается в антителах и рецепторах Т-клеток [26]. Более того, фагонейтрализующие антитела были обнаружены в сыворотках разных видов, что позволяет предположить, что фаговые антитела могут быть обычным явлением в человеческой популяции [32]. Интересно, что ограничивающим фактором для фагов в кишечнике считается продукция специфического иммуноглобулина А (). Было показано, что при низком уровне IgA фаги обнаруживаются в кале. Однако если уровень IgA повышался, то активных фагов в стуле не было (Рис.2) [26].

Рисунок 2. Иммунные реакции, опосредованные бактериофагами.

Следовательно, фагом формирует популяции бактерий в кишечнике, поддерживая гомеостаз. Однако может возникнуть дисбактериоз, способствующий исчезновению или необычному росту бактериальных хозяев [33].

3. Роль фагов в желудочно-кишечных заболеваниях и их потенциальные клинические результаты.

Желудочно-кишечные заболевания являются одним из наиболее рецидивирующих воспалительных состояний в здравоохранении, причем БК и Як являются двумя основными заболеваниями, включенными в состав воспалительных заболеваний кишечника. Фаги являются перспективной альтернативой модуляции кишечной микробиоты путем уничтожения патогенных бактерий. В настоящее время литическая фаготерапия в основном изучается в гастроэнтерологии для борьбы с при ЯК и эрадикации AIEC при БК [17]. Наиболее важным вопросом для терапевтического развития фагов является оценка безопасности и эффективности используемых фагов. В настоящее время исследования в этой области основаны на моделях животных in vivo или с использованием подходящей системы in vitro.

3.1. Литические фаги против Clostridioides difficile при язвенном колите (ЯК)

ЯК, вызванный C. difficile, является одним из наиболее распространенных воспалений толстой кишки, вызывающих диарею. C. difficile обычно встречается у бессимптомных людей, составляющих более 50% детей и 15% здоровых взрослых. Фактически, присутствие только C. difficile не является признаком воспаления кишечника. Прогрессирование заболевания фактически влечет за собой секрецию токсинов, таких как ферменты TcdA и TcdB, гликозилтрансферазы, которые модулируют цитоплазматические Rho GTPases (Rho ГТФазы), нарушая целостность цитоскелета. Кодирующая токсин область известна как локус патогенности, называемый PaLoc [34]. Считается, что происхождение PaLoc происходит от древнего фага, поскольку он имеет определенные характеристики с фагами, в частности ген tcdE, который кодирует фагоподобную последовательность, участвующую в секреции токсинов.

Прим. ред.: PaLoc - это генетический локус размером 19,6-kb, содержащий гены, кодирующие токсины A и B (tcdA и tcdB соответственно), а также три небольшие открытые рамки считывания (ORFs), кодирующие предполагаемые регуляторные элементы (tcdR / tcdD, tcdE и tcdC). Было высказано предположение, что варианты генов PaLoc объясняют гипервирулентность штамма у человека-хозяина.

В настоящее время для борьбы с ЯК, вызванным C. difficile, используются антибиотики и трансплантация фекальной микробиоты (FMT). Эффективность FMT была связана с переносом эубиотических бактерий, восстанавливающих гомеостаз [35]. Было проведено наблюдение за пациентом с инфекцией C. difficile, получавшим FMT в течение четырех с половиной лет [36]. Донорские образцы состояли в основном из Bacteroidetes и Firmicutes, которые характерны для здоровой кишечной микробиоты. Через 6–7 месяцев после FMT микробиота оставалась отличной от донорской. Три промежуточных образца содержали относительно высокие уровни Firmicutes, Proteobacteria и Verrucomicrobia по сравнению с донорским образцом, использованным для FMT. Через 4,5 года микробиота пациента обнаружила схожий с донором состав на уровне филы, предполагая, что для всего трансплантата потребуются годы. Однако клинические симптомы исчезли сразу после FMT, что свидетельствует о том, что микробиота восстанавливает метаболические функции еще до полной трансплантации. Несмотря на большие различия в составе во времени, все проанализированные образцы имели сопоставимое бактериальное и вирусное разнообразие. Вирусные последовательности были идентифицированы с помощью метагеномики, что выявило присутствие фагов Caudovirales во всех исследованных образцах доноров и пациентов [37]. В кишечнике человека преобладают Caudovirales, за ними следуют фаги оцДНК семейства Microviridae. Три литических фага были идентифицированы во всех тестируемых образцах от донора и пациента. Одним из них был фаг vB_EamP-L1, который заражает бактерию Erwinia amylovora, вероятно, являясь контаминантом пищи. Два других фага, Bip4v и B40-8, инфицируют бактерии рода Bacteroides, которых много у здоровых людей. Было высказано предположение, что эти фаги были переданы от донора реципиенту, где они могли сыграть ключевую роль. Кроме того, анализ вирома не обнаружил патогенных вирусов у донора или пациента [36]. В другом исследовании определялся фагеом одного донора и трех пациентов с ЯК, получивших FMT. FMT у всех реципиентов привел к 4 неделям без симптомов и предположил, что фаги были ответственны за период без симптомов. Фаги умеренного пояса из семейства Siphoviridaela передавались более эффективно, чем фаги из других таксономических групп, что указывает на конкурентное преимущество фагов умеренного пояса. Следовательно, важно рассматривать фаги как ключевой компонент микробиома при дальнейшем анализе FMT [38]. Недавнее исследование показало, что одного фагеома может быть достаточно для устранения инфекции C. difficile и восстановления здоровой микробной структуры [39]. Оценка проводилась у пяти пациентов с симптоматической БК с хроническим рецидивом. Пациенты находились под наблюдением от 6 до 33 месяцев. Трансплантаты с фекальной фильтрацией (FFT), включая вирусы, присутствующие в фекалиях, но не более крупные компоненты, такие как бактерии, были эффективны при лечении этих пяти пациентов. Было выделено и охарактеризовано в общей сложности семь фагов, включая морфологию, круг хозяев и молекулярное разнообразие. Из них шесть (phiCDHM1 - phiCDHM6) были миовирусами, а один (phiCDHS1) - сифовирусом. В сочетании они обладали литической активностью в 86% испытанных клинически значимых штаммов C. difficile. Они продемонстрировали, что фаги могут лизировать 12 из 13 наиболее распространенных штаммов при ЯК. Во всех случаях FFT восстанавливала нормальный стул и устраняла симптомы C. difficile как минимум на 6 месяцев. Эти результаты подчеркивают, что только бактериофаги модулируют бактериальное сообщество, восстанавливая гомеостаз [39].

Кроме того, получение метагеномной информации о кишечных фагах важно для разработки будущих специфических фаговых методов лечения патогенов в кишечнике. В недавнем исследовании бактериом и виром одних и тех же образцов стула от 101 здорового взрослого человека были подвергнуты метагеномному анализу для понимания ассоциаций хозяин-бактерия-фаг в кишечнике [39]. Всего успешно идентифицировано 114 профагов. Соответственно, метагеномная информация и ассоциации бактерий-хозяев могут быть использованы для выделения новых антибактериальных соединений, специфичных для фагов, которые могут контролировать патогены. Например, фаг-специфические эндолизины C. difficile считаются многообещающей стратегией инфекционного контроля [40].

3.2. Литические фаги против инвазивной адгезивной кишечной палочки (AIEC) при болезни Крона (БК)

Диаррогенная кишечная палочка является основным патогеном во всем мире, особенно в местах с ограниченным доступом к чистой воде и медицинскому обслуживанию. Среди патотипов E. coli AIEC является гетерогенной категорией, вызывающей острую и стойкую диарею [41]. К сожалению, современные методы лечения должны быть пересмотрены в связи с появлением штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. За последние 10 лет количество резистентных штаммов E. coli быстро растет и распространяется по всему миру. В этих условиях для борьбы с этой важной проблемой общественного здравоохранения необходимы альтернативные методы лечения, например, на основе фагов [15].

Штаммы AIEC считаются патобиотическими, поскольку они способствуют развитию воспалительных заболеваний, главным образом косвенно через стимуляцию иммунной системы. Было выявлено несколько факторов, которые участвуют в присутствии AIEC в слизистой оболочке кишечника, способствуя воспалению. Гены, участвующие в вирулентности AIEC, могут усиливать подвижность, экспрессию капсул и липополисахаридов (ЛПС), резистентность в сыворотке крови, абсорбцию железа, адгезию и инвазию эпителиальных клеточных линий и образование биопленок. Другие особенности вирулентности AIEC связаны с его репликацией и выживанием в макрофагах. AIEC может использовать механизмы апоптоза хозяина за счет увеличения S-нитрозилирования и протеасомной деградации каспазы-3 в инфицированных макрофагах. Стоит также упомянуть, что AIEC может индуцировать гибель клеток аутофагов в нейтрофилах. В присутствии антибиотиков AIEC активирует выработку нейтрофильных АФК, способствующих воспалению кишечника. Таким образом, AIEC может предотвратить адекватный антимикробный ответ [41].

Было проведено несколько интересных исследований по оценке использования фагов для борьбы с AIEC. Штамм AIEC LF82, выделенный из подвздошной кишки пациента с БК, обычно использовался для большинства исследований, связанных с воспалительными заболеваниями кишечника, ассоциированными с кишечной палочкой. Штамм LF82 может связываться с рецептором адгезии хозяина, который сильно экспрессируется в подвздошных тканях больных БК. Интересное исследование тестирования фагов в качестве потенциального лечения против AIEC было проведено с тремя фагами, LF82_P2, LF82_P6 и LF82_P8, чтобы определить способность этого коктейля заражать адгезивные бактерии LF82 в мышиной модели. К 24 ч после обработки уровень штамма LF82 в Кале был снижен в два раза в группе, обработанной фагом, оставаясь значительно ниже, чем в контрольной группе через 4 дня. Кроме того, кишечные срезы подвздошной кишки и толстой кишки были протестированы на количественное определение бактерий через 24 ч после лечения, показав, что LF82 был значительно ниже во всех кишечных срезах группы, обработанной фагами, чем в контроле. Таким образом, как прямыми, так и непрямыми методами они продемонстрировали, что однократное введение коктейля фагов снижает уровень колонизации LF82, предполагая, что фаговая терапия может быть интересным терапевтическим инструментом [42].

Другой пример использования фагов против диарогенной кишечной палочки был выполнен с использованием фага PDX, принадлежащего к семейству Myoviridae. PDX лизировал целевые бактерии в мышиной модели кишечной колонизации. In vitro было показано, что фаг PDX убивает целевые бактерии, и с помощью анализа 16S рДНК было продемонстрировано, что α-и β-разнообразие микробиоты не было затронуто. Используя модель колонизации мыши, однократная доза PDX значительно уменьшала количество колоний AIEC на 2, 3 и 5 день после заражения, что приводило к снижению присутствия E. coli у мыши. Таким образом, PDX представляет собой потенциальное решение против диареи, и его можно было бы использовать в профилактике и в качестве терапевтического средства [41].

3.3. Умеренные фаги для подавления факторов вирулентности

Фаговая терапия поощряет использование строго литических фагов, главным образом, чтобы избежать резистентности к горизонтальному переносу генов за счет специализированной трансдукции. Однако развитие фаговой геномной инженерии позволяет повысить безопасность и эффективность умеренных фагов [42]. Кроме того, умеренные фаги могут быть модифицированы для доставки синтетических генов с целью подавления генов вирулентности или для восстановления чувствительности бактерий к антибиотикам. Поскольку умеренные фаги не являются литическими, это приближение уменьшает риск высвобождения эндотоксина [43].

Например, умеренные фаги были сконструированы для введения генов rpsL и gyrA, которые придают чувствительность к двум антибиотикам, стрептомицину и налидиксовой кислоте. Модифицированный λ-фаг, содержащий гены rpsL и gyrA, позволяет после его интеграции восстановить чувствительность к двум антибиотикам. Однако этот вид аппроксимации все еще ограничен, и правильная реализация может потребовать использования нетоксичной формы селективного давления [43].

Интересный пример использования генетически модифицированных умеренных фагов был сделан для подавления Шига токсина (Stx) из установленной популяции E. coli, которая колонизирует кишечник млекопитающих, патогенной инфекции, трудно поддающейся лечению. Хотя антивирулентные препараты, нацеленные на токсин, были исследованы, клинические испытания не увенчались успехом [44]. Ген stx, кодируемый умеренным фагом 933W, экспрессируется после индукции литического цикла. В профагическом состоянии 933W остается латентным за счет экспрессии своего репрессорного белка cI. После индукции бактериальный SOS-ответ индуцирует опосредованную RecA деградацию cI, что приводит к экспрессии литических генов, которые индуцируют как фаговое потомство, так и экспрессию stx. Генетически модифицированный умеренный фаг λ (933W • cI ind-) был получен со способностью нейтрализовать продукцию токсина Stx и способным преодолевать механизмы устойчивости к фагам. Было показано, что сконструированный фаг инфицирует, лизогенизирует и ингибирует продукцию токсина Stx из E. coli in vitro и in vivo на мышиной модели [11].

4. Фаготерапия: клинические испытания при желудочно-кишечных заболеваниях

Рандомизированные контролируемые клинические испытания на людях необходимы для оценки потенциала фаготерапии в области здоровья желудочно-кишечного тракта. До сих пор было проведено несколько клинических испытаний на людях с бактериофагами для лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Для определения безопасности и эффективности коктейля из Т4-подобных колифагов [45] было проведено проспективное одноцентровое рандомизированное клиническое исследование [45]. Коктейль или плацебо вводили перорально в течение 4 дней детям с острым началом обезвоживающей диареи продолжительностью менее 48 ч. Безопасность коктейля оценивалась клинически и с помощью функционального тестирования. Коктейль состоял из 11 литических Т4-подобных фагов (AB2, 4, 6, 11, 46, 50, 55, JS34, 37, 98, D1. 4), лишенные генов бактериальной вирулентности. Плацебо было стандартным лечением, пероральным регидратационным раствором, дополненным цинком [45]. Результаты показали, что Т4-подобный фаговый коктейль не показал клинического улучшения по сравнению с плацебо с точки зрения фекального выхода, частоты или регидратации. Если углубиться в данные, то только 60% из 120 включенных в исследование пациентов имели переносимый калом патоген E. coli, на который нацелен фаговый коктейль, и у этих пациентов менее 5% всех фекальных бактерий составляли E. coli. Чтобы преодолеть ограничения будущих испытаний фармакотерапии, авторы настоятельно рекомендуют контролировать, инфицирует ли целевой патоген различные штаммы, чтобы поддерживать репликацию фага in vivo. Хотя это испытание не смогло завершить лечебную деятельность, было интересно проверить вопросы безопасности фаговой терапии. Примечательно, что существенной репликации in vivo перорально применяемого фага не наблюдалось. В целом, пероральное введение коктейля показало безопасный кишечный транзит у детей. Однако симптомы заболевания не лечились, вероятно, из-за низкого обилия кишечной палочки [45].

Кроме того, было проведено рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое перекрестное вмешательство для оценки безопасности и переносимости фагов у здоровых взрослых, страдающих легким и умеренным желудочно-кишечным дистрессом [46]. Используя коммерческий коктейль, содержащий четыре фага (LH01-Myoviridae, LL5-Siphoviridae, T4D-Myoviridae и LL12-Myoviridae), нацеленных на E. coli, исследование было направлено на определение их влияния на микробиоту кишечника, включая маркеры кишечного и системного воспаления. Хроническая диарея связана с низким уровнем tCO₂ в крови, и результаты показали значительное увеличение tCO₂ после лечения. Кроме того, уровни аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в образцах, собранных после лечения, были ниже по сравнению с плацебо. Известно, что уровень этих ферментов повышается после воздействия бактериальных липополисахаридов (ЛПС), связанных с системным воспалением и повреждением тканей. Фаги в коктейле нацелены на провоспалительную E. coli, и вполне возможно, что фаги уменьшают циркулирующий эндотоксин, модулируя кишечную микробиоту и барьерную функцию кишечника. Кроме того, было обнаружено снижение циркуляции цитокинов, вероятно связанное с уменьшением циркулирующих бактерий вследствие обработки фагами, поскольку ЛПС ассоциирован с системным воспалением и высвобождением цитокинов [47]. Кроме того, снижение фекальной нагрузки E. coli наблюдалось у пациентов, получавших лечение фагами, но с аналогичными параметрами разнообразия, что свидетельствует о том, что фаги поддерживают микробиоту. В заключение клиническое исследование пришло к выводу, что пероральное введение фагов было безопасным и переносимым у людей, страдающих умеренными желудочно-кишечными симптомами [48].

Наконец, продолжающееся клиническое исследование AIEC у пациентов с БК сейчас находится в фазе 2. Это двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое исследование оценивает безопасность и эффективность коктейля фагов (EcoActive) в когорте из 30 пациентов с БК. Это исследование зарегистрировано под номером ClinicalTrials.gov (NCT03808103).

В заключение, хотя это и не связано с инфекционными заболеваниями желудочно-кишечного тракта, стоит упомянуть об оценке фаговой терапии как безопасного лечения в недавнем клиническом испытании против тяжелых инфекций, таких как эндокардит и септический шок, вызванных Staphylococcus aureus. Фаговый коктейль из трех литических фагов (Myoviridae) использовали для лечения пациентов с бактериемией S. aureus. Внутривенное введение проводили в течение двух недель, дважды в день, и оценивали безопасность и переносимость фагов пациентами. Результаты показали, что фаговый препарат был безопасен при тяжелых инфекциях S. aureus, устраняя бактериемию и уменьшая воспаление. Интересно, что никакой бактериальной резистентности к фагам не наблюдалось [49].

5. Выводы

Желудочно-кишечные фагомы - это новая область исследований, которая будет иметь важное значение для понимания желудочно-кишечных заболеваний. Определение экологических ключевых параметров фагов в кишечнике предоставит интересную информацию об их роли как модуляторов гомеостаза. Таким образом, идентификация здорового фагома открывает захватывающий подход к разработке новых методов лечения. С этой точки зрения предварительные данные, показывающие вклад фагов в устойчивость к микробам и выздоровление пациентов с помощью трансплантатов с фекальной фильтрацией, обнадеживают. Кроме того, разработка животных моделей, имитирующих кишечное сообщество, будет полезна для проверки влияния фагов на бактериальные сообщества. Кроме того, синтетическая биология позволяет использовать умеренные фаги в терапевтических целях, открывая новую область исследований на основе фагов.

В заключение следует отметить, что фаги вносят свой вклад в структуру и функционирование кишечной микробиоты человека, влияя на состояние здоровья и болезни желудочно-кишечного тракта. При таком раскладе фаги следует рассматривать как перспективное терапевтическое средство против патогенных желудочно-кишечных бактерий. Однако по-прежнему существуют ограничения, связанные с нехваткой стандартизации и правовых рамок, которые необходимо устранить. Таким образом, поощрение будущих исследований в этой области будет способствовать созданию нормативных протоколов и протоколов безопасности, что приведет к использованию фагов в качестве клинических инструментов. Поэтому дополнительные и более глубокие исследования в этой области еще больше расширят наши нынешние знания о роли фагов в микробиоме и обеспечат прочную основу для будущих терапевтических последствий.

Дополнительно о бактериофагах см.:

• Бактериофаги против бактерий
• Бактериофаги (из раздела "Основы микробиологии. Микроорганизмы")
  
• Пищевые соединения могут вызывать образование полезных фагов
• Бактериофаги могут быть причастны к задержке роста у детей
• Обнаружен вирус, который охотится на бактериоидов (Bacterioides)

Литература

1. Chatterjee, A.; Duerkop, B.A. Beyond Bacteria: Bacteriophage-Eukaryotic Host Interactions Reveal Emerging Paradigms of Health and Disease. Front. Microbiol. 2018, 9, 1394. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
2. Ogilvie, L.A.; Jones, B.V. The human gut virome: A multifaceted majority. Front. Microbiol. 2015, 6, 918. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
3. Shkoporov, A.N.; Hill, C. Bacteriophages of the Human Gut: The “Known Unknown” of the Microbiome. Cell Host Microbe 2019, 25, 195–209. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
4. Sutton, T.D.S.; Hill, C. Gut Bacteriophage: Current Understanding and Challenges. Front. Endocrinol. 2019, 10, 784. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
5. Mirzaei, M.K.; Maurice, C.F. Menage trois in the human gut: Interactions between host, bacteria and phages. Nature reviews. Microbiology 2017, 15, 397–408. [Google Scholar] [PubMed]
6. Moelling, K.; Broecker, F.; Willy, C. A Wake-Up Call: We Need Phage Therapy Now. Viruses 2018, 10, 688. [Google Scholar] [CrossRef]
7. Domingo-Calap, P.; Delgado-Martínez, J. Bacteriophages: Protagonists of a Post-Antibiotic Era. Antibiotics 2018, 7, 66. [Google Scholar] [CrossRef]
8. Young, R.; Gill, J.J. Phage therapy redux—What is to be done? Science 2015, 350, 1163–1164. [Google Scholar] [CrossRef]
9. Gordillo Altamirano, F.L.; Barr, J.J. Phage Therapy in the Postantibiotic Era. Clin. Microbiol. Rev. 2019, 32. [Google Scholar] [CrossRef]
10. Hsu, B.B.; Way, J.C.; Silver, P.A. Stable Neutralization of a Virulence Factor in Bacteria Using Temperate Phage in the Mammalian Gut. Msystems 2020, 5. [Google Scholar] [CrossRef]
11. Sausset, R.; Petit, M.A.; Gaboriau-Routhiau, V.; De Paepe, M. New insights into intestinal phages. Mucosal Immunol. 2020, 13, 205–215. [Google Scholar] [CrossRef]
12. Mishima, Y.; Sartor, R.B. Manipulating resident microbiota to enhance regulatory immune function to treat inflammatory bowel diseases. J. Gastroenterol. 2020, 55, 4–14. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
13. Norman, J.M.; Handley, S.A.; Baldridge, M.T.; Droit, L.; Liu, C.Y.; Keller, B.C.; Kambal, A.; Monaco, C.L.; Zhao, G.; Fleshner, P.; et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell 2015, 160, 447–460. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
14. Palmela, C.; Chevarin, C.; Xu, Z.; Torres, J.; Sevrin, G.; Hirten, R.; Barnich, N.; Ng, S.C.; Colombel, J.F. Adherent-invasive Escherichia coli in inflammatory bowel disease. Gut 2018, 67, 574–587. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
15. Hsu, B.B.; Gibson, T.E.; Yeliseyev, V.; Liu, Q.; Lyon, L.; Bry, L.; Silver, P.A.; Gerber, G.K. Dynamic Modulation of the Gut Microbiota and Metabolome by Bacteriophages in a Mouse Model. Cell Host Microbe 2019, 25, 803–814.e5. [Google Scholar] [CrossRef]
16. Sabino, J.; Hirten, R.P.; Colombel, J.F. Review article: Bacteriophages in gastroenterology-from biology to clinical applications. Aliment. Pharmacol. Ther. 2020, 51, 53–63. [Google Scholar] [CrossRef]
17. Maronek, M.; Link, R.; Ambro, L.; Gardlik, R. Phages and Their Role in Gastrointestinal Disease: Focus on Inflammatory Bowel Disease. Cells 2020, 9, 1013. [Google Scholar] [CrossRef]
18. Kim, B.O.; Kim, E.S.; Yoo, Y.J.; Bae, H.W.; Chung, I.Y.; Cho, Y.H. Phage-Derived Antibacterials: Harnessing the Simplicity, Plasticity, Diversity of Phages. Viruses 2019, 11. [Google Scholar] [CrossRef]
19. Hillman, E.T.; Lu, H.; Yao, T.; Nakatsu, C.H. Microbial Ecology along the Gastrointestinal Tract. Microbes Environ. 2018, 32, 300–313. [Google Scholar] [CrossRef]
20. Dutilh, B.E.; Cassman, N.; McNair, K.; Sanchez, S.E.; Silva, G.G.; Boling, L.; Barr, J.J.; Speth, D.R.; Seguritan, V.; Aziz, R.K.; et al. A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown sequences of human faecal metagenomes. Nat. Commun. 2014, 5, 4498. [Google Scholar] [CrossRef]
21. Manrique, P.; Bolduc, B.; Walk, S.T.; van der Oost, J.; de Vos, W.M.; Young, M.J. Healthy human gut phageome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 113, 10400–10405. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
22. Knowles, B.; Silveira, C.B.; Bailey, B.A.; Barott, K.; Cantu, V.A.; Cobian-Guemes, A.G.; Coutinho, F.H.; Dinsdale, E.A.; Felts, B.; Furby, K.A.; et al. Lytic to temperate switching of viral communities. Nature 2016, 531, 466–470. [Google Scholar] [CrossRef]
23. Imamovic, L.; Balleste, E.; Martinez-Castillo, A.; Garcia-Aljaro, C.; Muniesa, M. Heterogeneity in phage induction enables the survival of the lysogenic population. Environ. Microbiol. 2016, 18, 957–969. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
24. Weiss, G.A.; Hennet, T. Mechanisms and consequences of intestinal dysbiosis. Cell Mol. Life Sci. 2017, 74, 2959–2977. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
25. Barr, J.J. A bacteriophages journey through the human body. Immunol. Rev. 2017, 279, 106–122. [Google Scholar] [CrossRef]
26. Van Belleghem, J.D.; Dabrowska, K.; Vaneechoutte, M.; Barr, J.J.; Bollyky, P.L. Interactions between Bacteriophage, Bacteria, and the Mammalian Immune System. Viruses 2018, 11. [Google Scholar] [CrossRef]
27. Sinha, A.; Maurice, C.F. Bacteriophages: Uncharacterized and Dynamic Regulators of the Immune System. Mediat. Inflamm. 2019, 2019, 3730519. [Google Scholar] [CrossRef]
28. Silveira, C.B.; Rohwer, F.L. Piggyback-the-Winner in host-associated microbial communities. NPJ Biofilms Microbiomes 2016, 2, 16010. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
29. Barr, J.J.; Youle, M.; Rohwer, F. Innate and acquired bacteriophage-mediated immunity. Bacteriophage 2013, 3, e25857. [Google Scholar] [CrossRef]
30. Gorski, A.; Dabrowska, K.; Miedzybrodzki, R.; Weber-Dabrowska, B.; Lusiak-Szelachowska, M.; Jonczyk-Matysiak, E.; Borysowski, J. Phages and immunomodulation. Future Microbiol. 2017, 12, 905–914. [Google Scholar] [CrossRef]
31. Gogokhia, L.; Buhrke, K.; Bell, R.; Hoffman, B.; Brown, D.G.; Hanke-Gogokhia, C.; Ajami, N.J.; Wong, M.C.; Ghazaryan, A.; Valentine, J.F.; et al. Expansion of Bacteriophages Is Linked to Aggravated Intestinal Inflammation and Colitis. Cell Host Microbe 2019, 25, 285–299.e8. [Google Scholar] [CrossRef]
32. Majewska, J.; Beta, W.; Lecion, D.; Hodyra-Stefaniak, K.; Klopot, A.; Kazmierczak, Z.; Miernikiewicz, P.; Piotrowicz, A.; Ciekot, J.; Owczarek, B.; et al. Oral Application of T4 Phage Induces Weak Antibody Production in the Gut and in the Blood. Viruses 2015, 7, 4783–4799. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
33. De Sordi, L.; Lourenco, M.; Debarbieux, L. “I will survive”: A tale of bacteriophage-bacteria coevolution in the gut. Gut Microbes 2019, 10, 92–99. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
34. Rupnik, M.; Wilcox, M.H.; Gerding, D.N. Clostridium difficile infection: New developments in epidemiology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 526–536. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
35. Ott, S.J.; Waetzig, G.H.; Rehman, A.; Moltzau-Anderson, J.; Bharti, R.; Grasis, J.A.; Cassidy, L.; Tholey, A.; Fickenscher, H.; Seegert, D.; et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology 2017, 152, 799–811.e7. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
36. Broecker, F.; Klumpp, J.; Moelling, K. Long-term microbiota and virome in a Zurich patient after fecal transplantation against Clostridium difficile infection. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2016, 1372, 29–41. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
37. Broecker, F.; Kube, M.; Klumpp, J.; Schuppler, M.; Biedermann, L.; Hecht, J.; Hombach, M.; Keller, P.M.; Rogler, G.; Moelling, K. Analysis of the intestinal microbiome of a recovered Clostridium difficile patient after fecal transplantation. Digestion 2013, 88, 243–251. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
38. Chehoud, C.; Dryga, A.; Hwang, Y.; Nagy-Szakal, D.; Hollister, E.B.; Luna, R.A.; Versalovic, J.; Kellermayer, R.; Bushman, F.D. Transfer of Viral Communities between Human Individuals during Fecal Microbiota Transplantation. MBio 2016, 7. [Google Scholar] [CrossRef]
39. Cepko, L.C.S.; Garling, E.E.; Dinsdale, M.J.; Scott, W.P.; Bandy, L.; Nice, T.; Faber-Hammond, J.; Mellies, J.L. Myoviridae phage PDX kills enteroaggregative Escherichia coli without human microbiome dysbiosis. J. Med. Microbiol. 2020, 69, 309–323. [Google Scholar] [CrossRef]
40. Fujimoto, K.; Kimura, Y.; Shimohigoshi, M.; Satoh, T.; Sato, S.; Tremmel, G.; Uematsu, M.; Kawaguchi, Y.; Usui, Y.; Nakano, Y.; et al. Metagenome Data on Intestinal Phage-Bacteria Associations Aids the Development of Phage Therapy against Pathobionts. Cell Host Microbe 2020, 28, 380–389.e9. [Google Scholar] [CrossRef]
41. Galtier, M.; De Sordi, L.; Sivignon, A.; de Vallee, A.; Maura, D.; Neut, C.; Rahmouni, O.; Wannerberger, K.; Darfeuille-Michaud, A.; Desreumaux, P.; et al. Bacteriophages Targeting Adherent Invasive Escherichia coli Strains as a Promising New Treatment for Crohn’s Disease. J. Crohns Colitis 2017, 11, 840–847. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
42. Monteiro, R.; Pires, D.P.; Costa, A.R.; Azeredo, J. Phage Therapy: Going Temperate? Trends Microbiol. 2019, 27, 368–378. [Google Scholar] [CrossRef]
43. Edgar, R.; Friedman, N.; Molshanski-Mor, S.; Qimron, U. Reversing bacterial resistance to antibiotics by phage-mediated delivery of dominant sensitive genes. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 744–751. [Google Scholar] [CrossRef]
44. Trachtman, H.; Cnaan, A.; Christen, E.; Gibbs, K.; Zhao, S.; Acheson, D.W.; Weiss, R.; Kaskel, F.J.; Spitzer, A.; Hirschman, G.H. Investigators of the HUS-SYNSORB Pk Multicenter Clinical Trial Effect of an oral Shiga toxin-binding agent on diarrhea-associated hemolytic uremic syndrome in children: A randomized controlled trial. JAMA 2003, 290, 1337–1344. [Google Scholar] [CrossRef]
45. Sarker, S.A.; Sultana, S.; Reuteler, G.; Moine, D.; Descombes, P.; Charton, F.; Bourdin, G.; McCallin, S.; Ngom-Bru, C.; Neville, T.; et al. Oral Phage Therapy of Acute Bacterial Diarrhea With Two Coliphage Preparations: A Randomized Trial in Children From Bangladesh. EBioMedicine 2016, 4, 124–137. [Google Scholar] [CrossRef]
46. Febvre, H.P.; Rao, S.; Gindin, M.; Goodwin, N.D.M.; Finer, E.; Vivanco, J.S.; Lu, S.; Manter, D.K.; Wallace, T.C.; Weir, T.L. PHAGE Study: Effects of Supplemental Bacteriophage Intake on Inflammation and Gut Microbiota in Healthy Adults. Nutrients 2019, 11. [Google Scholar] [CrossRef]
47. Gindin, M.; Febvre, H.P.; Rao, S.; Wallace, T.C.; Weir, T.L. Bacteriophage for Gastrointestinal Health (PHAGE) Study: Evaluating the Safety and Tolerability of Supplemental Bacteriophage Consumption. J. Am. Coll. Nutr. 2019, 38, 68–75. [Google Scholar] [CrossRef]
48. Manrique, P.; Dills, M.; Young, M.J. The Human Gut Phage Community and Its Implications for Health and Disease. Viruses 2017, 9, 141. [Google Scholar] [CrossRef]
49. Petrovic Fabijan, A.; Lin, R.C.Y.; Ho, J.; Maddocks, S.; Ben Zakour, N.L.; Iredell, J.R. Westmead Bacteriophage Therapy Team Safety of bacteriophage therapy in severe Staphylococcus aureus infection. Nat. Microbiol. 2020, 5, 465–472. [Google Scholar] [CrossRef]