Резюме: Неэрозивная рефлюксная болезнь (НЭРБ) и аденокарцинома пищевода (АП) часто рассматриваются как форзацы в спектре гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ). Тем не менее, существует ограниченное количество клинических данных, подтверждающих эту парадигму заболевания, в то время как основные механизмы прогрессирования заболевания остаются неясными. В этом исследовании мы использовали секвенирование 16S рРНК и масс-спектрометрическую протеомику для характеристики микробиоты пищевода и протеома слизистой оболочки хозяина, соответственно. Всего было проанализировано 70 участников из четырех групп пациентов (НЭРБ, рефлюкс-эзофагит (РЭ), пищевод Барретта (ПБ) и АП) и контрольной группы. Наши результаты показали уникальный состав микробиоты НЭРБ, отличный от контрольной и других групп. Мы предполагаем, что увеличение сульфатредуцирующих протеобактерий и бактероидетов (Proteobacteria and Bacteroidetes) наряду с продуцентом водорода Dorea связано с механистической ролью в висцеральной гиперчувствительности. Мы также наблюдали отчетливую микробиоту АП, состоящую из большого количества бактерий, продуцирующих молочную кислоту (Staphylococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium и Streptococcus), которые могут способствовать канцерогенезу за счет дисрегуляции метаболизма лактата. Это исследование предполагает тесную связь между микробиотой слизистой пищевода и появлением патологий этого органа.

1. Введение

Распространенность гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) увеличилась за последние два десятилетия и затронула 10–20% населения Запада и 5% в Азии [1]. ГЭРБ традиционно рассматривается как спектральное заболевание, при котором постепенное воздействие на желудочный дистальный отдел пищевода приводит к развитию более серьезных симптомов, повреждения слизистой оболочки и осложнений [2]. Вдоль спектра ГЭРБ неэрозивная рефлюксная болезнь (НЭРБ) находится на мягком конце, прогрессируя в направлении эрозивного рефлюкс-эзофагита (РЭ), пищевода Барретта (ПБ) и, в конечном счете, аденокарциномы пищевода (АП). Тем не менее, существует ограниченная клиническая информация в поддержку этой парадигмы. Например, текущие данные показывают, что только 10% НЭРБ прогрессируют до РЭ [3]. Точно так же частота развития АП у людей с хронической ГЭРБ является относительно низкой (3,2 / 100 000) [4], в то время как до настоящего времени ни медикаментозное, ни хирургическое лечение ГЭРБ и ПБ не показало убедительных доказательств предотвращения развития АП [5]. Таким образом, существует значительный интерес для определения основных механизмов этих рефлюксных заболеваний.

При нормальных обстоятельствах рефлюкс в пищевод предотвращается с помощью антирефлюксного барьерного соединения нижнего пищеводного сфинктера (НПС), внешней краральной (относящейся к мышечным ножкам поясничной части) диафрагмыи опорных структур желудочно-пищеводного клапана. Когда эти защитные компоненты скомпрометированы, вредные эффекты являются аддитивными, что приводит к увеличению рефлюкса. Длительность воздействия рефлюкса определяется эффективностью клиренса пищевода, из которых перистальтика, слюноотделение и наличие грыжи пищевода являются ключевыми определяющими факторами. Сенсорные механизмы в дистальном отделе пищевода определяют связь между воздействием рефлюкса и генерацией симптомов [2]. Кроме того, ряд гормонов модулирует секрецию желудочной кислоты и координирует функцию НПС. Гастрин ингибирует опорожнение желудка и, как показано, одновременно вызывает секрецию желудочной кислоты и сужение НПС. И наоборот, ингибиторы желудочной кислоты, секретин и нейротензин, также снижают тонус НПС [6]. В последние годы микробиота пищевода человека стала ассоциироваться с развитием рефлюксной болезни. Исследования с использованием секвенирования генов 16S рРНК выявили специфические профили микробиоты, связанные с ГЭРБ. Yang et al. [7], в 2009 году было выявлено изменение в популяции грамотрицательных бактерий в РЭ- и ПБ-микробиоме, в то время как Blackett et al. [8] объединили оценку, основанную на культивировании и секвенировании, и обнаружили высоко распространенную грамположительную бактериальную популяцию в биопсиях АП. Недавно в японском исследовании был проведен уникальный тест для количественной оценки общих бактериальных нагрузок с помощью количественной ПЦР гена 16S рРНК [9]. Исследование показало, что относительная распространенность таксонов (Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Fusobacteria и Actinobacteria), а не абсолютные бактериальные нагрузки, скорее всего, более актуальны для заболеваний пищевода.

Чтобы исследовать причинность и микробный дисбиоз в патогенезе рефлюксной болезни, мы стремимся охарактеризовать микробиоту пищевода и основной протеом слизистой оболочки хозяина. Предыдущие исследования характеризовали состав микробиоты в слизистой оболочке пищевода в конкретных условиях в спектре ГЭРБ (РЭ и ПБ [7] и АП [8]), однако микробиота через последствия нарушений кислотного рефлюкса остается неисследованной. Учитывая прогрессивную природу ГЭРБ, мы предположили, что изучение микробиоты слизистой пищевода и основного протеома хозяина по всему спектру ГЭРБ позволит получить представление о прогрессировании заболевания и возможных механизмах патогенеза.

2. Материал и методы

2.1. Проектирование исследования и отбор проб

Сбор проб был одобрен Комитетом по этике исследований местного округа здравоохранения Юго-Западного Сиднея (HREC / 16 / LPOOL / 143; 09 июня 2016 г.), Университет Западного Сиднея (RH11759; 07 июля 2016 г.), учреждение здравоохранения местного округа Nepean Blue Mountains (SSA / 18 / NEPEAN / 35 01 марта 2017 г.). От участников было получено письменное согласие.

Образцы для анализа были получены от пациентов, проходивших рутинную диагностическую эндоскопию верхних отделов желудочно-кишечного тракта для изучения симптомов в больнице Кэмпбеллтаун (Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в период с 2017 по 2018 год. Всего было набрано 70 человек и классифицировано на 1 из 5 фенотипов на основе симптоматических и гистопатологических характеристик (табл.1): (1) контрольные группы (n = 16) были отобраны из числа лиц, направленных на эндоскопию для исследования железодефицитной анемии или болей в нижней части живота, у которых не было эндоскопических признаков заболеваний пищевода, желудка или двенадцатиперстной кишки. Биопсия слизистой оболочки была получена и подтверждена гистологически нормальной в контрольных образцах. Был использован простой опросник симптомов ГЭРБ: пациентов спрашивали о наличии и частоте шести специфических симптомов (изжога, регургитация, боль в эпигастрии или груди, полнота эпигастрия, дисфагия и кашель), испытываемых в течение последних 3 месяцев. Пациенты контрольной группы не испытывали никаких симптомов. (2) участники НЭРБ (n = 11) не имели эндоскопических признаков заболевания пищевода и нормальной гистологии, но испытывали симптомы рефлюкса в течение последних 3 месяцев. (3) участники РЭ (n = 20) имели эндоскопические признаки эзофагита, основанные на Лос-Анджелесской классификации. (4) участники ПБ (n = 17) имели не менее 1 см столбчатого выстланного пищевода и наличие кишечной метаплазии, подтвержденной гистологически. (5) участники АП (n = 6) были набраны из больницы Кэмпбелтаун и больницы Непин (Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в период с 2017 по 2018 год. Диагноз АП был подтвержден гистологией. Образцы были взяты во время исследования. Пациенты были в возрасте > 18 лет, и критерием исключения было использование лекарств, которые могли нарушить микробиоту, а именно антибиотиков или пробиотиков в течение 3 месяцев исследования.

Таблица 1. Характеристики субъектов

Группа	Контроль	НЭРБ	РЭ	ПБ	АП
Переменные
Субъекты	16	11	20	17	6
Пол (Мужской : Женский)	2:14	3:9	6:14	12:5	6:0
Средний возраст (квартили 1 – 3)	52 (36–64)	63 (66–51)	55 (43–65)	58 (49–69)	67 (62–70)
Симптомы рефлюкса	0	11 (100%)	18 (90%)	10 (59%)	3 (50%)
Рефлюкс-лекарство
Ингибитор протонной помпы	0	4 (36%)	10 (50%)	10 (59%)	1 (17%)
Воспаление / наличие лимфоцитов	0	0	17 (85%)	4 (24%)	1 (17%)
Аномальная клеточная морфология
Гиперплазия	0	0	7 (35%)	0	0
Метаплазия	0	0	0	16 (94%)	0
Дисплазия	0	0	0	1 (6%)
Аденокарцинома	0	0	0	0	6 (100%)

НЭРБ: неэрозивная рефлюксная болезнь; РЭ: рефлюкс-эзофагит; ПБ: пищевод Барретта; АП: аденокарцинома пищевода.

Образцы цитологической щетки (Cook Medical, Bloomington, IN, USA) и эндоскопические биопсии слизистой оболочки брали во время введения, чтобы минимизировать загрязнение. Цитологические щетки были закрыты и эндоскопически вставлены в целевой участок, где были проведены 3 повторных чистки по всему участку, перед тем как кисти (щетки) были повторно укупорены и удалены. У каждого пациента были взяты две биопсии, на 1 см выше демаркационной линии (плоскоклеточный столб) или в месте патологии. Одна биопсия была использована для гистологии, другая биопсия и образец кисти были помещены в отдельные стерильные пробирки, быстро заморожены в жидком азоте при -80 °C и транспортированы замороженными для лабораторного анализа.

2.2. Анализ микробиома пищевода

Экстракцию бактериальной ДНК проводили с помощью набора Purelink Microbiome DNA Purification kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту бактериальной дсДНК определяли с помощью Нанофотометра, а концентрацию - с помощью набора для анализа дсДНК широкого спектра Qubit dsDNA и кубитового Флуорометра 2.0 (Invitrogen). Квалифицированные образцы ДНК были отправлены в австралийский исследовательский центр генома (AGRF, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) для профилирования разнообразия. Секвенирование ампликонов осуществляли с целью определения гипервариабельной области (V1-V3, 27F / 529R) гена 16S рРНК на платформе Illumina MiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США) с использованием индекса Illumina Nextera XT с парно-концевым секвенированием. Необработанные парные считывания Illumina были обрезаны с помощью Cutadapt [10]. Анализ последовательностей проводился с использованием количественного анализа микробной экологии 2 (версия QIIME 8.0.1623) [11]. В общей сложности было получено 8457356 необработанных последовательностей считывания, а качественная фильтрация привела к 3221362 считываниям. Затем последовательности были сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTUs) в соответствии с конвейером QIIME2 по умолчанию со ссылкой на 99%-ное сходство последовательностей с базой данных Greengenes версии 13.8 [12]. Показатели Альфа-разнообразия включали наблюдаемые OTUs, Chao1 и индекс Шеннона. Бета-разнообразие было проанализировано на основе расстояний Брэя Кертиса и Джаккарда. Перестановочный многомерный дисперсионный анализ (PERMANOVA [13]) и перестановочный многомерный дисперсионный анализ (PERMDISP) были выполнены в PRIMER version 6 (PRIMER-E, Великобритания) [14]. Визуализацию проводили с помощью неметрического многомерного шкалирования (nMDS). Сравнение относительной численности на уровнях таксономии различных групп проводилось с использованием многомерных обобщенных линейных моделей (GLM), предполагающих отрицательное биномиальное распределение в пакете R «mvabund» [15], а значимые пары определялись с помощью попарного критерия Манна-Уитни.

2.3. Анализ протеома пищевода

Биоптаты (прижизненный забор клеток, тканей – ред.) растворяли в буферном растворе, содержащем коктейль ингибиторов протеаз 2% (v/v) (Roche Australia, Sydney, NSW, Australia), RapiGest SF (0,1% w/v) (Waters, MA, USA) и 75 mM водного бикарбоната аммония. Суспензию клеток разрушали повторными циклами замораживания-оттаивания в жидком азоте и на водяной бане при температуре 50 °C. Смесь лизата (продукт лизиса бактериальных клеток – ред.) нагревали при 95 °С в течение 1 ч с последующим повторением циклов замораживания–оттаивания. Концентрацию белка в лизате определяли количественно с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (ThermoFisher Scientific, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия) в соответствии с инструкциями производителя.

Восстановление осуществляли с помощью 5 mM дитиотреитола (Calbiochem, Kenilworth, NJ, USA) и алкилированием с помощью 15 mM йодацетамида (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Образцы белка расщепляли при массовом соотношении белок:фермент 100: 1 (w/w) с помощью масс-спектрометра марки trypsin (Promega Gold, Madison, WI, USA) при 37 °С в течение ночи. Реакцию останавливали с помощью 0,4% (v/v) водной трифторуксусной кислоты (TFA), и липиды удаляли из пептидов посредством твердофазной экстракции на гидрофильно-липофильном балансе Oasis (HLB) 30 мг, картриджи 1 мл (Waters Corp., Milford, М.А., США). Образцы промывали 0,1% (v/v) TFA и ультрачистой водой. Пептиды элюировали 70% (v/v) водным ацетонитрилом. Растворители выпаривали с использованием роторного вакуумного концентратора до добавления 0,1%-ной водной муравьиной кислоты. После обработки ультразвуком и центрифугирования в течение 10 минут супернатанты переносили в хроматографические флаконы Total Recovery (Waters) для анализа. Анализ ЖХ / МС проводился с использованием масс-спектрометра Waters nanoAcquity UPLC и Waters Xevo QToF. Анализ ЖХ-МС / МС триптических расщеплений осуществляли путем инъекции 3 мкл раствора образца, загруженного со скоростью 5 мкл / мин, в улавливающую колонку (ловушку). Образец обессоливали при следующем составе растворителя: 1% ацетонитрил + 0,1% муравьиная кислота (растворитель В) в воде + 0,1% муравьиная кислота (растворитель А). Пептиды были смыты с ловушки при 400 нл / мин на аналитическую колонку с использованием следующего 60-минутного линейного метода: через одну минуту исходный состав растворителя, равный 1% В, линейно увеличивали до 50% В к 31 мин. Непосредственное линейное изменение в течение двух минут до 85% B было начато немедленно. Эту композицию выдерживали от 33 до 36 мин, после чего композицию растворителя возвращали к исходным условиям. После разделения пептиды анализировали с помощью тандемной масс-спектрометрии в непрерывном режиме, используя следующие условия прибора: капиллярное напряжение 2,3 кВ, конусное напряжение 25 В, экстракционный конус 4 В, температура источника 80 °C, поток конического газа (N₂) 20 л/ч, нано-поток газа 0,50 л/ч, продувочный газ 100 л/ч, напряжение детектора 2350 В. Точность массы поддерживалась коррекцией фиксации массы, достигаемой инфузией в 0,5 мкл / мин раствора лейцин-энцефалина 200 нг/мл в 50% водном ацетонитриле плюс 0,1%-ной муравьиной кислоте. Был проведен эксперимент по сбору данных (DDA), который непрерывно сканировал пептиды с заряженным состоянием от 2+ до 4+ с интенсивностью более 50 импульсов в секунду в диапазоне m/z 350–1500. Три наиболее распространенных иона, удовлетворяющих этим условиям, были фрагментированы по три секунды каждый, и полученные спектры МС/МС были собраны в диапазоне m/z 50–2000. Затем массу каждого пептида-предшественника исключали в течение 30 с. Энергии столкновения для родительских ионов пептида были увеличены с 15 до 25 В при m/z от 350 до 30–40 В при m/z 1500. Затем массу предшественника пептида исключали в течение 30 с.

Данные трех технических реплицирующих экспериментов для каждой выборки были проанализированы качественно и количественно с помощью программного обеспечения Progenesis QI (Нелинейная динамика, Милфорд, Массачусетс, США). Пиковый выбор осуществляется там, где исходные данные MS-спектров сводятся к набору обнаруженных пептидов и пептидных ионов. Идентификация белков была получена путем экспорта в MASCOT 2.6.00 (Matrix Science) с помощью встроенного алгоритма учета ионов программного обеспечения и поиска в базе данных человека (UniProt KB/Swiss-Prot Protein Knowledge Base release 2018_10 от 20 октября 2018 года). Вариабельные модификации карбамидометила (С), дезамидированного (NQ), окисленного (М) и проионамида (С) были использованы с допусками по массе пептида и MS / MS 0,05 Da. Для относительного количественного определения белка интенсивность репортерных ионов тандемной массы (TMT) экстрагировали для каждого пептида. Коррекция изотопной чистоты проводилась в рамках Progenesis QI для каждого репортера на основе изотопного распределения репортеров sixplex-TMT, предоставленных производителем. Статистические тесты проводились с использованием SPSS версии 25 (IBM, Армонк, Нью-Йорк, США), которая включала тест Шапиро-Уилка, H-критерий Крускала-Уоллиса, U-критерий Манна-Уитни и критерий однородности дисперсии Левена. Инструмент STRING версии 11.0 [16] (http://www.stringdb.org) использовался для построения сетей взаимодействия белков и выявления общих биологических процессов.

3. Результаты

3.1. Характеристика микробиоты слизистой оболочки ГЭРБ и АП

Всего было выявлено 13 типов, 87 родов и 48 таксономических единиц видового уровня. Анализ альфа-разнообразия показал, что оценка богатства Chao1 (дополнительный рисунок S1) была значительно снижена у НЭРБ по сравнению с контролем (Pchao1 = 0,041) и РЭ (Pchao1 = 0,022), в то время как индекс разнообразия Шеннона не показал различий между группами. Анализ бета-разнообразия проводили с использованием расстояний Брэя-Кертиса и Джаккарда (дополнительный рисунок S2). Парный тест (PERMANOVA) и тест дисперсии (PERMDISP) выявили достоверные различия между контролем и разнообразием АП (PANOVA < 0.006, PDISP = 0.030). Состав микробиоты внутри каждой группы представлен на дополнительном рисунке S3.

3.2. Ключевые OTUs коррелирующие с прогрессированием ГЭРБ и АП

Для выявления микробов-кандидатов патогенеза ГЭРБ и АП мы исследовали различия в составе микробиоты пищевода на разных стадиях ГЭРБ (от НЭРБ до РЭ) и в АП. Многомерный анализ выявил 41 дифференциальный OTUs в пределах 9 типов (Рис.1). Конкретные дифференциальные OTUs представлены на Рис.2, а значимые пары выборок суммированы в таблице 2.

Рисунок 1. Дифференцированные оперативные таксономические единицы (OTUs) на уровне типа между неэрозивной рефлюксной болезнью (NERD), рефлюкс-эзофагитом (RE), пищеводом Барретта (BE), аденокарциномой пищевода (EAC) и контрольными группами.

Рисунок 2. Тепловая карта представляет 41 дифференцированную оперативную таксономическую единицу (OTUs) между контролем (CON; n = 16) и фенотипами заболеваний (неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD; n = 11), рефлюкс-эзофагит (RE; n = 20), пищевод Барретта (BE; n = 17) и аденокарцинома пищевода (EAC; n = 6)). OTUs от каждого фенотипа заболевания сравнивались с помощью многовариантного анализа (anova.manyglm; p-значение < 0,05). p-значения приведены в скобках (), таксоны, классифицированные выше уровня рода, обозначены в [ ]. Попарный анализ выявил различия в OTUs, связанные с определенным фенотипом заболевания(ий), эти маркеры сгруппированы черными контурами. Тренд изменения для каждого маркера в пределах фенотипа обозначен стрелкой.

Таблица 2. Значимые пары в пределах 41 дифференцированной оперативной таксономической единицей (OTUs) между неэрозивным рефлюксом (NERD; n = 11), рефлюкс-эзофагитом (RE; n = 20), пищеводом Барретта (BE; n = 17), аденокарциномой пищевода (EAC; n = 6) и контролем.

OTUs	p-значение	Отдельная группа/ы	Значимые Пары (p-значение < 0.05)
Firmicutes \| Tissierellaceae [семейство]	0.001	Больше всего в контроле	NERD–Контроль (0.027); RE–Контроль (0.002); BE–Контроль (0.011)
Firmicutes \| Pseudoramibacter eubacterium	0.006	Больше всего в контроле	RE–Контроль (0.001); RE–BE (0.031)
Firmicutes \| Clostridiaceae [семейство]	0.013	Больше всего в контроле	RE–Контроль (0.005); BE–Контроль (0.012)
Actinobacteria \| Rubrobacter	0.006	Больше всего в контроле	NERD–Контроль (0.037); RE–Контроль (0.009); BE–Контроль (0.047)
Actinobacteria \| Geodermatophilus	0.014	Больше всего в контроле	RE–Контроль (0.022); BE–Контроль (0.044)
Bacteroidetes \| Bacteroides uniformis	0.016	Больше всего в NERD	Контроль–NERD (0.026); BE–NERD (0.016)
Bacteroidetes \| Capnocytophaga	0.017	Больше всего в NERD	RE–NERD (0.009); BE–NERD (0.023); BE–EAC (0.046)
Proteobacteria \| Neisseria oralis	0.007	Больше всего в NERD	RE–NERD (0.004); EAC–NERD (0.008)
Proteobacteria \| Moraxella	0.049	Больше всего в NERD	BE–NERD (0.025)
Firmicutes \| Dorea	0.001	Больше всего в NERD	Контроль–NERD (0.001); RE–NERD (0.001); BE–NERD (0.001); EAC–NERD (0.001); RE–Контроль (0.016)
Bacteroidetes \| Prevotella pallens	0.019	Больше всего в NERD	RE–NERD (0.017); BE–NERD (0.014)
Firmicutes \| Acidaminobacteraceae [семейство]	0.024	Больше всего в NERD	BE–NERD (0.047); RE–NERD (0.047)
Fusobacteria \| Leptotrichia	0.001	Меньше всего в NERD	NERD–Контроль (0.001); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.001); NERD–EAC (0.005)
Actinobacteria \| Rothia	0.001	Меньше всего в NERD	NERD–Контроль (0.002); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.007); NERD–EAC (0.029)
Firmicutes \| Peptococcus	0.001	Меньше всего в NERD	NERD–Контроль (0.012); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.002); NERD–EAC (0.027)
Firmicutes \| Moryella	0.001	Меньше всего в NERD	NERD–Контроль (0.001); NERD–RE (0.001); NERD–BE (0.001); NERD–EAC (0.001)
Firmicutes \| Peptostreptococcaceae [семейство]	0.001	Меньше всего в NERD	NERD–Контроль (0.009); NERD–RE (0.004); NERD–EAC (0.036); BE–RE (0.002); EAC–RE (0.022); Контроль–BE (0.003)
Firmicutes \| Aerococcaceae [семейство]	0.012	Меньше всего в NERD	NERD–Контроль (0.002); NERD–RE (0.022); EAC–Контроль (0.011)
Tenericutes \| Mollicutes RF39 [порядок]	0.020	Меньше всего в NERD	NERD–Контроль (0.012); NERD–RE (0.028); NERD–BE (0.008)
Firmicutes \| Bacilli [класс]	0.008	Больше всего в RE	NERD–RE (0.013); BE–RE (0.002)
Bacteroidetes \| Bacteroidales S24-7	0.012	Больше всего в RE	NERD–RE (0.012); BE–RE (0.010); BE– Контроль (0.030)
Verrucomicrobia \| Akkermansia muciniphila	0.005	Больше всего в RE	Контроль–RE (0.011); NERD–RE (0.022); BE–RE (0.011)
Proteobacteria \| Marivita	0.009	Больше всего в RE	Контроль–RE (0.022); NERD–RE (0.026); Контроль–BE (0.028)
Bacteroidetes \| Bacteroidales [порядок]	0.001	Меньше всего в RE	NERD–Контроль (0.003); RE–Контроль (0.001); RE–BE (0.002); RE–EAC (0.001)
Firmicutes \| Solobacterium moorei	0.012	Меньше всего в RE	RE–Контроль (0.010); RE–NERD (0.004); RE–EAC (0.013)
Firmicutes \| Streptococcus infantis	0.001	Меньше всего в RE/BE	RE–Контроль (0.012); RE–NERD (0.004); RE–EAC (0.002); BE–Контроль (0.015); BE– NERD (0.001); BE–EAC (0.001)
Firmicutes \| Shuttleworthia	0.001	Больше всего в BE	Контроль–BE (0.004); NERD–BE (0.017); RE–BE (0.002); EAC–BE (0.003); NERD– EAC (0.007); Контроль–EAC (0.004)
Acidobacteria \| Acidobacteria-6	0.005	Больше всего в BE	RE–BE (0.006); NERD–BE (0.035); RE– Контроль (0.015)
Proteobacteria \| Nisaea	0.010	Больше всего в BE	Контроль–BE (0.009); NERD–BE (0.024); Контроль–RE (0.043)
Proteobacteria \| Mesorhizobium	0.028	Больше всего в BE	Контроль–BE (0.022); NERD–BE (0.041)
Firmicutes \| Mogibacterium	0.023	Меньше всего в BE	BE–Контроль (0.030); BE–NERD (0.014); BE–RE (0.012)
Proteobacteria \| Haemophilus influenzae	0.003	Больше всего в EAC	Контроль–BE (0.013); RE–BE (0.004); BE– EAC (0.013); Контроль–EAC (0.015)
Unknown/Unassigned	0.003	Больше всего в EAC	Контроль–EAC (0.003); NERD–EAC (0.015); BE–EAC (0.002); RE–EAC (0.002)
Firmicutes \| Staphylococcus aureus	0.025	Больше всего в EAC	Контроль–EAC (0.014); BE–EAC (0.010)
Actinobacteria \| Bifidobacterium	0.003	Больше всего в EAC	Контроль–EAC (0.002); NERD–EAC (0.004); BE–EAC (0.001)
Spirochaetes \| Sphaerochaeta	0.004	Больше всего в EAC	Контроль–EAC (0.025); NERD–EAC (0.033); BE–EAC (0.015); RE–EAC (0.020)
Proteobacteria \| Sinobacteraceae	0.009	Больше всего в EAC	NERD–EAC (0.028); BE–EAC (0.014); RE–EAC (0.018)
Firmicutes \| Lactobacillus salivarius	0.017	Больше всего в EAC	RE–EAC (0.038); BE–EAC (0.041)
Proteobacteria \| Rhodospirillaceae [семейство]	0.018	Больше всего в EAC	Контроль–EAC (0.018); NERD–EAC (0.037); RE–EAC (0.021)
Actinobacteria \| Rothia mucilaginosa	0.013	Минимально в EAC	EAC–Контроль; EAC–NERD (0.023); EAC–BE (0.032); EAC–RE (0.001)
Bacteroidetes \| Prevotella copri	0.039	Минимально в EAC	EAC–RE (0.003); EAC–BE (0.001); NERD–RE (0.030)

Контрольная микробиота имела более высокий уровень грамположительных Firmicutes (фирмикутов) и Actinobacteria (актинобактерий) по сравнению с другими группами. Состав микробиоты НЭРБ сместился в сторону протеобактерий (Neisseria oralis и Moraxella sp.) и бактероидетов (Bacteroidesiformis, Capnocytophaga sp. и Prevotella pallens), и от фузобактерий (Leptotrichia) и актинобактерий (Rothia). Несколько родов Firmicutes были снижены при НЭРБ (Peptococcus и Moryella), в то время как повышенное содержание Dorea привело к общему более высокому составу Firmicutes по сравнению с контролем. Микробиота РЭ и ПБ характеризовалась сдвигом от Firmicutes (Mogibacterium sp., Streptococcus infantis, Solobacterium moorei) к грамотрицательным Fusobacteria (Leptotrichia sp.) и Proteobacteria (Marivita, Nisaea, Mesorhizobium) относительно контроля. Микробиота АП характеризовалась сдвигом в сторону Firmicutes, главным образом Staphylococcus aureus, Streptococcus infantis, Moryella sp. и Lactobacillus salivarius, и Proteobacteria, и в то же время вдали от Actiobacteria (Rothia mucilaginosa) относительно контроля.

3.3. Функциональные изменения в протеоме слизистой оболочки хозяина ГЭРБ и АП

Чтобы получить механистическое понимание роли микробов и микросреды в ГЭРБ и АП, мы провели объективный количественный протеомный анализ эндоскопической биопсии слизистой оболочки, собранной в той же области пищевода, где были получены щеточные образцы микробиомов. Всего было подсчитано 378 белков; из них только 26 белков имели медианное соотношение выше 10-кратного и > 2 уникальных пептидов. Пятнадцать (15) количественно определенных белков были идентифицированы как дифференциально экспрессированные между тестируемыми группами (тест Крускала-Уоллиса р <0,05) (рис. 3). Значимые пары групп были идентифицированы и суммированы в таблице 3. Анализ белковых цепочек (Рис.4) выявил основную группу белков, повышенных в образцах РЭ и ПБ, ассоциированных с реакцией на токсические вещества: Аннексин-А1, реакцией на внеклеточный стимул: кератин 20, шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5) и связанный с окислительной детоксификацией: сывороточный альбумин, желудочная триацилглицеролипаза (фермент GSTP1) и бета-субъединица гемоглобина. Несколько эпителиальных маркеров были повышены в отношении РЭ, кератина 13, кератина 20 и гастрокина-1 по сравнению с другими группами, в то время как маркеры неоплазии десмин и виментин были повышены в ПБ и АП по сравнению с контролем.

Рисунок 3. Представлено обилие белка в 15 дифференциальных белках между фенотипами контроля и заболевания. p-значения, полученные с помощью теста Крускала-Уоллиса, отображаются в скобках ( ). Неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD); рефлюкс-эзофагит (RE); пищевод Барретта (BE); аденокарцинома пищевода (EAC); субъединица АТФ-синтазы бета (ATP5B); глутатион S-трансфераза p (GSTP1); шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5).

Рисунок 4. Карта межбелкового взаимодействия 15 дифференциальных белков между тестируемыми группами. Три биологических процесса были характерны для прогрессирования заболевания. Узлы являются репрезентативными для видов белков, а линии представляют белково-белковые ассоциации. Узлы одного цвета и / или соединенные линиями представляют общую функцию. Инструмент STRING (http://www.string-db.org) использовался для построения сетей взаимодействия. Десмин (DES); виментин (VIM); аннексин А1 (ANXA1); преламин-A/C (LMNA); сывороточный альбумин (ALB); глутатион-S-трансфераза р (GSTP1); бета-субъединица гемоглобина (HBA2); шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5); протеин дисульфид-изомераза (P4HB); Бета-субъединица АТФ-синтазы (ATP5B); 14-3-3 белок тета (YWHAQ); желудочная триацилглицеролипаза (LIPF); гастрокин-1 (GKN1); кератин 13 (KRT13); кератин 20 (KRT20).

Таблица 3. Значимые пары в пределах 15 дифференциальных белков между неэрозивным рефлюксом (NERD), рефлюкс-эзофагитом (RE), пищеводом Барретта (BE), аденокарциномой пищевода (EAC) и контролем.

Белок	p-значение	Отдельная группа/ы	Значимые Пары (p-значение < 0.05)
Кератин 13	0.017	Больше всего в RE	BE–RE (0.002); EAC–RE (0.021); NERD–RE (0.039)
Сывороточный альбумин	0.003	Низко в Контроль/NERD	NERD–RE (0.001); NERD–BE (<0.001); Контроль–BE (0.030)
Виметин	0.009	Меньше всего в NERD	NERD–BE (<0.001); NERD–RE (0.007); Контроль–BE (0.013)
Альфа-субъединица гемоглобина	0.016	Низко в NERD/EAC	NERD–RE (0.010); NERD–BE (0.010); EAC–BE (0.042)
Бета-субъединица АТФ-синтазы	0.016	Меньше всего в NERD	NERD–RE (0.003); NERD–BE (0.004)
Белковая дисульфид-изомераза	0.004	Высоко в RE/BE	NERD–RE (0.006); NERD–BE (0.008); EAC–RE (0.011); EAC–BE (0.013); Контроль–BE (0.033); Контроль–RE (0.039)
Гастрокин-1	0.034	Низко в Контроль/NERD	Контроль–BE (0.007); NERD–RE (0.015)
Глутатион-S-трансфераза p (GSTP1)	0.038	Высоко в RE/BE	NERD–RE (0.014); CON–RE (0.031); NERD–BE (0.034)
Десмин	0.020	Меньше всего в NERD	NERD–BE (0.004); NERD–RE (0.005); NERD–EAC (0.007); Контроль–EAC (0.011)
Шаперон эндоплазматического ретикулума BiP (HSPA5)	0.035	Меньше всего в NERD	NERD–BE (0.007); NERD–RE (0.008)
Желудочная триацилглицеролипаза	0.010	Высоко в RE/BE	Контроль–BE (0.004); CON–RE (0.012); NERD–BE (0.026)
Кератин 20	0.009	Больше всего в RE	BE–RE (0.008); NERD–RE (0.010); EAC–RE (0.017); BE–Контроль (0.047)
14-3-3 белок тета	0.009	Больше всего в RE	NERD–RE (0.002); EAC–RE (0.009); BE–RE (0.014)
Преламин-A/C	0.014	Низко в Контроль/NERD	NERD–RE (0.004); NERD–BE (0.010); Контроль–RE (0.017)
Аннексин А1	0.008	Низко в RE	NERD–RE (0.009); Контроль–RE (0.010); EAC–RE (0.012)

4. Обсуждение

В этом исследовании мы обнаружили отчетливую микробиоту пищевода у пациентов с НЭРБ, РЭ, ПБ и АП, что дает представление о молекулярных механизмах рефлюкс-ассоциированных заболеваний и потенциально новых направлениях стратификации заболеваний. Наше исследование показало, что общий состав микробиоты был изменен у НЭРБ и АП по сравнению с контролем, в то время как уникальные OTUs, присутствующие при НЭРБ и АП, не были обнаружены у пациентов с РЭ и ПБ.

Накопленные данные подтверждают характеристику НЭРБ как отдельного объекта от других заболеваний в спектре ГЭРБ. Гетерогенность у пациентов с НЭРБ была предположена, когда эта группа менее благоприятно реагировала на терапию подавления кислоты по сравнению с пациентами с РЭ [17]. Позднее это было продемонстрировано в ходе длительных исследований рН, которые показали, что у 30–50% пациентов с НЭРБ было нормальное время воздействия кислоты, но наблюдалась рефлюксная гиперчувствительность [18,19]. Недавнее протеомное исследование показало, что НЭРБ и эрозивно-рефлюксная болезнь являются различными заболеваниями, при этом у пациентов с НЭРБ сохраняется способность восстанавливать слизистую оболочку пищевода после кислотно-пепсиновых инсультов, в то время как у пациентов с эрозивно-рефлюксным заболеванием способность снижается [20]. Здесь мы продемонстрировали, что микробиота НЭРБ отклоняется от парадигмы микробиоты ГЭРБ [7], заключающейся в увеличении количества грамотрицательных бактерий (Fusobacteria и Proteobacteria) и снижении грамположительных Firmicutues (Streptococcus), наблюдаемых в нашей РЭ и ПБ микробиоте. Наш анализ протеома также показывает отсутствие значительных изменений в белках НЭРБ по сравнению с контролем, в то время как в РЭ наблюдались повышенные уровни белков реакции на стресс. Большинство наших пациентов с НЭРБ (64%) принимали ингибиторы протонной помпы из-за отсутствия реакции; поэтому мы постулируем, что уникальная микробиота НЭРБ может быть связана с гиперчувствительностью рефлюкса. Роль микробиоты в двунаправленном перекрестном разговоре между кишечником и мозгом еще далеко не установлена. Недавнее исследование синдрома раздраженного кишечника (СРК) показало, что передача фекальной микробиоты от гиперчувствительных пациентов с СРК крысам без микробов сопровождается передачей висцеральной гиперчувствительности при отсутствии каких-либо аномалий слизистой оболочки и изменения проницаемости кишечника [21]. Авторы сообщают о дисбиозе, характеризующемся значительным увеличением протеобактерий (в том числе сульфатредуцирующих Enterobacteriacaea и Desulfohalobioaceae) у мышей с СРК, и предполагают, что проноцицептивная роль люминального сероводорода (H₂S) вызывает возбуждение сенсорных нервов посредством активации каналов Т-типа. Последние данные свидетельствуют о том, что H₂S действует на преходящий рецепторный потенциал анкирина 1 (TRPA1) непосредственно в афферентных нейронах толстой кишки, усиливая ноцицептивную функцию [22]. Наши данные НЭРБ также показывают значительное увеличение протеобактерий и бактероидетов (включая Neisseria, Prevotella и Bacteroides с сульфатредуцирующими способностями у некоторых видов), наряду с более высокой распространенностью производителя газообразного водорода Dorea sp. Хотя специфические сульфатредуцирующие бактерии, идентифицированные у пациентов с СРК, не были идентифицированы в дистальном отделе пищевода наших пациентов с НЭРБ, их особая микробиота требует дальнейшего изучения механистической роли взаимодействия микробиота-хозяин.

Длительный желудочный рефлюкс с последующей инфильтрацией воспалительных клеток в слизистую пищевода являются преобладающими микросредовыми характеристиками РЭ и ПБ. В этих условиях наша РЭ и ПБ микробиота показала характерный сдвиг от грамположительных видов Firmicute к грамотрицательным Fusobacteria и Proteobacteria по сравнению с контролем. Это согласуется с прошлыми исследованиями у пациентов с РЭ и ПБ [7,23,24]. Здоровый дистальный отдел пищевода питает преимущественно Firmicutes перорального происхождения (70–87%). Это изменено в RE и BE, чтобы напоминать желудочную микробиоту, которая состоит из меньшего количества Firmicutes (22–30%) и большего количества грамотрицательных бактерий [25]. Хотя в этом исследовании не оценивалась микробиота полости рта или желудка, вполне вероятно, что пищевод постоянно подвергается воздействию преходящих колонизаторов из слюны полости рта и желудочного рефлюкса. Изменения в микробиоте пищевода отражают источник преходящих бактерий и микросреды. В случае РЭ и ПБ повышенное воздействие желудочного рефлюкса в сочетании с кислой микроокружающей средой привело к изменению состава желудочных бактерий. Растет интерес к желудочным бактериям Helicobacter pylori и их роли в рефлюксных заболеваниях. Ликвидация H. pylori совпала с увеличением распространенности ГЭРБ и повышенным риском ПБ. Хотя состав H. pylori существенно не различался между нашими группами, известно, что эти бактерии модулируют некоторые гормоны (гастрин, грелин и лептин) и могут оказывать косвенное влияние на ГЭРБ [26], а также на метаболизм хозяина [27] и другие органы, такие как поджелудочная железа [28].

Протеом РЭ и ПБ продемонстрировал согласованные усилия по обеспечению выживания клеток за счет повышенной экспрессии белков, ответственных за репарацию ДНК и белков (преламин-A/C, белковая дисульфид-изомераза и 14-3-3 протеин тета), что согласуется с предыдущими исследованиями [20,29,30]. Белки, связанные со стрессовой реакцией аннексин-А1 и GSTP1, также были повышены. Аннексин-А1 считается предполагаемым медиатором глюкокортикоидной иммуносупрессивной активности [31] и ассоциируется с хроническим воспалением в пищеводе [32], в то время как фермент GSTP1 принадлежит к супергенному семейству ферментов, участвующих в защите клеток от окислительного стресса. Фермент GSTP1 является наиболее важной формой в пищеводе, с повышенной экспрессией во время кислотного рефлюкса [33]. Длительное воздействие желудочных ферментов и желчных кислот может усугубить повреждение слизистой оболочки пищевода, что приводит к метаплазии и неоплазии [34]. Желудочно-специфический фермент желудочная триацилглицероллипаза была повышена в РЭ и ПБ наряду с маркером желудочного эпителия гастрокином-1. Признаки неоплазии в ПБ и АП характеризовались снижением маркеров желудочно-кишечного эпителия кератина 13 и кератина 20 [35] по сравнению с РЭ, в то время как маркеры эпителиально-мезенхимного перехода виментин и десмин были повышены в ПБ и АП соответственно, по сравнению с контролем.

Ингибиторы протонной помпы (ИПП) являются основой лечения рефлюксной болезни. Изменения микробиома пищевода в результате снижения желудочной кислотности, вызванной ИПП, были изучены в нескольких исследованиях, и было показано, что они играют важную роль в формировании популяций микробов [36–39]. Наши результаты предполагают связь между лечением ИПП с небольшим снижением количества Bacteroidetes и Proteobacteria и повышенным содержанием Firmicutes (дополнительный рисунок S4), о чем ранее также сообщали Amir et al. [39]. Эффекты лечения ИПП на протеоме НЭРБ и РЭ показали снижение уровней белковой дисульфидизомеразы и сывороточного альбумина, связанных со стрессовой реакцией и детоксикацией, соответственно. Однако в ПБ лечение ИПП приводило к повышению уровня этих белков (дополнительная фигура S5). Связь между ИПП и неопластической прогрессией при ПБ противоречива. С одной стороны, снижение воздействия пищеводной кислоты на ИПП уменьшает воспаление и пролиферацию [40]. С другой стороны, терапия ИПП препятствует воздействию вторичных желчных кислот на пищевод, повышает уровень циркулирующего гастрина и вызывает активацию ЦОГ-2 [41,42]. Наши результаты показывают, что лечение ИПП может оказывать положительное влияние на НЭРБ и РЭ, но может отрицательно влиять на ПБ. Однако, учитывая, что основная цель нашего исследования не состояла в том, чтобы исследовать лечение ИПП, будущие исследования, включающие большие размеры выборки и лучший контроль переменных (например, время лечения ИПП, дозировка), необходимы для оценки влияния лечения ИПП на ПБ.

Микробиота АП менее четко определена, чем у РЭ и ПБ. Ранние культурные исследования образцов эзофагэктомии, выделенных из АП, не выявили каких-либо различий в организмах, изолированных в доброкачественной и злокачественной ткани [43,44]. Blackett et al. использовала современную технику секвенирования для выявления «U-образной» тенденции с сопоставимым грамположительным составом у здоровых контролей и АП, в отличие от микробиоты ГЭРБ [8]. Исследование с использованием Cytosponge-проб показало, что фирмикуты родов Lactobacillus и Streptococcus доминируют в АП [45]. Авторы предполагают, что виды Streptococcus способны выживать в микроокружении с низким содержанием питательных веществ благодаря ингибированию роста конкурентов, процессу, который может индуцировать toll-подобные рецепторы хозяина и повреждение тканей высвобождением токсина. Наши данные также показали сходную композицию микробиоты АП, состоящую из Staphylococcus aureus, Lactobacillus salivarius, Haemophilus influenzae, Sphaerochaeta sp. и Bifidobacterium sp., наряду с ростом Streptococcus infantis, вида, присутствующего в контроле и НЭРБ, но отсутствующего в РЭ и ПБ, Высокая распространенность молочнокислых бактерий (Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus, Streptococcus) традиционно связана со здоровьем желудочно-кишечного тракта, учитывая их полезную роль в иммуномодуляции [46], выработке перекисей, кислот и бактериоцинов, а также белков, которые изменяют проницаемость эпителия и связывание с кишечными рецепторами патогенов [47]. Однако в контексте рака повышенные уровни молочной кислоты могут быть очень вредными. Нарушение метаболизма лактата является одним из признаков канцерогенеза [48]. Лактат может служить источником энергии в АП и других формах рака, вызывая гликолитические ферменты, что приводит к увеличению снабжения АТФ. Этот метаболит может также способствовать воспалению и стимулировать ангиогенез опухоли [49–51]. О последовательном увеличении количества молочнокислых бактерий (Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium) сообщается на разных стадиях аденокарциномы желудка, и считается, что он напрямую способствует канцерогенезу [52]. In vivo доказательством роли бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в канцерогенезе желудка является колонизация модели инсулин-гастрин-трансгенных мышей микробиотой, продуцирующей молочную кислоту, что приводит к интраэпителиальной неоплазии желудочно-кишечного тракта и повышенной регуляции генов, связанных с раком [53]. Другие факторы могут также способствовать развитию микробиоты АП. Дисфагия, распространенный симптом АП, часто уменьшает выбор питания пациента, который больше полагается на жидкие блюда, такие как молочные питательные смеси. Диетические изменения и последующая доступность макронутриентов могут оказать существенное влияние на состав микробиоты кишечника [54], при этом исследование показало увеличение состава лактобацилл в дистальном отделе пищевода мышей, получавших рацион с высоким содержанием жиров [55]. Аналогичным образом, возрастные изменения в выработке слюны, учитывая, что когорта АП имеет самый высокий средний возраст, может изменить здоровье полости рта и микробиоту [56]. Было показано, что снижение выработки слюны влияет на здоровье желудочно-кишечного тракта, например, замедленное заживление язв желудка и двенадцатиперстной кишки [57, 58]. Снижение микробного разнообразия и относительной численности также сообщалось в слюне пациентов с АП относительно контроля [59]. Предварительная связь между АП и здоровьем полости рта начинает появляться в литературе и может объяснить происхождение отдельной микробиоты АП.

Ограничением нашего исследования было то, что культивирование бактерий пищевода не проводилось наряду с секвенированием 16S рРНК. Экстрагированная ДНК в основном поступает из живых бактерий, но этот метод также выделяет ДНК из мертвых бактерий, а также бактериальных остатков. Следовательно, идентификация ДНК, специфичной для любых бактериальных штаммов, не обязательно указывает на присутствие живых бактерий в пищеводе. Еще одним ограничением было относительно небольшое количество белков, идентифицированных в наших биопсийных образцах тканей. Хотя наши результаты были сопоставимы с исследованиями с использованием эндоскопических биопсий аналогичного размера [60], они были значительно меньше по сравнению с протеомным анализом с использованием хирургических резекций АП (>300 белков) [30,61]. Небольшие диагностические биопсии слизистой оболочки в дозе 3-5 мг [62] могут не захватывать достаточное количество раковых клеток для всестороннего протеомного анализа по сравнению с гораздо более крупными хирургически резецированными тканями (30-60 мг) [61]. В результате классические маркеры рака, такие как молекула эпителиальной клеточной адгезии (EpCAM) и маркеры воспаления, не были идентифицированы в наших образцах АП. Наши результаты показывают, что сложность протеома пищевода превосходит аналитические возможности нашего подхода. Более комплексный протеомный подход может заключаться в использовании глубоких биопсий тканей и обогащении белков низкой плотности за счет использования библиотеки лигандов твердофазных гексапептидов.

В целом наши результаты подчеркивают важность микробного сообщества и его взаимодействия с хозяином при заболеваниях, связанных с кислотным рефлюксом. Мы предлагаем центральную роль для дисбиотической микробиоты в развитии НЭРБ и АП. Хотя трудно определить механизмы, лежащие в основе роли бактерий в патогенезе заболевания, роль микробиоты в стимуляции висцеральной гиперчувствительности и развития аденокарциномы была продемонстрирована в других органах желудочно-кишечного тракта. Таким образом, наши результаты также предполагают участие микробиоты слизистой пищевода в патогенезе НЭРБ и АП.

Дополнительные материалы: следующие материалы доступны в Интернете по адресу www.mdpi.com/2077-0383/9/7/2162/s1 или по этой ссылке (ниже даны комментарии к рисункам).

Рисунок S1: Альфа-анализ разнообразия контроля, неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагита (RE), пищевода Барретта (BE) и аденокарциномы пищевода (EAC) с использованием оценки богатства Chao1 и индекса разнообразия Шеннона.

Рисунок S2. Неметрический график многомерного масштабирования (nMDS) для анализа несходства Брэя-Кертиса (изобилия и состава) и анализа Джаккарда (наличия/отсутствия) контроля, неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагита (RE), пищевода Барретта (BE) и аденокарциномы пищевода (EAC).

Рисунок S3. Состав микробиоты внутри каждой группы: контроль, неэрозивная рефлюксная болезнь (NERD), рефлюкс-эзофагит (RE), пищевод Барретта (BE) и аденокарцинома пищевода (EAC).

Рисунок S4. Различия в составе бактериального типа между лечением ингибиторами протонной помпы при неэрозивной рефлюксной болезни (NERD), рефлюкс-эзофагите (RE) и фенотипах болезни пищевода Барретта (BE).

Рисунок S5: (А) белковая дисульфид-изомераза и (Б) сывороточный альбумин были обнаружены дифференцированно экспрессированными между обработанными ингибитором протонной помпы (ИПП) и необработанными протеомными образцами слизистой оболочки при неэрозивных рефлюксных заболеваниях (NERD), рефлюкс-эзофагите (RE) и пищеводе Барретта (BE).

К разделу: Роль микробиома в развитии и терапии рака

Литература

El-Serag, H.B. Time trends of gastroesophageal reflux disease: A systematic review. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2007, 5, 17–26, doi:10.1016/j.cgh.2006.09.016.
Tack, J.; Pandolfino, J.E. Pathophysiology of Gastroesophageal Reflux Disease. Gastroenterology 2018, 154, 277–288, doi:10.1053/j.gastro.2017.09.047.
Fass, R. Non-erosive reflux disease (NERD) and erosive esophagitis—A spectrum of disease or special entities? Z Gastroenterol. 2007, 45, 1156–1163, doi:10.1055/s-2007-963628.
Devesa, S.S.; Blot, W.J.; Fraumeni, J.F., Jr. Changing patterns in the incidence of esophageal and gastric carcinoma in the United States. Cancer 1998, 83, 2049–2053.
Chang, J.T.; Katzka, D.A. Gastroesophageal reflux disease, Barrett esophagus, and esophageal adenocarcinoma. Arch. Intern. Med. 2004, 164, 1482–1488, doi:10.1001/archinte.164.14.1482.
Ceranowicz, P.; Warzecha, Z.; Dembinski, A. Peptidyl hormones of endocrine cells origin in the gut—their discovery and physiological relevance. J. Physiol. Pharmacol. 2015, 66, 11–27.
Yang, L.; Lu, X.; Nossa, C.W.; Francois, F.; Peek, R.M.; Pei, Z. Inflammation and intestinal metaplasia of the distal esophagus are associated with alterations in the microbiome. Gastroenterology 2009, 137, 588–597, doi:10.1053/j.gastro.2009.04.046.
Blackett, K.L.; Siddhi, S.S.; Cleary, S.; Steed, H.; Miller, M.H.; Macfarlane, S.; Macfarlane, G.T.; Dillon, J.F. Oesophageal bacterial biofilm changes in gastro-oesophageal reflux disease, Barrett’s and oesophageal carcinoma: Association or causality? Aliment. Pharmacol. Ther. 2013, 37, 1084–1092, doi:10.1111/apt.12317.
Liu, N.; Ando, T.; Ishiguro, K.; Maeda, O.; Watanabe, O.; Funasaka, K.; Nakamura, M.; Miyahara, R.; Ohmiya, N.; Goto, H. Characterization of bacterial biota in the distal esophagus of Japanese patients with reflux esophagitis and Barrett’s esophagus. BMC Infect. Dis. 2013, 13, 130, doi:10.1186/1471-2334-13-130.
Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 2011, 17, 10–12.
Caporaso, J.G.; Kuczynski, J.; Stombaugh, J.; Bittinger, K.; Bushman, F.D.; Costello, E.K.; Fierer, N.; Pena, A.G.; Goodrich, J.K.; Gordon, J.I.; et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Methods 2010, 7, 335–336, doi:10.1038/nmeth.f.303.
DeSantis, T.Z.; Hugenholtz, P.; Larsen, N.; Rojas, M.; Brodie, E.L.; Keller, K.; Huber, T.; Dalevi, D.; Hu, P.; Andersen, G.L. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 5069–5072, doi:10.1128/AEM.03006-05.
Anderson, M.J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecol. 2001, 26, 32–46.
Anderson, M.J. Distance-based tests for homogeneity of multivariate dispersions. Biometrics 2006, 62, 245–253.
Wang, Y.; Naumann, U.; Wright, S.T.; Warton, D.I. Mvabund—An R package for model-based analysis of multivariate abundance data. Methods Ecol. Evol. 2012, 3, 471–474.
Szklarczyk, D.; Gable, A.L.; Lyon, D.; Junge, A.; Wyder, S.; Huerta-Cepas, J.; Simonovic, M.; Doncheva, N.T.; Morris, J.H.; Bork, P.; et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019, 47, D607–D613, doi:10.1093/nar/gky1131.
Lind, T.; Havelund, T.; Carlsson, R.; Anker-Hansen, O.; Glise, H.; Hernqvist, H.; Junghard, O.; Lauritsen, K.; Lundell, L.; Pedersen, S.A.; et al. Heartburn without oesophagitis: Efficacy of omeprazole therapy and features determining therapeutic response. Scand. J. Gastroenterol. 1997, 32, 974–979, doi:10.3109/00365529709011212.
Fass, R.; Fennerty, M.B.; Vakil, N. Nonerosive reflux disease—Current concepts and dilemmas. Am. J. Gastroenterol. 2001, 96, 303–314, doi:10.1111/j.1572-0241.2001.03511.x.
Yamasaki, T.; Fass, R. Reflux Hypersensitivity: A New Functional Esophageal Disorder. J. Neurogastroenterol. Motil. 2017, 23, 495–503, doi:10.5056/jnm17097.
Calabrese, C.; Marzano, V.; Urbani, A.; Lazzarini, G.; Valerii, M.C.; Liguori, G.; Di Molfetta, S.; Rizzello, F.; Gionchetti, P.; Campieri, M.; et al. Distinct proteomic profiles characterise non-erosive from erosive reflux disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 2011, 34, 982–993, doi:10.1111/j.1365-2036.2011.04801.x.
Distinct proteomic profiles characterise non-erosive from erosive Crouzet, L.; Gaultier, E.; Del’Homme, C.; Cartier, C.; Delmas, E.; Dapoigny, M.; Fioramonti, J.; Bernalier-Donadille, A. The hypersensitivity to colonic distension of IBS patients can be transferred to rats through their fecal microbiota. Neurogastroenterol. Motil. 2013, 25, e272–e282, doi:10.1111/nmo.12103.
Blachier, F.; Davila, A.M.; Mimoun, S.; Benetti, P.H.; Atanasiu, C.; Andriamihaja, M.; Benamouzig, R.; Bouillaud, F.; Tome, D. Luminal sulfide and large intestine mucosa: Friend or foe? Amino Acids 2010, 39, 335–347, doi:10.1007/s00726-009-0445-2.
Fillon, S.A.; Harris, J.K.; Wagner, B.D.; Kelly, C.J.; Stevens, M.J.; Moore, W.; Fang, R.; Schroeder, S.; Masterson, J.C.; Robertson, C.E.; et al. Novel device to sample the esophageal microbiome—The esophageal string test. PLoS ONE 2012, 7, e42938, doi:10.1371/journal.pone.0042938.
Pei, Z.; Yang, L.; Peek, R.M.; Levine, S.M., Jr.; Pride, D.T.; Blaser, M.J. Bacterial biota in reflux esophagitis and Barrett’s esophagus. World J. Gastroenterol. 2005, 11, 7277–7283, doi:10.3748/wjg.v11.i46.7277.
Snider, E.J.; Freedberg, D.E.; Abrams, J.A. Potential Role of the Microbiome in Barrett’s Esophagus and Esophageal Adenocarcinoma. Dig. Dis. Sci. 2016, 61, 2217–2225, doi:10.1007/s10620-016-4155-9.
Eross, B.; Farkas, N.; Vincze, A.; Tinusz, B.; Szapary, L.; Garami, A.; Balasko, M.; Sarlos, P.; Czopf, L.; Alizadeh, H.; et al. Helicobacter pylori infection reduces the risk of Barrett’s esophagus: A meta-analysis and systematic review. Helicobacter 2018, 23, e12504, doi:10.1111/hel.12504.
Blaser, M.J. Helicobacter pylori and esophageal disease: Wake-up call? Gastroenterology 2010, 139, 1819–1822, doi:10.1053/j.gastro.2010.10.037.
Warzecha, Z.; Dembinski, A.; Ceranowicz, P.; Dembinski, M.; Sendur, R.; Pawlik, W.W.; Konturek, S.J. Deleterious effect of Helicobacter pylori infection on the course of acute pancreatitis in rats. Pancreatology 2002, 2, 386–395, doi:10.1159/000065086.
Hsieh, L.Y. Understanding the Fibroblast-Extracellular Matrix Interaction Regarding Tissue Remodeling in EoE. UC San Diego, San Diego, CA, USA, 2019.
Zhao, J.; Chang, A.C.; Li, C.; Shedden, K.A.; Thomas, D.G.; Misek, D.E.; Manoharan, A.P.; Giordano, T.J.; Beer, D.G.; Lubman, D.M. Comparative proteomics analysis of Barrett metaplasia and esophageal adenocarcinoma using two-dimensional liquid mass mapping. Mol. Cell. Proteom. 2007, 6, 987–999, doi:10.1074/mcp.M600175-MCP200.
Hannon, R.; Croxtall, J.D.; Getting, S.J.; Roviezzo, F.; Yona, S.; Paul-Clark, M.J.; Gavins, F.N.; Perretti, M.; Morris, J.F.; Buckingham, J.C.; et al. Aberrant inflammation and resistance to glucocorticoids in annexin 1-/-mouse. FASEB J. 2003, 17, 253–255, doi:10.1096/fj.02-0239fje.
Takaoka, R.T.C.; Sertorio, N.D.; Magalini, L.P.J.; Dos Santos, L.M.; Souza, H.R.; Iyomasa-Pilon, M.M.; Possebon, L.; Costa, S.S.; Girol, A.P. Expression profiles of Annexin A1, formylated peptide receptors and cyclooxigenase-2 in gastroesophageal inflammations and neoplasias. Pathol. Res. Pract. 2018, 214, 181–186, doi:10.1016/j.prp.2017.12.003.
Brabender, J.; Lord, R.V.; Wickramasinghe, K.; Metzger, R.; Schneider, P.M.; Park, J.M.; Holscher, A.H.; DeMeester, T.R.; Danenberg, K.D.; Danenberg, P.V. Glutathione S-transferase-pi expression is downregulated in patients with Barrett′s esophagus and esophageal adenocarcinoma. J. Gastrointest. Surg. 2002, 6, 359–367, doi:10.1016/s1091-255x(02)00003-3.
Jankowski, J.A.; Harrison, R.F.; Perry, I.; Balkwill, F.; Tselepis, C. Barrett’s metaplasia. Lancet 2000, 356, 2079–2085, doi:10.1016/S0140-6736(00)03411-5.
Stairs, D.B.; Nakagawa, H.; Klein-Szanto, A.; Mitchell, S.D.; Silberg, D.G.; Tobias, J.W.; Lynch, J.P.; Rustgi, A.K. Cdx1 and c-Myc foster the initiation of transdifferentiation of the normal esophageal squamous epithelium toward Barrett’s esophagus. PLoS ONE 2008, 3, e3534, doi:10.1371/journal.pone.0003534.
Jackson, M.A.; Goodrich, J.K.; Maxan, M.E.; Freedberg, D.E.; Abrams, J.A.; Poole, A.C.; Sutter, J.L.; Welter, D.; Ley, R.E.; Bell, J.T.; et al. Proton pump inhibitors alter the composition of the gut microbiota. Gut 2016, 65, 749–756, doi:10.1136/gutjnl-2015-310861.
Freedberg, D.E.; Toussaint, N.C.; Chen, S.P.; Ratner, A.J.; Whittier, S.; Wang, T.C.; Wang, H.H.; Abrams, J.A. Proton Pump Inhibitors Alter Specific Taxa in the Human Gastrointestinal Microbiome: A Crossover Trial. Gastroenterology 2015, 149, 883–885, doi:10.1053/j.gastro.2015.06.043.
Rosen, R.; Amirault, J.; Liu, H.; Mitchell, P.; Hu, L.; Khatwa, U.; Onderdonk, A. Changes in gastric and lung microflora with acid suppression: Acid suppression and bacterial growth. JAMA Pediatrics 2014, 168, 932– 937, doi:10.1001/jamapediatrics.2014.696.
Amir, I.; Konikoff, F.M.; Oppenheim, M.; Gophna, U.; Half, E.E. Gastric microbiota is altered in oesophagitis and Barrett’s oesophagus and further modified by proton pump inhibitors. Environ. Microbiol. 2014, 16, 2905–2914, doi:10.1111/1462-2920.12285.
Li, D.; Deconda, D.; Li, A.; Habr, F.; Cao, W. Effect of Proton Pump Inhibitor Therapy on NOX5, mPGES1 and iNOS expression in Barrett’s Esophagus. Sci. Rep. 2019, 9, 16242, doi:10.1038/s41598-019-52800-7.
Dall’Olmo, L.; Fassan, M.; Dassie, E.; Scarpa, M.; Realdon, S.; Cavallin, F.; Cagol, M.; Battaglia, G.; Pizzi, M.; Guzzardo, V.; et al. Role of proton pump inhibitor on esophageal carcinogenesis and pancreatic acinar cell metaplasia development: An experimental in vivo study. PLoS ONE 2014, 9, e112862, doi:10.1371/journal.pone.0112862.
Hu, Q.; Sun, T.T.; Hong, J.; Fang, J.Y.; Xiong, H.; Meltzer, S.J. Proton Pump Inhibitors Do Not Reduce the Risk of Esophageal Adenocarcinoma in Patients with Barrett’s Esophagus: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS ONE 2017, 12, e0169691, doi:10.1371/journal.pone.0169691.
Lau, W.F.; Wong, J.; Lam, K.H.; Ong, G.B. Oesophageal microbial flora in carcinoma of the oesophagus. ANZ J. Surg. 1981, 51, 52–55, doi:10.1111/j.1445-2197.1981.tb05905.x.
Finlay, I.G.; Wright, P.A.; Menzies, T.; McArdle, C.S. Microbial flora in carcinoma of oesophagus. Thorax 1982, 37, 181–184, doi:10.1136/thx.37.3.181.
Elliott, D.R.F.; Walker, A.W.; O’Donovan, M.; Parkhill, J.; Fitzgerald, R.C. A non-endoscopic device to sample the oesophageal microbiota: A case-control study. Lancet Gastroenterol. Hepatol. 2017, 2, 32–42, doi:10.1016/S2468-1253(16)30086-3.
Dembinski, A.; Warzecha, Z.; Ceranowicz, P.; Dembinski, M.; Cieszkowski, J.; Gosiewski, T.; Bulanda, M.; Kusnierz-Cabala, B.; Galazka, K.; Konturek, P.C. Synergic Interaction of Rifaximin and Mutaflor (Escherichia coli Nissle 1917) in the Treatment of Acetic Acid-Induced Colitis in Rats. Gastroenterol. Res. Pract. 2016, 2016, 3126280, doi:10.1155/2016/3126280.
Madsen, K.; Cornish, A.; Soper, P.; McKaigney, C.; Jijon, H.; Yachimec, C.; Doyle, J.; Jewell, L.; De Simone, C. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology 2001, 121, 580–591, doi:10.1053/gast.2001.27224.
San-Millan, I.; Brooks, G.A. Reexamining cancer metabolism: Lactate production for carcinogenesis could be the purpose and explanation of the Warburg Effect. Carcinogenesis 2017, 38, 119–133, doi:10.1093/carcin/bgw127.
Huhta, H.; Helminen, O.; Palomaki, S.; Kauppila, J.H.; Saarnio, J.; Lehenkari, P.P.; Karttunen, T.J. Intratumoral lactate metabolism in Barrett’s esophagus and adenocarcinoma. Oncotarget 2017, 8, 22894– 22902, doi:10.18632/oncotarget.15284.
Doherty, J.R.; Cleveland, J.L. Targeting lactate metabolism for cancer therapeutics. J. Clin. Investig. 2013, 123, 3685–3692, doi:10.1172/JCI69741.
Sonveaux, P.; Copetti, T.; De Saedeleer, C.J.; Vegran, F.; Verrax, J.; Kennedy, K.M.; Moon, E.J.; Dhup, S.; Danhier, P.; Frerart, F.; et al. Targeting the lactate transporter MCT1 in endothelial cells inhibits lactateinduced HIF-1 activation and tumor angiogenesis. PLoS ONE 2012, 7, e33418, doi:10.1371/journal.pone.0033418.
Vinasco, K.; Mitchell, H.M.; Kaakoush, N.O.; Castano-Rodriguez, N. Microbial carcinogenesis: Lactic acid bacteria in gastric cancer. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 2019, 1872, 188309, doi:10.1016/j.bbcan.2019.07.004.
Lertpiriyapong, K.; Whary, M.T.; Muthupalani, S.; Lofgren, J.L.; Gamazon, E.R.; Feng, Y.; Ge, Z.; Wang, T.C.; Fox, J.G. Gastric colonisation with a restricted commensal microbiota replicates the promotion of neoplastic lesions by diverse intestinal microbiota in the Helicobacter pylori INS-GAS mouse model of gastric carcinogenesis. Gut 2014, 63, 54–63, doi:10.1136/gutjnl-2013-305178.
Wu, G.D.; Chen, J.; Hoffmann, C.; Bittinger, K.; Chen, Y.Y.; Keilbaugh, S.A.; Bewtra, M.; Knights, D.; Walters, W.A.; Knight, R.; et al. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science 2011, 334, 105–108, doi:10.1126/science.1208344.
Zhao, X.; Liu, X.W.; Xie, N.; Wang, X.H.; Cui, Y.; Yang, J.W.; Chen, L.L.; Lu, F.G. Lactobacillus species shift in distal esophagus of high-fat-diet-fed rats. World J. Gastroenterol. 2011, 17, 3151–3157, doi:10.3748/wjg.v17.i26.3151.
Xu, F.; Laguna, L.; Sarkar, A. Aging-related changes in quantity and quality of saliva: Where do we stand in our understanding? J. Texture Stud. 2019, 50, 27–35, doi:10.1111/jtxs.12356.
Konturek, S.J.; Dembinski, A.; Warzecha, Z.; Brzozowski, T.; Gregory, H. Role of epidermal growth factor in healing of chronic gastroduodenal ulcers in rats. Gastroenterology 1988, 94, 1300–1307, doi:10.1016/0016-5085(88)90667-1.
Warzecha, Z.; Kownacki, P.; Ceranowicz, P.; Dembinski, M.; Cieszkowski, J.; Dembinski, A. Ghrelin accelerates the healing of oral ulcers in non sialoadenectomized and sialoadenectomized rats. J. Physiol. Pharmacol. 2013, 64, 657–668.
Chen, X.; Winckler, B.; Lu, M.; Cheng, H.; Yuan, Z.; Yang, Y.; Jin, L.; Ye, W. Oral Microbiota and Risk for Esophageal Squamous Cell Carcinoma in a High Risk Area of China. PLoS ONE 2015, 10, e0143603, doi:10.1371/journal.pone.0143603.
Roesch-Ely, M.; Leipold, A.; Nees, M.; Holzinger, D.; Dietz, A.; Flechtenmacher, C.; Wolf, T.; Zapatka, M.; Bosch, F.X. Proteomic analysis of field cancerization in pharynx and oesophagus: A prospective pilot study. J. Pathol. 2010, 221, 462–470, doi:10.1002/path.2726.
O’Neill, J.R.; Pak, H.S.; Pairo-Castineira, E.; Save, V.; Paterson-Brown, S.; Nenutil, R.; Vojtesek, B.; Overton, I.; Scherl, A.; Hupp, T.R. Quantitative Shotgun Proteomics Unveils Candidate Novel Esophageal Adenocarcinoma (EAC)-specific Proteins. Mol. Cell. Proteom. 2017, 16, 1138–1150, doi:10.1074/mcp.M116.065078.
Danesh, B.J.; Burke, M.; Newman, J.; Aylott, A.; Whitfield, P.; Cotton, P.B. Comparison of weight, depth, and diagnostic adequacy of specimens obtained with 16 different biopsy

Будьте здоровы!

Перейти к ссылкам к основным разделам