Энтеротип Bacteroides ассоциируется с высоким риском сахарного диабета

Энтеротип Bacteroides ассоциируется с высоким риском у пациентов с сахарным диабетом

 

Энтеротип Bacteroides является независимым фактором риска развития сахарного диабета 2 типа, что связано с повышением уровня липополисахаридов (LPS), вызывающих снижение чувствительности к инсулину

Фон. Все больше исследований посвящено взаимосвязи между микробиомом желудочно-кишечного тракта и сахарным диабетом 2 типа, но лишь немногие из них действительно изучали взаимосвязь между энтеротипами и сахарным диабетом 2 типа.

Материалы и методы. Мы включили 134 пациента с сахарным диабетом 2 типа и 37 недиабетических контроля. Были измерены антропометрические и клинические показатели каждого испытуемого. Фекальные образцы каждого субъекта также были собраны и обработаны для секвенирования 16S рДНК. Для определения ассоциаций энтеротипов с сахарным диабетом 2 типа был использован множественный логистический регрессионный анализ. Множественный линейный регрессионный анализ был использован для изучения взаимосвязи между уровнем липополисахаридов (LPS) и чувствительностью к инсулину после корректировки на возраст, индекс массы тела (ИМТ), триглицериды (TG), холестерин липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), диаминоксидазу (DAO) и фактор некроза опухолей-альфа (TNF-α). Корреляционный анализ между факторами и микробиотой был выявлен с помощью корреляционного анализа Спирмена. Корреляционный анализ между факторами был выявлен с помощью частичного корреляционного анализа.

Результаты. Микробиота кишечника в группе диабета 2 типа демонстрировала более низкое бактериальное разнообразие по сравнению с недиабетическим контролем. Фекальные сообщества всех испытуемых сгруппировались в два энтеротипа, различающихся по уровню Bacteroides и Prevotella. Логистический регрессионный анализ показал, что энтеротип Bacteroides является независимым фактором риска развития сахарного диабета 2 типа за счет снижения чувствительности к инсулину. Уровни липополисахарида и фактора некроза опухоли-альфа были выше в энтеротипе Bacteroides по сравнению с энтеротипом Prevotella. Частичный корреляционный анализ показал, что липополисахарид был тесно связан с диаминоксидазой, фактором некроза опухоли-альфа и индексом чувствительности к инсулину Гутта ISI (0,120) после корректировки на множественные ковариаты. Кроме того, было установлено, что уровень липополисахаридов является независимым фактором риска чувствительности к инсулину.

Выводы. Мы определили два энтеротипа, Bacteroides и Prevotella, среди всех испытуемых. Наши результаты показали, что энтеротип Bacteroides является независимым фактором риска развития сахарного диабета 2 типа, что связано с повышением уровня липополисахаридов, вызывающих снижение чувствительности к инсулину.

1. Вступление

Диабет 2-го типа (СД2), представляющий собой сложное заболевание, на которое влияют как генетические, так и экологические компоненты, стал серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. В настоящее время все больше данных свидетельствует о взаимосвязи между микробиотой кишечника и СД2 [1-5]. Многие исследования показали, что микробиом больных сахарным диабетом 2 типа характеризуется обогащением несколькими условно-патогенными микроорганизмами [2], сульфатредуцирующими бактериями [6, 7], а также истощением некоторых пробиотиков [8] и некоторых бутиратпродуцирующих бактерий [2, 6, 7]. Кроме того, как исследования человека, так и исследования грызунов показали, что перенос кишечной микробиоты может также привести к переносу специфических фенотипов метаболических заболеваний [9, 10], включая гипергликемию. Модификация микробиоты кишечника диетой и пребиотиками может улучшить толерантность к глюкозе и инсулиновую реакцию [11, 12]. Кроме того, терапевтические эффекты некоторых гипогликемических средств, таких как метформин и ингибиторы α-глюкозидазы, могут частично опосредоваться микробиотой кишечника [13, 14]. Однако результаты не всегда совпадают. Larsen et al. обнаружили более низкое различие в выборке у пациентов с СД2 [1], в то время как Qin et al. не наблюдали существенной разницы в этом разнообразии между пациентами с СД2 и контрольной группой [2]. Кроме того, в последнем исследовании было обнаружено увеличение количества слизистой бактерии Akkermansia muciniphila, которая играет защитную роль в барьерной функции кишечника, у пациентов с СД2. Однако Zhang et al. сообщили об обратном эффекте, в частности, о снижении численности A. muciniphila у пациентов с диабетом и непереносимостью глюкозы [15]. Эти несоответствия показывают, что нам еще многое предстоит узнать о взаимосвязи между СД2 и кишечной микробиотой.

Энтеротип является еще одним средством для исследования кишечной микробиоты. Впервые этот метод был введен Arumugam et al.  в 2011 году в исследовании, в котором на основе таксономического состава они кластеризовали метагеномные образцы фекалий человека с трех континентов в три энтеротипа: энтеротип Bacteroides (ET B), энтеротип Prevotella (ET P) и энтеротип Ruminococcus, которые не связаны с этнической принадлежностью, полом, возрастом или индексом массы тела (ИМТ) [16]. (см. дополнительно: Энтеротипы и функциональный гомеостаз).

С тех пор в нескольких исследованиях были воспроизведены энтеротипы в новых наборах данных и в разной степени, как по количеству энтеротипов, так и по статистической поддержке [17–21]. Тем не менее, несколько исследований непосредственно изучали связь между энтеротипами и СД2. Следовательно, здесь, используя данные таксонов и энтеротипов, мы стремились выяснить, существуют ли энтеротипы в СД2 и недиабетическом контроле и существует ли связь между энтеротипами и СД2.

2. Материалы и методы

2.1. Участники. Первоначально были включены 150 пациентов с диабетом 2 типа и 50 недиабетических контролей. Все 150 пациентов с СД2 были диагностированы с использованием диагностических критериев диабета Всемирной организации здравоохранения [22]. Концентрацию глюкозы в плазме всех 50 недиабетических контролей оценивали с помощью теста на толерантность к глюкозе (OGTT). Критерии исключения для нашего исследования были следующими: (1) история воспалительных заболеваний кишечника, (2) постоянная диарея или (3) использование антибиотиков или применение пробиотических или пребиотических добавок в течение трех месяцев до сбора данных. Среди пациентов с СД2, девять использовали антибиотики в течение трех месяцев до сбора фекалий, у одного была постоянная диарея, и шесть использовали добавки с пребиотиками. Эти пациенты были исключены, и окончательное число пациентов с СД2 составило 134 (65 женщин, 69 мужчин). Среди недиабетических контролей шесть выпили йогурт за три дня до сбора фекалий и семь не закончили OGTT. Таким образом, конечное число в контрольной группе составило 37 (27 женщин, 10 мужчин). Информированное согласие было получено от всех участников. Это исследование было одобрено этическим комитетом больницы Qilu Университета Шаньдун (Shandong University) (IRB № KYLL-2017-595).

2.2. Диета и Медицина. Все пациенты с СД2 были обследованы во время их госпитализации в больницу Qilu Университета Шаньдун. Недиабетическими контролями были люди, которые работали в больнице. Все участники ответили на вопросники об истории своего рациона. Все они ели китайскую еду в своей повседневной жизни, и среди них не было вегетарианцев.

Была опрошена и записана история применения гипогликемических препаратов пациентами с СД2 в течение полугода до сбора фекалий.

2.3. Антропометрическое измерение. Рост, вес и артериальное давление (АД) каждого испытуемого измеряли по стандартным протоколам. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывали как Вес (кг), деленный на квадрат роста (м²). АД измеряли три раза подряд с помощью АД-монитора (OMRON, модель HEM-752, Fuzzy, Omron Company, Далянь, Китай) на левой руке пациента после того, как пациент сидел не менее пяти минут. Для анализа использовался средний показатель.

2.4. Биохимия сыворотки крови. После не менее 10 часов голодания в течение ночи отбирали образцы венозной крови для измерения уровня глюкозы в плазме натощак (FPG), холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и уровней триглицеридов (TG) с использованием автоматического анализатора (Architect cil6200 Integrated Система, Эбботт, США). Инсулин натощак (FINS) и С-пептид натощак (FCP) измеряли с использованием иммунохемилюминометрических анализов (Centaur, Bayer Germany), тогда как гликированный гемоглобин (Hb_A1c) измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием автоматического анализатора Hb_A1c (G7, Tosoh, Japan). Двух-часовой постпрандиальный уровень глюкозы в плазме (2hPG), 2-часовой постпрандиальный уровень инсулина в плазме (2hINS) и 2-часовой постпрандиальный C-пептид (2hCP) измеряли после того, как субъекты завершили 75 г OGTT, используя тот же метод, что и натощак. Уровни сывороточной диаминоксидазы (DAO), липополисахарида (LPS) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) определяли с использованием иммуноферментного анализа ИФА (Cusabio Biotech Company, Ухань, провинция Хубэй, Китай; № по каталогу CSB-E09945h, CSBE10137h и CSB-E04740h, соответственно) с использованием крови, собранной в состоянии поста. Модель гомеостаза оценки функции β-клеток (HOMA-β) и резистентности к инсулину (HOMA-IR) была рассчитана с использованием FPG и FCP [23]. Индекс чувствительности Гутта к инсулину (Gutt-ISI) рассчитывали следующим образом: Gutt-ISI = [75000 + (G0 - Gl20) × 18 × 0,19 × BW] / {120 × lg [(I0 + I120) / 2] × [(G0 + Gl20) × 90] [G0: FPG (ммоль / л), G120: 2hPG (ммоль / л), BW: масса тела (кг), I0: FINS (мкМЕ/мл) и I120: 2hINS (мкМЕ/мл)].

2.5. Сбор образцов фекалий. Образцы фекалий и крови были собраны в одно и то же утро. После не менее 10 часов голодания в течение ночи и взятия проб крови каждому давали чистую пластиковую тарелку и чистую пробирку, в которую можно было помещать и собирать пробы стула с помощью туалета в больнице. Образцы фекалий хранили при 4 °С сразу после дефекации и доставляли в лабораторию в течение 12 часов после дефекации и хранили при -80 °С до анализа.

2.6. Извлечение ДНК и ПЦР-амплификация. Микробная ДНК была извлечена из 171 образца с помощью мини-набора Qiaamp DNA Stool (Qiagen, Hilden, Германия). Концентрацию геномной ДНК в каждом образце кала определяли количественно с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Целостность и размер ДНК оценивали путем растворения ДНК на 1% агарозном геле с помощью гель-электрофореза на агарозном геле.

2.7. Ампликон и секвенирование гена 16S рРНК. Универсальные праймеры (341F и 806R), связанные с индексами и адаптерами секвенирования, были использованы для амплификации областей V3-V4 гена 16S рРНК. Ампликоны были секвенированы с помощью платформы Illumina HiSeq для получения парных считываний по 250 пар нуклеотидов (п.н.).

Метки, обрезанные по штрих-кодам и праймерам, были дополнительно проверены на их длину покоя и среднее базовое качество, а метки 16S были ограничены 220-500 п.н., так что средний показатель Phred оснований был не хуже 20 (Q20).

2.8. Статистический анализ. Число копий меток было перечислено, а избыточность повторяющихся меток была удалена. Только метки с частотой более 1, которые, как правило, являются более надежными, были сгруппированы в оперативные таксономические единицы (OTUs), каждая из которых имела репрезентативную метку. OTUs были сгруппированы с сходством 97% с использованием UPARSE, а химерные последовательности были идентифицированы и удалены с помощью USEARCH (версия 7.0). Каждая репрезентативная метка была назначена таксонам классификатором RDP для базы данных RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) с использованием доверительного порога 0,8. Таблица профилирования OTUs и анализ альфа- / бета-разнообразия были получены с использованием python-скриптов QIIME. Непрерывные переменные с нормальным распределением были выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD), а переменные с ненормальным распределением были представлены как медиана (межквартильный диапазон). Категориальные переменные были представлены в виде чисел (%). Нормальное распределение данных проверялось с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Различия между группами были обнаружены с использованием критерия Стьюдента (для нормально распределенных непрерывных переменных), U-критерия Манна-Уитни (для асимметричных непрерывных переменных) или критерия хи-квадрат (для категориальных переменных). Множественный логистический регрессионный анализ был использован для определения ассоциаций энтеротипов с СД2. Множественный линейный регрессионный анализ был использован для изучения взаимосвязи между уровнями LPS и чувствительностью к инсулину. Корреляционный анализ между показателями и родами был идентифицирован с использованием корреляционного анализа Спирмена. Корреляционный анализ между несколькими показателями был идентифицирован с использованием частичного корреляционного анализа. Статистический анализ был выполнен с использованием cтатистического пакета для социальных наук (SPSS), версия 17.0, и пакета R для анализа энтеротипа (кластерный пакет). Во всех статистических тестах P <0,05 считалось значимым.

3. Результаты

3.1. Клинические характеристики. Описательные характеристики всех участников показаны в Таблице 1. По сравнению с недиабетическими контролями, у пациентов с СД2 был значительно более высокий возраст, Hb_A1c, FPG, FINS, 2hPG, 2hINS и TG. Пациенты с СД2 также демонстрировали значительно более низкие DBP, 2hСР, холестерин ЛПВП, HOMA-β и Gutt-ISI по сравнению с недиабетической контрольной группой (все P <0,05). Однако не было никакой разницы между двумя группами в значениях HOMA-IR, что, возможно, было связано с плохой функцией β-клеток в группе СД2.

Таблица 1. Характеристики СД2 и контрольной группы.

Параметры	Контрольная группа	Группа СД2	P значение
Возраст (лет)*	50.00 (45.00, 57.50)	59.50 (50.27, 66.64)	<0.001
ИМТ (кг/м2)	25.84 (23.10, 27.17)	25.39 (23.49, 27.51)	0.896
SBP (мм рт. ст.)	133 (120, 147)	131.25 (123.00, 145.50)	0.912
DBP (мм рт. ст.)*	81.80 ±11.31	75.85 ±10.52	0.004
HbA1c (%)*	5.10 (4.90, 5.40)	8.40 (7.30, 9.70)	<0.001
FPG (ммоль/л)*	5.30 (5.20, 5.50)	7.57 (6.31, 8.95)	<0.001
FINS (мкМЕ/мл)*	6.85 (4.29, 8.99)	10.72 (5.97, 19.77)	<0.001
FCP (нг/мл)	1.19 (0.96, 1.58)	1.21 (0.86, 2.01)	0.535
2hPG (ммоль/л)*	5.60 (5.23, 7.45)	16.96 (14.60, 18.41)	<0.001
2hINS (мкМЕ/мл)*	20.81 (15.53, 35.11)	38.40 (22.63, 54.57)	<0.001
2hCP (нг/мл)*	4.62 (4.08, 8.00)	3.87 (2.56, 5.39)	0.001
HDL-C (ммоль/л)*	1.55 (1.38, 1.85)	1.20 (1.02, 1.41)	<0.001
TG (ммоль/л)*	1.04 (0.77, 1.38)	1.38 (1.00, 1.92)	0.001
Gutt-ISI*	0.54 (0.42, 0.65)	0.20 (0.17, 0.25)	<0.001
HOMA-β (CP)*	77.00 (61.70, 90.50)	41.45 (26.60, 63.75)	<0.001
HOMA-IR (CP)	0.89 (0.74, 1.19)	1.05 (0.70, 1.68)	0.100

Нормальное распределение данных было проверено с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Значения выражаются как медиана (межквартильный диапазон; аномальное распределение) и среднее значение ± SD (нормальное распределение). Различия между группами определялись с помощью t-критерия Стьюдента (нормальное распределение) или U–критерия Манна-Уитни (аномальное распределение). СД2, диабет 2 типа; ИМТ, индекс массы тела; SBP, систолическое артериальное давление; DBP, диастолическое артериальное давление; Hb_A1c, уровень гликированного гемоглобина; FPG, глюкоза в плазме крови натощак; FINS, инсулин натощак; FCP, С-пептид натощак; 2hPG, 2 часовая постпрандиальная глюкоза плазмы крови; 2hINS, 2-часовой постпрандиальный плазменный инсулин; 2hCP, 2-часовой постпрандиальный С-пептид;  HDL-C: холестерин липопротеинов высокой плотности (ЛПВП-холестерин); TG, уровень триглицеридов; Gutt-ISI, Гутт-индекс чувствительности к инсулину; HOMA-β, оценка модели гомеостаза функции β-клеток; HOMA-IR, оценка модели гомеостаза инсулинорезистентности. *P < 0,05.

3.2. Анализ микробиоты кишечника между контрольной и СД2 группами

3.2.1. Оценка достоверности данных кишечной микробиоты. После применения контроля качества и обрезки мы получили 9459608 высококачественных чистых считываний от 171 субъекта. Число чистых считываний варьировалось между испытуемыми от 30154 до 64929 со средним значением 55319,35 (SD 7667,47) (таблица S1). Глубина секвенирования была достаточной для достижения целей нашего исследования (рис.S1A). Длина последовательности обрезанных считываний составляла 240-460 п.н. (таблица S2), а большинство считываний варьировалось от 400 до 440 п.н. (рисунок S1B). Качество полученных считываний было надежным.

3.2.2. Анализ OTUs. Общее число OTUs, полученных от 171 субъекта, составило 1141 (таблица S3). Поскольку число считываний между испытуемыми имело широкий диапазон, мы выровняли набор данных, чтобы избежать отклонения, а затем выровненный параметр был определен глубиной секвенирования. Затем мы произвольно извлекли 26437 считываний из каждого образца. Конечное число проанализированных OTUs составило 1129, что составило 98,95% от общего числа OTUs (таблица S4). Из этого конечного числа OTUs 697 были общими как для контрольной, так и для СД2-группы, 406-специфичными только для СД2-группы и 26-специфичными только для контрольной группы (рис.S1C).

Классификатор RDP (http://rdp.cme.msu.edu/)  смог назначить все OTUs на уровне царства, и 1085 (96,10%) были назначены на уровне типа (Таблица S5). OTUs были распределены среди 16 бактериальных типов. Четырьмя доминирующими типами были Firmicutes (46,87%), Bacteroidetes (35,05%), Proteobacteria (11,05%) и Actinobacteria (4,54%) (Таблица S6). Кроме того, 1036, 1018, 904 и 612 OTUs были дополнительно назначены на уровне класса, порядка, семейства и рода соответственно (Таблица S5).

3.2.3. Анализ альфа и бета разнообразия. Альфа (α) разнообразие было использовано для оценки видового разнообразия в образцах. Анализ α-разнообразия, основанный на индексе Шеннона и индексе наблюдаемых видов, показал, что бактериальное разнообразие в образцах фекалий пациентов с СД2 было более низким по сравнению с недиабетической контрольной группой (Рисунки 1 (a) и 1 (b), Таблица S7). Бета (β) разнообразие - состав микробиоты - между контрольной и СД2 группами было проанализировано с использованием анализа основных координат (PCoA), и результаты показали значительное различие между контрольной и СД2 группами (рис. 1 (c)).

Рис.1. Анализ α-разнообразия и β-разнообразия СД2 и контрольной групп. а) разница в индексе Шеннона между группой СД2 и контрольной группой. Р = 0,009. (b) наблюдаемая разница видового индекса между СД2 и контрольными группами. Р = 0,040. На осях-x (а) и (b) показаны две различные группы. Оси y показывают значение индекса α-разнообразия. Аномальные значения показаны “o” (c) PCoA микробиоты между СД2 и контрольной группами. Ось x представляет собой первую главную координату, а процент представляет влияние на разницу между двумя группами. Ось-y представляет вторую главную координату, а процент представляет влияние на разницу между двумя группами. Р_Х = 0,001, Р_у = 0,005. Нижняя сплошная горизонтальная линия представляет минимальное значение, нижняя пунктирная вертикальная линия представляет первый квартиль, центральная сплошная горизонтальная линия представляет медиану, верхняя пунктирная вертикальная линия представляет третий квартиль, а верхняя сплошная горизонтальная линия представляет максимальное значение. Оранжевый цвет представляет группу СД2. Синий цвет представляет контрольную группу. PCoA, анализ главных координат.

3.2.4. Дифференциальный анализ. Мы исследовали структуру микробиома кишечника в двух группах. На уровне типа мы обнаружили, что группа СД2 имела меньшее количество бактероидетов (Bacteroidetes) и более высокое соотношение фирмикутов к бактероидетам (F/B), чем контрольная группа. Кроме того, группа СД2 была обогащена протеобактериями (Proteobacteria) и Актинобактериями (Actinobacteria) (Рис. 2(a) and 2(b)). На уровне родов между этими двумя группами было выявлено 23 рода, существенно отличающихся друг от друга (таблица S8). Среди них было 9 родов, для которых обилие находилось в пределах топ-20 (Рис. 2(c)).

Рис. 2. Относительное содержание фекальных таксонов на разных уровнях. а) для различий в фекальной микробиоте на уровне типа. b) соотношение F/B в двух группах. с) для различий в фекальной микробиоте на уровне родов. Статистический анализ проводился с помощью U-критерия Манна-Уитни. *P < 0,05, **P < 0,01. Контроль, недиабетическая контрольная группа; СД2, группа диабета 2 типа.

3.2.5. Факторный анализ. Уровни DAO, LPS и TNF-α сравнивались между группой СД2 и контрольной группой. За исключением всех гемолитических проб, было проанализировано в общей сложности 144 пробы (108 СД2 и 36 недиабетических). После анализа мы обнаружили, что в группе СД2 уровень DAO, LPS и TNF-α был значительно выше, чем в контрольной группе (Табл. S9).

3.3. Анализ энтеротипов всех 171 субъектов

3.3.1. Номера кластеров и характеристики энтеротипов. Все 171 человек были разделены на два кластера с самой сильной поддержкой (Рисунок 3 (а)). Одним из кластеров был энтеротип Bacteroides (ET B), который включал 134 субъекта (21 контроль, 113 СД2), а другим был энтеротип Prevotella (ET P), который включал 37 субъектов (16 контролей, 21 СД2) (Рисунок 3 (b) Таблица S10). ET B был обогащен 16 родами, включая Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium XIVa, Parabacteroides, Staphylococcus, Granulicatella, Porphyromonas, Clostridium XI, Blautia, Anaerostipes, Clostridium XVIII, Fusicatenibacter, Enterococcus, Clostridium IV, Eggerthella и Flavonifractor. В свою очередь, ET P был обогащен тремя родами, включая Prevotella, Dialister и Sutterella (Рисунок 3 (c)). Для ET B относительная распространенность родов Eggerthella, Enterocuccus, Granulicatella и  Bifidobacterium значительно различалась между СД2 и контрольной группами, и все они были выше в группе СД2. Для ET P относительная численность родов Prevotella значительно различалась между двумя группами и была выше в контрольной группе (Таблица S8).

Рисунок 3. Энтеротипы, идентифицированные у 171 участника с использованием PCoA. (a) Панель (A) показывает, что данные наиболее естественно разделяются на два кластера с помощью анализа Lefse (LDA EffectSize). Ось x показывает номер кластера, а ось y - индекс Калински-Харабаша (Caliński–Harabasz index), который является мерой разделения кластеров. На панели (B) показана кластеризация по первым двум основным компонентам. Красный цвет представляет энтеротип 1 (Bacteroides), а зеленый цвет символизирует энтеротип 2 (Prevotella). (b) Индекс обилия и Превотелл и Бактероидов в каждом энтеротипе. Прямоугольники представляют межквартильный диапазон (IQR), а линия внутри представляет медиану. PCoA, анализ главных координат. (c) Анализ LDA EffectSize двух энтеротипов. Ось x показывает оценку LDA (log 10) после анализа, а ось y показывает значительно дифференцированный род между двумя энтеротипами. Пороговое значение LDA равно 2.

Противодиабетические препараты, принимаемые пациентами с СД2, сравнивали между двумя энтеротипами. Мы обнаружили, что не было значительного различия от употребления лекарств в двух энтеротипах (Таблица S11).

3.3.2. Корреляционный анализ дифференциальных родовых и глюкозных метаболических показателей. Среди родов, распространенных в двух энтеротипах, некоторые были связаны с метаболическими показателями глюкозы. Для ET P превотелла (Prevotella) имела отрицательную корреляцию с Hb_A1c, FPG, 2hPG, HOMA2-IR и положительную корреляцию с Gutt-ISI (r₁ = −0,187, r₂ = −0,284, r3 = −0,252, r₄ = −0,289, r₅ = 0,296, все P < 0,05). Для ET B Enterococcus и Granulicatella имели положительную корреляцию с Hb_A1c (r₁ = 0,237, r₂ = 0,254, P < 0,05). Eggerthella имела положительную корреляцию с FPG (r = 0,189, P = 0,034). Eggerthella, Enterococcus и Bifidobacterium имели положительную корреляцию с 2hPG (r = 0,291, r₁ = 0,236, r₂ = 0,242, all P < 0,05). Eggerthella имела отрицательную корреляцию с HOMA2-β (r = −0,209, P = 0,019), а Clostridium XVIII имели положительную корреляцию с HOMA2-β (r = 0,202, P = 0,024). Bacteroides, Bifidobacterium и Fusicatenibacter имели положительную корреляцию с HOMA2-IR (r₁ = 0,178, r₂ = 0,207, r₃ = 0,215, все P < 0,05). Eggerthella, Enterococcus, Granulicatella и Bifidobacterium имели отрицательную корреляцию с Gutt-ISI (r₁ = −0,363, r₂ = −0,231, r₃ = −0,218, r₄ = −0,299, all P < 0,05) (таблица S12).

3.3.3. Логистический регрессионный анализ ассоциации энтеротипов с СД2. Мы установили три разные модели для наблюдения ассоциаций энтеротипов с СД2 (Таблица 2). В модели 1 мы сначала просто рассмотрели роль энтеротипов в СД2 и обнаружили, что ETB представляет значительно увеличенное отношение шансов (OR) для СД2 (OR = 4,100, P = 0,001). Затем мы скорректировали модель 1 по полу, возрасту и ИМТ, чтобы получить модель 2, и отметили, что ETB оказывал такое же влияние на СД2 (OR = 4,362, P = 0,001). Кроме того, как возраст, так и мужской пол были факторами риска развития СД2; однако ИМТ не имел отношения к СД2. Чтобы исключить влияние других факторов на результаты, мы дополнительно скорректировали модель 2 для TG и HDL-C (ЛПВП-холестерин) (модель 3). Интересно, что ETB и возраст все еще значительно увеличивали риск развития СД2 (OR1 = 3124, P1 = 0,029; OR2 = 1,066, P2 = 0,003), в то время как пол и ИМТ не влияли. Кроме того, TG был также фактором риска для СД2, в то время как HDL-C был защитным фактором. Для дальнейшего изучения роли энтеротипов в СД2 мы добавили HOMA-β, HOMA-IR и Gutt-ISI в логистическую регрессию к модели 3, тем самым установив модели 4, 5 и 6 соответственно (таблица 2). Удивительно, но когда в анализ были добавлены HOMA-β и HOMA-IR, ETB все еще оказывал значительное влияние на СД2; однако, когда был добавлен Gutt-ISI, ETB больше не проявлял значительного влияния на СД2 (P = 0,059).

Таблица 2. Логистический регрессионный анализ связи энтеротипов с риском СД2. 

(a)
Характеристики	Модель 1 OR (95% CI)	P значение	Модель 2 OR (95% CI)	P значение	Модель 3 OR (95% CI)	P значение
ET B	4.100 (1.842–9.124)	0.001*	4.362 (1.820–10.454)	0.001*	3.124 (1.121–8.705)	0.029*
Мужчина	—	—	3.002 (1.268–7.109)	0.012∗	1.218 (0.435–3.408)	0.708
Возраст (лет)	—	—	1.057 (1.022–1.093)	0.001∗	1.066 (1.023–1.111)	0.003∗
ИМТ (кг/м2)	—	—	1.006 (0.909–1.113)	0.911	0.928 (0.830–1.037)	0.188
TG (ммоль/л)	—	—			1.604 (1.030–2.497)	0.037∗
HDL-C (ммоль/л)	—	—			0.038 (0.008–0.184)	<0.001∗
(b)
Характеристики	Модель 4 OR (95% CI)	P значение	Модель 5 OR (95% CI)	P значение	Модель 6 OR (95% CI)	P значение
ET B	4.668 (1.298–16.786)	0.018*	3.096 (1.096–8.742)	0.033*	5.786 (0.935–35.801)	0.059
Мужчина	1.871 (0.560–6.254)	0.309	1.218 (0.434–3.416)	0.708	2.141 (0.371–12.347)	0.394
Возраст (лет)	1.059 (1.006–1.114)	0.029*	1.065 (1.021–1.110)	0.003*	1.070 (1.001–1.144)	0.047*
ИМТ (кг/м2)	0.918 (0.810–1.041)	0.183	0.929 (0.828–1.043)	0.047∗	—	—
TG (ммоль/л)	1.760 (1.030–3.006)	0.038∗	1.612 (1.032–2.518)	0.036∗	0.915 (0.658–1.273)	0.915
HDL-C (ммоль/л)	0.014 (0.002–0.107)	<0.001∗	0.037 (0.007–0.191)	<0.001∗	0.170 (0.016–1.808)	0.170
HOMA-β	0.956 (0.938–0.974)	<0.001∗	—	—	—	—
HOMA-IR	—	—	0.903 (0.386–2.112)	0.814	—	—
Gutt-ISI	—	—	—	—	0.000 (0.000–0.000)	<0.001*

Модель 1 не имела регулируемой переменной. Модель 2 корректируется с учетом возраста, пола и ИМТ. Модель 3 с поправкой на модель 2 плюс TG и HDL-C (ЛПВП-холестерин). Модель 4 настраивается для модели 3, а также индекса HOMA-β. Модель 5 приспособлена для модели 3 плюс HOMA-IR. Модель 6 корректируется для модели 3 плюс Gutt-ISI, так как для расчета Gutt-ISI использовалась масса тела, ИМТ был удален в модели 6. *P < 0,05. ET B, энтеротип Bacteroides; ИМТ, индекс массы тела; TGs, уровень триглицеридов; HDL-C, холестерин липопротеидов высокой плотности; HOMA-β, оценка модели гомеостаза функции β-клеток; HOMA-IR, оценка модели гомеостаза инсулинорезистентности; Gutt-ISI, индекс чувствительности к инсулину.

3.3.4. Сравнение индекса HOMA-β, Нома-IR и Gutt-ISI между двумя Энтеротипами. Основываясь на различных результатах, касающихся взаимосвязи между ETB и СД2 в моделях 3 и 6 (табл.2), мы предположили, что ETB может увеличить риск развития СД2 за счет снижения чувствительности к инсулину. Для дальнейшей проверки этого предположения мы сравнили значения HOMA-β, HOMA-IR и Gutt-ISI между двумя энтеротипами (таблица S13), что позволило предположить наличие разницы в чувствительности к инсулину, но не в функции β-клеток.

3.3.5. Сравнение DAO, LPS, TNF-α и возраста между двумя Энтеротипами. Предыдущие исследования показали, что микробиота кишечника может снижать чувствительность к инсулину путем эндотоксемии и низкодифференцированного воспаления [24, 25]. Поэтому мы сравнили уровни DAO, LPS и TNF-α между ETB и ETP и обнаружили, что уровни LPS и TNF-α были выше в ETB, в то время как не было никакой существенной разницы в уровне DAO и возрасте (Табл. 3).

Таблица 3. Сравнение четырех факторов в ETB и ETP.

Фактор	ET B	ET P	P значение
DAO (мкМЕ/мл)	367.75 (223.31, 547.55)	258.50 (167.01, 404.86)	0.081
LPS (пг/мл)	128.88 (89.04, 184.00)	88.73 (64.81, 128.83)	0.007*
TNF-α (пг/мл)	58.28 (35.81, 93.76)	36.75 (22.01, 87.43)	0.047*
Возраст (лет)	58.61 (49.60, 65.24)	52.44 (47.00, 63.82)	0.188

*Р <0:05. ET B: энтеротип Bacteroides; ET P: энтеротип Prevotella; DAO: диаминоксидаза; LPS: липополисахарид; TNF-α: фактор некроза опухолей-альфа.

3.3.6. Корреляционный анализ DAO, LPS, TNF-α, возраста и фекального микробиома. Корреляционный анализ Спирмена использовался для дальнейшего изучения взаимосвязи между DAO, LPS, TNF-α, возрастом и родами, обогащенными ET B и ET P. Для ET P Sutterella имела отрицательную корреляцию с возрастом (r = −0,234, P = 0,009). Prevotella имела отрицательную корреляцию с LPS и TNF-α (r₁ = −0,24, r₂ = −0,319, all P < 0,05). Для ET B Bifidobacterium и Eggerthella имели положительную корреляцию с возрастом (r₁ = 0,392, r₂ = 0,256, both P < 0,05). Blautia, Eggerthella и Flavonifractor имели положительную корреляцию с DAO (r₁ = 0,222, r₂ = 0,309, r₃ = 0,241, all P < 0,05). Bifidobacterium, Granulicatella и Eggerthella имели положительную корреляцию с LPS (r₁ = 0,246, r₂ = 0,187, r₃ = 0,223, all P < 0,05). Flavonifractor имел положительную корреляцию с TNF-α (r = 0,214, P = 0,024) (таблица S14).

3.3.7. Частичный корреляционный анализ DAO, LPS, TNF-α и Gutt-ISI. Чтобы дополнительно изучить связь между уровнями DAO, LPS, TNF-α и чувствительностью к инсулину, мы проанализировали корреляцию Gutt-ISI с DAO, LPS и TNF-α, используя частичный корреляционный анализ, с учетом возраста, ИМТ, TG, и HDL-C (таблица 4). Интересно, что LPS был тесно связан с DAO, TNF-α и Gutt-ISI. Кроме того, TNF-α имеет тенденцию к отрицательной корреляции с Gutt-ISI (значение P = 0,059).

Таблица 4. Частичный корреляционный анализ Gutt-ISI с DAO, LPS и TNF-α.

Характеристика	DAO r	P	LPS r	P	TNF-α r	P	Gutt-ISI r	P
DAO			0.237	0.006*	0.094	0.279	-0.032	0.717
LPS	0.237	0.006*			0.242	0.005*	-0.223	0.010*
TNF-α	0.094	0.279	0.242	0.005*			-0.164	0.059
Gutt-ISI	-0.032	0.717	-0.223	0.010*	-0.164	0.059

Частичный корреляционный анализ был скорректирован с учетом возраста, ИМТ, TG и HDL-C (ЛПВП-холестерин). r: коэффициент корреляции; P: значение P *P <0:05; DAO: диаминоксидаза; LPS: липополисахарид; TNF-α: фактор некроза опухолей-альфа; Gutt-ISI: индекс чувствительности к инсулину.

3.3.8. Анализ множественной линейной регрессии. Мы также выполнили множественный линейный регрессионный анализ, чтобы определить, были ли уровни LPS или DAO независимыми факторами риска для чувствительности к инсулину (Таблица 5). Исходя из результатов, мы пришли к выводу, что LPS является независимым фактором риска для чувствительности к инсулину после корректировки на возраст, ИМТ, TG, HDL-C (ЛПВП-холестерин), DAO и TNF-α. Когда дело доходит до DAO, после поправки на возраст он больше не является фактором риска для чувствительности к инсулину (Таблица S15).

Таблица 5: Множественный линейный регрессионный анализ ассоциации Gutt-ISI с LPS.

Характеристики	Модель 1 B	P значение	Модель 2 B	P value	Модель 3 B	P значение
LPS (пг/мл)	0.000 (-0.001-0.000)	<0.001*	0.000 (-0.001-0.000)	0.010*	0.000 (-0.001-0.000)	0.027*
Возраст (лет)	—	—	-0.005 (-0.007-0.002)	0.001*	-0.005 (-0.008-0.002)	0.001*
ИМТ (кг/м2)	—	—	-0.001 (-0.009-0.007)	0.787	-0.002 (-0.010-0.007)	0.702
TG (ммоль/л)	—	—	-0.020 (-0.033-0.006)	0.005*	-0.020 (-0.034-0.006)	0.005*
HDL-C (ммоль/л)	—	—	0.180 (0.096-0.264)	<0.001*	0.179 (0.095-0.263)	<0.001*
DAO (мкМЕ/мл)	—	—	—	—	0.000 (0.000-0.000)	0.758
TNF-α (пг/мл)	—	—			0.000 (-0.001-0.000)	0.182

Модель 1 не имела скорректированной переменной. Модель 2 с поправкой на возраст, ИМТ, TG и HDL-C. Модель 3 приспособлена для модели 2 плюс DAO и TNF-α. P: значение P, *P <0:05; Gutt-ISI: индекс чувствительности к инсулину Гутта; DAO: диаминоксидаза; LPS: липополисахарид; TNF-α: фактор некроза опухолей-альфа; ИМТ: индекс массы тела; TG: уровни триглицеридов; HDL-C: холестерин липопротеинов высокой плотности.

4. Дискуссия

В нашем исследовании мы сначала сравнили различия в микробиоме кишечника между СД2 и контрольной группой. Анализ разнообразия показал, что состав микробиоты был разным в контрольной и СД2-группе, а СД2-группа имела более низкое бактериальное разнообразие, чем контрольная группа, что согласуется с результатами предыдущих исследований [1, 2]. Дифференциальный анализ показал, что число таксонов-кандидатов, связанных с микробным дисбиозом кишечника, в группе СД2 было 3 на уровне типа и 23 на уровне родов. На уровне типов в некоторых исследованиях было обнаружено большее количество Bacteroidetes у пациентов с СД2, что казалось несовместимым с нашим результатом [1, 8]. Исследования показали, что более низкая распространенность типа Bacteroidetes и увеличение отношения Firmicutes / Bacteroidetes связано с ожирением и дислипидемией [26, 27]. В нашем исследовании пациенты в группе СД2 имели более высокий уровень триглицеридов (TG), чем контрольная группа, что может повлиять на результат. На уровне рода большинство дифференциальных родов соответствовали другим исследованиям, таким как обогащение Prevotella в контрольной группе [8] или обогащение Escherichia / - Shigella, Lactobacillus в группе СД2 [28]. Тем не менее, Bifidobacterium был обогащен в группе СД2, что может быть связано с использованием AGI [14]. В соответствии с одним из механизмов, касающихся микробиома кишечника и СД2, мы обнаружили повышенные уровни DAO, LPS и TNF-α в группе СД2, которые показали нарушение проницаемости кишечника, метаболическую эндотоксемию и воспаление слабой степени в группе СД2.

Энтеротипный анализ был предложен в качестве полезного метода для понимания микробных сообществ человека, включая энтеротипы Bacteroides, Ruminococcus и Prevotella, независимо от этнической принадлежности, пола, возраста или ИМТ [16]. В 2011 году Wu et al. сгруппированные фекальные сообщества человека в два энтеротипа, отличающиеся в первую очередь уровнем Bacteroides и Prevotella. Затем они обнаружили, что эти два энтеротипа были тесно связаны с долгосрочным рационом питания, особенно с белком и животным жиром (Bacteroides) по сравнению с углеводами (Prevotella). В нашем исследовании все образцы фекалий были разделены на два одинаковых энтеротипа, хотя среди людей не было различий в рационе. Дифференциальный анализ между двумя энтеротипами и корреляционный анализ дифференциальных метаболических индексов рода и глюкозы показали, что существует связь между энтеротипом и СД2. Дальнейший анализ логистической регрессии показал, что ET B был независимым фактором риска развития СД2, который может быть обусловлен снижением чувствительности к инсулину, а не влиянием на функцию β-клеток. Основываясь на предыдущих исследованиях, касающихся микробиоты кишечника и резистентности к инсулину [24, 25], мы предположили, что ET B был связан с повышенной кишечной проницаемостью, которая затем приводила к более высокой концентрации бактериального LPS в крови. Вызванное эндотоксемией низкосортное воспаление может вызвать снижение чувствительности к инсулину. Таким образом, мы сравнили уровни DAO, LPS и TNF-α у двух энтеротипов и обнаружили, что у группы ET B были более высокие уровни LPS и TNF-α, но не было значительного изменения уровня DAO. Дальнейший корреляционный анализ показал, что роды Eggerthella, которые имели наиболее сильную положительную корреляцию с DAO, также имели положительную корреляцию с возрастом. Таким образом, по сравнению с энтеротипом, возраст может играть более важную роль на уровне DAO, и более высокий уровень LPS в ET B может быть независимым от DAO у наших субъектов. Частичный корреляционный анализ с поправкой на возраст, ИМТ, TG и HDL-C показал, что LPS положительно коррелирует с DAO и TNF-α и отрицательно коррелирует с чувствительностью к инсулину. Это объясняет, почему возраст был независимым фактором риска развития СД2. После поправки на возраст, ИМТ, TG, HDL-C, DAO и TNF-α уровень LPS оставался независимым фактором риска для чувствительности к инсулину. Но после поправки на возраст DAO больше не был фактором риска для Gutt-ISI. На основании результатов, приведенных выше, мы пришли к выводу, что более высокий DAO, обнаруженный в группе СД2, был результатом старшего возраста, и что у людей с ET B наблюдалась более высокая концентрация LPS в сыворотке, независимая от DAO. Это повышение уровня LPS в сыворотке может вызвать эндотоксемию и слабое воспаление, что, в свою очередь, может снизить чувствительность к инсулину.

Предыдущие исследования показали, что ET P был связан с диетой с высоким содержанием клетчатки [19], а индуцированное пищевыми волокнами улучшение метаболизма глюкозы было связано с увеличением обилия Prevotella (Превотеллы) и высоким соотношением Prevotella/Bacteroides [11]. Rampelli et al. установлено, что функциональный репертуар Превотеллы связан с повышенной способностью кишечной микробиоты ферментировать сложные полисахариды из рациона питания [29]. Эти исследования показали, что различная способность Превотеллы и Бактероидов осуществлять ферментацию углеводов в кишечнике способствовала различиям, наблюдаемым с точки зрения метаболизма глюкозы, и подчеркнули важность Превотеллы в улучшении толерантности к глюкозе. Благотворный механизм до сих пор не ясен. В нашем исследовании мы также наблюдали, что ET P был защитным фактором для метаболизма глюкозы. Хотя не было никакой разницы в диете, ET P, который имел более высокий уровень Prevotella, мог использовать углеводы в рационе более эффективно и мог производить больше короткоцепочечных жирных кислот (SCFAs). SCFAs являются основным источником энергии для энтероцитов и могут помочь поддерживать целостность кишечной стенки.

Для ETB, хотя Bacteroides был т.н. ведущим родом, его обилие не отличалось между СД2 и контрольной группой, и оно не имело корреляции с уровнями факторов. Таким образом, другие роды могут играть доминирующую роль в инсулинорезистентности. Помимо бактероидов, ETB был обогащен многими условно-патогенными микроорганизмами, такими как Eggerthella, Clostridium, Staphylococcus, Granulicatella и Enterococcus. Многие из них также были обнаружены обогащенными у пациентов с СД2 в других исследованиях [1, 3]. Эти роды могут повреждать кишечную проницаемость эндотоксином или экзотоксином, что затем приводит к бактериальной транслокации, эндотоксемии, низкосортному воспалению и инсулинорезистентности.

Наше исследование показало, что ET B является фактором риска развития СД2 из-за эндотоксемии и слабого воспаления. Проанализировав характеристики двух энтеротипов, мы подумали, что более высокий уровень LPS в ET B может быть вызван нарушением проницаемости кишечника. Но наше исследование не обнаружило значительного повышения уровня DAO в ET B. Несколько причин могут объяснить этот сценарий. Во-первых, кишечная барьерная функция состоит из трех основных частей: механического барьера, экологического барьера и иммунологического барьера. DAO - это просто биомаркер целостности эпителия кишечника, который может частично отражать функцию механического барьера. Поскольку другие барьерные функции, такие как структурная функция плотного соединения и иммунная функция слизистой, не оценивались, необходимо провести дальнейшие исследования для сравнения проницаемости кишечника между энтеротипом ET B и ET P. Во-вторых, номер выборки из двух энтеротипов был несбалансированным, что влияет на результат U-теста Манна-Уитни.

Наше исследование имеет некоторые ограничения. Во-первых, количество анализируемых выборок было небольшим, а это значит, что репрезентативность нашего исследования не была идеальной. Во-вторых, мы использовали только один метод для кластеризации образцов фекалий, и мы не подтверждали структуру микробиоты в других популяциях. В-третьих, дизайн нашего исследования был поперечным, что не может доказать причинно-следственные связи. Исходя из вышеизложенного, точное влияние энтеротипов на СД2 должно быть дополнительно подтверждено большим проспективным исследованием, а также должно быть подтверждено на животных моделях. Тем не менее, результаты нашего исследования дают новое направление для изучения взаимосвязи между микробиотой кишечника и СД2.

5. Выводы

Наше исследование было направлено на изучение существования энтеротипов среди пациентов с СД2 и недиабетическим контролем, а также на наличие взаимосвязи между энтеротипом и СД2. Наши результаты показали, что существует существенная разница в структуре кишечной микробиоты между СД2 и недиабетическими группами. Кроме того, мы определили два энтеротипа среди наших субъектов и показали, что ETB (энтеротип  Bacteroides) был независимым фактором риска развития СД2. Кроме того, этот повышенный риск был связан с повышением уровня LPS и снижением чувствительности к инсулину в ET B, который не зависел от уровня DAO, но мог быть связан с барьерной функцией кишечника. Взятые вместе, наше исследование дает новое понимание взаимосвязи между кишечной микробиотой и СД2, а также новое направление для изучения взаимодействия между СД2 и кишечной микробиотой.

Дополнительный материал (Supplementary):

• Supplementary 1. Таблица S1. Количество чистых чтений и средняя продолжительность чтения по каждому субъекту.
• Supplementary 2. Таблица S2. Распределение длины последовательности усеченных чтений.
• Supplementary 3. Таблица S3. Количество OTUs (оперативных таксономических единиц) по каждому субъекту.
• Supplementary 4. Окончательное количество OTUs каждого субъекта после выравнивания.
• Supplementary 5. Таблица S5. Количество OTUs, которые могут быть назначены на каждом уровне.
• Supplementary 6. Таблица S6. Распределение OTUs в 16 бактериальных типах в каждом образце.
• Supplementary 7. Таблица S7. Анализ α-разнообразия в контрольной и СД2 группах.
• Supplementary 8. Таблица S8. Дифференциальные роды между СД2 и контрольной группой.
• Supplementary 9. Таблица S9. Сравнение трех факторов между СД2 и контрольной группой.
• Supplementary 10. Таблица S10. Кластер, к которому принадлежит каждый образец.
• Supplementary 11. Таблица S11. Употребление лекарств в двух энтеротипах.
• Supplementary 12. Таблица S12. Корреляционный анализ дифференциальных метаболических показателей рода и глюкозы.
• Supplementary 13. Таблица S13. Сравнение двух энтеротипов с использованием трех индексов.
• Supplementary 14. Таблица S14. Корреляционный анализ DAO, LPS, TNF-α, возраста и фекального микробиома.
• Supplementary 15. Таблица S15. Множественный линейный регрессионный анализ ассоциации Gutt-ISI с DAO.
• Supplementary 16. Рисунок S1. Изображение кривой разведения индекса Chao1, длина усеченных чтений и диаграмма OTU Венна для всех субъектов.

К разделам:

• Микробиом и диабет
  
• Дополнительная информация к разделу "Микробиом человека"

Дополнительно см.:  Вклад кишечной микробиоты в патогенез инсулинорезистентности

Литература

1. N. Larsen, F. K. Vogensen, F. W. van den Berg et al., “Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults,” PLoS One, vol. 5, no. 2, article e9085, 2010.View at: Publisher Site | Google Scholar
2. J. Qin, Y. Li, Z. Cai et al., “A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes,” Nature, vol. 490, no. 7418, pp. 55–60, 2012.View at: Publisher Site | Google Scholar
3. X. Wang, X. Xu, and Y. Xia, “Further analysis reveals new gut microbiome markers of type 2 diabetes mellitus,” Antonie Van Leeuwenhoek, vol. 110, no. 3, pp. 445–453, 2017.View at: Publisher Site | Google Scholar
4. M. U. Sohail, A. Althani, H. Anwar, R. Rizzi, and H. E. Marei, “Role of the gastrointestinal tract microbiome in the pathophysiology of diabetes mellitus,” Journal Diabetes Research, vol. 2017, article 9631435, 9 pages, 2017.View at: Publisher Site | Google Scholar
5. Y. Yamaguchi, K. Adachi, T. Sugiyama et al., “Association of intestinal microbiota with metabolic markers and dietary habits in patients with type 2 diabetes,” Digestion, vol. 94, no. 2, pp. 66–72, 2016.View at: Publisher Site | Google Scholar
6. F. H. Karlsson, V. Tremaroli, I. Nookaew et al., “Gut metagenome in European women with normal, impaired and diabetic glucose control,” Nature, vol. 498, no. 7452, pp. 99–103, 2013.View at: Publisher Site | Google Scholar
7. J. Sato, A. Kanazawa, F. Ikeda et al., “Gut dysbiosis and detection of “live gut bacteria” in blood of Japanese patients with type 2 diabetes,” Diabetes Care, vol. 37, no. 8, pp. 2343–2350, 2014.View at: Publisher Site | Google Scholar
8. X. Wu, C. Ma, L. Han et al., “Molecular characterisation of the faecal microbiota in patients with type II diabetes,” Current Microbiology, vol. 61, no. 1, pp. 69–78, 2010.View at: Publisher Site | Google Scholar
9. S. Ussar, N. W. Griffin, O. Bezy et al., “Interactions between gut microbiota, host genetics and diet modulate the predisposition to obesity and metabolic syndrome,” Cell Metabolism, vol. 22, no. 3, pp. 516–530, 2015.View at: Publisher Site | Google Scholar
10. A. Vrieze, E. Van Nood, F. Holleman et al., “Transfer of intestinal microbiota from lean donors increases insulin sensitivity in individuals with metabolic syndrome,” Gastroenterology, vol. 143, no. 4, pp. 913–916.e7, 2012.View at: Publisher Site | Google Scholar
11. P. Kovatcheva-Datchary, A. Nilsson, R. Akrami et al., “Dietary fiber-induced improvement in glucose metabolism is associated with increased abundance of Prevotella,” Cell Metabolism, vol. 22, no. 6, pp. 971–982, 2015.View at: Publisher Site | Google Scholar
12. A. Everard, V. Lazarevic, M. Derrien et al., “Responses of gut microbiota and glucose and lipid metabolism to prebiotics in genetic obese and diet-induced leptin-resistant mice,” Diabetes, vol. 60, no. 11, pp. 2775–2786, 2011.View at: Publisher Site | Google Scholar
13. K. Forslund, F. Hildebrand, T. Nielsen et al., “Disentangling type 2 diabetes and metformin treatment signatures in the human gut microbiota,” Nature, vol. 528, no. 7581, pp. 262–266, 2015.View at: Publisher Site | Google Scholar
14. F. Zhang, M. Wang, J. Yang et al., “Response of gut microbiota in type 2 diabetes to hypoglycemic agents,” Endocrine, vol. 66, no. 3, pp. 485–493, 2019.View at: Publisher Site | Google Scholar
15. X. Zhang, D. Shen, Z. Fang et al., “Human gut microbiota changes reveal the progression of glucose intolerance,” PLoS One, vol. 8, no. 8, article e71108, 2013.View at: Publisher Site | Google Scholar
16. M. Arumugam, J. Raes, E. Pelletier et al., “Enterotypes of the human gut microbiome,” Nature, vol. 473, no. 7346, pp. 174–180, 2011.View at: Publisher Site | Google Scholar
17. T. Ding and P. D. Schloss, “Dynamics and associations of microbial community types across the human body,” Nature, vol. 509, no. 7500, pp. 357–360, 2014.View at: Publisher Site | Google Scholar
18. Y. Zhou, K. A. Mihindukulasuriya, H. Gao et al., “Exploration of bacterial community classes in major human habitats,” Genome Biology, vol. 15, no. 5, p. R66, 2014.View at: Publisher Site | Google Scholar
19. G. D. Wu, J. Chen, C. Hoffmann et al., “Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes,” Science, vol. 334, no. 6052, pp. 105–108, 2011.View at: Publisher Site | Google Scholar
20. H. M. Roager, T. R. Licht, S. K. Poulsen, T. M. Larsen, and M. I. Bahl, “Microbial enterotypes, inferred by the Prevotella-to-Bacteroides ratio, remained stable during a 6-month randomized controlled diet intervention with the new Nordic diet,” Applied and Environmental Microbiology, vol. 80, no. 3, pp. 1142–1149, 2014.View at: Publisher Site | Google Scholar
21. M. J. Claesson, I. B. Jeffery, S. Conde et al., “Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly,” Nature, vol. 488, no. 7410, pp. 178–184, 2012.View at: Publisher Site | Google Scholar
22. K. G. Alberti and P. Z. Zimmet, “Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation,” Diabetic Medicine, vol. 15, no. 7, pp. 539–553, 1998.View at: Publisher Site | Google Scholar
23. J. C. Levy, D. R. Matthews, and M. P. Hermans, “Correct homeostasis model assessment (HOMA) evaluation uses the computer program,” Diabetes Care, vol. 21, no. 12, pp. 2191-2192, 1998.View at: Publisher Site | Google Scholar
24. P. D. Cani, R. Bibiloni, C. Knauf et al., “Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia-induced inflammation in high-fat diet-induced obesity and diabetes in mice,” Diabetes, vol. 57, no. 6, pp. 1470–1481, 2008.View at: Publisher Site | Google Scholar
25. P. D. Cani, J. Amar, M. A. Iglesias et al., “Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance,” Diabetes, vol. 56, no. 7, pp. 1761–1772, 2007.View at: Publisher Site | Google Scholar
26. P. J. Turnbaugh, F. Bäckhed, L. Fulton, and J. I. Gordon, “Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome,” Cell Host & Microbe, vol. 3, no. 4, pp. 213–223, 2008.View at: Publisher Site | Google Scholar
27. P. J. Turnbaugh, R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon, “An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest,” Nature, vol. 444, no. 7122, pp. 1027–1031, 2006.View at: Publisher Site | Google Scholar
28. M. Sedighi, S. Razavi, F. Navab-Moghadam et al., “Comparison of gut microbiota in adult patients with type 2 diabetes and healthy individuals,” Microbial Pathogenesis, vol. 111, pp. 362–369, 2017.View at: Publisher Site | Google Scholar
29. S. Rampelli, S. L. Schnorr, C. Consolandi et al., “Metagenome sequencing of the Hadza hunter-gatherer gut microbiota,” Current Biology, vol. 25, no. 13, pp. 1682–1693, 2015.View at: Publisher Site | Google Scholar

Будьте здоровы!