ООО "ПРОПИОНИКС"
пн-пт с 09:00 до 18:00 | |
СОДЕРЖАНИЕ
Резюме: Неэрозивная рефлюксная болезнь (НЭРБ) и аденокарцинома пищевода (АП) часто рассматриваются как форзацы в спектре гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ). Тем не менее, существует ограниченное количество клинических данных, подтверждающих эту парадигму заболевания, в то время как основные механизмы прогрессирования заболевания остаются неясными. В этом исследовании мы использовали секвенирование 16S рРНК и масс-спектрометрическую протеомику для характеристики микробиоты пищевода и протеома слизистой оболочки хозяина, соответственно. Всего было проанализировано 70 участников из четырех групп пациентов (НЭРБ, рефлюкс-эзофагит (РЭ), пищевод Барретта (ПБ) и АП) и контрольной группы. Наши результаты показали уникальный состав микробиоты НЭРБ, отличный от контрольной и других групп. Мы предполагаем, что увеличение сульфатредуцирующих протеобактерий и бактероидетов (Proteobacteria and Bacteroidetes) наряду с продуцентом водорода Dorea связано с механистической ролью в висцеральной гиперчувствительности. Мы также наблюдали отчетливую микробиоту АП, состоящую из большого количества бактерий, продуцирующих молочную кислоту (Staphylococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium и Streptococcus), которые могут способствовать канцерогенезу за счет дисрегуляции метаболизма лактата. Это исследование предполагает тесную связь между микробиотой слизистой пищевода и появлением патологий этого органа.
Распространенность гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) увеличилась за последние два десятилетия и затронула 10–20% населения Запада и 5% в Азии [1]. ГЭРБ традиционно рассматривается как спектральное заболевание, при котором постепенное воздействие на желудочный дистальный отдел пищевода приводит к развитию более серьезных симптомов, повреждения слизистой оболочки и осложнений [2]. Вдоль спектра ГЭРБ неэрозивная рефлюксная болезнь (НЭРБ) находится на мягком конце, прогрессируя в направлении эрозивного рефлюкс-эзофагита (РЭ), пищевода Барретта (ПБ) и, в конечном счете, аденокарциномы пищевода (АП). Тем не менее, существует ограниченная клиническая информация в поддержку этой парадигмы. Например, текущие данные показывают, что только 10% НЭРБ прогрессируют до РЭ [3]. Точно так же частота развития АП у людей с хронической ГЭРБ является относительно низкой (3,2 / 100 000) [4], в то время как до настоящего времени ни медикаментозное, ни хирургическое лечение ГЭРБ и ПБ не показало убедительных доказательств предотвращения развития АП [5]. Таким образом, существует значительный интерес для определения основных механизмов этих рефлюксных заболеваний.
При нормальных обстоятельствах рефлюкс в пищевод предотвращается с помощью антирефлюксного барьерного соединения нижнего пищеводного сфинктера (НПС), внешней краральной (относящейся к мышечным ножкам поясничной части) диафрагмыи опорных структур желудочно-пищеводного клапана. Когда эти защитные компоненты скомпрометированы, вредные эффекты являются аддитивными, что приводит к увеличению рефлюкса. Длительность воздействия рефлюкса определяется эффективностью клиренса пищевода, из которых перистальтика, слюноотделение и наличие грыжи пищевода являются ключевыми определяющими факторами. Сенсорные механизмы в дистальном отделе пищевода определяют связь между воздействием рефлюкса и генерацией симптомов [2]. Кроме того, ряд гормонов модулирует секрецию желудочной кислоты и координирует функцию НПС. Гастрин ингибирует опорожнение желудка и, как показано, одновременно вызывает секрецию желудочной кислоты и сужение НПС. И наоборот, ингибиторы желудочной кислоты, секретин и нейротензин, также снижают тонус НПС [6]. В последние годы микробиота пищевода человека стала ассоциироваться с развитием рефлюксной болезни. Исследования с использованием секвенирования генов 16S рРНК выявили специфические профили микробиоты, связанные с ГЭРБ. Yang et al. [7], в 2009 году было выявлено изменение в популяции грамотрицательных бактерий в РЭ- и ПБ-микробиоме, в то время как Blackett et al. [8] объединили оценку, основанную на культивировании и секвенировании, и обнаружили высоко распространенную грамположительную бактериальную популяцию в биопсиях АП. Недавно в японском исследовании был проведен уникальный тест для количественной оценки общих бактериальных нагрузок с помощью количественной ПЦР гена 16S рРНК [9]. Исследование показало, что относительная распространенность таксонов (Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Fusobacteria и Actinobacteria), а не абсолютные бактериальные нагрузки, скорее всего, более актуальны для заболеваний пищевода.
Чтобы исследовать причинность и микробный дисбиоз в патогенезе рефлюксной болезни, мы стремимся охарактеризовать микробиоту пищевода и основной протеом слизистой оболочки хозяина. Предыдущие исследования характеризовали состав микробиоты в слизистой оболочке пищевода в конкретных условиях в спектре ГЭРБ (РЭ и ПБ [7] и АП [8]), однако микробиота через последствия нарушений кислотного рефлюкса остается неисследованной. Учитывая прогрессивную природу ГЭРБ, мы предположили, что изучение микробиоты слизистой пищевода и основного протеома хозяина по всему спектру ГЭРБ позволит получить представление о прогрессировании заболевания и возможных механизмах патогенеза.
Сбор проб был одобрен Комитетом по этике исследований местного округа здравоохранения Юго-Западного Сиднея (HREC / 16 / LPOOL / 143; 09 июня 2016 г.), Университет Западного Сиднея (RH11759; 07 июля 2016 г.), учреждение здравоохранения местного округа Nepean Blue Mountains (SSA / 18 / NEPEAN / 35 01 марта 2017 г.). От участников было получено письменное согласие.
Образцы для анализа были получены от пациентов, проходивших рутинную диагностическую эндоскопию верхних отделов желудочно-кишечного тракта для изучения симптомов в больнице Кэмпбеллтаун (Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в период с 2017 по 2018 год. Всего было набрано 70 человек и классифицировано на 1 из 5 фенотипов на основе симптоматических и гистопатологических характеристик (табл.1): (1) контрольные группы (n = 16) были отобраны из числа лиц, направленных на эндоскопию для исследования железодефицитной анемии или болей в нижней части живота, у которых не было эндоскопических признаков заболеваний пищевода, желудка или двенадцатиперстной кишки. Биопсия слизистой оболочки была получена и подтверждена гистологически нормальной в контрольных образцах. Был использован простой опросник симптомов ГЭРБ: пациентов спрашивали о наличии и частоте шести специфических симптомов (изжога, регургитация, боль в эпигастрии или груди, полнота эпигастрия, дисфагия и кашель), испытываемых в течение последних 3 месяцев. Пациенты контрольной группы не испытывали никаких симптомов. (2) участники НЭРБ (n = 11) не имели эндоскопических признаков заболевания пищевода и нормальной гистологии, но испытывали симптомы рефлюкса в течение последних 3 месяцев. (3) участники РЭ (n = 20) имели эндоскопические признаки эзофагита, основанные на Лос-Анджелесской классификации. (4) участники ПБ (n = 17) имели не менее 1 см столбчатого выстланного пищевода и наличие кишечной метаплазии, подтвержденной гистологически. (5) участники АП (n = 6) были набраны из больницы Кэмпбелтаун и больницы Непин (Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в период с 2017 по 2018 год. Диагноз АП был подтвержден гистологией. Образцы были взяты во время исследования. Пациенты были в возрасте > 18 лет, и критерием исключения было использование лекарств, которые могли нарушить микробиоту, а именно антибиотиков или пробиотиков в течение 3 месяцев исследования.
Таблица 1. Характеристики субъектов
Группа
|
Контроль
|
НЭРБ
|
РЭ
|
ПБ
|
АП
|
Переменные
|
|||||
Субъекты
|
16
|
11
|
20
|
17
|
6
|
Пол (Мужской : Женский)
|
2:14
|
3:9
|
6:14
|
12:5
|
6:0
|
Средний возраст (квартили 1 – 3)
|
52 (36–64)
|
63 (66–51)
|
55 (43–65)
|
58 (49–69)
|
67 (62–70)
|
Симптомы рефлюкса
|
0
|
11 (100%)
|
18 (90%)
|
10 (59%)
|
3 (50%)
|
Рефлюкс-лекарство
|
|||||
Ингибитор протонной помпы
|
0
|
4 (36%)
|
10 (50%)
|
10 (59%)
|
1 (17%)
|
Воспаление / наличие лимфоцитов
|
0
|
0
|
17 (85%)
|
4 (24%)
|
1 (17%)
|
Аномальная клеточная морфология
|
|||||
Гиперплазия
|
0
|
0
|
7 (35%)
|
0
|
0
|
Метаплазия
|
0
|
0
|
0
|
16 (94%)
|
0
|
Дисплазия
|
0
|
0
|
0
|
1 (6%)
|
|
Аденокарцинома
|
0
|
0
|
0
|
0
|
6 (100%)
|
НЭРБ: неэрозивная рефлюксная болезнь; РЭ: рефлюкс-эзофагит; ПБ: пищевод Барретта; АП: аденокарцинома пищевода.
Образцы цитологической щетки (Cook Medical, Bloomington, IN, USA) и эндоскопические биопсии слизистой оболочки брали во время введения, чтобы минимизировать загрязнение. Цитологические щетки были закрыты и эндоскопически вставлены в целевой участок, где были проведены 3 повторных чистки по всему участку, перед тем как кисти (щетки) были повторно укупорены и удалены. У каждого пациента были взяты две биопсии, на 1 см выше демаркационной линии (плоскоклеточный столб) или в месте патологии. Одна биопсия была использована для гистологии, другая биопсия и образец кисти были помещены в отдельные стерильные пробирки, быстро заморожены в жидком азоте при -80 °C и транспортированы замороженными для лабораторного анализа.
Экстракцию бактериальной ДНК проводили с помощью набора Purelink Microbiome DNA Purification kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту бактериальной дсДНК определяли с помощью Нанофотометра, а концентрацию - с помощью набора для анализа дсДНК широкого спектра Qubit dsDNA и кубитового Флуорометра 2.0 (Invitrogen). Квалифицированные образцы ДНК были отправлены в австралийский исследовательский центр генома (AGRF, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) для профилирования разнообразия. Секвенирование ампликонов осуществляли с целью определения гипервариабельной области (V1-V3, 27F / 529R) гена 16S рРНК на платформе Illumina MiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США) с использованием индекса Illumina Nextera XT с парно-концевым секвенированием. Необработанные парные считывания Illumina были обрезаны с помощью Cutadapt [10]. Анализ последовательностей проводился с использованием количественного анализа микробной экологии 2 (версия QIIME 8.0.1623) [11]. В общей сложности было получено 8457356 необработанных последовательностей считывания, а качественная фильтрация привела к 3221362 считываниям. Затем последовательности были сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTUs) в соответствии с конвейером QIIME2 по умолчанию со ссылкой на 99%-ное сходство последовательностей с базой данных Greengenes версии 13.8 [12]. Показатели Альфа-разнообразия включали наблюдаемые OTUs, Chao1 и индекс Шеннона. Бета-разнообразие было проанализировано на основе расстояний Брэя Кертиса и Джаккарда. Перестановочный многомерный дисперсионный анализ (PERMANOVA [13]) и перестановочный многомерный дисперсионный анализ (PERMDISP) были выполнены в PRIMER version 6 (PRIMER-E, Великобритания) [14]. Визуализацию проводили с помощью неметрического многомерного шкалирования (nMDS). Сравнение относительной численности на уровнях таксономии различных групп проводилось с использованием многомерных обобщенных линейных моделей (GLM), предполагающих отрицательное биномиальное распределение в пакете R «mvabund» [15], а значимые пары определялись с помощью попарного критерия Манна-Уитни.
Биоптаты (прижизненный забор клеток, тканей – ред.) растворяли в буферном растворе, содержащем коктейль ингибиторов протеаз 2% (v/v) (Roche Australia, Sydney, NSW, Australia), RapiGest SF (0,1% w/v) (Waters, MA, USA) и 75 mM водного бикарбоната аммония. Суспензию клеток разрушали повторными циклами замораживания-оттаивания в жидком азоте и на водяной бане при температуре 50 °C. Смесь лизата (продукт лизиса бактериальных клеток – ред.) нагревали при 95 °С в течение 1 ч с последующим повторением циклов замораживания–оттаивания. Концентрацию белка в лизате определяли количественно с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (ThermoFisher Scientific, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в соответствии с инструкциями производителя.
Восстановление осуществляли с помощью 5 mM дитиотреитола (Calbiochem, Kenilworth, NJ, USA) и алкилированием с помощью 15 mM йодацетамида (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Образцы белка расщепляли при массовом соотношении белок:фермент 100: 1 (w/w) с помощью масс-спектрометра марки trypsin (Promega Gold, Madison, WI, USA) при 37 °С в течение ночи. Реакцию останавливали с помощью 0,4% (v/v) водной трифторуксусной кислоты (TFA), и липиды удаляли из пептидов посредством твердофазной экстракции на гидрофильно-липофильном балансе Oasis (HLB) 30 мг, картриджи 1 мл (Waters Corp., Milford, М.А., США). Образцы промывали 0,1% (v/v) TFA и ультрачистой водой. Пептиды элюировали 70% (v/v) водным ацетонитрилом. Растворители выпаривали с использованием роторного вакуумного концентратора до добавления 0,1%-ной водной муравьиной кислоты. После обработки ультразвуком и центрифугирования в течение 10 минут супернатанты переносили в хроматографические флаконы Total Recovery (Waters) для анализа. Анализ ЖХ / МС проводился с использованием масс-спектрометра Waters nanoAcquity UPLC и Waters Xevo QToF. Анализ ЖХ-МС / МС триптических расщеплений осуществляли путем инъекции 3 мкл раствора образца, загруженного со скоростью 5 мкл / мин, в улавливающую колонку (ловушку). Образец обессоливали при следующем составе растворителя: 1% ацетонитрил + 0,1% муравьиная кислота (растворитель В) в воде + 0,1% муравьиная кислота (растворитель А). Пептиды были смыты с ловушки при 400 нл / мин на аналитическую колонку с использованием следующего 60-минутного линейного метода: через одну минуту исходный состав растворителя, равный 1% В, линейно увеличивали до 50% В к 31 мин. Непосредственное линейное изменение в течение двух минут до 85% B было начато немедленно. Эту композицию выдерживали от 33 до 36 мин, после чего композицию растворителя возвращали к исходным условиям. После разделения пептиды анализировали с помощью тандемной масс-спектрометрии в непрерывном режиме, используя следующие условия прибора: капиллярное напряжение 2,3 кВ, конусное напряжение 25 В, экстракционный конус 4 В, температура источника 80 °C, поток конического газа (N2) 20 л/ч, нано-поток газа 0,50 л/ч, продувочный газ 100 л/ч, напряжение детектора 2350 В. Точность массы поддерживалась коррекцией фиксации массы, достигаемой инфузией в 0,5 мкл / мин раствора лейцин-энцефалина 200 нг/мл в 50% водном ацетонитриле плюс 0,1%-ной муравьиной кислоте. Был проведен эксперимент по сбору данных (DDA), который непрерывно сканировал пептиды с заряженным состоянием от 2+ до 4+ с интенсивностью более 50 импульсов в секунду в диапазоне m/z 350–1500. Три наиболее распространенных иона, удовлетворяющих этим условиям, были фрагментированы по три секунды каждый, и полученные спектры МС/МС были собраны в диапазоне m/z 50–2000. Затем массу каждого пептида-предшественника исключали в течение 30 с. Энергии столкновения для родительских ионов пептида были увеличены с 15 до 25 В при m/z от 350 до 30–40 В при m/z 1500. Затем массу предшественника пептида исключали в течение 30 с.
Данные трех технических реплицирующих экспериментов для каждой выборки были проанализированы качественно и количественно с помощью программного обеспечения Progenesis QI (Нелинейная динамика, Милфорд, Массачусетс, США). Пиковый выбор осуществляется там, где исходные данные MS-спектров сводятся к набору обнаруженных пептидов и пептидных ионов. Идентификация белков была получена путем экспорта в MASCOT 2.6.00 (Matrix Science) с помощью встроенного алгоритма учета ионов программного обеспечения и поиска в базе данных человека (UniProt KB/Swiss-Prot Protein Knowledge Base release 2018_10 от 20 октября 2018 года). Вариабельные модификации карбамидометила (С), дезамидированного (NQ), окисленного (М) и проионамида (С) были использованы с допусками по массе пептида и MS / MS 0,05 Da. Для относительного количественного определения белка интенсивность репортерных ионов тандемной массы (TMT) экстрагировали для каждого пептида. Коррекция изотопной чистоты проводилась в рамках Progenesis QI для каждого репортера на основе изотопного распределения репортеров sixplex-TMT, предоставленных производителем. Статистические тесты проводились с использованием SPSS версии 25 (IBM, Армонк, Нью-Йорк, США), которая включала тест Шапиро-Уилка, H-критерий Крускала-Уоллиса, U-критерий Манна-Уитни и критерий однородности дисперсии Левена. Инструмент STRING версии 11.0 [16] (http://www.stringdb.org) использовался для построения сетей взаимодействия белков и выявления общих биологических процессов.
Всего было выявлено 13 типов, 87 родов и 48 таксономических единиц видового уровня. Анализ альфа-разнообразия показал, что оценка богатства Chao1 (дополнительный рисунок S1) была значительно снижена у НЭРБ по сравнению с контролем (Pchao1 = 0,041) и РЭ (Pchao1 = 0,022), в то время как индекс разнообразия Шеннона не показал различий между группами. Анализ бета-разнообразия проводили с использованием расстояний Брэя-Кертиса и Джаккарда (дополнительный рисунок S2). Парный тест (PERMANOVA) и тест дисперсии (PERMDISP) выявили достоверные различия между контролем и разнообразием АП (PANOVA < 0.006, PDISP = 0.030). Состав микробиоты внутри каждой группы представлен на дополнительном рисунке S3.
Для выявления микробов-кандидатов патогенеза ГЭРБ и АП мы исследовали различия в составе микробиоты пищевода на разных стадиях ГЭРБ (от НЭРБ до РЭ) и в АП. Многомерный анализ выявил 41 дифференциальный OTUs в пределах 9 типов (Рис.1). Конкретные дифференциальные OTUs представлены на Рис.2, а значимые пары выборок суммированы в таблице 2.
Рисунок 1. Дифференцированные оперативные таксономические единицы (OTUs) на уровне типа между неэрозивной рефлюксной болезнью (NERD), рефлюкс-эзофагитом (RE), пищеводом Барретта (BE), аденокарциномой пищевода (EAC) и контрольными группами.
Рисунок 2. Тепловая карта представляет 41 дифференцированную оперативную таксономическую единицу (OTUs) между контролем (CON; n = 16) и фенотипами заболеваний (неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD; n = 11), рефлюкс-эзофагит (RE; n = 20), пищевод Барретта (BE; n = 17) и аденокарцинома пищевода (EAC; n = 6)). OTUs от каждого фенотипа заболевания сравнивались с помощью многовариантного анализа (anova.manyglm; p-значение < 0,05). p-значения приведены в скобках (), таксоны, классифицированные выше уровня рода, обозначены в [ ]. Попарный анализ выявил различия в OTUs, связанные с определенным фенотипом заболевания(ий), эти маркеры сгруппированы черными контурами. Тренд изменения для каждого маркера в пределах фенотипа обозначен стрелкой.
Таблица 2. Значимые пары в пределах 41 дифференцированной оперативной таксономической единицей (OTUs) между неэрозивным рефлюксом (NERD; n = 11), рефлюкс-эзофагитом (RE; n = 20), пищеводом Барретта (BE; n = 17), аденокарциномой пищевода (EAC; n = 6) и контролем.
OTUs
|
p-значение
|
Отдельная группа/ы
|
Значимые Пары
(p-значение < 0.05)
|
Firmicutes | Tissierellaceae [семейство]
|
0.001
|
Больше всего в контроле
|
NERD–Контроль (0.027); RE–Контроль (0.002); BE–Контроль (0.011)
|
Firmicutes | Pseudoramibacter eubacterium
|
0.006
|
Больше всего в контроле
|
RE–Контроль (0.001); RE–BE (0.031)
|
Firmicutes | Clostridiaceae [семейство]
|
0.013
|
Больше всего в контроле
|
RE–Контроль (0.005); BE–Контроль (0.012)
|
Actinobacteria | Rubrobacter
|
0.006
|
Больше всего в контроле
|
NERD–Контроль (0.037); RE–Контроль (0.009); BE–Контроль (0.047)
|
Actinobacteria | Geodermatophilus
|
0.014
|
Больше всего в контроле
|
RE–Контроль (0.022); BE–Контроль (0.044)
|
Bacteroidetes | Bacteroides uniformis
|
0.016
|
Больше всего в NERD
|
Контроль–NERD (0.026); BE–NERD (0.016)
|
Bacteroidetes | Capnocytophaga
|
0.017
|
Больше всего в NERD
|
RE–NERD (0.009); BE–NERD (0.023); BE–EAC (0.046)
|
Proteobacteria | Neisseria oralis
|
0.007
|
Больше всего в NERD
|
RE–NERD (0.004); EAC–NERD (0.008)
|
Proteobacteria | Moraxella
|
0.049
|
Больше всего в NERD
|
BE–NERD (0.025)
|
Firmicutes | Dorea
|
0.001
|
Больше всего в NERD
|
Контроль–NERD (0.001); RE–NERD (0.001); BE–NERD (0.001); EAC–NERD (0.001); RE–Контроль (0.016)
|
Bacteroidetes | Prevotella pallens
|
0.019
|
Больше всего в NERD
|
RE–NERD (0.017); BE–NERD (0.014)
|
Firmicutes | Acidaminobacteraceae [семейство]
|
0.024
|
Больше всего в NERD
|
BE–NERD (0.047); RE–NERD (0.047)
|
Fusobacteria | Leptotrichia
|
0.001
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–Контроль (0.001); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.001); NERD–EAC (0.005)
|
Actinobacteria | Rothia
|
0.001
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–Контроль (0.002); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.007); NERD–EAC (0.029)
|
Firmicutes | Peptococcus
|
0.001
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–Контроль (0.012); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.002); NERD–EAC (0.027)
|
Firmicutes | Moryella
|
0.001
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–Контроль (0.001); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.001); NERD–EAC (0.001)
|
Firmicutes | Peptostreptococcaceae [семейство]
|
0.001
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–Контроль (0.009); NERD–RE (0.004); NERD–EAC (0.036); BE–RE (0.002); EAC–RE (0.022); Контроль–BE (0.003)
|
Firmicutes | Aerococcaceae [семейство]
|
0.012
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–Контроль (0.002); NERD–RE (0.022); EAC–Контроль (0.011)
|
Tenericutes | Mollicutes RF39 [порядок]
|
0.020
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–Контроль (0.012); NERD–RE (0.028); NERD–BE (0.008)
|
Firmicutes | Bacilli [класс]
|
0.008
|
Больше всего в RE
|
NERD–RE (0.013); BE–RE (0.002)
|
Bacteroidetes | Bacteroidales S24-7
|
0.012
|
Больше всего в RE
|
NERD–RE (0.012); BE–RE (0.010); BE– Контроль (0.030)
|
Verrucomicrobia | Akkermansia muciniphila
|
0.005
|
Больше всего в RE
|
Контроль–RE (0.011); NERD–RE (0.022); BE–RE (0.011)
|
Proteobacteria | Marivita
|
0.009
|
Больше всего в RE
|
Контроль–RE (0.022); NERD–RE (0.026); Контроль–BE (0.028)
|
Bacteroidetes | Bacteroidales [порядок]
|
0.001
|
Меньше всего в RE
|
NERD–Контроль (0.003); RE–Контроль (0.001); RE–BE (0.002); RE–EAC (0.001)
|
Firmicutes | Solobacterium moorei
|
0.012
|
Меньше всего в RE
|
RE–Контроль (0.010); RE–NERD (0.004); RE–EAC (0.013)
|
Firmicutes | Streptococcus infantis
|
0.001
|
Меньше всего в RE/BE
|
RE–Контроль (0.012); RE–NERD (0.004); RE–EAC (0.002); BE–Контроль (0.015); BE– NERD (0.001); BE–EAC (0.001)
|
Firmicutes | Shuttleworthia
|
0.001
|
Больше всего в BE
|
Контроль–BE (0.004); NERD–BE (0.017); RE–BE (0.002); EAC–BE (0.003); NERD– EAC (0.007); Контроль–EAC (0.004)
|
Acidobacteria | Acidobacteria-6
|
0.005
|
Больше всего в BE
|
RE–BE (0.006); NERD–BE (0.035); RE– Контроль (0.015)
|
Proteobacteria | Nisaea
|
0.010
|
Больше всего в BE
|
Контроль–BE (0.009); NERD–BE (0.024); Контроль–RE (0.043)
|
Proteobacteria | Mesorhizobium
|
0.028
|
Больше всего в BE
|
Контроль–BE (0.022); NERD–BE (0.041)
|
Firmicutes | Mogibacterium
|
0.023
|
Меньше всего в BE
|
BE–Контроль (0.030); BE–NERD (0.014); BE–RE (0.012)
|
Proteobacteria | Haemophilus influenzae
|
0.003
|
Больше всего в EAC
|
Контроль–BE (0.013); RE–BE (0.004); BE– EAC (0.013); Контроль–EAC (0.015)
|
Unknown/Unassigned
|
0.003
|
Больше всего в EAC
|
Контроль–EAC (0.003); NERD–EAC (0.015); BE–EAC (0.002); RE–EAC (0.002)
|
Firmicutes | Staphylococcus aureus
|
0.025
|
Больше всего в EAC
|
Контроль–EAC (0.014); BE–EAC (0.010)
|
Actinobacteria | Bifidobacterium
|
0.003
|
Больше всего в EAC
|
Контроль–EAC (0.002); NERD–EAC (0.004); BE–EAC (0.001)
|
Spirochaetes | Sphaerochaeta
|
0.004
|
Больше всего в EAC
|
Контроль–EAC (0.025); NERD–EAC (0.033); BE–EAC (0.015); RE–EAC (0.020)
|
Proteobacteria | Sinobacteraceae
|
0.009
|
Больше всего в EAC
|
NERD–EAC (0.028); BE–EAC (0.014); RE–EAC (0.018)
|
Firmicutes | Lactobacillus salivarius
|
0.017
|
Больше всего в EAC
|
RE–EAC (0.038); BE–EAC (0.041)
|
Proteobacteria | Rhodospirillaceae [семейство]
|
0.018
|
Больше всего в EAC
|
Контроль–EAC (0.018); NERD–EAC (0.037); RE–EAC (0.021)
|
Actinobacteria | Rothia mucilaginosa
|
0.013
|
Минимально в EAC
|
EAC–Контроль; EAC–NERD (0.023); EAC–BE (0.032); EAC–RE (0.001)
|
Bacteroidetes | Prevotella copri
|
0.039
|
Минимально в EAC
|
EAC–RE (0.003); EAC–BE (0.001); NERD–RE (0.030)
|
Контрольная микробиота имела более высокий уровень грамположительных Firmicutes (фирмикутов) и Actinobacteria (актинобактерий) по сравнению с другими группами. Состав микробиоты НЭРБ сместился в сторону протеобактерий (Neisseria oralis и Moraxella sp.) и бактероидетов (Bacteroidesiformis, Capnocytophaga sp. и Prevotella pallens), и от фузобактерий (Leptotrichia) и актинобактерий (Rothia). Несколько родов Firmicutes были снижены при НЭРБ (Peptococcus и Moryella), в то время как повышенное содержание Dorea привело к общему более высокому составу Firmicutes по сравнению с контролем. Микробиота РЭ и ПБ характеризовалась сдвигом от Firmicutes (Mogibacterium sp., Streptococcus infantis, Solobacterium moorei) к грамотрицательным Fusobacteria (Leptotrichia sp.) и Proteobacteria (Marivita, Nisaea, Mesorhizobium) относительно контроля. Микробиота АП характеризовалась сдвигом в сторону Firmicutes, главным образом Staphylococcus aureus, Streptococcus infantis, Moryella sp. и Lactobacillus salivarius, и Proteobacteria, и в то же время вдали от Actiobacteria (Rothia mucilaginosa) относительно контроля.
Чтобы получить механистическое понимание роли микробов и микросреды в ГЭРБ и АП, мы провели объективный количественный протеомный анализ эндоскопической биопсии слизистой оболочки, собранной в той же области пищевода, где были получены щеточные образцы микробиомов. Всего было подсчитано 378 белков; из них только 26 белков имели медианное соотношение выше 10-кратного и > 2 уникальных пептидов. Пятнадцать (15) количественно определенных белков были идентифицированы как дифференциально экспрессированные между тестируемыми группами (тест Крускала-Уоллиса р <0,05) (рис. 3). Значимые пары групп были идентифицированы и суммированы в таблице 3. Анализ белковых цепочек (Рис.4) выявил основную группу белков, повышенных в образцах РЭ и ПБ, ассоциированных с реакцией на токсические вещества: Аннексин-А1, реакцией на внеклеточный стимул: кератин 20, шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5) и связанный с окислительной детоксификацией: сывороточный альбумин, желудочная триацилглицеролипаза (фермент GSTP1) и бета-субъединица гемоглобина. Несколько эпителиальных маркеров были повышены в отношении РЭ, кератина 13, кератина 20 и гастрокина-1 по сравнению с другими группами, в то время как маркеры неоплазии десмин и виментин были повышены в ПБ и АП по сравнению с контролем.
Рисунок 3. Представлено обилие белка в 15 дифференциальных белках между фенотипами контроля и заболевания. p-значения, полученные с помощью теста Крускала-Уоллиса, отображаются в скобках ( ). Неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD); рефлюкс-эзофагит (RE); пищевод Барретта (BE); аденокарцинома пищевода (EAC); субъединица АТФ-синтазы бета (ATP5B); глутатион S-трансфераза p (GSTP1); шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5).
Рисунок 4. Карта межбелкового взаимодействия 15 дифференциальных белков между тестируемыми группами. Три биологических процесса были характерны для прогрессирования заболевания. Узлы являются репрезентативными для видов белков, а линии представляют белково-белковые ассоциации. Узлы одного цвета и / или соединенные линиями представляют общую функцию. Инструмент STRING (http://www.string-db.org) использовался для построения сетей взаимодействия. Десмин (DES); виментин (VIM); аннексин А1 (ANXA1); преламин-A/C (LMNA); сывороточный альбумин (ALB); глутатион-S-трансфераза р (GSTP1); бета-субъединица гемоглобина (HBA2); шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5); протеин дисульфид-изомераза (P4HB); Бета-субъединица АТФ-синтазы (ATP5B); 14-3-3 белок тета (YWHAQ); желудочная триацилглицеролипаза (LIPF); гастрокин-1 (GKN1); кератин 13 (KRT13); кератин 20 (KRT20).
Таблица 3. Значимые пары в пределах 15 дифференциальных белков между неэрозивным рефлюксом (NERD), рефлюкс-эзофагитом (RE), пищеводом Барретта (BE), аденокарциномой пищевода (EAC) и контролем.
Белок
|
p-значение
|
Отдельная группа/ы
|
Значимые Пары
(p-значение < 0.05)
|
Кератин 13
|
0.017
|
Больше всего в RE
|
BE–RE (0.002); EAC–RE (0.021); NERD–RE (0.039)
|
Сывороточный альбумин
|
0.003
|
Низко в Контроль/NERD
|
NERD–RE (0.001); NERD–BE (<0.001); Контроль–BE (0.030)
|
Виметин
|
0.009
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–BE (<0.001); NERD–RE (0.007); Контроль–BE (0.013)
|
Альфа-субъединица гемоглобина
|
0.016
|
Низко в NERD/EAC
|
NERD–RE (0.010); NERD–BE (0.010); EAC–BE (0.042)
|
Бета-субъединица АТФ-синтазы
|
0.016
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–RE (0.003); NERD–BE (0.004)
|
Белковая дисульфид-изомераза
|
0.004
|
Высоко в RE/BE
|
NERD–RE (0.006); NERD–BE (0.008); EAC–RE (0.011); EAC–BE (0.013); Контроль–BE (0.033); Контроль–RE (0.039)
|
Гастрокин-1
|
0.034
|
Низко в Контроль/NERD
|
Контроль–BE (0.007); NERD–RE (0.015)
|
Глутатион-S-трансфераза p (GSTP1)
|
0.038
|
Высоко в RE/BE
|
NERD–RE (0.014); CON–RE (0.031); NERD–BE (0.034)
|
Десмин
|
0.020
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–BE (0.004); NERD–RE (0.005); NERD–EAC (0.007); Контроль–EAC (0.011)
|
Шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5)
|
0.035
|
Меньше всего в NERD
|
NERD–BE (0.007); NERD–RE (0.008)
|
Желудочная триацилглицеролипаза
|
0.010
|
Высоко в RE/BE
|
Контроль–BE (0.004); CON–RE (0.012); NERD–BE (0.026)
|
Кератин 20
|
0.009
|
Больше всего в RE
|
BE–RE (0.008); NERD–RE (0.010); EAC–RE (0.017); BE–Контроль (0.047)
|
14-3-3 белок тета
|
0.009
|
Больше всего в RE
|
NERD–RE (0.002); EAC–RE (0.009); BE–RE (0.014)
|
Преламин-A/C
|
0.014
|
Низко в Контроль/NERD
|
NERD–RE (0.004); NERD–BE (0.010); Контроль–RE (0.017)
|
Аннексин А1
|
0.008
|
Низко в RE
|
NERD–RE (0.009); Контроль–RE (0.010); EAC–RE (0.012)
|
В этом исследовании мы обнаружили отчетливую микробиоту пищевода у пациентов с НЭРБ, РЭ, ПБ и АП, что дает представление о молекулярных механизмах рефлюкс-ассоциированных заболеваний и потенциально новых направлениях стратификации заболеваний. Наше исследование показало, что общий состав микробиоты был изменен у НЭРБ и АП по сравнению с контролем, в то время как уникальные OTUs, присутствующие при НЭРБ и АП, не были обнаружены у пациентов с РЭ и ПБ.
Накопленные данные подтверждают характеристику НЭРБ как отдельного объекта от других заболеваний в спектре ГЭРБ. Гетерогенность у пациентов с НЭРБ была предположена, когда эта группа менее благоприятно реагировала на терапию подавления кислоты по сравнению с пациентами с РЭ [17]. Позднее это было продемонстрировано в ходе длительных исследований рН, которые показали, что у 30–50% пациентов с НЭРБ было нормальное время воздействия кислоты, но наблюдалась рефлюксная гиперчувствительность [18,19]. Недавнее протеомное исследование показало, что НЭРБ и эрозивно-рефлюксная болезнь являются различными заболеваниями, при этом у пациентов с НЭРБ сохраняется способность восстанавливать слизистую оболочку пищевода после кислотно-пепсиновых инсультов, в то время как у пациентов с эрозивно-рефлюксным заболеванием способность снижается [20]. Здесь мы продемонстрировали, что микробиота НЭРБ отклоняется от парадигмы микробиоты ГЭРБ [7], заключающейся в увеличении количества грамотрицательных бактерий (Fusobacteria и Proteobacteria) и снижении грамположительных Firmicutues (Streptococcus), наблюдаемых в нашей РЭ и ПБ микробиоте. Наш анализ протеома также показывает отсутствие значительных изменений в белках НЭРБ по сравнению с контролем, в то время как в РЭ наблюдались повышенные уровни белков реакции на стресс. Большинство наших пациентов с НЭРБ (64%) принимали ингибиторы протонной помпы из-за отсутствия реакции; поэтому мы постулируем, что уникальная микробиота НЭРБ может быть связана с гиперчувствительностью рефлюкса. Роль микробиоты в двунаправленном перекрестном разговоре между кишечником и мозгом еще далеко не установлена. Недавнее исследование синдрома раздраженного кишечника (СРК) показало, что передача фекальной микробиоты от гиперчувствительных пациентов с СРК крысам без микробов сопровождается передачей висцеральной гиперчувствительности при отсутствии каких-либо аномалий слизистой оболочки и изменения проницаемости кишечника [21]. Авторы сообщают о дисбиозе, характеризующемся значительным увеличением протеобактерий (в том числе сульфатредуцирующих Enterobacteriacaea и Desulfohalobioaceae) у мышей с СРК, и предполагают, что проноцицептивная роль люминального сероводорода (H2S) вызывает возбуждение сенсорных нервов посредством активации каналов Т-типа. Последние данные свидетельствуют о том, что H2S действует на преходящий рецепторный потенциал анкирина 1 (TRPA1) непосредственно в афферентных нейронах толстой кишки, усиливая ноцицептивную функцию [22]. Наши данные НЭРБ также показывают значительное увеличение протеобактерий и бактероидетов (включая Neisseria, Prevotella и Bacteroides с сульфатредуцирующими способностями у некоторых видов), наряду с более высокой распространенностью производителя газообразного водорода Dorea sp. Хотя специфические сульфатредуцирующие бактерии, идентифицированные у пациентов с СРК, не были идентифицированы в дистальном отделе пищевода наших пациентов с НЭРБ, их особая микробиота требует дальнейшего изучения механистической роли взаимодействия микробиота-хозяин.
Длительный желудочный рефлюкс с последующей инфильтрацией воспалительных клеток в слизистую пищевода являются преобладающими микросредовыми характеристиками РЭ и ПБ. В этих условиях наша РЭ и ПБ микробиота показала характерный сдвиг от грамположительных видов Firmicute к грамотрицательным Fusobacteria и Proteobacteria по сравнению с контролем. Это согласуется с прошлыми исследованиями у пациентов с РЭ и ПБ [7,23,24]. Здоровый дистальный отдел пищевода питает преимущественно Firmicutes перорального происхождения (70–87%). Это изменено в RE и BE, чтобы напоминать желудочную микробиоту, которая состоит из меньшего количества Firmicutes (22–30%) и большего количества грамотрицательных бактерий [25]. Хотя в этом исследовании не оценивалась микробиота полости рта или желудка, вполне вероятно, что пищевод постоянно подвергается воздействию преходящих колонизаторов из слюны полости рта и желудочного рефлюкса. Изменения в микробиоте пищевода отражают источник преходящих бактерий и микросреды. В случае РЭ и ПБ повышенное воздействие желудочного рефлюкса в сочетании с кислой микроокружающей средой привело к изменению состава желудочных бактерий. Растет интерес к желудочным бактериям Helicobacter pylori и их роли в рефлюксных заболеваниях. Ликвидация H. pylori совпала с увеличением распространенности ГЭРБ и повышенным риском ПБ. Хотя состав H. pylori существенно не различался между нашими группами, известно, что эти бактерии модулируют некоторые гормоны (гастрин, грелин и лептин) и могут оказывать косвенное влияние на ГЭРБ [26], а также на метаболизм хозяина [27] и другие органы, такие как поджелудочная железа [28].
Протеом РЭ и ПБ продемонстрировал согласованные усилия по обеспечению выживания клеток за счет повышенной экспрессии белков, ответственных за репарацию ДНК и белков (преламин-A/C, белковая дисульфид-изомераза и 14-3-3 протеин тета), что согласуется с предыдущими исследованиями [20,29,30]. Белки, связанные со стрессовой реакцией аннексин-А1 и GSTP1, также были повышены. Аннексин-А1 считается предполагаемым медиатором глюкокортикоидной иммуносупрессивной активности [31] и ассоциируется с хроническим воспалением в пищеводе [32], в то время как фермент GSTP1 принадлежит к супергенному семейству ферментов, участвующих в защите клеток от окислительного стресса. Фермент GSTP1 является наиболее важной формой в пищеводе, с повышенной экспрессией во время кислотного рефлюкса [33]. Длительное воздействие желудочных ферментов и желчных кислот может усугубить повреждение слизистой оболочки пищевода, что приводит к метаплазии и неоплазии [34]. Желудочно-специфический фермент желудочная триацилглицероллипаза была повышена в РЭ и ПБ наряду с маркером желудочного эпителия гастрокином-1. Признаки неоплазии в ПБ и АП характеризовались снижением маркеров желудочно-кишечного эпителия кератина 13 и кератина 20 [35] по сравнению с РЭ, в то время как маркеры эпителиально-мезенхимного перехода виментин и десмин были повышены в ПБ и АП соответственно, по сравнению с контролем.
Ингибиторы протонной помпы (ИПП) являются основой лечения рефлюксной болезни. Изменения микробиома пищевода в результате снижения желудочной кислотности, вызванной ИПП, были изучены в нескольких исследованиях, и было показано, что они играют важную роль в формировании популяций микробов [36–39]. Наши результаты предполагают связь между лечением ИПП с небольшим снижением количества Bacteroidetes и Proteobacteria и повышенным содержанием Firmicutes (дополнительный рисунок S4), о чем ранее также сообщали Amir et al. [39]. Эффекты лечения ИПП на протеоме НЭРБ и РЭ показали снижение уровней белковой дисульфидизомеразы и сывороточного альбумина, связанных со стрессовой реакцией и детоксикацией, соответственно. Однако в ПБ лечение ИПП приводило к повышению уровня этих белков (дополнительная фигура S5). Связь между ИПП и неопластической прогрессией при ПБ противоречива. С одной стороны, снижение воздействия пищеводной кислоты на ИПП уменьшает воспаление и пролиферацию [40]. С другой стороны, терапия ИПП препятствует воздействию вторичных желчных кислот на пищевод, повышает уровень циркулирующего гастрина и вызывает активацию ЦОГ-2 [41,42]. Наши результаты показывают, что лечение ИПП может оказывать положительное влияние на НЭРБ и РЭ, но может отрицательно влиять на ПБ. Однако, учитывая, что основная цель нашего исследования не состояла в том, чтобы исследовать лечение ИПП, будущие исследования, включающие большие размеры выборки и лучший контроль переменных (например, время лечения ИПП, дозировка), необходимы для оценки влияния лечения ИПП на ПБ.
Микробиота АП менее четко определена, чем у РЭ и ПБ. Ранние культурные исследования образцов эзофагэктомии, выделенных из АП, не выявили каких-либо различий в организмах, изолированных в доброкачественной и злокачественной ткани [43,44]. Blackett et al. использовала современную технику секвенирования для выявления «U-образной» тенденции с сопоставимым грамположительным составом у здоровых контролей и АП, в отличие от микробиоты ГЭРБ [8]. Исследование с использованием Cytosponge-проб показало, что фирмикуты родов Lactobacillus и Streptococcus доминируют в АП [45]. Авторы предполагают, что виды Streptococcus способны выживать в микроокружении с низким содержанием питательных веществ благодаря ингибированию роста конкурентов, процессу, который может индуцировать toll-подобные рецепторы хозяина и повреждение тканей высвобождением токсина. Наши данные также показали сходную композицию микробиоты АП, состоящую из Staphylococcus aureus, Lactobacillus salivarius, Haemophilus influenzae, Sphaerochaeta sp. и Bifidobacterium sp., наряду с ростом Streptococcus infantis, вида, присутствующего в контроле и НЭРБ, но отсутствующего в РЭ и ПБ, Высокая распространенность молочнокислых бактерий (Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus, Streptococcus) традиционно связана со здоровьем желудочно-кишечного тракта, учитывая их полезную роль в иммуномодуляции [46], выработке перекисей, кислот и бактериоцинов, а также белков, которые изменяют проницаемость эпителия и связывание с кишечными рецепторами патогенов [47]. Однако в контексте рака повышенные уровни молочной кислоты могут быть очень вредными. Нарушение метаболизма лактата является одним из признаков канцерогенеза [48]. Лактат может служить источником энергии в АП и других формах рака, вызывая гликолитические ферменты, что приводит к увеличению снабжения АТФ. Этот метаболит может также способствовать воспалению и стимулировать ангиогенез опухоли [49–51]. О последовательном увеличении количества молочнокислых бактерий (Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium) сообщается на разных стадиях аденокарциномы желудка, и считается, что он напрямую способствует канцерогенезу [52]. In vivo доказательством роли бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в канцерогенезе желудка является колонизация модели инсулин-гастрин-трансгенных мышей микробиотой, продуцирующей молочную кислоту, что приводит к интраэпителиальной неоплазии желудочно-кишечного тракта и повышенной регуляции генов, связанных с раком [53]. Другие факторы могут также способствовать развитию микробиоты АП. Дисфагия, распространенный симптом АП, часто уменьшает выбор питания пациента, который больше полагается на жидкие блюда, такие как молочные питательные смеси. Диетические изменения и последующая доступность макронутриентов могут оказать существенное влияние на состав микробиоты кишечника [54], при этом исследование показало увеличение состава лактобацилл в дистальном отделе пищевода мышей, получавших рацион с высоким содержанием жиров [55]. Аналогичным образом, возрастные изменения в выработке слюны, учитывая, что когорта АП имеет самый высокий средний возраст, может изменить здоровье полости рта и микробиоту [56]. Было показано, что снижение выработки слюны влияет на здоровье желудочно-кишечного тракта, например, замедленное заживление язв желудка и двенадцатиперстной кишки [57, 58]. Снижение микробного разнообразия и относительной численности также сообщалось в слюне пациентов с АП относительно контроля [59]. Предварительная связь между АП и здоровьем полости рта начинает появляться в литературе и может объяснить происхождение отдельной микробиоты АП.
Ограничением нашего исследования было то, что культивирование бактерий пищевода не проводилось наряду с секвенированием 16S рРНК. Экстрагированная ДНК в основном поступает из живых бактерий, но этот метод также выделяет ДНК из мертвых бактерий, а также бактериальных остатков. Следовательно, идентификация ДНК, специфичной для любых бактериальных штаммов, не обязательно указывает на присутствие живых бактерий в пищеводе. Еще одним ограничением было относительно небольшое количество белков, идентифицированных в наших биопсийных образцах тканей. Хотя наши результаты были сопоставимы с исследованиями с использованием эндоскопических биопсий аналогичного размера [60], они были значительно меньше по сравнению с протеомным анализом с использованием хирургических резекций АП (>300 белков) [30,61]. Небольшие диагностические биопсии слизистой оболочки в дозе 3-5 мг [62] могут не захватывать достаточное количество раковых клеток для всестороннего протеомного анализа по сравнению с гораздо более крупными хирургически резецированными тканями (30-60 мг) [61]. В результате классические маркеры рака, такие как молекула эпителиальной клеточной адгезии (EpCAM) и маркеры воспаления, не были идентифицированы в наших образцах АП. Наши результаты показывают, что сложность протеома пищевода превосходит аналитические возможности нашего подхода. Более комплексный протеомный подход может заключаться в использовании глубоких биопсий тканей и обогащении белков низкой плотности за счет использования библиотеки лигандов твердофазных гексапептидов.
В целом наши результаты подчеркивают важность микробного сообщества и его взаимодействия с хозяином при заболеваниях, связанных с кислотным рефлюксом. Мы предлагаем центральную роль для дисбиотической микробиоты в развитии НЭРБ и АП. Хотя трудно определить механизмы, лежащие в основе роли бактерий в патогенезе заболевания, роль микробиоты в стимуляции висцеральной гиперчувствительности и развития аденокарциномы была продемонстрирована в других органах желудочно-кишечного тракта. Таким образом, наши результаты также предполагают участие микробиоты слизистой пищевода в патогенезе НЭРБ и АП.
Дополнительные материалы: следующие материалы доступны в Интернете по адресу www.mdpi.com/2077-0383/9/7/2162/s1 или по этой ссылке (ниже даны комментарии к рисункам).
Рисунок S1: Альфа-анализ разнообразия контроля, неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагита (RE), пищевода Барретта (BE) и аденокарциномы пищевода (EAC) с использованием оценки богатства Chao1 и индекса разнообразия Шеннона.
Рисунок S2. Неметрический график многомерного масштабирования (nMDS) для анализа несходства Брэя-Кертиса (изобилия и состава) и анализа Джаккарда (наличия/отсутствия) контроля, неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагита (RE), пищевода Барретта (BE) и аденокарциномы пищевода (EAC).
Рисунок S3. Состав микробиоты внутри каждой группы: контроль, неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD), рефлюкс-эзофагит (RE), пищевод Барретта (BE) и аденокарцинома пищевода (EAC).
Рисунок S4. Различия в составе бактериального типа между лечением ингибиторами протонной помпы при неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагите (RE) и фенотипах болезни пищевода Барретта (BE).
Рисунок S5: (А) белковая дисульфид-изомераза и (Б) сывороточный альбумин были обнаружены дифференцированно экспрессированными между обработанными ингибитором протонной помпы (ИПП) и необработанными протеомными образцами слизистой оболочки при неэрозивных рефлюксных заболеваниях (NERD), рефлюкс-эзофагите (RE) и пищеводе Барретта (BE).
К разделу: Роль микробиома в развитии и терапии рака