Глобальное исследование Микробиома открывает тысячи новых видов

Слева: Хеба Шабаан, студентка третьего курса медицинского колледжа Вейл Корнелл (слева) и доктор Кристофер Мейсон (справа) готовятся взять мазок на наличие микробов в Нью-Йоркском метро 21 июня 2020 года. Справа: Турникет метро протирают тампоном. Фото предоставлено доктором Мейсоном.

Согласно новому исследованию, около 12 000 бактерий и вирусов, собранных в выборке из систем общественного транспорта и больниц по всему миру с 2015 по 2017 год, никогда не были идентифицированы.

НЬЮ — ЙОРК (26 мая 2021 года) - Около 12 000 бактерий и вирусов, собранных в пробах из систем общественного транспорта и больниц по всему миру с 2015 по 2017 год, никогда не были идентифицированы, согласно исследованию Международного консорциума MetaSUB, глобальной попытки отслеживать микробы, которую возглавляют исследователи Weill Cornell Medicine.

Для исследования, опубликованного 26 мая в журнале Cell, международные исследователи собрали почти 5000 образцов в течение трехлетнего периода в 60 городах 32 стран и шести континентах. Исследователи проанализировали образцы с помощью метода геномного секвенирования, называемого секвенированием дробовика, чтобы обнаружить присутствие различных микробов, включая бактерии, археи (одноклеточные организмы, отличные от бактерий) и вирусы, которые используют ДНК в качестве своего генетического материала. (Другие типы вирусов, которые используют РНК в качестве своего генетического материала, такие как SARS-CoV-2, вирус, вызывающий COVID-19, не были бы обнаружены с помощью методов анализа ДНК, используемых в этом предпандемическом исследовании).

Количество генов устойчивости к противомикробным препаратам, выявленных по городам. Предоставлено Cell Press.

Эта область исследований имеет важное значение для выявления вспышек как известных, так и неизвестных инфекций, а также для изучения распространенности устойчивых к антибиотикам микробов в различных городских условиях.

«Каждый раз, когда вы садитесь в метро, вы, скорее всего, путешествуете с совершенно новым видом», - сказал старший автор доктор Кристофер Мейсон (Dr. Christopher Mason), содиректор WorldQuant Initiative for Quantitative Prediction и профессор физиологии и биофизики в Weill Cornell Medicine. Доктор Мейсон также является соучредителем и платным консультантом Biotia и Onegevity Health, а также платным спикером WorldQuant LLC.

Нынешнее исследование привело к открытию 10 928 вирусов и 748 бактерий, которые не присутствуют ни в одной справочной базе данных.

Доктор Мейсон основал MetaSUB (сокращенно от Metagenomics and Metadesign of Subways and Urban Biomes) в 2015 году вместе с доктором Эваном Афшиным (Dr. Evan Afshin), который тогда был студентом бакалавриата в колледже Маколея Хонорса в Квинс-колледже, а теперь является клиническим сотрудником по физиологии и биофизике в Weill Cornell Medicine и платным консультантом Onegevity Health. Недавно опубликованное исследование было проведено докторами Мейсоном, Дэвидом Данко (David Danko), докторантом Высшей школы Вейля Корнелла в лаборатории доктора Мейсона во время исследования, и Даниэлой Бездан (Daniela Bezdan), которая в то время была научным сотрудником в области вычислительной биомедицины в Weill Cornell Medicine.

Собирая образцы микробов и анализируя их гены, известные под общим названием микробиом, исследователи надеются узнать больше о бактериях, вирусах и других микроорганизмах, которые живут среди людей. Например, исследование может помочь выявить появление устойчивых к антибиотикам штаммов. Прогнозирование устойчивости к антибиотикам только на основе генетических последовательностей является сложной задачей, но исследователи смогли составить карту некоторых генов, которые, как известно, связаны с устойчивостью, количественно оценить их численность и подтвердить способность генетических маркеров придавать устойчивость. Они обнаружили, что в некоторых городах было больше генов устойчивости, чем в других, и что для некоторых из этих генов могут быть характерные для города сигнатуры.

Устойчивость к противомикробным препаратам остается серьезной глобальной проблемой здравоохранения. «Хотя необходимы дальнейшие исследования, этот набор данных демонстрирует ценность и потенциал картирования и мониторинга микробиома, а также ту информацию, которую он может дать врачам, ученым и должностным лицам общественного здравоохранения», - сказал доктор Афшин.

Кроме того, изучение малых молекул и белков, производимых микробами, может также привести к открытию новых антибиотиков, а также других молекул, которые могут быть разработаны в качестве лекарств. Многие антибиотики и лекарства, используемые в настоящее время, были получены из микробных источников. Открытия, сделанные в отношении новых видов микробов, также могут привести к новым лабораторным инструментам и подходам, таким как новые способы использования инструмента молекулярного редактирования, известного как CRISPR. В этом исследовании исследователи обнаружили 838,532 новых массивов CRISPR-фрагментов вирусной ДНК, найденных внутри бактерий, - и 4,3 миллиона новых пептидов (небольших белков).

Благодаря этим усилиям по отбору проб доктор Мейсон сказал, что он может предсказать примерно с 90-% точностью, где живет человек, просто секвенируя ДНК на его обуви. Было обнаружено, что на микробиом города влияют многие факторы, в том числе общая численность населения и плотность населения, высота над уровнем моря, близость к океану и климат. Выводы об этих отдельных признаках могли бы позволить провести будущие судебные исследования.

«Микробиом содержит молекулярные отголоски того места, где он был собран. Прибрежный образец может содержать солелюбивые микробы, в то время как образец из густонаселенного города может показать поразительное биологическое разнообразие», - сказал доктор Данко.

Доктора Мейсон и Афшин начали собирать и анализировать образцы микробов в Нью-йоркском метро в 2013 году. После того как они опубликовали свои первые результаты, получившие название PathoMap, с ними связались исследователи со всего мира, которые хотели провести аналогичные исследования для своих собственных городов. Международный интерес вдохновил лабораторию доктора Мейсона на создание MetaSUB, и он нанял Даниэлу Бездан в качестве директора по исследованиям. «Нам нужны были международно признанные протоколы, логистика и соглашения о сотрудничестве с учеными, поставщиками, правительственными учреждениями и благотворительными фондами для потенциально 100 городов в 20 странах», - сказала Бездан.

Сегодня MetaSUB продолжает расти и расширился до сбора образцов РНК и ДНК из воздуха, воды и сточных вод, в дополнение к твердым поверхностям. Это привело к выделению гранта в размере 5 миллионов долларов на секвенирование сточных вод и отслеживание вирусов в трех штатах (Флорида, Нью-Йорк и Висконсин), который является частью новой Национальной системы наблюдения за сточными водами (NWSS) Центров по контролю и профилактике заболеваний.

Группа также курирует такие проекты, как Глобальный день отбора проб городов (gCSD), проводимый ежегодно 21 июня, и провела широкомасштабные исследования, включая всесторонний микробиологический анализ Рио-де-Жанейро до, во время и после летних Олимпийских игр 2016 года. Многие образцы, проанализированные в настоящем исследовании, были собраны в Глобальный день отбора проб городов в 2016 и 2017 годах. Отбор проб в Нью-Йорке проводился при поддержке Центра клинических и трансляционных исследований Weill Cornell Medicine (CTSC), в сотрудничестве со старшим менеджером программы CTSC Джеффом Чжу (Jeff Zhu). Доктор Мейсон и его коллеги в настоящее время готовятся к мероприятию этого года.

«Когда мы начинали в 2015 году, консорциум состоял из 16 городов, а через шесть лет у нас уже более 100 городов. Очень здорово иметь такую группу любопытных, самоотверженных и восторженных коллег-исследователей», - сказал доктор Мейсон, который также является профессором вычислительной геномики в области вычислительной биомедицины в Институте вычислительной биомедицины принца Альвалида Бин Талала Бин Абдулазиза Аль-Сауда в Weill Cornell Medicine.

«Хотя образцы собираются по всему миру, большая часть анализа проводится прямо здесь, в Нью-Йорке, в клинике Weill Cornell Medicine», - сказал доктор Мейсон. Анализ и сборка последовательностей также использовали суперкомпьютеры Bridges и Bridges-2, Extreme Science and Engineering Discovery Environment (XSEDE) в Питтсбургском суперкомпьютерном центре. Исследователи MetaSUB в Швейцарии (Dr. Андре Калес (Andre Kahles) и Гуннар Ретш (Gunnar Rätsch)) использовали эти сборки и необработанные данные для создания доступного для поиска глобального портала последовательностей ДНК (MetaGraph) который индексировал все известные генетические последовательности (включая данные MetaSUB). Портал сопоставляет любые известные или недавно обнаруженные генетические элементы с их местоположением на Земле и может помочь в открытии новых микробных взаимодействий и предполагаемых функций.

Выделение ДНК из образцов было в основном выполнено при поддержке Zymo Research и Promega и секвенировано в сотрудничестве с доктором Шоном Леви (Dr. Shawn Levy) из Института биотехнологии Хадсональфа, доктором Класом Удекву (Dr. Klas Udekwu) из Стокгольмского университета и Нью-Йоркским Центром генома. Будущие и текущие исследования будут рассматривать РНК и ДНК с помощью длинных считываний и методов пространственной визуализации, а также отслеживать метаболиты из глобальных сайтов и продолжать обновлять генетическую карту планетарного масштаба.

Краткие выдержки из соответствующей статьи в журнале Cell

Глобальная метагеномная карта городских микробиомов и устойчивости к противомикробным препаратам

Особенности

• Города обладают постоянным «основным» набором нечеловеческих микробов.
• Городские микробиомы отражают важные черты городов и городской жизни
• Гены устойчивости к противомикробным препаратам широко распространены в городах.
• В городах обитает множество новых видов бактерий и вирусов.

Резюме

Мы представляем глобальный атлас 4728 метагеномных образцов из систем общественного транспорта в 60 городах за 3 года, представляющий первый систематический всемирный каталог городской микробной экосистемы. Этот атлас предоставляет аннотированный геопространственный профиль микробных штаммов, функциональные характеристики, маркеры устойчивости к противомикробным препаратам (AMR) и генетические элементы, включая 10928 вирусов, 1302 бактерии, 2 археи и 838532 массивов CRISPR, не найденных в справочных базах данных. Мы идентифицировали 4246 известных видов городских микроорганизмов и 31 вид, обнаруженный в 97% образцов, которые отличались от комменсальных организмов человека. Профили генов AMR сильно различались по типу и плотности в разных городах. Города демонстрировали отчетливые таксономические признаки микробов, обусловленные климатическими и географическими различиями. Эти результаты представляют собой глобальный метагеномный атлас с высоким разрешением, который позволяет обнаруживать организмы и гены, выделяет потенциальные приложения для общественного здравоохранения и судебной медицины и обеспечивает независимое от культуры представление о бремени AMR в городах.

***

Ядро городского микробиома центрирует глобальное разнообразие

Рис. 1А. Ядро микробиома. Таксономическое дерево, показывающее 31 основной таксон, окрашенный по типу и аннотированный в соответствии с окраской грама, способность образовывать биопленки, предсказанную ассоциацию с вирусом и является ли бактерия человеческим комменсальным видом. Изображение предоставлено компанией Cell Press.

Сначала мы исследовали распространение видов микробов в глобальной городской среде. В частности, мы спросили, представляет ли городская среда особый тип микробной экосистемы или набор связанных, но отличных друг от друга сообществ, особенно с точки зрения биоразнообразия. Мы наблюдали бимодальное распределение распространенности таксонов в нашем наборе данных, которое мы использовали для определения двух отдельных наборов таксонов на основе точек перегиба распределения: предполагаемый «вспомогательный» набор городских видов микробов, которые постоянно наблюдаются (> 70 % образцов) и менее распространенные «периферические» (<25% образцов) виды. Мы также определили набор истинных «основных» таксонов, которые встречаются практически во всех образцах (> 97% образцов) (рис. 1A).

Применяя эти пороговые значения, мы идентифицировали 1145 видов микробов (рис. 1B), как определено аннотацией NCBI в KrakenUniq, которые составляют суб-ядерный городской микробиом с 31 видом в истинном ядре микробиома (рис. 1A). Классификации основных и подосновных таксонов были дополнительно оценены на предмет сложности последовательности и покрытия генома на подмножестве образцов. Из подосновных видов 69 были отмечены как низкокачественные классификации (см. Методы STAR). Субъядерный микробиом был в основном бактериальным, и был идентифицирован только один эукариот с высокой степенью достоверности: Saccharomyces cerevisiae. Примечательно, что в группе субосновных микроорганизмов не было обнаружено ни архей, ни вирусов. В частности, для вирусов это может зависеть от используемых методов выделения ДНК, ограничений глубины секвенирования или отсутствия аннотаций в справочных базах данных, используемых для классификации. Тремя наиболее распространенными типами бактерий в городах мира, упорядоченными по количеству наблюдаемых видов, были Proteobacteria, Actinobacteria и Firmicutes.

Несмотря на их глобальное распространение, основные таксоны не были одинаково многочисленны во всех городах. Многие виды демонстрируют высокое стандартное отклонение и эксцесс (определение Фишера) по сравнению с другими видами (рис. 1С). Некоторые виды демонстрировали отчетливо высокую среднюю численность, часто выше, чем основные виды, но более неоднородную глобальную распространенность. Например, Salmonella enterica была идентифицирована в <50% проб, но была 12-м по численности видом по доле приписанной ей ДНК. Самым относительно многочисленным видом микробов был Cutibacterium acnes (рис. 1D), который имел сравнительно стабильное распределение численности по всем образцам и является известным комменсалом кожи человека. Чтобы скорректировать систематическую ошибку, возникающую из-за

неравномерной географической выборки, мы измерили относительную численность каждого таксона, вычислив долю прочтений, отнесенных к каждому таксону, и сравнили необработанное распределение с распределением медианной численности в каждом городе; эти две меры тесно связаны. Анализ положительных и отрицательных контролей показывает, что эти результаты маловероятны из-за загрязнения или эффекта партии (см. Методы STAR). В общей сложности мы наблюдали 31 основной таксон (распространенность > 97%), 1145 вспомогательных таксонов (распространенность 70–97%), 2 466 периферических таксонов (распространенность <25%) и 4 424 таксона во всех выборках. Мы называем набор всех таксонов с высокой степенью достоверности, наблюдаемых в городском панмикробиоме.

Чтобы оценить количество таксонов, присутствующих в наших образцах, но которые, возможно, были пропущены нашими методами (например, тип выборки и глубина секвенирования), мы провели анализ разрежения для идентифицированных таксонов. Оценивая количество таксонов, идентифицированных для различных выборок, в зависимости от количества считываний, мы видим тенденцию к уменьшению (рис. 1D), которая указывает на то, что в какой-то момент виды в каждой новой выборке, вероятно, уже были идентифицированы в предыдущей. Наша кривая разрежения не достигла плато, и даже после включения всех образцов она все еще показывала предельную частоту обнаружения примерно одного нового вида на каждые 10 образцов, добавленных в исследование. Для ясности отметим, что в этом анализе рассматриваются только таксоны, уже присутствующие в справочных базах данных, а не вновь обнаруженные таксоны (ниже – см. в исследовании). Несмотря на оставшиеся неопознанные таксоны, по нашим оценкам, большинство (80%) классифицируемых таксонов в городском микробиоме могут быть идентифицированы примерно с 1000 образцами.

Поскольку люди составляют основную часть городской среды, можно ожидать, что ДНК в наших образцах будет напоминать комменсальные человеческие микробиомы. Чтобы исследовать это, мы сравнили нечеловеческие фрагменты ДНК из наших образцов с 50 случайно выбранными образцами из пяти участков комменсального микробиома (стул, кожа, дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт, урогенитальный тракт; 10 образцов каждого типа) в проекте Human Microbiome Project (HMP) (Консорциум и др., 2012). Мы использовали MASH для выполнения основанного на k-мерном сравнении наших образцов с выбранными образцами HMP, которые показали примерно одинаковое несходство между образцами MetaSUB и образцами из разных участков тела человека. Образцы, взятые с поверхностей, к которым чаще всего прикасалась человеческая кожа, таких как дверные ручки, кнопки, перила и сенсорные экраны, действительно были больше похожи на микробиомы кожи человека, чем на такие поверхности, как тумбы, окна и пол. Например, дверные ручки были значительно больше похожи на кожу, чем на окна (t-тест, p <2e-16).

Мы провели аналогичное сравнение с набором из 28 метагеномных образцов почвы (Bahram et al., 2018). Наши образцы были более непохожи на образцы почвы, чем на микробиом кожи человека. Это говорит о том, что неклассифицированная ДНК в наших образцах может представлять нехарактерные таксоны, которые не являются известными комменсальными или почвенными видами.

Затем мы оценили долю последовательностей в наших данных, которые не походили на последовательности в известных справочных базах данных. Мы взяли подмножество из 10000 считываний из каждого образца и согласовали эти считывания с четырьмя крупномасштабными базами данных последовательностей с помощью BLASTn (Altschul et al., 1990). Мы определили считывания, которые сопоставлены со средней нуклеотидной идентичностью (ANI) 80%, 90% и 95% с последовательностями в справочной базе данных RefSeq, базе данных NCBI NT Environment, большом наборе метагеномных собранных геномов (MAG) от Pasolli et al., 2019, и MAG из самого MetaSUB (см. широко распространенные наблюдения биологии, которых нет в справочных базах данных). При 80% ANI, наиболее допустимом пороге, мы наблюдали, что 34,6% операций чтения не сопоставлялись ни с какой базой данных, а 47,3% операций чтения не сопоставлялись ни с какой базой данных, кроме MAG из самого MetaSUB. Это отражает результаты предыдущих исследований городского микробиома (Afshinnekoo et al., 2015; Hsu et al., 2016). Когда мы разбили уровни выравнивания по регионам, мы обнаружили, что образцы из Европы имели самую высокую долю невыровненных чтений, за ними следовали Ближний Восток, в то время как образцы из Африки к югу от Сахары имели наименьшую долю невыровненных чтений.

Предыдущие экологические исследования наблюдали уменьшение таксономического разнообразия по мере увеличения расстояния от экватора (O’Hara et al., 2017). Наши данные резюмируют этот результат и указывают на значительное уменьшение таксономического разнообразия (хотя и со значительным шумом, p <2e16, R2 = 0,06915) в зависимости от абсолютной широты; по оценкам, образцы теряют 6,97 особей на каждый градус широты от экватора. Хотя это наблюдение согласуется с экологической теорией, мы отмечаем, что наши образцы несколько сгруппированы в определенных широтах…

Подробнее об исследовании см. по ссылке: Christopher E. Mason, et al. A global metagenomic map of urban microbiomes and antimicrobial resistance. Cell, May 26, 2021

Будьте здоровы!