Пропионибактерии в качестве пробиотиков для свиней

Продукт, ферментированный P. freudenreichii, улучшил потребление пищи и рост поросят

Оценка пробиотического потенциала молочного продукта, ферментированного Propionibacterium freudenreichii, у поросят

Молочные пропионибактерии, в том числе Propionibacterium freudenreichii, проявляют многообещающие пробиотические свойства, включая иммуномодуляцию. Эти свойства сильно зависят от штамма и редко изучаются в кисломолочных продуктах. Мы проверили 10 штаммов, выращенных в недавно разработанном кисломолочном ультрафильтрате (UF), на иммуномодулирующие свойства in vitro. Самый противовоспалительный штамм P. freudenreichii BIA129 был дополнительно протестирован на поросятах. Продукт, ферментированный P. freudenreichii, улучшил потребление пищи и рост поросят. Эксплантаты слизистой оболочки толстой кишки обработанных свиней секретировали меньше интерлейкина 8 (-25%, P <0,05) и фактора некроза опухоли α (-20%, P <0,05) как в исходных условиях, так и после введения липополисахаридов. Напротив, структура кишечника, барьерная функция (измеренная ex vivo в камерах Уссинга), микробное разнообразие (оцененное пиросеквенированием 16S рРНК) и содержание короткоцепочечных жирных кислот в толстой кишке не изменились, что предполагает сохранение нормальной физиологии кишечника. В заключение, данная работа подтверждает in vivo пробиотические свойства молочных продуктов, ферментированных пропионибактериями, которые перспективны для профилактики или лечения воспалительных заболеваний кишечника.

Вступление

Молочные пропионибактерии, особенно Propionibacterium freudenreichii (PF), считаются рассматриваются как потенциальные пробиотики для использования как животными, так и людьми. Это основано на недавно рассмотренных различных потенциальных преимуществах для здоровья.¹ Потребляемая в больших количествах в составе Эмменталя и других видов швейцарского сыра, PF представляет собой бактерию со статусом GRAS, которая стимулирует рост бифидобактерий², что, как было доказано, полезно для здоровья человека.

PF также является многообещающим иммуномодулирующим пробиотиком. Он индуцирует высокие уровни регуляторного противовоспалительного цитокина интерлейкина 10 (IL-10) в мононуклеарных клетках периферической крови человека (РВМСs) штамм-зависимым образом.³ В этом участвуют вариабельные поверхностные соединения пропионибактерий; штаммы, имеющие ключевые поверхностные белки, индуцируют цитокины, а штаммы, покрытые поверхностным β-глюканом, - нет.⁴ Наиболее стрессоустойчивые штаммы PF продуцируют в кишечнике короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs),^5,6 которые общепризнаны как полезные метаболиты.⁷ В частности, они оказывают трофическое воздействие на здоровые колоноциты толстой кишки.¹⁰ Интересно, что пропионовая кислота также играет благотворную роль в модуляции воспаления кишечника.¹¹ Другие полезные метаболиты пропионибактерий включают 1,4-дигидрокси-2-нафтойную кислоту (DHNA), известную как бифидогенное соединение,¹² которое также ослабляет экспериментальный колит у мышей.^13,14, и конъюгированную линолевую кислоту,¹⁵ известную тем, что она модулирует воспаление. Соответственно, несколько молочных пропионибактерий защищают от различных моделей экспериментального колита у грызунов.^3,16 Более того, в исследовании на человеке было отмечено, что употребление штамма JS PF приводит к снижению базального уровня С-реактивного белка в сыворотке крови, биомаркера воспаления.¹⁷ В целом, эти данные убедительно свидетельствуют о благотворном потенциале отдельных штаммов молочных пропионибактерий и их метаболитов при различных заболеваниях, включая дисбактериоз и воспалительные заболевания кишечника.

Было показано, что полезные для здоровья свойства PF,^3,6, как и у других пробиотических бактерий, в значительной степени зависят от штамма.¹⁸ Удивительно, но зависимость этих эффектов от штамма и соответствующие молекулярные механизмы, ответственные за такую изменчивость, были плохо изучены. Эффективность пробиотиков также во многом зависит от используемого средства доставки. Во-первых, это средство определяет количество живых пропионибактерий, достигающих толстой кишки, и это количество остается основным «узким местом».¹⁹ Во-вторых, оно определяет условия роста, включая субстрат, используемый для роста бактерий. Это может существенно повлиять на состав бактериальных клеток и функциональные свойства пробиотика.²⁰ Таким образом, очевидно, что соответствующий скрининг штаммов пропионибактерий и средств доставки является необходимым условием перед доклиническими и клиническими исследованиями.

Таблица 1. Штаммы бактерий и их происхождение

Номер штаммаа	Идентификация	Происхождение
MG1363ь	Lactococcus lactis	Сырная закваска
NCFM	Lactobacillus acidophilus	Коммерческий штамм/Danisco
Ls33	Lactobacillus salivarius	Коммерческий штамм/Danisco
IPL А12-1	Pediococcus acidilactici	коллекция IPL
BB536	Bifidobacterium longum	Morinaga Milk Industry Ltd
BlА1	Propionibacterium freudenreichii	Сыр
BlА118	Propionibacterium freudenreichii	Сыр Грюйер
BlА127	Propionibacterium freudenreichii	Сыр
BlА129	Propionibacterium freudenreichii	Сыр
BlА131	Propionibacterium freudenreichii	Сыр
BlА136	Propionibacterium freudenreichii	Человеческие фекалии
BlА455	Propionibacterium jensenii	Пахта
BlА456	Propionibacterium freudenreichii	Сыр Раклет
BlА457	Propionibacterium freudenreichii	Человеческие фекалии
BlА458	Propionibacterium freudenreichii	Сыр

^aCIRM-BIA = Международный центр микробиологических ресурсов – Bactéries d’Intérêt Alimentaire, INRA, Ренн, Франция; IPL = Институт Пастера Лилля, Лилль, Франция. ^bНекоторые бактериальные штаммы (затенение серого цвета) использовались в качестве эталонных штаммов для стимуляции иммунных клеток, как описано ранее.

В этой работе мы проверили набор из 10 штаммов молочных пропионибактерий на предмет их иммуномодулирующего потенциала на хорошо зарекомендовавшей себя модели PBMC, которая, как было показано, предсказывает противовоспалительные свойства пробиотических бактерий.¹⁸ Чтобы учесть влияние роста в молочном продукте, мы сравнили лабораторную среду с лактатом дрожжевого экстракта (YEL) и пищевой молочный продукт, ферментированный исключительно молочными пропионибактериями, который мы недавно разработали (как на основе молока, так и на основе молочного ультрафильтрата).²¹ Поскольку известно, что молочные белки или полученные из них пептиды могут модулировать иммунную систему,²² мы использовали кисломолочный ультрафильтрат (UF; водная фракция молока, обедненная белками), а не ферментированное молоко, чтобы ограничить это воздействие. Используя это средство доставки, мы исследовали воздействие наиболее перспективного иммуномодулирующего штамма PF на модели поросят. Мы убедились в отсутствии негативного влияния на здоровье и рост поросят и искали профилактический эффект в отношении провоспалительных сигналов на уровне кишечника. Действительно, безопасность лечения и профилактика воспаления в кишечнике являются ключевыми вопросами в данном контексте перед проведением дальнейших испытаний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий и условия культивирования. Штаммы были получены из коллекций Международного центра микробиологических ресурсов CIRM-BIA и Института Пастера в Лилле (табл. 1). Референтные штаммы для стимуляции иммунных клеток культивировали, как описано ранее.¹⁸ Молочные пропионибактерии регулярно культивировали при 30 °C без встряхивания либо в среде YEL²³, либо в UF, дополненной 50 мМ пищевого L(+) лактата натрия (galaflow SL60, чистота ≥97%, Societéé Arnaud, Париж, Франция) и 5 г/л гидролизата казеина (Organotechnie, La Courneuve, Франция), стерилизованного фильтрацией с размером пор 0,2 мкм (Nalgene, Roskilde, Дания). Кинетика роста представлена на Дополнительном рисунке 1 (Вспомогательная информация).

UF получали методом ультрафильтрации.²⁴ Сырое молоко обезжиривали и ультрафильтровали с помощью пилотного оборудования UF (TIA, Bollene, Франция), оснащенного органической спиральной мембраной с порогом молекулярной массы 5000 (Koch International, Лион, Франция). Собранный ультрафильтрат затем стерилизовали фильтрацией с размером пор 0,2 мкм (Nalgene) и хранили при 4 °C.

Выделение PBMCs и индукция высвобождения цитокинов. РВМСs были выделены из крови четырех здоровых доноров, а эталонные бактериальные штаммы были приготовлены, как описано ранее.¹⁸ Пропионибактерии собирали из ферментированных UF или YEL и обрабатывали таким же образом. Бактерии ресуспендировали в PBS, содержащем 20% глицерина, и добавляли к РВМСs. В результате соотношение бактерий к клеткам составило примерно 10:1. PBS, содержащий 20% глицерина, использовали в качестве отрицательного (нестимулированного) контроля. После 24 часов стимуляции культуральные супернатанты собирали, осветляли центрифугированием и хранили при -20°C до анализа цитокинов. Их количественную оценку проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием пар антител BD Pharmingen (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) для IL-10, интерферона γ (IFN-γ) и IL-12p70, а также R&D-систем (Миннеаполис, Миннесота) для человеческого фактора некроза опухоли α (TNF-α), как описано ранее.¹⁸ Было рассчитано соотношение IL-10:IL-12, которое, как ранее было показано, является прогностическим фактором противовоспалительного потенциала in vivo¹⁸.

Ферментация пищевых продуктов для потребления животными. В испытаниях in vivo использовался штамм P. freudenreichii ssp. shermanii CIRM-BIA129. Среда UF, дополненная 50 мМ лактата натрия и 5 г/л казеинового пептона²¹, была инокулирована (1%) PF и инкубирована в течение 3 дней при 30 °C (ранняя стационарная фаза). Концентрацию молочных пропионибактерий определяли в каждой культуре для расчета суточной дозы. Физико-химические анализы молочных продуктов, ферментированных или нет, проводились в соответствии с процедурой, описанной Thierry et al.²⁵, и представлены в таблице 2.

Таблица 2. Состав ферментированного продукта^a

Измеренный  параметр	UF стерильного молока	UF ферментированного молока	Водная фаза кисломолочного UFb
pH	6.94	5.12	5.12
общее содержание сухого вещества	63.97	58.55	56.77
общее содержание азота	5.67	5.75	4.94
содержание небелкового азота	5.5	4.94	4.85
общее содержание золы	7.3	7.26	7.36
содержание лактозы	50.90	-	41.34
концентрация лактата	5.39	-	0.07
концентрация ацетата	0	-	1.31
концентрация пропионата	0	-	4.64
концентрация пирувата	0	-	0.90
концентрация цитрата	1.75	-	1.79
концентрация сукцината	0	-	0.57

^aРезультаты представляют собой средние значения двух независимых экспериментов. Все параметры, кроме pH, выражены в граммах на килограмм. Прочерк означает "не определено". ^bВодная фаза была отделена центрифугированием с последующей стерильной фильтрацией.

Процедура с животными. Протокол эксперимента был разработан в соответствии с рекомендациями французского закона (2001-464 29/05/01) и ЕЕС (86/609/CEE) по уходу и использованию лабораторных животных на основании сертификата разрешения на проведение экспериментов на живых животных №3569. Использовали шестнадцать поросят (порода: крупная белая х (ландрас × пьетрен)) из экспериментального стада INRA Сен-Жиль (Франция). Восемь пар однопометников 7-недельного возраста, совпадающих по полу и весу, содержались индивидуально в клетках из нержавеющей стали в помещении с контролируемой температурой (23 °C) и циклическим режимом темноты/света 12 ч/12 ч. Исходная масса тела была одинаковой в обеих группах (19,7 ± 0,5 кг против 19,4 ± 0,4 кг для контрольных и PF-обработанных поросят соответственно, P > 0,05). Поросят взвешивали два раза в неделю. Их кормили ad libitum (вволю) на диете для отъема (чистая энергия 10,6 МДж/кг и 195 г сырого белка/кг сухого вещества, Cooperl-Hunaudaye, Ламбаль, Франция). Потребление пищи измеряли ежедневно. Свиньи имели свободный доступ к воде.

PF-обработанным поросятам каждое утро в течение 14 дней вводили через зонд ферментированный UF, обеспечивающий ежедневную дозу 2 × 10¹⁰ КОЕ/мл PF. Это соответствует количеству, содержащемуся примерно в 10 г сыра Эмменталь. Контрольным свиньям также ежедневно вводили через зонд по 10 мл неферментированного UF в течение 14 дней. В конце периода лечения свиней забивали через 3 часа после последнего приема пищи путем электронаркоза и обескровливания. Кровь собирали в гепаринизированные пробирки, центрифугировали, а плазму хранили при -20 °C для последующего анализа гаптоглобина. Проксимальный отдел толстой кишки вскрывали и собирали дигестивные массы. Фракцию немедленно анализировали на наличие популяции пропионибактерий, а другую фракцию немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 °C до количественного определения SCFAs и секвенирования микробиоты. Сегменты слизистой промывали холодным стерильным физиологическим раствором и помещали либо в буфер Рингера при 4 °C для немедленного анализа в камере Уссинга, либо в РНК-контейнер (поперечный срез ткани) при 4 °C на 24 ч, а затем хранили при -80 °C для последующего анализа с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Смежный сегмент использовался для немедленного выращивания эксплантов, как описано ранее.²⁶ Соседние сегменты длиной пять сантиметров также промывали и фиксировали в 4% формальдегидном буфере в течение 24 часов, обезвоживали в этаноле и хранили при температуре 4 °C перед заливкой в парафин для дальнейшего гистологического анализа.

Подсчет количества пропионибактерий в образцах фекалий и толстой кишки. Фекалии собирали на 0-й день (до лечения) и на 14-й день (конец лечения). Содержимое толстой кишки собирали таким же образом. Свежесобранные фекалии (или содержимое толстой кишки) немедленно замораживали и хранили при температуре -80 °C до анализа. Концентрацию пропионибактерий определяли методом qPCR, как описано ранее.⁵ Результаты выражены в log [бактерии] на грамм образца.

Анализ короткоцепочечных жирных кислот в образцах толстой кишки. SCFAs экстрагировали в холодном Трис-буфере (50 мМ, pH 7,5) и хранили при -20 °C до проведения газофазного хроматографического анализа. Белки осаждали инкубацией в течение 1 ч при 4 °С в присутствии щавелевой кислоты (конечная концентрация 0,03 М). SCFAs были разделены на колонке BP21 и количественно оценены с помощью пламенно-ионизационного детектора, как описано ранее.²⁷ Изокапроновая кислота использовалась в качестве внутреннего стандарта, поскольку она отсутствовала в образцах толстой кишки поросят (данные не показаны). Образцы анализировали в двух экземплярах, и результаты выражали в миллимолях по влажному веществу.

Пиросеквенирование 16s рРНК в образцах содержимого толстой кишки. Это было выполнено, как описано ранее²⁸ и подробно описано во вспомогательной информации.

Гистология. Гистологические срезы (5 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином, рассматривали под световым микроскопом (Nikon ECLIPSE E400, Nikon Instruments, Франция) и проводили анализ изображений (программное обеспечение NIS-Elements AR3.0, Nikon Instruments). Глубину и поверхность крипт измеряли в 15-20 хорошо ориентированных криптах на свинью. Гистологические срезы также исследовали на наличие признаков воспаления или поражения. Все измерения проводились одним исследователем, который не знал, от какой группы свиней был получен срез.

Камера Уссинга. Ткани толстой кишки очищали от продольных мышц, вскрывали вдоль противобрыжеечной границы и затем помещали в камеру Уссинга (World Precision Instrument, Стивенейдж, Великобритания). Парацеллюлярные и трансклеточные пассажи определяли, как уже описано.²⁶

Количественный анализ RT-PCR. Тотальную РНК выделяли из тканей с помощью реактива Trizol и хлороформа, осаждали 2-пропанолом и ресуспендировали гранулы в 100 мкл воды. Выделенную РНК количественно измеряли с помощью спектрофотометрии (Nanodrop, Wilmington, DE) и обрабатывали набором DNA-free kit (Ambion, Austin, TX). Качество РНК оценивали методом флуориметрии с помощью набора RNA 6000 nano LabChipH в биоанализаторе 2100 (Agilent Biotechnologies, Санта-Клара, Калифорния). Обратную транскрипцию и количественную PCR в реальном времени для генов GAPDH, TLR4, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10, TGF-β, IL-4 и IL-13 проводили, как уже описано²⁶.

Эксплантная культура. Протокол культивирования эксплантов был выполнен, как уже описано.²⁶ Небольшие кусочки слизистой оболочки толстой кишки инкубировали с 0, 50, 100 или 200 мкг/мл липополисахаридов (LPSs; Sigma-Aldrich). Затем концентрацию IL-8 и TNF-α определяли методом ELISA (R&D Systems Europe, Лилль, Франция) в супернатантах.

Анализ плазменного гаптоглобина. Концентрации гаптоглобина определяли в плазме с помощью колориметрического набора, предназначенного для свиней (Tridelta Ltd., Мейнут, Ирландия).

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием процедуры общей линейной модели программного обеспечения Statistical Analysis Systems (SAS Institute, Cary, NC), тестируя пару поросят и эффект лечения с помощью t-теста в качестве последующих множественных сравнений, когда это было необходимо. Для данных по секреции цитокинов в модель также включали дозу LPS и взаимодействие доза LPS × лечение. Все результаты представлены как средние ± SEM. Различия между группами признавались значимыми при P < 0,05. Для анализа 16s рРНК статистический анализ на таксономическом уровне проводили с помощью DESeq (https://www.bioconductor.org/packages/2.6/bioc/html/DESeq.html). Значения P, полученные с помощью t-теста, корректировали по Бенджамини-Хохбергу с учетом множественных факторов. Для индексов разнообразия и богатства проводили классический двухвыборочный t-тест Уэлча и применяли поправку Бонферрони, как указано для коррекции множественных сравнений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка ультрафильтрата кисломолочного продукта, ферментированного P. freudenreichii. Лактат натрия и гидролизат казеина пищевого качества были добавлены в ультрафильтрат молока (UF) - водную фазу молока, лишенную белка, для обеспечения роста пропионибактерий. Действительно, это оптимальные источники углерода и азота, которые молочные пропионибактерии используют для роста. Как показано на Дополнительном рисунке 1 (Вспомогательная информация), параметры роста PF были схожи в этом экспериментальном молочном продукте и в лабораторной эталонной среде YEL, однако начальная лаг-фаза была длиннее. Максимальная концентрация пропионовокислых бактерий была достигнута в течение 72 ч в обеих средах. Она составила 6,00 × 10⁹ и 3,93 × 10⁹ КОЕ/мл в среде YEL и в добавленной среде UF, соответственно. Анализ состава добавленной среды UF до и после ферментации, представленный в таблице 2, показал, что PF потребляет 5,32 г лактата (почти весь предоставленный лактат) и 9,36 г лактозы (только 18% предоставленной лактозы). Ферментация привела к подкислению до pH 5,12 и образованию органических кислот, в основном пропионата (4,64 г/кг) и ацетата (1,31 г/кг), в ферментированном UF. Пропионибактерии собирали из обоих типов культур на одной и той же физиологической стадии (ранняя стационарная фаза, 72 ч) для дальнейшего скрининга на основе иммуномодулирующих свойств.

Скрининг молочных штаммов пропионибактерий in vitro выявил зависимую от штамма иммуномодуляцию. Эта работа расширила скрининг³ на основе PBMCs до 10 штаммов и позволила получить дальнейшее представление об изменчивости иммуномодулирующих свойств у видов P. freudenreichii.

Рисунок 1. Продукция цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови в ответ на бактерии. IL-10 (A), IL-12 (B), IFN-γ (C), TNF-α (D) и соотношение IL-10:IL-12 (E) анализировали с помощью ELISA в супернатантах, полученных из 24-часовых культур человеческих PBMCs с контрольными бактериями (серые столбики) и молочными пропионибактериями, культивированными в дополненном UF (белые столбики) или в YEL (черные столбики). Данные выражены как среднее ± SEM (n = 4 здоровых донора). Референтные бактерии: Ll, Lactococcus lactis; La, Lactobacillus acidophilus; Ls, Lactobacillus salivarius; Bl, Bifidobacterium longum; Pa, Pediococcus acidilactici. Штамм, выбранный для исследования in vivo, указан стрелкой. Ключи: *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001 (UF против YEL).

Модели индукции цитокинов, определенные на человеческих PBMCs, действительно были изменчивы (рис. 1), о чем свидетельствует широкий диапазон секреции четырех измеренных цитокинов: 250-2500 пг/мл для IL-10 (Рисунок 1A), неопределяемый уровень до 1140 пг/мл для IL-12 (Рисунок 1B), неопределяемый уровень до 120 000 пг/мл для IFN-γ (Рисунок 1C), и 1350-24780 пг/мл для TNF-α (Рисунок 1D). Среди молочных пропионибактерий не наблюдалось провоспалительного паттерна, так как выделение провоспалительных медиаторов было очень низким, по сравнению с Lactococcus lactis. Это относится к IL-12 (рис. 1B) и в меньшей степени к TNF-α и IFN-γ (рис. 1C,D). Это исследование подтвердило большое разнообразие противовоспалительных пролифератов среди молочных пропионибактерий, что можно оценить по соотношению IL-10:IL-12 (рис. 1E).

Молекулярные основы такой изменчивости в настоящее время изучаются. Штаммы BIA1, BIA456, BIA457 и BIA458 практически не индуцировали высвобождение цитокинов. Эти штаммы, в отличие от других, обладают поверхностным слоем полисахарида β-глюкана, что, как недавно было показано, совпадает с отсутствием иммуномодулирующего свойства; считается, что в этом слое у P. freudenreichii скрываются противовоспалительные молекулы.^4,29 У этого вида также сообщалось о большой изменчивости геномных профилей³⁰ и пробиотических свойств, включая устойчивость к стрессу³¹, метаболическую активность в кишечнике⁶ и выработку витамина B12.³² Это заслуживает внимания для разработки новых и эффективных пробиотических продуктов, содержащих молочные пропионибактерии со специфическими для здоровья преимуществами.

Иммуномодуляция пропионибактериями в зависимости от питательной среды. В данной работе впервые были продемонстрированы иммуномодулирующие свойства молочных пропионибактерий, выращенных и употребляемых в составе кисломолочного продукта. Действительно, недавно сообщалось о многообещающих иммуномодулирующих свойствах этих бактерий при выращивании в лабораторной культуральной среде YEL.³ Однако большинство пищевых полезных бактерий потребляется в составе молочных продуктов, а кисломолочные продукты ответственны за иммуномодулирующие эффекты.^33,34 В этой связи недавно было показано, что протеом и метаболическая активность Lactobacillus rhamnosus GG значительно различаются, независимо от того, выращивается ли эта пробиотическая бактерия на лабораторной среде MRS или на среде промышленного типа на основе молочной сыворотки, что указывает на различные функциональные возможности и характеристики.²⁰ Было показано, что экспрессия клеточных белков зависит от среды роста молочнокислых бактерий^20,35 и биобактерий.³⁶ Кроме того, было показано, что среда и условия роста определяют иммуномодулирующие свойства молочнокислых бактерий.^37,38 В нашей работе среда, обеспечивающая рост пропионибактерий, изменяла их иммуномодулирующий паттерн. Как показано на рис. 1, индукция цитокинов может варьироваться в зависимости от того, выращивается ли штамм на лабораторной культуральной среде YEL или на кисломолочном UF. Действительно, уровень провоспалительного цитокина TNF-α был выше, когда штаммы BIA118, BIA136, BIA455 и BIA456 выращивались на UF. Подобные изменения наблюдались для IFN-γ и IL-12. Напротив, все штаммы индуцировали IL-10, независимо от питательной среды. Таким образом, влияние питательной среды на функциональные свойства, включая иммуномодуляцию, следует принимать во внимание в исследованиях, направленных на установление эффектов бактерии-кандидата и/или пробиотического продукта. Данный скрининг позволил отобрать наиболее перспективный противовоспалительный штамм P. freudenreichii, а именно штамм CIRM-BIA129, для дальнейших доклинических исследований.

Пропионибактерии выживали в желудочно-кишечном тракте. Поросятам ежедневно в течение 14 дней давали либо UF, ферментированный P. freudenreichii CIRM-BIA129, обеспечивающий 2 × 10¹⁰ КОЕ пропионибактерий в день, либо стерильный UF, использовавшийся в качестве контроля. Поросята оставались здоровыми на протяжении всего эксперимента. Более того, лечение PF хорошо переносилось животными, не вызывая ни дискомфорта, ни дистресса. Уровень популяции пропионибактерий в фекалиях до лечения (день 0) не обнаруживался, однако в группе, получавшей PF, пропионибактерии достигли 6,75 ± 0,22 log/g в фекалиях за 1 день до убоя (день 14) и 6,26 ± 0,17 log/g в содержимом толстой кишки при убое (день 15). В контрольной группе пропионибактерии не обнаруживались на протяжении всего эксперимента.

Рисунок 2. Увеличение веса и потребление пищи контрольными свиньями (□) и свиньями, получавшими PF (■). Прирост веса (А) измеряли у контрольных свиней и свиней, которым ежедневно вводили 2 × 10¹⁰ КОЕ P. freudenreichii CIRM-BIA129 в течение 2 недель. Потребление корма (B) также измерялось в течение того же периода и выражалось в граммах корма на килограмм массы тела. Свиньи, обработанные PF, демонстрировали больший прирост массы тела и большее потребление корма, чем контрольные свиньи. Ключ: *, P < 0,05 по сравнению с контролем; #, P < 0,07 по сравнению с контролем (n = 8).

P. freudenreichii CIRM-BIA129 улучшил рост поросят и потребление корма. Никакого вредного воздействия на общее состояние здоровья и рост поросят не наблюдалось. Напротив, потребление UF, ферментированного P. freudenreichii, привело к увеличению веса на 10% в течение всего двухнедельного периода по сравнению с контрольными поросятами (P <0,01, рисунок 2A). Этот больший вес коррелировал с большим потреблением пищи (+13% за весь период, P <0,05, рисунок 2B), начиная с первого дня употребления молочного продукта. В нескольких исследованиях изучалось влияние различных пробиотиков на продуктивность поросят. Они привели к разным результатам в зависимости от используемого пробиотика, времени введения или дозы введенного пробиотика. Однако они часто описывали повышенное потребление пищи, прибавку массы тела и/или коэффициент конверсии пищи у поросят.^39-45 Хотя эти изменения и достигали статистической значимости, они всегда находились в диапазоне 5-10% по сравнению с контрольными поросятами. Это похоже на то, что мы наблюдали у поросят в результате употребления P. freudenreichii CIRM-BIA129. Уже сообщалось о стимулировании роста у телят и поросят, употреблявших комбинации пробиотиков, содержащие молочнокислые бактерии, бифидобактерии и молочные пропионибактерии или чистые культуры P. freudenreichii, что приводило к увеличению прироста веса на 9-15%.⁴⁶ Хотя это и гипотетически, стимулирующий рост эффект пропионибактерий может быть обусловлен выработкой витаминов пропионибактериями, модулированием кишечной микробиоты или противовоспалительными свойствами. Следовательно, пробиотики, включая молочные пропионибактерии, могут рассматриваться как более безопасная альтернатива антибиотикам в качестве стимуляторов роста.⁴⁷ Наконец, недавно было показано, что потребление пробиотиков изменяет состав жирных кислот в мясе свиней, повышая концентрацию конъюгированной линолевой кислоты.⁴⁸ Известно, что пропионибактерии производят такие липиды в ферментированных молочных продуктах¹⁵ , их влияние на качество мяса также заслуживает внимания.

P. freudenreichii CIRM-BIA129 оказывает иммуномодулирующее действие на проксимальный отдел толстой кишки свиньи. Количественный RT-PCR анализ экспрессии цитокинов и TLR4 в тканях, а также секреции IL-8 и TNF-α культурами эксплантов использовали для оценки влияния лечения PF на иммунную функцию проксимального отдела толстой кишки поросят. Лечение PF не оказало влияния на уровни TLR4 и мРНК цитокинов в слизистой оболочке проксимального отдела толстой кишки поросят (таблица 3). Не наблюдалось увеличения секреции TNF-α или IL-8 в ответ на LPS в эксплантатах толстой кишки контрольных свиней (обработка LPS, P = 0,37 и 0,27 для TNF-α и IL-8 соответственно, рисунок 3).

Рисунок 3. Секреция провоспалительных цитокинов эксплантатами проксимального отдела толстой кишки контрольных свиней (□) и свиней, получавших PF (■), в ответ на различные дозы LPS. Секрецию TNF-α (А) и IL-8 (B) эксплантатами толстой кишки измеряли после 20 часов воздействия различных доз LPS. Свиньи, получавшие PF, демонстрировали более низкую секрецию TNF-α и IL-8, чем контрольные свиньи. Как и ожидалось, толстая кишка контрольных свиней не реагировала на LPS, независимо от дозы. Лечение PF не изменило толерантность к LPS. Звездочка указывает P <0,05 по сравнению с контрольными свиньями (n = 8).

Лечение PF не изменило эту нечувствительность к LPS проксимального отдела толстой кишки (рис. 3). Однако исходная секреция провоспалительных цитокинов была снижена в среднем на 25% для TNF-α для всех протестированных доз LPS (P <0,0001, рисунок 3А) и на 26% и 15% для IL-8 при дозах LPS 50 и 100 мкг/мл соответственно (P <0,0001, рисунок 3B) у свиней, получавших PF, по сравнению с контрольными свиньями. Кроме того, хотя и незначительно, уровень гаптоглобина в плазме снизился на 33% в группе, получавшей PF (1,04 ± 0,2 и 0,70 ± 0,18 мг/мл для контрольных и обработанных PF свиней соответственно, P = 0,23).

Таблица 3. Уровни мРНК целевых генов в толстой кишке поросят^a

Целевой ген	Контроль	Обработка PF
TLR-4	0.260 ± 0.044	0.302 ± 0.054
IL-1β	0.081 ± 0.019	0.054 ± 0.011
TNF-α	0.016 ± 0.004	0.015 ± 0.002
IL-6	0.006 ± 0.001	0.005 ± 0.001
IL-10	0.029 ± 0.004	0.024 ± 0.003
TGF-β1	0.596 ± 0.083	0.571 ± 0.079
IL-13	0.014 ± 0.004	0.022 ± 0.008

^a Направленную экспрессию генов выражали относительно уровня транскрипта GAPDH. Значения представляют собой средние значения ± SEM (n = 8).

В ряде исследований уже сообщалось о противовоспалительном эффекте пробиотических бактерий или дрожжей (например, Saccharomyces boulardii,⁴⁹ различных видов бифидобактерий^,50,51 или лактобактерий^52-54) против LPS-индуцированного воспаления. Была предложена роль ингибирования активации NF-κB пробиотиками.^49,50 Соответственно, было показано, что Lactobacillus paracasei подавляет воспаление, вызванное патогеном Escherichia coli O157:H7 у мышей, с более низкой кумулятивной заболеваемостью.⁵⁵ В настоящем исследовании мы распространили этот противовоспалительный эффект пробиотиков в отношении LPS на P. freudenreichii, предоставляемых в виде ферментированного молока.

P. freudenreichii CIRM-BIA129 не вызвал значительных изменений в микробиоте и физиологии кишечника. На основе 16S рРНК был проведен анализ микробного разнообразия содержимого толстой кишки как у обработанных PF, так и у контрольных поросят. Мы создали набор данных, состоящий из 155 095 отфильтрованных высококачественных, классифицируемых последовательностей гена 16S рРНК со средним средним значением (±SD) 9693 ± 3866 последовательностей на образец. Таксономическое отнесение на уровне семейства для всех образцов показано на рисунке 4А. Никаких существенных статистических различий между двумя группами образцов на уровне типа, семейства и рода не наблюдалось. Более того, микробное богатство, оцениваемое по индексу Chao1, и биоразнообразие, оцениваемое по непараметрическому индексу Шеннона, не выявили статистических различий между группами при пороговых значениях оперативной таксономической единицы (OTU) 0,03, 0,05 и 0,10. При ограничении OTU 0,03 было получено среднее значение (±SD) 1087 ± 398 кластеров.

Рисунок 4. Профили микробиоты и SCFAs контрольных свиней (□) и свиней, получавших PF (■). (A,B) Анализ содержимого толстой кишки на основе 16S рРНК, выраженный в процентах последовательностей на бактериальное семейство. (A) Показаны доминантные семейства, превышающие 1%. (B) Показаны три второстепенных семейства, менее 1%. Звездочкой отмечено P < 0,05 по сравнению с контрольными свиньями (n = 8). (C) Концентрацию SCFAs в толстом кишечнике определяли методом газофазной хроматографии. Изокапроновая кислота была добавлена в качестве внутреннего стандарта для проверки воспроизводимости анализа. Коэффициент воспроизводимости для количества изокапроновой кислоты составил 1,46%.

До сих пор очень немногие исследования изучали бактериальный состав пищеварительного тракта поросят методом пиросеквенирования. Важно отметить, что, в отличие от других исследований⁵⁶ , образцы не объединялись, и для каждой группы было изучено восемь биологических реплик. Интересно, что наши результаты, указывающие на Lactobacillus sp. и Clostridium sp. как на два повсеместно распространенных рода микробиоты толстой кишки, подтверждают результаты, полученные в образцах подвздошной кишки.⁵⁷ В микробиоте преобладали Firmicutes со средним значением (±SD) 95,9 ± 2,3 %. На уровне семейств большинство считываний относилось к семейству Lactobacillaceae со средним значением (±SD) 59,9 ± 15,9 %. Интересно, что такие же высокие доли Firmicutes и Lactobacillaceae наблюдались в подвздошной кишке поросят.⁵⁶ Мы оценили максимальное количество уникальных оперативных таксономических единиц видового уровня (3 % несходства) в толстой кишке этих свиней. Эти прогнозы показали, что в толстой кишке свиней может быть до 821 различных видов. Кластеризация OTUs на уровне 0,03% обычно считается уровнем кластеризации, представляющим таксономический уровень видов. Среднее (±SD) количество OTUs (0,03%) составляло 1087 ± 398. Это число было аналогично 821 OTUs, идентифицированным в среднем Dowd et al.⁵⁷. Интересно, что разнообразие и богатство выборок для уровней кластеризации OTUs 0,03, 0,05 и 0,10 не были статистически модифицированы лечением. Отсутствие статистически значимой разницы при рассмотрении доминирующих семейств, превышающих 1% от всей микробиоты, указывает на отсутствие резких нарушений микробиоты в результате потребления молочных пропионибактерий. Тем не менее, мы заметили, что три второстепенных семейства, о которых известно, что они включают в себя потенциальные патогенные бактерии, имели тенденцию к меньшему количеству в группе, получавшей PF. Это было статистически значимо для семейства Porphyromonadaceae (рис. 4B). Такая модуляция недоминантных, но условно-патогенных микроорганизмов уже была описана в результате потребления молочных пропионибактерий^58-60 и может зависеть от продукции бактериоцинов и SCFAs пропионибактериями.¹ Таким образом, нельзя исключать некоторые изменения на видовом уровне или у редких видов.

Никаких серьезных изменений показателей толстокишечной ферментации не наблюдалось. Общая концентрация SCFAs не изменилась в группе, получавшей PF (149,9 ± 4,0 мМ), по сравнению с контрольной группой (150,6 ± 8,0 мМ). Концентрации всех основных SCFAs в толстой кишке также оставались неизменными независимо от группы лечения (рис. 4C). Три основных SCFAs, уксусная, пропионовая и масляная кислоты, находились на одинаковом уровне в двух группах в концентрациях 85, 40 и 17 мМ соответственно.

Глубину и поверхность крипт проксимальной части толстой кишки оценивали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Никаких различий не наблюдалось между свиньями, обработанными PF, и контрольными свиньями по этим двум параметрам (глубина крипт, PF 472 ± 16 против контроля 463 ± 18 мкм, P > 0,05; поверхность крипт, PF 32490 ± 1283 мкм² против контроля 33999 ± 1864 мкм², P > 0,05). Более того, исследование гистологических срезов не выявило каких-либо признаков воспаления или поражения у свиней, обработанных PF (данные не показаны). Эпителиальную барьерную функцию проксимального отдела толстой кишки оценивали путем измерения потока малых молекул (FD-4, 4 кДа) или больших молекул (HRP, 40 кДа) через ткань, установленную в камерах Уссинга. Не было различий в парацеллюлярной (PF 703 ± 140 (нг/см²)/ч против контроля 698 ± 85 (нг/см²)/ч, P > 0,05) и трансклеточной (PF 123 ± 17 (нг/см2)/ч) против контроля 140 ± 32 (нг/см²)/ч, P > 0,05) проницаемости для этих двух функциональных зондов между контрольными и обработанными PF свиньями. Несколько исследований показали, что пробиотические бактерии влияют на морфологию кишечника, увеличивая длину ворсинок и/или крипт в различных моделях животных.^61,62 Однако в большинстве случаев прием пробиотических бактерий влиял только на тощую и реже на подвздошную кишку, практически не влияя на толстую кишку, что говорит о трофическом эффекте приема пробиотических бактерий в проксимальном, а не дистальном желудочно-кишечном тракте. Аналогичным образом, в недавнем обзоре обобщается влияние пробиотических бактерий на барьерную функцию кишечника с акцентом на слизь, секрецию IgA, выработку антибактериальных пептидов, адгезию бактерий и экспрессию белков плотного соединения⁶³. Что касается белков плотных контактов, которые непосредственно регулируют проницаемость малых зондов, то общая схема такова: пробиотические бактерии усиливают барьерную функцию за счет увеличения экспрессии ключевого белка плотных контактов. Однако эти результаты были получены в основном на клеточных линиях (T84, Caco-2, HT-29) или в условиях заболевания.⁶³ Единственный отчет, полученный на здоровых животных, не показал никакого эффекта комбинации Lactobacillus helveticus и L. rhamnosus на барьерную функцию подвздошной и толстой кишки у крыс.⁶⁴ В одном из исследований также изучался эффект 6-часового введения Lactobacillus plantarum в двенадцатиперстную кишку здоровых добровольцев на расположение белков плотного соединения в образцах биоптатов. Они наблюдали транслокацию каркасного белка zonula occludens ZO-1 в область плотного соединения после кратковременного лечения L. plantarum.⁶⁵ Однако функциональные последствия для проницаемости не были оценены. В совокупности эти данные позволяют предположить, что эффект пробиотиков не может быть так легко экстраполирован из условий in vitro в условия in vivo и что пробиотики, по-видимому, не изменяют базальную физиологию в нормальных условиях, как иллюстрируют наши результаты с P. freudenreichii CIRM-BIA129.

Настоящее исследование представляет собой первый доклинический шаг в изучении большого разнообразия штаммов P. freudenreichii с точки зрения пробиотического потенциала и разработки адаптированного кисломолочного средства доставки. Никаких побочных эффектов не наблюдалось, а молочные пропионибактерии пережили прохождение через пищеварительный тракт поросят. Стимулирование роста и противовоспалительная иммуномодуляция подтвердили потенциал выбранных штаммов молочных пропионибактерий в качестве пробиотиков для животных. Эти результаты являются многообещающими и открывают новые перспективы для дальнейших исследований механизмов пробиотических свойств P. freudenreichii их с учетом штаммовой специфичности и влияния средства доставки.

Доп. информация:

• Пробиотики как средства биоконтроля (якорь)
• Пробиотики в системах животноводства (якорь)

к основному разделу: Пробитики в животноводстве (+ доп.)

Литература

1. Cousin, F. J.; Mater, D.; Foligne,́B.; Jan, G. Dairy propionibacteria as human probiotics: A review of recent evidence. DairySci.Technol.2011, 91(1), 1−26.
2. Bougle,́D.; Roland, N.; Lebeurrier, F.; Arhan, P. Effect of propionibacteria supplementation on fecal bifidobacteria and segmental colonic transit time in healthy human subjects. Scand. J. Gastroenterol. 1999, 34 (2), 144−148.
3. Foligne,́B.; Deutsch, S. M.; Breton, J.; Cousin, F. J.; Dewulf, J.; Samson, M.; Pot, B.; Jan, G. Promising immunomodulatory effects of selected strains of dairy propionibacteria as evidenced in vitro and in vivo. Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76 (24), 8259−8264.
4. Deutsch, S. M.; Parayre, S.; Bouchoux, A.; Guyomarc’h, F.; Dewulf, J.; Dols-Lafargue, M.; Baglinier̀e, F.; Cousin, F. J.; Falentin, H.; Jan, G.; Foligne,́B. Contribution of surface beta-glucan polysaccharide to physicochemical and immunomodulatory properties of Propionibacterium freudenreichii. Appl.Environ.Microbiol.2012, 78(6), 1765−1775.
5. Herve,́C.; Fondrevez, M.; Cheron, A.; Barloy-Hubler, F.; Jan, G. Transcarboxylase mRNA: A marker which evidences P.freudenreichii survival and metabolic activity during its transit in the human gut. Int. J.Food Microbiol. 2007, 113(3), 303−314.
6. Lan, A.; Bruneau, A.; Philippe, C.; Rochet, V.; Rouault, A.; Herve,́ C.; Roland, N.; Rabot, S.; Jan, G. Survival and metabolic activity of selected strains of Propionibacterium freudenreichii in the gastrointestinal tract of human microbiota-associated rats. Br. J. Nutr. 2007, 97 (4), 714−724.
7. Hosseini, E.; Grootaert, C.; Verstraete, W.; Van de Wiele, T. Propionate as a health-promoting microbial metabolite in the human gut. Nutr. Rev. 2011, 69 (5), 245−258.
8. Wong, J. M.; de, S. R.; Kendall, C. W.; Emam, A.; Jenkins, D. J. Colonic health: Fermentation and short chain fatty acids. J. Clin. Gastroenterol. 2006, 40 (3), 235−243.
9. Lan, A.; Bruneau, A.; Bensaada, M.; Philippe, C.; Bellaud, P.; Rabot, S.; Jan, G. Increased induction of apoptosis by Propionibacterium freudenreichii TL133 in colonic mucosal crypts of human microbiota-associated rats treated with 1,2-dimethylhydrazine. Br. J. Nutr. 2008, 100, 1251−1259.
10. Foo, N. P.; Ou, Y. H.; Chiu, H. H.; Chan, H. Y.; Liao, C. C.; Yu, C. K.; Wang, Y. J. Probiotics prevent the development of 1,2-dimethylhydrazine (DMH)-induced colonic tumorigenesis through suppressed colonic mucosa cellular proliferation and increased stimulation of macrophages. J. Agric. Food Chem. 2011, 59 (24), 13337−13345.
11. Tedelind, S.; Westberg, F.; Kjerrulf, M.; Vidal, A. Anti- inflammatory properties of the short-chain fatty acids acetate and propionate: A study with relevance to inflammatory bowel disease. World J. Gastroenterol. 2007, 13 (20), 2826−2832.
12. Kaneko, T.; Mori, H.; Iwata, M.; Meguro, S. Growth stimulator for bifidobacteria produced by Propionibacterium freudenreichii and several intestinal bacteria. J. Dairy Sci. 1994, 77 (2), 393−404.
13. Okada, Y.; Tsuzuki, Y.; Miyazaki, J.; Matsuzaki, K.; Hokari, R.; Komoto, S.; Kato, S.; Kawaguchi, A.; Nagao, S.; Itoh, K.; Watanabe, T.; Miura, S. Propionibacterium freudenreichii component 1.4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) attenuates dextran sodium sulphate induced colitis by modulation of bacterial flora and lymphocyte homing. Gut 2006, 55 (5), 681−688.
14. Okada, Y.; Hokari, R.; Kato, S.; Mataki, N.; Okudaira, K.; Takebayashi, K.; Matsunaga, H.; Tsuzuki, Y.; Komoto, S.; Watanabe, C.; Kawaguchi, A.; Nagao, S.; Itoh, K.; Miura, S. 1.4-dihydroxy-2- naphthoic acid (DHNA) shows anti-inflammatory effect on NSAID- induced colitis in IL-10-knockout mice through suppression of inflammatory cell infiltration and increased number of genus Bifidobacterium. Gastroenterology 2006, 130 (4), A313.
15. Xu, S.; Boylston, T. D.; Glatz, B. A. Conjugated linoleic acid content and organoleptic attributes of fermented milk products produced with probiotic bacteria. J. Agric. Food Chem. 2005, 53 (23), 9064−9072.
16. Uchida, M.; Mogami, O. Milk whey culture with Propionibacterium freudenreichii ET-3 is effective on the colitis induced by 2,4,6- trinitrobenzene sulfonic acid in rats. J. Pharmacol. Sci. 2005, 99 (4), 329−334.
17. Kekkonen, R. A.; Lummela, N.; Karjalainen, H.; Latvala, S.; Tynkkynen, S.; Jarvenpaa, S.; Kautiainen, H.; Julkunen, I.; Vapaatalo, H.; Korpela, R. Probiotic intervention has strain-specific anti-inflammatory effects in healthy adults. World J. Gastroenterol. 2008, 14 (13), 2029−2036.
18. Foligne,́B.; Nutten, S.; Grangette, C.; Dennin, V.; Goudercourt, D.; Poiret, S.; Dewulf, J.; Brassart, D.; Mercenier, A.; Pot, B. Correlation between in vitro and in vivo immunomodulatory properties of lactic acid bacteria. World J. Gastroenterol. 2007, 13 (2), 236−243.
19. Sanders, M. E.; Marco, M. L. Food formats for effective delivery of probiotics. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 2010, 1, 65−85.
20. Koskenniemi, K.; Koponen, J.; Kankainen, M.; Savijoki, K.; Tynkkynen, S.; de Vos, W. M.; Kalkkinen, N.; Varmanen, P. Proteome analysis of Lactobacillus rhamnosus GG using 2-D DIGE and mass spectrometry shows differential protein production in laboratory and industrial-type growth media. J. Proteome Res. 2009, 8(11), 4993− 5007.
21. Cousin, F. J.; Louesdon, S.; Maillard, M. B.; Parayre, S.; Falentin, H.; Deutsch, S. M.; Boudry, G.; Jan, G. The first dairy product exclusively fermented by Propionibacterium freudenreichii: A new vector to study probiotic potentialities in vivo. FoodMicrobiol.2012, 32, 135−146.
22. Cross, M. L.; Gill, H. S. Immunomodulatory properties of milk. Br. J. Nutr. 2000, 84(Suppl. 1), S81−S89.
23. Malik, A. C.; Reinbold, G. W.; Vedamuthu, E. R. An evaluation of the taxonomy of Propionibacterium. Can.J.Microbiol.1968, 14(11), 1185−1191.
24. Michalski, M. C.; Leconte, N.; Briard-Bion, V.; Fauquant, J.; Maubois, J. L.; Goudedranche, H. Microfiltration of raw whole milk to select fractions with different fat globule size distributions: Process optimization and analysis. J. Dairy Sci. 2006, 89 (10), 3778−3790.
25. Thierry, A.; Salvat-Brunaud, D.; Madec, M. N.; Michel, F.; Maubois, J. L. Swiss cheese ripening: Dynamics of bacterial populations and evolution of the aqueous phase composition for three industrial cheeses. Lait 1998, 78 (5), 521−542.
26. Chatelais, L.; Jamin, A.; Gras-Le, G. C.; Lalles, J. P.; Le Huerou-Luron, I.; Boudry, G. The level of protein in milk formula modifies ileal sensitivity to LPS later in life in a piglet model. PLoS ONE 2011, 6 (5), e19594.
27. Thierry, A.; Maillard, M. B.; Yvon, M. Conversion of L-leucine to isovaleric acid by Propionibacterium freudenreichii TL 34 and ITGP23. Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68 (2), 608−615.
28. De Filippo, C.; Cavalieri, D.; Di Paola, M.; Ramazzotti, M.; Poullet, J. B.; Massart, S.; Collini, S.; Pieraccini, G.; Lionetti, P. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2010, 107 (33), 14691−14696.
29. Deutsch, S. M.; Le Bivic, P.; Herve,́C.; Madec, M. N.; Lapointe, G.; Jan, G.; Le Loir, Y.; Falentin, H. Correlation of the capsular phenotype in Propionibacterium freudenreichii with the level of expression of gtf, a unique polysaccharide synthase-encoding gene. Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76 (9), 2740−2746.
30. Dalmasso, M.; Nicolas, P.; Falentin, H.; Valence, F.; Tanskanen, J.; Jatila, H.; Salusjarvi, T.; Thierry, A. Multilocus sequence typing of Propionibacterium freudenreichii. Int.J.FoodMicrobiol.2011, 145(1), 113−120.
31. Anastasiou, R.; Leverrier, P.; Krestas, I.; Rouault, A.; Kalantzopoulos, G.; Boyaval, P.; Tsakalidou, E.; Jan, G. Changes in protein synthesis during thermal adaptation of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Int.J.FoodMicrobiol.2006, 108(3), 301−314.
32. Hugenschmidt, S.; Schwenninger, S. M.; Gnehm, N.; Lacroix, C. Screening of a natural biodiversity of lactic and propionic acid bacteria for folate and vitamin B12 production in supplemented whey permeate. Int. Dairy J. 2010, 20 (12), 852−857.
33. Medrano, M.; Racedo, S. M.; Rolny, I. S.; Abraham, A. G.; Perez, P. F. Oral administration of kefiran induces changes in the balance of immune cells in a murine model. J. Agric. Food Chem. 2011, 59 (10), 5299−5304.
34. Peng, S.; Lin, J. Y.; Lin, M. Y. Antiallergic effect of milk fermented with lactic acid bacteria in a murine animal model. J. Agric. Food Chem. 2007, 55 (13), 5092−5096.
35. Plumed-Ferrer, C.; Koistinen, K. M.; Tolonen, T. L.; Lehesranta, S. J.; Karenlampi, S. O.; Makimattila, E.; Joutsjoki, V.; Virtanen, V.; von Wright, A. Comparative study of sugar fermentation and protein expression patterns of two Lactobacillus plantarum strains grown in three different media. Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74(17), 5349−5358.
36. Yuan, J.; Zhu, L.; Liu, X.; Li, T.; Zhang, Y.; Ying, T.; Wang, B.; Wang, J.; Dong, H.; Feng, E.; Li, Q.; Wang, J.; Wang, H.; Wei, K.; Zhang, X.; Huang, C.; Huang, P.; Huang, L.; Zeng, M.; Wang, H. A proteome reference map and proteomic analysis of Bifidobacterium longum NCC2705. Mol. Cell. Proteomics 2006, 5 (6), 1105−1118.
37. Masuda, S.; Yamaguchi, H.; Kurokawa, T.; Shirakami, T.; Tsuji, R. F.; Nishimura, I. Immunomodulatory effect of halophilic lactic acid bacterium TetragenococcushalophilusTh221 from soy sauce moromi grown in high-salt medium. Int.J.FoodMicrobiol.2008, 121(3), 245−252.
38. Sashihara, T.; Sueki, N.; Furuichi, K.; Ikegami, S. Effect of growth conditions of Lactobacillus gasseri OLL2809 on the immunostimulatory activity for production of interleukin-12 (p70) by murine splenocytes. Int.J. Food Microbiol. 2007, 120(3), 274−281.
39. Alexopoulos, C.; Georgoulakis, I. E.; Tzivara, A.; Kritas, S. K.; Siochu, A.; Kyriakis, S. C. Field evaluation of the efficacy of a probiotic containing Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis spores, on the health status and performance of sows and their litters. J.Anim.Physiol. Anim. Nutr. 2004, 88 (11−12), 381−392.
40. Taras, D.; Vahjen, W.; Macha, M.; Simon, O. Performance, diarrhea incidence, and occurrence of Escherichia coli virulence genes during long-term administration of a probiotic Enterococcus faecium strain to sows and piglets. J. Anim. Sci. 2006, 84 (3), 608−617.
41. Zeyner, A.; Boldt, E. Effects of a probiotic Enterococcusfaecium strain supplemented from birth to weaning on diarrhoea patterns and performance of piglets. J.Anim.Physiol.Anim.Nutr.2006, 90(1−2), 25−31.
42. Bohmer, B. M.; Kramer, W.; Roth-Maier, D. A. Dietary probiotic supplementation and resulting effects on performance, health status, and microbial characteristics of primiparous sows. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 2006, 90 (7−8), 309−315.
43. Guo, X.; Li, D.; Lu, W.; Piao, X.; Chen, X. Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs. Antonie van Leeuwenhoek 2006, 90 (2), 139−146.
44. Ross, G. R.; Gusils, C.; Oliszewski, R.; de Holgado, S. C.; Gonzalez, S. N. Effects of probiotic administration in swine. J. Biosci. Bioeng. 2010, 109 (6), 545−549.
45. Konstantinov, S. R.; Smidt, H.; Akkermans, A. D.; Casini, L.; Trevisi, P.; Mazzoni, M.; De Filippi, S.; Bosi, P.; de Vos, W. M. Feeding of Lactobacillus sobrius reduces Escherichia coli F4 levels in the gut and promotes growth of infected piglets. FEMS Microbiol. Ecol. 2008, 66 (3), 599−607.
46. Mantere-Alhonen, S. Propionibacteria used as probiotics - A review. Lait 1995, 75 (4/5), 447−452.
47. Vondruskova, H.; Slamova, R.; Trckova, M.; Zraly, Z.; Pavlik, I. Alternatives to antibiotic growth promoters in prevention of diarrhoea in weaned piglets: A review. Vet. Med. 2010, 55 (5), 199−224.
48. Ross, G. R.; Van Nieuwenhove, C. P.; Gonzalez, S. N. Fatty acid profile of pig meat after probiotic administration. J.Agric.FoodChem. 2012, 60 (23), 5974−5978.
49. Sougioultzis, S.; Simeonidis, S.; Bhaskar, K. R.; Chen, X. H.; Anton, P. M.; Keates, S.; Pothoulakis, C.; Kelly, C. P. Saccharomyces boulardii produces a soluble anti-inflammatory factor that inhibits NF-kappa B-mediated IL-8 gene expression. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 343 (1), 69−76.
50. Riedel, C. U.; Foata, F.; Philippe, D.; Adolfsson, O.; Eikmanns, B. J.; Blum, S. Anti-inflammatory effects of bifidobacteria by inhibition of LPS-induced NF-kappa B activation. World J. Gastroenterol. 2006, 12 (23), 3729−3735.
51. Grimoud, J.; Durand, H.; de Souza, S.; Monsan, P.; Ouarne, F.; Theodorou, V.; Rogues, C. In vitro screening of probiotics and synbiotics according to anti-inflammatory and anti-proliferative effects. Int. J. Food Microbiol. 2010, 144 (1), 42−50.
52. (52)  Watanabe, T.; Nishio, H.; Tanigawa, T.; Yamagami, H.; Okazaki, H.; Watanabe, K.; Tominaga, K.; Fujiwara, Y.; Oshitani, N.; Asahara, T.; Nomoto, K.; Higuchi, K.; Takeuchi, K.; Arakawa, T. Probiotic Lactobacilluscaseistrain Shirota prevents indomethacin-induced small intestinal injury: involvement of lactic acid. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2009, 297 (3), G506−G513.
53. Paolillo, R.; Carratelli, C. R.; Sorrentino, S.; Mazzola, N.; Rizzo, C. Immunomodulatory effects of Lactobacillusplantarumon human colon cancer cells. Int. Immunopharmacol. 2009, 9 (11), 1265−1271.
54. Liu, Y. Y.; Fatheree, N. Y.; Mangalat, N.; Rhoads, J. M. Human-derived probiotic Lactobacillusreuteristrains differentially reduce intestinal inflammation. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2010, 299 (5), G1087−G1096.
55. Tsai, Y. T.; Cheng, P. C.; Pan, T. M. Immunomodulating activity of Lactobacillusparacaseisubsp. Paracasei NTU 101 in enterohemorrhagic Escherichia coli O157H7-infected mice. J. Agric. Food Chem. 2010, 58 (21), 11265−11272.
56. Vahjen, W.; Pieper, R.; Zentek, J. Barcoded pyrosequencing of 16S rRNA gene amplicons reveals changes in ileal porcine bacterial communities due to high dietary zinc intake. Appl.Environ.Microbiol. 2010, 76 (19), 6689−6691.
57. Dowd, S. E.; Sun, Y.; Wolcott, R. D.; Domingo, A.; Carroll, J. A. Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) for microbiome studies: bacterial diversity in the ileum of newly weaned Salmonella-infected pigs. Food borne Pathog. Dis. 2008, 5(4), 459−472.
58. Mitsuyama, K.; Masuda, J.; Yamasaki, H.; Kuwaki, K.; Kitazaki, S.; Koga, H.; Uchida, M.; Sata, M. Treatment of ulcerative colitis with milk whey culture with Propionibacterium freudenreichii. J. Intest. Microbiol. 2007, 21 (2), 143−147.
59. Sarkar, S.; Misra, A. K. Effect of feeding propiono-acido-bifido (PAB) milk on the nutritional status and excretory pattern in rats and infants. Milchwissenschaft - Milk Sci. Int. 1998, 53 (12), 666−668.
60. Perez Chaia, A.; Zarate, G.; Oliver, G. The probiotic properties of propionibacteria. Lait 1999, 79 (1), 175−185.
61. Mair, C.; Plitzner, C.; Pfaffl, M. W.; Schedle, K.; Meyer, H. H. D.; Windisch, W. Inulin and probiotics in newly weaned piglets: effects on intestinal morphology, mRNA expression levels of inflammatory marker genes and haematology. Arch. Anim. Nutr. 2010, 64(4), 304−321.
62. Muftoglu, M. A.; Civak, T.; Cetin, S.; Civak, L.; Gungor, O.; Saglam, A. Effects of probiotics on experimental short-bowel syndrome. Am. J. Surg. 2011, 202 (4), 461−468.
63. Ohland, C. L.; MacNaughton, W. K. Probiotic bacteria and intestinal epithelial barrier function. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2010, 298 (6), G807−G819.
64. Zareie, M.; Johnson-Henry, K.; Jury, J.; Yang, P. C.; Ngan, B. Y.; Mckay, D. M.; Soderholm, J. D.; Perdue, M. H.; Sherman, P. M. Probiotics prevent bacterial translocation and improve intestinal barrier function in rats following chronic psychological stress. Gut 2006, 55 (11), 1553−1560.
65. Karczewski, J.; Troost, F. J.; Konings, I.; Dekker, J.; Kleerebezem, M.; Brummer, R. J. M.; Wells, J. M. Regulation of human epithelial tight junction proteins by Lactobacillus plantarumin vivo and protective effects on the epithelial barrier. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2010, 298 (6), G851−G859.