Микробиом и технология “кишечник-на-чипе”.

Кишечная микрофлора, или микробиота, играет фундаментальную роль в здоровье человека, регулируя такие важные функции, как защита от повреждения клеточного эпителия кишечника, отложение жиров и стимулирование кишечного ангиогенеза. В кишечнике присутствует порядка 10¹⁴ (более 1000 видов) бактерий, а также грибы, вирусы и простейшие. На сегодняшний день изучена только треть этих микроорганизмов [1–4].

Специфика симбиоза микроорганизмов в кишечнике человека отражает непрерывное влияние окружающих факторов на организм хозяина.

У взрослых доминируют такие типы бактерий, как Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria и Actinobacteria [5]. Микробиота достаточно стабильна и, как показано в клинических исследованиях, способна к восстановлению исходного состояния после терапии антибиотиками [6]. Данный факт объясняется тем, что бокаловидные клетки кишечника (клетки Гоблета, Goblet cells) секретируют высокомолекулярные гликопротеины, известные как муцины (от лат. mucus – слизь), образующие своего рода физический барьер, защищающий клетки кишечника, а также наличием в кишечнике так называемых крипт (рис. 1), в том числе и аппендикса. В глубине крипты находятся только бактерии, способные пройти через слизь и сформировать там устойчивые колонии, непосредственно взаимодействующие с клетками эпителия, и при этом не погибнуть в результате атаки иммунной системы (клетки кишечника ежедневно вырабатывают порядка 3‒6 г IgА) [7]. Таким образом, подобные “ответвления” служат хранилищем бактерий-комменсалов в случае терапии антибиотиками или других химических воздействий.

Рис. 1. Слои слизи в толстой (слева) и тонкой (справа) кишке. ЭАП ‒ эндогенные антимикробные пептиды.

В тонкой кишке также есть специальные клетки, обеспечивающие выделение катионных пептидов ‒ альфа-дефензинов, ‒ которые могут формировать поры в мембранах атакуемых клеток. Благодаря распространенности отрицательных ионов на мембранах бактерий в противовес более положительно заряженным клеткам человека, дефензины выполняют свою функцию, не повреждая органы хозяина. Градиент кислорода в просвете кишечника и около стенок влияет на распределение анаэробных и аэробных бактерий [8, 9].

Экспериментально показано, что повреждение слизистого барьера и воспаление связано с высокой концентрацией флагеллина ‒ главного белка бактериальных жгутиков. Флагеллин представляет собой лиганд Toll-подобного рецептора-5 (TLR5). Бактериальная подвижность в кишечнике, как правило, ограничена иммуногенностью флагеллина и вязкостью слизи, которая ограничивает передвижение бактерий [8]. Тем не менее шансы добраться до тканей хозяина для таких микроорганизмов, как Salmonella, зависят от жгутиков и хемотаксиса. Напротив, у клеток Escherichia coli развита альтернативная стратегия: они секретируют сериновую протеазу, которая быстро разлагает слизь. А у Proteobacteria для этого есть пептидаза М60 [9].

Адгезивными свойствами характеризуются как представители нормальной микрофлоры, так и патогенные микроорганизмы. Благодаря адгезии резидентная микрофлора препятствует заселению кишечника патогенными микроорганизмами. А для последних адгезия ‒ первый шаг на пути образования резистентных биопленок, объединившись в которые микробы приобретают повышенную устойчивость к действию иммунной системы и антибиотикам. Таким образом, молекулярные механизмы адгезии универсальны как для комменсалов, так и для патогенных видов. Это, как правило, селективное лиганд‒рецепторное взаимодействие специфических внемембранных белков, капсул, лектинов, адгезинов и фимбрии (пили) с белками и липидами кишечника.

Например, у бактерии Helicobacter, обитающей в желудке и тонком кишечнике, развито взаимодействие с поверхностными гликанами эпителия [10, 11]. В качестве примеров различного механизма связывания можно привести патоген Vibrio cholera (штамм O395), который формирует токсинрегулируемый слой клеток, прикрепляющийся к эпителию тонкой кишки [12]. Кроме того, холерные вибрионы штаммов O1 и O139 прикрепляются к слизи с помощью внемембранного белка, связывающего N-ацетил-D-глюкозамин [13].

Клетки E. coli обладают большим разнообразием лектинов, связывающихся как со слизью, так и с гликопротеинами, а также внеклеточными компонентами эпителиальных клеток [14]. Недавно на слое клеток кишечного эпителия in vitro культивировали сегментированную филаментную (нитчатую) бактерию (segmented filamentous bacteria, SFB) Candidatus savagella, хотя механизм ее прикрепления к эпителию пока не выяснен [15].

Клетки грамположительной бактерии Listeria экспрессируют поверхностный белок, так называемый интерналин А, который сначала связывается с эпителиальным кадгерином, а затем взаимодействует с актином, тем самым индуцируя фагоцитоз [16].

Бактерии-комменсалы прикрепляются к слизи и эпителию аналогичными способами, занимая сайты связывания патогенов и тем самым блокируя их прикрепление. Так, D. Savage [17] и M. Morotomi с соавт. [18] показали, что бактерии Lactobacillus, образуя связанный с эпителием слой клеток, предотвращают прикрепление к эпителию дрожжей и стафилококков. F. Turroni c соавт. [19] описали аналогичные механизмы для бактерии Bifidobacterium bifidum, которая использует пили для связывания с белками внеклеточного матрик- са эпителия.

Бактерии, связавшись со слизистой кишечника, остаются там только в том случае, если не вызывают иммунный ответ хозяина. В слизи содержится много секреторного иммуноглобулина А (sIgA), который находится в форме димера и связывается с чужеродными для хозяина компонентами, в том числе бактериями. sIgA устойчив к действию протеолитических ферментов и, в отличие от IgG, не является спутником воспаления, а, наоборот, связывает антигены на поверхности слизистой оболочки и препятствует их проникновению, предотвращая дальнейшее воспаление. Связывание sIgA с клетками-комменсалами приводит к образованию биопленки, которая служит барьером для патогенов. Таким образом, с помощью этого механизма sIgA регулирует гомеостаз между хозяином и микробиотой, как и между хозяином и потенциальными патогенами на поверхности слизистых оболочек.

Альтернативное мнение состоит в том, что иммунная система не запрограммирована четко распознавать симбионты, а скорее всего, некоторые виды просто приспособились не индуцировать сильный иммунный ответ. Некоторые бактерии, например Bacteroides fragilis, научились подавать и использовать обратные сигналы иммунной системы хозяина [20]. Компонент их капсулы, полисахарид А, через “посредника” подает сигнал в антигенпрезентирующую клетку и стимулирует экспрессию интерлейкина-10 T-клеткой. Появление противовоспалительных клеток, вырабатывающихся в ответ на этот сигналинг, облегчает прохождение Bacteroides fragilis через слой слизи.

Похожим образом SFB стимулируют выработку T-хелперных клеток [21]. И, как выяснилось недавно, SFB могут “тренировать” иммунитет: вызывать сильный иммунный ответ за счет интенсивной стимуляции созревания Т- и В-клеток. Колонии этих бактерий способствуют созреванию лимфоидной ткани в слизистой кишечника, активируют медиаторы врожденного иммунитета в кишечнике. Кроме того, колонизация этими бактериями оказывает адъювантное действие на системный иммунный ответ [22].

Следует отметить, что не только комменсальные составляющие микробиоты кишечника функционируют как барьер для патогенов, но и условно-патогеннные бактерии (например, E. coli и другие) являются неотъемлемой частью здоровой микробиоты, которая помимо барьерной выполняет и стимулирующую функцию.

Распределение микробов в кишечнике способствует развитию и стабильности микробного сообщества, поскольку пространственно разделенные ниши увеличивают диверсификацию видов. Частично развитие микробиоты может происходить от проксимальных к дистальным отделам, так как соответствует направлению потока фекалий. Такой поток, совместно с факторами внешней среды (инфекция, химикаты и т.п.), может физически удалить все компоненты микробиома и, как следствие, вызовет серьезные нарушения в организме. По-видимому, чтобы предотвратить такое развитие событий, в процессе эволюции появились защищенные резервуары, а именно крипты и аппендикс, который, кстати, ранее считали атавизмом. В работах D. Gevers с соавт. [23] и F. Rowan с соавт. [24] приведены прямые и косвенные доказательства положительного влияния обособленных резервуаров на микробиоту. Кроме того, известно, что состояние микробиоты влияет на течение воспалительных заболеваний кишечника, цирроза печени [23–25] и на развитие синдрома раздраженного кишечника (СРК) [26]. По результатам мета-анализа 13 клинических исследований по микрофлоре кишечника X. Zhuang с соавт. [27] пришли к выводу, что пациенты с СРК существенно отличаются от здоровых по количеству бактерий Lactobacillus, Bifidobacterium и Faecalibacterium prausnitzii. Кроме того, J. Beatty и др. [28] обнаружили негативное влияние инфекции Giardia duodenalis: помимо ранее известной активности провоцировать диарею, лямблии поддерживают длительный дисбиоз и последующее развитие СРК.

Кроме пробиотиков и лекарственных средств, обычно используемых для нормализации микрофлоры кишечника, известны и другие, пока еще не столь широко используемые подходы. Так, исследуют возможность трансплантации микробиоты здоровых доноров пациентам с нарушенной микрофлорой. В ряде клинических исследований показано позитивное действие трансплантированной микробиоты на пациентов с СРК и с инфекцией Clostridium difficile в более 50% описанных случаев [29–31]. На сегодняшний день есть три способа трансплантации образцов здорового донора: i) через колоноскопию, ii) через назальную трубку, до- стигающую двенадцатиперстной кишки, iii) перорально с помощью кишечнорастворимой капсулы.

Полученные клинические данные за последнее десятилетие подтверждают важнейшую роль нарушений микробиоты в течении и развитии многих заболеваний [32]. Интересно, что выявлена прямая связь нарушений в микробиоме с риском развития различных нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера [33].

В настоящее время для изучения микробиоты используют метагеномный анализ [3]. Для его проведения необходим набор отработанных воспроизводимых методик, позволяющих обеспечивать точность и однозначную интерпретацию данных. Так, правильная экстракция ДНК из образцов фекалий или клеток кишечника ‒ ключевые этапы пробоподготовки для анализа микрофлоры кишечника. В ряде исследований показано, что на выделение и последующий анализ ДНК оказывает влияние множество факторов. Установлено, что образцы для исследования скрытой крови в фекалиях хорошо сохраняются вплоть до четырех суток без замораживания; а в случае необходимости заморозки получают мазки и ДНК экстрагируют из них 70%-ным этанолом [34–36].

Помимо изучения образцов бактерий напрямую, разработаны различные подходы, такие как библиотеки клонов, конечный полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (T-RFLP), количественная ПЦР (qPCR), анализ транскриптома и высокопроизводительное секвенирование. Заметим, что пиросеквенирование ампликонов 16S рРНК и секвенирование Illumina считаются надежными методами для изучения разнообразия геномов и различий в экспрессии генов микробного сообщества в кишечнике [3] и в полости рта [37]. Эти две технологические платформы не только ускорили метатранскриптомные исследования микробиома, но и вместе с банком метагеномных данных открыли новые возможности в понимании структурно-функциональных зависимостей в микробных сообществах. Более того, эти методы не требуют культивирования образцов и тем самым позволяют идентифицировать “некультивируемые” микроорганизмы (то есть, для которых пока не разработаны условия культивирования) в составе микробиома.

Одно из основных ограничений метагеномных исследований относится к чувствительности метода, так как современные технологии не позволяют обнаруживать бактерии в концентрациях менее 10⁵ клеток/г фекалий. Хотя с помощью метагеномики удается определять последовательности ДНК многих “некультивируемых” бактерий, для проведения дальнейших исследований необходимы жизнеспособные микроорганизмы в чистой культуре. Культуральные изоляты не только расширят референтную базу геномных данных, но и позволяют идентифицировать новые гены и их функции, а также молекулярные мишени для разработки новых терапевтических средств. Так, J. Lagier с соавт. [38], используя 212 различных условий культивирования и времяпролетную масс-спектрометрию с матричноактивированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TОF-MS) для анализа полученных образцов, идентифицировали 340 видов бактерий, 5 грибов и один гигантский вирус в трех пробах фекалий. Эти важнейшие результаты послужили платформой к возрождению методов культивирования и развития таксономии для классификации новых бактерий [39].

Микробиота кишечника отвечает за такие метаболические функции, как биосинтез аминокислот, короткоцепочечных жирных кислот, незаменимых витаминов (например, K и B12), биотрансформацию и гидролиз желчных кислот, а также ферментацию неперевариваемых полисахаридов [40]. Метаболомика включает широкомасштабное исследование низкомолекулярных продуктов метаболизма клеток, тканей, биологических жидкостей и организма в целом в конкретный момент времени. Эта технология эффективна для “распутывания” сложных взаимодействий метаболитов кишечной микробиоты ‒ метаболома. Сравнительные исследования метаболома микробиоты здоровых людей и пациентов с различными заболеваниями позволят выявить уникальные метаболиты, которые могут быть использованы в качестве диагностических или прогностических биомаркеров. Две основными технологии, которые используют в метаболомике, ‒ это масс-спектрометрия (MS) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Эти спектральные методы характеризуются широким диапазоном подлежащих исследованию соединений, высокой чувствительностью и возможностью количественного анализа [41]. Используя этот подход, G. Le Gall и др. [42] продемонстрировали, что метаболомный профиль фекальных экстрактов у пациентов с язвенным колитом при наличии и отсутствии СРК отличался от такового образцов, полученных от здоровых доноров. Обнаружено, что нарушенный микробный метаболизм при СРК приводит к увеличению уровня газообразного водорода, а также индола, фенолов и других соединений [43]. Летучие органические соединения (ЛОС) выделяются бактериями в качестве побочных продуктов метаболизма, которые могут быть определены с помощью твердофазной микроэкстракции с последующим газохроматографическим масс-спектрометрическим анализом (solid-phase microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry method, SPME- GC-MS). Специфические микробные профили ЛОС можно рассматривать в качестве потенциальных биомаркеров в диагностике конкретных заболеваний [44]. Современные подходы, используемые для изучения микробиома человека, кратко суммированы в табл. 1.

В связи с накопившимися данными о важной роли микробиоты кишечника к началу XXI века в США было начато финансирование проекта “The Human Microbiome Project” (“Микробиом человека”) (https://commonfund.nih.gov/hmp). Этот проект ‒ инициатива Национальных институтов здравоохранения США (NIH), направленная на лучшее понимания микрофлоры человека и ее значения для здоровья и проблем, с ним связанных. Первая фаза запущенного в 2007 году проекта была сосредоточена на определении и характеристиках микрофлоры человека. Вторая фаза, известная как Integrative Human Microbiome Project (Интегративный проект “Микробиом человека”), началась в 2014 году с целью развития ресурсной базы для характеристики микробиома и выяснения роли микробов в состоянии здоровья человека. За период 2007‒2016 гг. эта программа получила финансовую поддержку в размере 170 млн долларов США из общего фонда NIH. Основные результаты этих программных исследований описаны в ряде работ [14, 31, 45–58]. Обнаружены явные ассоциации между изменениями в микробиоме и псориазом, артритом, СРК и другими патологическими состояниями. Помимо этих работ следует отметить появление новых “дочерних” проектов: например, “Alzheimer Gut Microbiome project” (https://alzheimergut.org/). Несмотря на существенные инвестиции в проект, до определения “эталонного микробиома” еще очень далеко и многие ответы на поставленные вопросы до сих пор не получены. Главный результат проекта – огром- нейшая база метаданных, которая легла в основу дальнейшего изучения взаимосвязи микробиома и различных заболеваний.

Система совместного культивирования клеток кишечника и микробов in vitro имеет много преимуществ для раскрытия непосредственного участия бактерий в функционировании этого органа при условии, что система надежна и действительно имитирует пищеварительную экосистему. Ниже дано краткое описание недавно разработанных систем, которые позволяют совместно культивировать (анаэробные) кишечные бактерии и эпителиальные клетки (требующие кислорода).

Модели совместного культивирования Transwell® (Corning Inc., США) ‒ пример систем, ко- торые используют для изучения межклеточного взаимодействия. Такие системы совместного культивирования, по-видимому, особенно полезны для изучения взаимодействия между бактериями, иммунными клетками слизистой оболочки и эпителиальными клетками кишечника в статических условиях, причем, как правило, аэробных [59–61].

Модуль HMITM (LabMET, Бельгия) [62] представляет собой изготовленную на заказ систему совместного культивирования, состоящую из двух отсеков: “просветного”, содержащего кишечные бактерии, и “хозяина”, содержащего условные энтероциты (например, клетки Caco-2). Важное отличие от вышеописанной системы совместного культивирования Transwell^® состоит в том, что через эти два отсека идет непрерывный поток жидкости и отсеки разделены функциональным двойным слоем (полупроницаемой мембраной и искусственно добавленным слоем слизи).

Третья система, HoxBan [63], нацелена на имитацию взаимодействий между хозяином и микроорганизмом, происходящих в кислородно-аноксической интерфазе кишки человека. Это система совместного культивирования Boxteria anaerobic и клеток Caco-2 или DLD-1 (CCL-221™). В отличие от модели Transwell^® и модуля HMITM, система HoxBan не требует специального (в том числе изготовленного на заказ) оборудования.

Четвертая, относительно недавно описанная аэробно‒анаэробная система совместного культивирования, представляет собой модульное микрофлюидное устройство HuMiX [64]. Этот “сэндвич” модульных эластомерных прокладок, расположенных между двумя поликарбонатными кожухами, позволяет сокультивировать клетки Caco-2 и Lactobacillus rhamnosus GG.

Пятая система, которая получила наибольшую популярность при изучении взаимодействия между хозяином и микроорганизмом, ‒ это “кишечник-на-чипе” (“gut-on-a-chip”). В отличие от ранее описанных эта система до недавнего времени не получила широкого применения для совместного культивирования клеток человека со строго анаэробными кишечными бактериями [65]. Это связано с тем, что технически поддержание анаэробных условий в системе затруднено. Тем не менее очень интересные результаты получены J. Barrila с соавт. [66] при совместном культивировании клеток Caco-2 с толерантными к кислороду кишечными бактериями. Полученные авторами результаты важны для дальнейшего развития истинных аэробно‒анаэробных систем совместного культивирования. Особенно следует отметить возможность проводить исследование симбиоза бактерий и клеток человека в течение продолжительного времени – до двух недель.

Как видно из табл. 2, система “кишечник-на-чипе” обладает рядом весомых преимуществ, что позволяет считать ее универсальной и эффективной моделью сокультивирования клеток бактерий и кишечника. Главное преимущество состоит в том, что открывается перспектива культивирования нескольких видов органоидов одновременно (например, ткань эпителия кишечника, клетки печени и нейрональные клетки), создавая приближенные к реальности модели различных заболеваний.

Детальное сравнение вышеописанных моделей приведено в табл. 2.

Разработка и внедрение микрофлюидных моделей “орган-на-чипе” (“organ-on-a-chip”) с тканями кишечника человека произвели в своем роде революцию в исследованиях кишечной физиологии и патофизиологии. Ранее совместное культивирование энтеральных бактерий с жизнеспособным эпителием более чем в течение 24 ч было невозможно. Более того, подобное было недостижимо даже для культур органоидов кишечника. Например, в формате двумерной клеточной культуры с однослойными клетками Caco-2 невозможно воспроизвести физиологические условия в кишечнике (такие как уникальная морфология кишечной ткани с ворсинками и образующейся слизи), а также ключевые дифференцированные функции этого отдела желудочно-кишечного тракта, включая метаболизм лекарственных препаратов на основе цитохрома Р-450. Помимо указанных проблем, в этих моделях совместного культивирования все комменсальные бактерии быстро разрастаются и загрязняют культуры клеток человека. И только недавно, благодаря изобретению моделей микрофлюидных чипов органов кишечника человека, эти проблемы были преодолены [67].

Одно из самых ранних устройств “кишечник-на-чипе” было разработано Х. Ким (H. Kim) и ее коллегами под руководством Д. Ингбера (D. Ingber) [68]. Устройство представляло собой перистальтическую микрофлюидную двухканальную модель кишечного чипа и включало пористую гибкую мембрану, служащую каркасом для эпителиальных клеток кишечника. Прибор имитировал динамику (перистальтику), структуру и физиологические функции (абсорбция и транспорт) кишечника человека и был пригоден для культивирования не только клеток кишечника человека, но и эндотелиальных клеток капилляров, иммунных клеток и микроорганизмов. Интересно, что естественный обитатель кишечника человека – Lactobacillus rhamnosus GG ‒ совместно культивировалась с клетками кишечника на поверхности просвета в течение двух недель. Уже через год разработчики системы и ее исследователи, D. Huh и соавт. [69], подробно описали микроинженерию, стоящую за изготовлением этих органов-на-чипах. Описаны материалы и размеры, используемые для конструирования микроустройств, а также принципы машиностроения, которые воспроизводят движения, подобные перистальтике, и поток жидкости, который имитирует реальную ситуацию в кишечнике. Микрофлюидное устройство предназначалось для оценки проницаемости, фармакокинетики и фармакодинамики тестируемых лекарственных средств, а также их доставки в определенный отдел кишечника. Вскоре H. Kimura и др. [70] адаптировали похожее устройство к исследованию микробиома.

Крайне важным аспектом применения “кишечника-на-чипе” является возможность исследования перекрестных взаимодействий между клетками иммунной системы человека и микробиомом и идентификация новых маркеров хронических воспалительных заболеваний [71]. Предполагается, что в будущем применение “кишечного чипа” распространится на другие модели заболеваний. В настоящее время производство чипов для различных органоидов активно развивается. Уже по- лучили известность несколько профильных компаний, предлагающих широкий спектр продуктов и услуг в этой области. Так, коммерческая система “кишечник-на-чипе” представляет собой перфузированные канальцы кишечного эпителия ‒ трех- мерные кишечные канальцы в так называемой OrganoPlate (https://mimetas.com/page/products).

Биочипы позиционируют как современные и универсальные платформы, позволяющие оперативно получать важную информацию, причем в данном случае крайне практично использование оптических методов мониторинга. При исследовании симбиотических процессов применяют ряд современных неинвазивных оптических технологий, таких как рамановская, флуоресцентная или фосфоресцентная спектроскопии. Например, в Федеральном институте технологий Швейцарии (Integrated Systems Laboratory, Swiss Federal Institute of Technology, Швейцария) успешно применена флуоресцентная микроскопия для мониторинга иммунного ответа, индуцируемого бактериальным липополисахаридом в клетках Caco-2, культивируемых на чипе совместно с иммунными клетками (концепция NutriChip) [72]. В Бостоне (Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, США) под руководством D. Ingber также применили иммунофлуоресцентные методы мониторинга [73]. Следует отметить, что благодаря форме самих чипов, похожей на предметные стекла, подобные методики широко используют для получения изображений клеточных культур. В недавно опубликованной работе M. Maurer и др. [74] описаны иммунофлуоресцентные методы для окрашивания маркеров эпителиальных тканей и использование высокоразрешающей сканирующей электронной микроскопии.

Одно из интересных направлений развития флуоресцентной технологии ‒ микроскопия визуализации жизни флуоресценции (fluorescence-lifetime imaging microscopy, FLIM). Этот метод применяют для неинвазивного мониторинга сдвигов в метаболоме клеток Caco-2: например, в сторону гликолиза либо окислительного фосфорилирования [75]. Помимо эукариотических клеток описано применение FLIM для фингерпринтинга (дактилоскопии) бактерий, в частности E. coli [76].

Следует заметить, что, как продолжение FLIM, разработан метод микроскопии визуализации жизни фосфоресценции (phosphorescence lifetime imaging, PLIM). Использование комбинации методов FLIM и PLIM со счетом единичных фотонов с корреляцией по времени описан в двух работах еще в 2017 году [77, 78]. Подобный подход позволяет получать высокоточные данные о распределении кислорода в изучаемых тканях в реальном времени. Важно заметить, что этот неинвазивный метод детекции пригоден для исследований не только микробиоты, но и гипоксии различных тканей.

Успехи в изучении микробиоты и ее взаимодействия с клетками хозяина существенно расширяют наши знания о влиянии микрофлоры на здоровье человека, позволяют идентифицировать терапевтические мишени и разрабатывать на их основе новые лекарственные средства. Так, недавно изучены механизмы сократительных бионанотрубок – шприцеобразных наномашин для молекулярной пункции. Эти нанотрубки продуцируются некоторыми бактериями: бактериоцины R-типа Pseudomonas aeruginosa, пиоцин R-типа или диффоцин R-типа Clostridium difficile [79]. Подобные системы инъекции есть у бактериофагов с сократительным хвостом, например у фага T4 (Escherichia virus T4). Механизм этой естественной антимикробной функции вируса заключается во введении полой трубки в клеточную стенку бактерии, инъекции вирусной ДНК с последующим лизисом хозяина под действием потока ионов и деполяризации внутренней мембраны [80]. Используя этот уникальный природный механизм, можно синтезировать нанотрубки с различной специфичностью для микроорганизмов- мишеней, заменив домены распознавания лигандов рецепторсвязывающих белков фагов или сократительных бактериоцинов.

Несмотря на множество преимуществ моделей “орган-на-чипе” перед другими системами in vitro, у них есть и некоторые ограничения. Многие из этих моделей имеют несколько типов ячеек, улучшенную 3D-архитектуру, но пока они работают только на узком репертуаре из множества известных на сегодня типов клеток. Так, пока нет сообщений по микроскладчатым клеткам (М-клеткам) в системах “кишечник-на-чипе”. Конечно, назрела необходимость в создании физически связанных многоорганных моделях типа “человек-на-чипе” (“human-on-a-chip”) [69, 81]. Другим ограничением является материал ‒ полидиметилсилоксан (ПДМС), ‒ обычно используемый для изготовления чипов. Во-первых, ПДМС может поглощать небольшие гидрофобные молекулы и тем самым искажать результаты скрининга лекарственных средств и анализа клеточных сигналов [82–84]. Во-вторых, есть риск выщелачивания мономера в культуру, если полимеризация полностью не завершена, что приводит к повреждению клеток [83, 84].

Как упомянуто выше, в большинстве совре- менных моделей кишечника число ячеек достаточно, чтобы разместить в них различные типы клеток, но в некоторых экспериментах может потребоваться гораздо большее число таких ячеек, их может не хватать, особенно если речь идет о компонентах внеклеточного матрикса [85, 86]. Моделирование инфекционных заболеваний, как правило, включает множество последовательных пассажей всех клеток, поэтому в работе используют несколько многолуночных планшетов. Например, при исследовании колонизации модели кишечника образцы собирают в разное время. В этом случае прагматичный подход заключается в использовании нескольких модельных 3D-систем, которые будут адаптированы к решению определенной экспериментальной задачи. Это связано с тем, что единой модельной системы недостаточно для рассмотрения всех сценариев инфекционных заболеваний.

Безусловно, создание моделей “орган-на-чипе” и их дальнейшее усовершенствование до специализированной, “кишечник-на-чипе” с возможностью сокультивирования с бактериальными клетками, следует рассматривать как прорывную технологию в биомедицине. Создание в недалеком будущем модели “человек-на-чипе” позволит проводить скрининг разрабатываемых лекарственных средств в условиях, максимально приближенных к физиологическим. Нет сомнения, что такие системы станут мощным инструментом персонифицированной медицины. Следует отметить, что до недавнего времени персонифицированная медицина имела только один важный вектор развития – онкология. Но с открытием новых данных по микробиому человека появляется так же и второе направление – персонифицированная гастроэнтерология.

Данная наука достаточно молода и, с точки зрения регуляторного вопроса, о замене клинических исследований моделями “человек-на-чипе” либо о персонифицированной медицине говорить всерьез пока рано. В настоящий момент все лекарственные препараты, в том числе и медицинские услуги/протоколы, проходят обязательные клинические исследования на людях в парадигме доказательной медицины. В то же время на ранних этапах исследования большинство фармацевтических компаний уже прибегает к моделям человеческих органоидов и активно их использует как для оценки токсичности, так и эффективности изучаемых кандидатов. Уже более 10 лет в обязательный набор испытаний для формирования регистрационного досье нового перорального лекарственного средства входит предварительное исследование проницаемости молекулы основного вещества на клетках Caco-2. И данный подход не ограничивается только моделью кишечника. Так, для первичной оценки токсичности соединения-кандидата на лекарственный препарат в стандартный набор доклинических исследований уже более 30 лет входят in vitro модели печени, основанные на гепатоцитах, культивируемых совместно с эпителиальными клетками [87]. Особую популярность сегодня набирают микрофлюидные устройства и 3D-органоиды [88, 89]. Главная задача использования таких моделей ‒ отбор перспективных соединений по результатам первичного in vitro скрининга: выбирают наиболее активные, наименее токсичные, наиболее стабильные к окислению и максимально биодоступные. Таким образом, дальнейшее развитие микрофлюидных модельных комбинаций: “3D-печень” и “кишечник с микробиотой” ‒ позволит заменить ряд фармакокинетических моделей на животных. Учитывая объемы инвестиций в проекты по микробиому человека и персонифицированную медицину в развитых странах, можно ожидать, что в ближайшие 10‒15 лет “органы-на-чипе” частично или полностью (в зависимости от нозологии) заменят доклинические исследования на животных.

Доп. информация:

• Микробиом человека в анаэробном «кишечнике на чипе»
• Метагеномика и кишечный микробиом
• Микробиом человека (раздел)

1. Lozupone C.A., Stombaugh J.I., Gordon J.I., Jansson J.K., Knight R. Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota. Nature, 2012, 489, 220–230. https://doi.org/10.1038/nature11550
2. Turnbaugh P.J., Ley R.E., Hamady M., Fraser-Liggett C.M., Knight R., Gordon J.I. The Human Microbiome Project. Nature, 2007, 449, 804–810. https://doi.org/10.1038/nature06244
3. Qin J., Li R., Raes J., Arumugam M., Burgdorf K.S., Manichanh C., Nielsen T., Pons N., Levenez F., Yamada T., Mende D.R., Li J., Xu J., Li S., Li D., Cao J., Wang B., Liang H., Zheng H., Xie Y., Tap J., Lepage P., Bertalan M., Batto J.M., Hansen T., Le Paslier D., Linneberg A., Niel- sen H.B., Pelletier E., Renault P., Sicheritz-Ponten T., Turner K., Zhu H., Yu C., Li S., Jian M., Zhou Y., Li Y., Zhang X., Li S., Qin N., Yang H., Wang J., Brunak S., Doré J., Guarner F., Kristiansen K., Pedersen O., Parkhill J., Weissenbach J., Bork P., Ehrlich S.D., Wang J., Antolin M., Artiguenave F., Blottiere H., Borruel N., Bruls T., Casellas F., Chervaux C., Cultrone A., Delorme C., Denariaz G., Dervyn R., Forte M., Friss C., Van De Guchte M., Guedon E., Haimet F., Jamet A., Juste C., Kaci G., Kleerebezem M., Knol J., Kristensen M., Layec S., Le Roux K., Leclerc M., Maguin E., Melo Minardi R., Oozeer R., Rescigno M., Sanchez N., Tims S., Torrejon T., Varela E., De Vos W., Winogradsky Y., Zoetendal E. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature, 2010, 464, 59–65. https://doi.org/10.1038/nature08821
4. Arumugam M., Raes J., Pelletier E., Le Paslier D., Yamada T., Mende D.R., Fernandes G.R., Tap J., Bruls T., Batto J.M., Bertalan M., Borruel N., Casellas F., Fernandez L., Gautier L., Hansen T., Hattori M., Hayashi T., Kleerebezem M., Kurokawa K., Leclerc M., Levenez F., Manichanh C., Nielsen H.B., Nielsen T., Pons N., Poulain J., Qin J., Sicheritz-Ponten T., Tims S., Torrents D., Ugarte E., Zoetendal E.G., Wang J., Guarner F., Pedersen O., De Vos W.M., Brunak S., Doré J., Weissenbach J., Ehrlich S.D., Bork P. Enterotypes of the human gut microbiome, Nature, 2011, 473, 174–180. https://doi.org/10.1038/nature09944
5. Bäckhed F., Fraser C.M., Ringel Y., Sanders M.E., Sartor R.B., Sherman P.M., Versalovic J., Young V., Finlay B.B. Defining a healthy human gut microbiome: current concepts, future directions, and clinical applications. Cell Host Microbe, 2012, 12, 611–622. https://doi.org/10.1016/j.chom.2012.10.012
6. Koo H., Hakim J.A., Crossman D.K., Kumar R., Lefkowitz E.J., Morrow C.D. Individualized recovery of gut microbial strains post antibiotics. NPJ Biofilms Microbiomes, 2019, 5, 30. https://doi.org/10.1038/s41522-019-0103-8
7. Donaldson G.P., Lee S.M., Mazmanian S.K. Gut biogeography of the bacterial microbiota. Nat. Rev. Microbi- ol., 2015, 14, 20–32. https://doi.org/10.1038/nrmicro3552
8. Cullender T.C., Chassaing B., Janzon A., Kumar K., Muller C.E., Werner J.J., Angenent L.T., Bell M.E., Hay A.G., Peterson D.A., Walter J., Vijay-Kumar M., Gewirtz A.T., Ley R.E. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome f lagellar motility in the gut. Cell Host Microbe, 2013, 14, 571–581. https://doi.org/10.1016/j.chom.2013.10.009
9. Nakjang S., Ndeh D.A., Wipat A., Bolam D.N., Hirt R.P. A novel extracellular metallopeptidase domain shared by animal host-associated mutualistic and pathogenic microbes. PLoS One, 2012, 7(1), e30287. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0030287
10. Mahdavi J., Sondén B., Hurtig M., Olfat F.O., Forsberg L., Roche N., Ångström J., Larsson T., Teneberg S., Karlsson K.A., Altraja S., Wadström T., Kersulyte D., Berg D.E., Dubois A., Petersson C., Magnusson K.E., Norberg T., Lindh F., Lundskog B.B., Arnqvist A., Hammarström L., Borén T. Helicobacter pylori sabA adhesin in persistent infection and chronic inflammation. Science, 2002, 297 (80), 573–578. https://doi.org/10.1126/science.1069076
11. Matos R., Amorim I., Magalhães A., Haesebrouck F., Gärtner F., Reis C. Adhesion of Helicobacter species to the human gastric mucosa: a deep look into glycans role. Front. Mol. Biosci., 2021, 8, 656439. https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.656439
12. Chatterjee D., Chaudhuri K. Vibrio cholerae O395 outer membrane vesicles modulate intestinal epithelial cells in a NOD1 protein-dependent manner and induce dendritic cell-mediated Th2/Th17 cell responses. J. Biol. Chem., 2013, 288(6), 4299‒4309. https://doi.org/10.1074/jbc.M112.408302
13. Vezzulli L., Stauder M., Grande C., Pezzati E., Verheye H.M., Owens N.J.P., Pruzzo C. gbpA as a novel qPCR target for the species-specific detection of Vibrio cholerae O1, O139, non-O1/Non-O139 in environmental, stool, and historical continuous plankton recorder samples. PLoS One, 2015, 10(4), e0123983. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123983
14. Sokurenko E.V., Chesnokova V., Doyle R.J., Hasty D.L. Diversity of the Escherichia coli type 1 fimbrial lectin: differential binding to mannosides and uroepithelial cells. J. Biol. Chem., 1997, 272(28), 17880‒17886. https://doi.org/10.1074/jbc.272.28.17880
15. Schnupf P., Gaboriau-Routhiau V., Gros M., Friedman R., Moya-Nilges M., Nigro G., Cerf-Bensussan N., Sansonetti P.J. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature, 2015, 520 (7545), 99–103. https://doi.org/10.1038/nature14027
16. Lecuit M., Vandormael-Pournin S., Lefort J., Huerre M., Gounon P., Dupuy C., Babinet C., Cossart P. A transgen- ic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science, 2001, 292(5522), 1722–1725. https://doi.org/10.1126/science.1059852
17. Savage D.C. Microbial interference between indigenous yeast and lactobacilli in the rodent stomach. J. Bacteri- ol., 1969, 98, 1278–1283.
18. Morotomi M., Watanabe T., Suegara N., Kawai Y., Mu- tai M. Distribution of indigenous bacteria in the digestive tract of conventional and gnotobiotic rats. Infect. Immun., 1975, 11, 962–968.
19. Turroni F., Serafini F., Foroni E., Duranti S., Motherway M.O.C., Taverniti V., Mangifesta M., Milani C., Viappiani A., Roversi T., Sańchez B., Santoni A., Gioiosa L., Ferrarini A., Delledonne M., Margolles A., Piazza L., Palanza P., Bolchi A., Guglielmetti S., Van Sinderen D., Ventura M. Role of sortase-dependent pili of Bifidobac- terium bifidum PRL2010 in modulating bacterium-host interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, 110, 11151–11156. https://doi.org/10.1073/pnas.1303897110
20. Round J.L., Mazmanian S.K. Inducible Foxp3+ regulatory T-cell development by a commensal bacterium of the intestinal microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107, 12204–12209. https://doi.org/10.1073/pnas.0909122107
21. Ivanov I.I., Atarashi K., Manel N., Brodie E.L., Shima T., Karaoz U., Wei D., Goldfarb K.C., Santee C.A., Lynch S. V., Tanoue T., Imaoka A., Itoh K., Takeda K., Umesaki Y., Honda K., Littman D.R. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell, 2009, 139, 485–498. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.09.033
22. Blutt S.E., Estes M.K. Gut bacterial bouncers: keeping viral pathogens out of the epithelium. Cell Host Microbe, 2019, 26, 569–570. https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.10.018
23. Gevers D., Kugathasan S., Denson L.A., Vázquez-Baeza Y., Van Treuren W., Ren B., Schwager E., Knights D., Song S.J., Yassour M., Morgan X.C., Kostic A.D., Luo C., González A., McDonald D., Haberman Y., Walters T., Baker S., Rosh J., Stephens M., Heyman M., Markowitz J., Baldassano R., Griffiths A., Sylvester F., Mack D., Kim S., Crandall W., Hyams J., Huttenhower C., Knight R., Xavier R.J. The treatment-naive microbiome in new-onset Crohn’s disease. Cell Host Microbe, 2014, 15, 382–392. https://doi.org/10.1016/j.chom.2014.02.005
24. Rowan F., Docherty N.G., Murphy M., Murphy T.B., Coffey J.C., O’Connell P.R. Bacterial colonization of colonic crypt mucous gel and disease activity in ulcerative colitis. Ann. Surg., 2010, 252, 869–874. https://doi.org/10.1097/SLA.0b013e3181fdc54c
25. Lynch S.V., Pedersen O. The human intestinal microbiome in health and disease. N. Engl. J. Med., 2016, 375, 2369–2379. https://doi.org/10.1056/NEJMra1600266
26. Chong P.P., Chin V.K., Looi C.Y., Wong W.F., Madhavan P., Yong V.C. The microbiome and irritable bowel syndrome ‒ a review on the pathophysiology, current research and future therapy. Front.Microbiol., 2019, 10, 1136. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01136
27. Zhuang X., Xiong L., Li L., Li M., Chen M. Alterations of gut microbiota in patients with irritable bowel syndrome: a systematic review and meta-analysis. J. Gas- troenterol. Hepatol., 2017, 32, 28–38. https://doi.org/10.1111/jgh.13471
28. Beatty J.K., Akierman S.V., Motta J.P., Muise S., Workentine M.L., Harrison J.J., Bhargava A., Beck P.L., Rioux K.P., McKnight G.W., Wallace J.L., Buret A.G. Giardia duodenalis induces pathogenic dysbiosis of human intestinal microbiota biofilms. Int. J. Parasitol., 2017, 47, 311–326. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2016.11.010
29. Halkjær S.I., Boolsen A.W., Günther S., Christensen A.H., Petersen A.M. Can fecal microbiota transplantation cure irritable bowel syndrome? World J. Gastroenterol., 2017, 23, 4112–4120. https://doi.org/10.3748/wjg.v23.i22.4112
30. Mizuno S., Masaoka T., Naganuma M., Kishimoto T., Kitazawa M., Kurokawa S., Nakashima M., Takeshita K., Suda W., Mimura M., Hattori M., Kanai T. Bifidobacterium ‒ rich fecal donor may be a positive predictor for successful fecal microbiota transplantation in patients with ir- ritable bowel syndrome. Digestion, 2017, 96, 29–38. https://doi.org/10.1159/000471919
31. Kao D., Roach B., Silva M., Beck P., Rioux K., Kaplan G.G., Chang H.J., Coward S., Goodman K.J., Xu H., Madsen K., Mason A., Wong G.K.S., Jovel J., Patterson J., Louie T. Effect of oral capsule– vs colonoscopy-delivered fecal microbiota transplantation on recurrent Clostridium difficile infection: a randomized clinical trial. J. Am. Med. Assoc., 2017, 318, 1985–1993. https://doi.org/10.1001/jama.2017.17077
32. Hou, K., Wu, Z.X., Chen, X.Y., Wang J., Zhang D., Xiao C., Zhu D., Koya J.B., Wei L., Li J., Chen Z. Microbiota in health and diseases. Sig. Transduct. Target Ther., 2022, 7, 135. https://doi.org/10.1038/s41392-022-00974-4
33. Chandra S., Sisodia S.S., Vassar R.J. The gut microbiome in Alzheimer’s disease: what we know and what re- mains to be explored. Mol. Neurodegener., 2023, 18, 9. https://doi.org/10.1186/s13024-023-00595-7
34. Sinha R., Chen J., Amir A., Vogtmann E., Shi J., Inman K.S., Flores R., Sampson J., Knight R., Chia N. Collecting fecal samples for microbiome analyses in epidemiology studies. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2016, 25, 407–416. https://doi.org/10.1158/1055-9965.EPI-15-0951
35. Vogtmann E., Chen J., Amir A., Shi J., Abnet C.C., Nelson H., Knight R., Chia N., Sinha R. Comparison of collection methods for fecal samples in microbiome studies. Am. J. Epidemiol., 2017, 185, 115–123. https://doi.org/10.1093/aje/kww177
36. Wu W.K., Chen C.C., Panyod S., Chen R.A., Wu M.S., Sheen L.Y., Chang S.C. Optimization of fecal sample processing for microbiome study ‒ the journey from bathroom to bench. J. Formos. Med. Assoc., 2019, 118, 545–555. https://doi.org/10.1016/j.jfma.2018.02.005
37. Lazarevic V., Whiteson K., Huse S., Hernandez D., Farinelli L., Østerås M., Schrenzel J., François P. Metagenomic study of the oral microbiota by Illumina high- throughput sequencing. J. Microbiol. Methods, 2009, 79, 266–271. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2009.09.012
38. Lagier J.C., Armougom F., Million M., Hugon P., Pagnier I., Robert C., Bittar F., Fournous G., Gimenez G., Maraninchi M., Trape J.F., Koonin E. V., La Scola B., Raoult D. Microbial culturomics: paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin. Microbiol. Infect., 2012, 18, 1185–1193. https://doi.org/10.1111/1469-0691.12023
39. Lagier J.C., Hugon P., Khelaifia S., Fournier P.E., La Scola B., Raoult D. The rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics to study human gut microbiota. Clin. Microbiol. Rev., 2015, 28, 237–264. https://doi.org/10.1128/CMR.00014-14
40. Putignani L., Del Chierico F., Petrucca A., Vernocchi P., Dallapiccola B. The human gut microbiota: a dynamic interplay with the host from birth to senescence settled during childhood. Pediatr. Res., 2014, 76, 2–10. https://doi.org/10.1038/pr.2014.49
41. Vernocchi P., Del Chierico F., Putignani L. Gut microbi- ota profiling: metabolomics based approach to unravel compounds affecting human health. Front. Microbiol., 2016, 7, 1144. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01144
42. Le Gall G., Noor S.O., Ridgway K., Scovell L., Jamieson C., Johnson I.T., Colquhoun I.J., Kemsley E.K., Narbad A. Metabolomics of fecal extracts detects altered metabolic activity of gut microbiota in ulcerative colitis and irritable bowel syndrome. J. Proteome Res., 2011, 10, 4208–4218. https://doi.org/10.1021/pr2003598
43. Kumar S., Misra A., Ghoshal U.C. Patients with irritable bowel syndrome exhale more hydrogen than healthy subjects in fasting state. J. Neurogastroenterol. Motil., 2010, 16, 299–305. https://doi.org/10.5056/jnm.2010.16.3.299
44. Bunge M., Araghipour N., Mikoviny T., Dunkl J., Schnitzhofer R., Hansel A., Schinner F., Wisthaler A., Margesin R., Märk T.D. On-line monitoring of micro- bial volatile metabolites by proton transfer reaction- mass spectrometry. Appl. Environ. Microbiol., 2008, 74, 2179–2186. https://doi.org/10.1128/AEM.02069-07
45. Proctor L.M., Creasy H.H., Fettweis J.M., Lloyd-Price J., Mahurkar A., Zhou W., Buck G.A., Snyder M.P., Strauss J.F., Weinstock G.M., White O., Huttenhower C. The Integrative Human Microbiome Project. Nature, 2019, 569, 641–648. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1238-8
46. Huttenhower C., Gevers D., Knight R., Abubucker S., Badger J.H., Chinwalla A.T., Creasy H.H., Earl A.M., Fitzgerald M.G., Fulton R.S., Giglio M.G., Hallsworth-PepinK., LobosE.A., MadupuR., MagriniV., MartinJ.C., Mitreva M., Muzny D.M., Sodergren E.J., Versalovic J., Wollam A.M., Worley K.C., Wortman J.R., Young S.K., Zeng Q., Aagaard K.M., Abolude O.O., Allen-Vercoe E., Alm E.J., Alvarado L., Andersen G.L., Anderson S., Ap- pelbaum E., Arachchi H.M., Armitage G., Arze C.A., Ayvaz T., Baker C.C., Begg L., Belachew T., Bhonagiri V., Bihan M., Blaser M.J., Bloom T., Bonazzi V., Paul Brooks J., Buck G.A., Buhay C.J., Busam D.A., Campbell J.L., Canon S.R., Cantarel B.L., Chain P.S.G., Chen I.M.A., Chen L., Chhibba S., Chu K., Ciulla D.M., Clemente J.C., Clifton S.W., Conlan S., Crabtree J., Cutting M.A., Davi- dovics N.J., Davis C.C., Desantis T.Z., Deal C., Dele- haunty K.D., Dewhirst F.E., Deych E., Ding Y., Dooling D.J., Dugan S.P., Michael Dunne W., Scott Durkin A., Ed- gar R.C., Erlich R.L., Farmer C.N., Farrell R.M., Faust K., Feldgarden M., Felix V.M., Fisher S., Fodor A.A., For- ney L.J., Foster L., Di Francesco V., Friedman J., Fried- rich D.C., Fronick C.C., Fulton L.L., Gao H., Garcia N., Giannoukos G., Giblin C., Giovanni M.Y., Goldberg J.M., Goll J., Gonzalez A., Griggs A., Gujja S., Kinder Haake S., Haas B.J., Hamilton H.A., Harris E.L., Hepburn T.A., Herter B., Hoffmann D.E., Holder M.E., Howarth C., Huang K.H., Huse S.M., Izard J., Jansson J.K., Jiang H., Jordan C., Joshi V., Katancik J.A., Keitel W.A., Kelley S.T., Kells C., King N.B., Knights D., Kong H.H., Koren O., Koren S., Kota K.C., Kovar C.L., Kyrpides N.C., La Rosa P.S., Lee S.L., Lemon K.P., Lennon N., Lewis C.M., Lewis L., Ley R.E., Li K., Liolios K., Liu B., Liu Y., Lo C.C., Lozupone C.A., Dwayne Lunsford R., Madden T., Mahurkar A.A., Mannon P.J., Mardis E.R., Markow- itz V.M., Mavromatis K., McCorrison J.M., McDonald D., McEwen J., McGuire A.L., McInnes P., Mehta T., Mihin- dukulasuriya K.A., Miller J.R., Minx P.J., Newsham I., Nusbaum C., Oglaughlin M., Orvis J., Pagani I., Pala- niappan K., Patel S.M., Pearson M., Peterson J., Podar M., Pohl C., Pollard K.S., Pop M., Priest M.E., Proctor L.M., Qin X., Raes J., Ravel J., Reid J.G., Rho M., Rhodes R., Riehle K.P., Rivera M.C., Rodriguez-Mueller B., Rog- ers Y.H., Ross M.C., Russ C., Sanka R.K., Sankar P., Fah Sathirapongsasuti J., Schloss J.A., Schloss P.D., Schmidt T.M., Scholz M., Schriml L., Schubert A.M., Segata N., Segre J.A., Shannon W.D., Sharp R.R., Sharpton T.J., Shenoy N., Sheth N.U., Simone G.A., Singh I., Smillie C.S., Sobel J.D., Sommer D.D., Spicer P., Sutton G.G., Sykes S.M., Tabbaa D.G., Thiagarajan M., Tomlinson C.M., Torralba M., Treangen T.J., Truty R.M., Vishnivetskaya T.A., Walker J., Wang L., Wang Z., Ward D.V., Warren W., Watson M.A., Wellington C., Wetterstrand K.A., White J.R., Wilczek-Boney K., Wu Y., Wylie K.M., Wylie T., Yandava C., Ye L., Ye Y., Yooseph S., Youmans B.P., Zhang L., Zhou Y., Zhu Y., Zoloth L., Zucker J.D., Birren B.W., Gibbs R.A., Highlander S.K., Methé B.A., Nelson K.E., Petrosino J.F., Weinstock G.M., Wilson R.K., White O. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature, 2012, 486, 207–214. https://doi.org/10.1038/nature11234
47. Lloyd-Price J., Mahurkar A., Rahnavard G., Crabtree J., Orvis J., Hall A.B., Brady A., Creasy H.H., McCracken C., Giglio M.G., McDonald D., Franzosa E.A., Knight R., White O., Huttenhower C. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature, 2017, 550, 61–66. https://doi.org/10.1038/nature23889
48. Cuellar-Partida G., Buske F.A., McLeay R.C., Whitington T., Noble W.S., Bailey T.L. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics, 2012, 28, 56–62. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr614
49. Haft D.H. Bioinformatic evidence for a widely distributed, ribosomally produced electron carrier precursor, its maturation proteins, and its nicotinoprotein redox partners. BMC Genomics, 2011, 12, 21. https://doi.org/10.1186/1471-2164-12-21
50. Caporaso J.G., Lauber C.L., Costello E.K., Berg-Lyons D., Gonzalez A., Stombaugh J., Knights D., Gajer P., Ravel J., Fierer N., Gordon J.I., Knight R. Moving pictures of the human microbiome. Genome Biol., 2011, 12(5), R50. https://doi.org/10.1186/gb-2011-12-5-r50
51. Sczesnak A., Segata N., Qin X., Gevers D., Petrosino J.F., Huttenhower C., Littman D.R., Ivanov I.I. The genome of Th17 cell-inducing segmented filamentous bacteria reveals extensive auxotrophy and adaptations to the intestinal environment. Cell Host Microbe, 2011, 10, 260–272. https://doi.org/10.1016/j.chom.2011.08.005
52. Ballal S.A., Gallini C.A., Segata N., Huttenhower C., Garrett W.S. Host and gut microbiota symbiotic factors: lessons from inflammatory bowel disease and successful symbionts. Cell. Microbiol., 2011, 13, 508–517. https://doi.org/10.1111/j.1462-5822.2011.01572.x
53. Bergmann G.T., Bates S.T., Eilers K.G., Lauber C.L., Caporaso J.G., Walters W.A., Knight R., Fierer N. The under-recognized dominance of Verrucomicrobia in soil bacterial communities. Soil Biol. Biochem., 2011, 43, 1450–1455. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2011.03.012
54. Yeoman C.J., Yildirim S., Thomas S.M., Durkin A.S., Torralba M., Sutton G., Buhay C.J., Ding Y., Dugan-Rocha S.P., Muzny D.M., Qin X., Gibbs R.A., Leigh S.R., Stumpf R., White B.A., Highlander S.K., Nelson K.E., Wilson B.A. Comparative genomics of Gardnerella vaginalis strains reveals substantial differences in metabolic and virulence potential. PLoS One, 2010, 5(8), e12411. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012411
55. Koren O., Spor A., Felin J., Fåk F., Stombaugh J., Tremaroli V., Behre C.J., Knight R., Fagerberg B., Ley R.E., Bäckhed F. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108, 4592–4598. https://doi.org/10.1073/pnas.1011383107
56. Cattaneo A., Cattane N., Galluzzi S., Provasi S., Lopizzo N., Festari C., Ferrari C., Guerra U.P., Paghera B., Muscio C., Bianchetti A., Volta G.D., Turla M., Cotelli M.S., Gen- nuso M., Prelle A., Zanetti O., Lussignoli G., Mirabile D., Bellandi D., Gentile S., Belotti G., Villani D., Harach T., Bolmont T., Padovani A., Boccardi M., Frisoni G.B. As- sociation of brain amyloidosis with pro-inflammatory gut bacterial taxa and peripheral inflammation markers in cognitively impaired elderly. Neurobiol. Aging, 2017, 49, 60–68. https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2016.08.019
57. Roy Sarkar S., Banerjee S. Gut microbiota in neurodegenerative disorders. J.Neuroimmunol., 2019, 328, 98–104. https://doi.org/10.1016/j.jneuroim.2019.01.004
58. Marri P.R., Paniscus M., Weyand N.J., Rendón M.A., Cal- ton C.M., Hernández D.R., Higashi D.L., Sodergren E., Weinstock G.M., Rounsley S.D., So M. Genome sequencing reveals widespread virulence gene exchange among human Neisseria species. PLoS One, 2010, 5(7), e11835. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011835
59. Haller D., Bode C., Hammes W.P., Pfeifer A.M.A., Schiffrin E.J., Blum S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut, 2000, 47, 79–87. https://doi.org/10.1136/gut.47.1.79
60. Zoumpopoulou G., Tsakalidou E., Dewulf J., Pot B., Grangette C. Differential crosstalk between epithelial cells, dendritic cells and bacteria in a co-culture model. Int. J. Food Microbiol., 2009, 131, 40–51. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2008.12.037
61. Parlesak A., Haller D., Brinz S., Baeuerlein A., Bode C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand. J. Immunol., 2004, 60, 477‒485. https://doi.org/10.1111/j.0300-9475.2004.01495.x
62. Marzorati M., Vanhoecke B., De Ryck T., Sadaghian Sadabad M., Pinheiro I., Possemiers S., Van Den Abbeele P., Derycke L., Bracke M., Pieters J., Hennebel T., Harmsen H.J., Verstraete W., Van De Wiele T. The HMITM module: a new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiol., 2014, 14. https://doi.org/10.1186/1471-2180-14-133
63. Sadabad M.S., Von Martels J.Z.H., Khan M.T., Blokzijl T., Paglia G., Dijkstra G., Harmsen H.J.M., Faber K.N. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci. Rep., 2015, 5, 17906. https://doi.org/10.1038/srep17906
64. Shah P., Fritz J. V., Glaab E., Desai M.S., Greenhalgh K., Frachet A., Niegowska M., Estes M., Jäger C., Seguin-Devaux C., Zenhausern F., Wilmes P. A microfluidics- based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat. Commun., 2016, 7, 11535. https://doi.org/10.1038/ncomms11535
65. Jalili-Firoozinezhad S., Gazzaniga F.S., Calamari E.L., Camacho D.M., Fadel C.W., Bein A., Swenor B., Nestor B., Cronce M.J., Tovaglieri A., Levy O., Gregory K.E., Breault D.T., Cabral J.M.S., Kasper D.L., Novak R., Ingber D.E. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat. Biomed. Eng., 2019, 3, 520–531. https://doi.org/10.1038/s41551-019-0397-0
66. Barrila J., Crabbé A., Yang J., Franco K., Nydam S.D., Forsyth R.J., Davis R.R., Gangaraju S., Mark Ott C., Coyne C.B., Bissell M.J., Nickerson C.A. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: three-dimensional cell culture comes of age. Infect. Immun., 2018, 86(11), e00282-18. https://doi.org/10.1128/IAI.00282-18
67. Bein A., Shin W., Jalili-Firoozinezhad S., Park M.H., Sontheimer-Phelps A., Tovaglieri A., Chalkiadaki A., Kim H.J., Ingber D.E. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol., 2018, 5, 659–668. https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2017.12.010
68. Kim H.J., Huh D., Hamilton G., Ingber D.E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial f lora that experi- ences intestinal peristalsis-like motions and f low. Lab Chip, 2012, 12, 2165–2174. https://doi.org/10.1039/c2lc40074j
69. Huh D., Kim H.J., Fraser J.P., Shea D.E., Khan M., Bahinski A., Hamilton G.A., Ingber D.E. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat. Protoc., 2013, 8, 2135–2157. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.137
70. Kimura H., Ikeda T., Nakayama H., Sakai Y., Fujii T. An on-chip small intestine–liver model for pharmacokinetic studies. J. Lab. Autom., 2015, 20, 265–273. https://doi.org/10.1177/2211068214557812
71. Kang T.H., Kim H.J. Farewell to animal testing: innovations on human intestinal microphysiological systems. Micromachines (Basel), 2016, 7, 107. https://doi.org/10.3390/mi7070107
72. Ghaye J., Kamat M.A., Corbino-Giunta L., Silacci P., Vergères G., De Micheli G., Carrara S. Image threshold- ing techniques for localization of sub-resolution fluorescent biomarkers. Cytom. Part A, 2013, 83, 1001‒1016. https://doi.org/10.1002/cyto.a.22345
73. Kim H.J., Ingber D.E. Gut-on-a-chip microenviron- ment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr. Biol. (United Kingdom), 2013, 5, 1130–1140. https://doi.org/10.1039/c3ib40126j
74. Maurer M., Gresnigt M.S., Last A., Wollny T., Berlinghof F., Pospich R., Cseresnyes Z., Medyukhina A., Graf K., Gröger M., Raasch M., Siwczak F., Nietzsche S., Jacobsen I.D., Figge M.T., Hube B., Huber O., Mosig A.S. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials, 2019, 220, 119396. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119396
75. Lakner P.H., Monaghan M.G., Möller Y., Olayioye M.A., Schenke-Layland K. Applying phasor approach analysis of multiphoton FLIM measurements to probe the metabolic activity of three-dimensional in vitro cell culture models. Sci. Rep., 2017, 7, 42730. https://doi.org/10.1038/srep42730
76. Bhattacharjee A., Datta R., Gratton E., Hochbaum A.I. Metabolic fingerprinting of bacteria by f luorescence lifetime imaging microscopy. Sci. Rep., 2017, 7, 3743. https://doi.org/10.1038/s41598-017-04032-w
77. Okkelman I.A., Foley T., Papkovsky D.B., Dmitriev R.I. Multi-parametric imaging of hypoxia and cell cycle in intestinal organoid culture. Adv. Exp. Med. Biol., 2017, 1035, 85‒103. https://doi.org/10.1007/978-3-319-67358-5_6
78. Zhdanov A.V., Okkelman I.A., Golubeva A.V., Doerr B., Hyland N.P., Melgar S., Shanahan F., Cryan J.F., Papkovsky D.B. Quantitative analysis of mucosal oxygenation using exvivoimaging of healthy and inflamed mammalian colon tissue. Cell.Mol.LifeSci., 2017, 74, 141–151. https://doi.org/10.1007/s00018-016-2323-x
79. Ge P., Scholl D., Leiman P.G., Yu X., Miller J.F., Zhou Z.H. Atomic structures of a bactericidal contractile nanotube in its pre- and postcontraction states. Nat. Struct. Mol. Biol., 2015, 22(5), 377–382. https://doi.org/10.1038/nsmb.2995
80. Maghsoodi A., Chatterjee A., Andricioaei I., Perkins N.C. How the phage T4 injection machinery works including energetics, forces, and dynamic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2019, 116(50), 250974–25105. https://doi.org/10.1073/pnas.1909298116
81. Abaci H.E., Shuler M.L. Human-on-a-chip design strategies and principles for physiologically based pharmacokinetics/pharmacodynamics modeling. Integr. Biol. (United Kingdom), 2015, 7, 383–391. https://doi.org/10.1039/c4ib00292j
82. Huh D., Torisawa Y.S., Hamilton G.A., Kim H.J., Ingber D.E. Microengineered physiological biomimicry: Organs-on-Chips. Lab Chip, 2012, 12, 2156–2164. https://doi.org/10.1039/c2lc40089h
83. Halldorsson S., Lucumi E., Gómez-Sjöberg R., Fleming R.M.T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens. Bioelectron., 2015, 63, 218–231. https://doi.org/10.1016/j.bios.2014.07.029
84. Sackmann E.K., Fulton A.L., Beebe D.J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature, 2014, 507, 181–189. https://doi.org/10.1038/nature13118
85. Frantz C., Stewart K.M., Weaver V.M. The extracellular matrix at a glance. J. Cell Sci., 2010, 123, 4195–4200. https://doi.org/10.1242/jcs.023820
86. Bonnans C., Chou J., Werb Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2014, 15, 786–801. https://doi.org/10.1038/nrm3904
87. Fabre G., Combalbert J., Berger Y., Cano J.-P. Human hepatocytes as a key in vitro model to improve preclinical drug development. Eur. J. Drug Metab. Pharmacoki- net., 1990, 15, 165–171. https://doi.org/10.1007/BF03190200
88. Poloznikov A. In vitro and in silico liver models: current trends, challenges and opportunities. ALTEX, 2018, 397–412. https://doi.org/10.14573/altex.1803221
89. Zakharyants A.A., Burmistrova O.A., Poloznikov A.A. The use of human liver cell model and cytochrome P450 substrate‒inhibitor panel for studies of dasatinib and warfarin interactions. Bull. Exp. Biol. Med., 2017, 162, 515–519. https://doi.org/10.1007/s10517-017-3651-z