Сухой синбиотик с кедровым шротом и бифидобактериями

СОЗДАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ФОРМЫ СУХОГО СИНБИОТИКА

Разработка сухого синбиотика с использованием бифидобактерий Bifidobacterium longum B379M и кедрового шрота в качестве пребиотика

Предложен принципиально новый метод иммобилизации бифидобактерий при их непосредственном культивировании в питательной среде с адсорбентом - кедровым шротом. Подобраны условия ферментации кедрового шрота закваской бифидобактерий. Установлено, что кедровый шрот обладает пребиотическими свойствами и стимулирует рост бифидобактерий. Установлена высокая выживаемость иммобилизованных на кедровом шроте бифидобактерий при лиофильной сушке ферментированного шрота и в процессе длительного хранения. В результате проведенных исследований сконструированы сухие формы иммобилизованных синбиотиков, содержащих в качестве пробиотика – бифидобактерии, а пребиотика – кедровый шрот, который является уникальным природным источником биологически активных веществ.

Введение

Создание пробиотиков на основе бифидобактерий, которые при попадании в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) быстро адаптируются, возобновляют активный метаболизм, рассматривается как стратегическое направление медицины при профилактике болезней и восстановлении здоровья человека и животных [1]. В настоящее время рынок продуктов, обладающих про- и пребиотическими свойствами, активно расширяется. На основе бифидобактерий получают не только традиционные кисломолочные продукты, но и мороженое и другие пищевые продукты [2].

Одной из важных проблем использования пробиотических препаратов является потеря жизнеспособности бифидобактерий при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды или в агрессивной среде желудка, а также в процессе хранения.

В связи с этим приоритетной технологической задачей, имеющей коммерческую значимость, является повышение устойчивости бифидобактерий в пробиотических препаратах путем иммобилизации клеток. Иммобилизированные клетки приобретают большую устойчивость к стрессовым факторам, дольше сохраняют жизнеспособность и могут использоваться с большей эффективностью в лечебных и пищевых препаратах [3].

---

Иммобилизация – это прикрепление клеток микроорганизмов или ферментов к нерастворимым носителям. Иммобилизация клеток может быть естественным процессом или может быть вызвана химическими или физическими способами.

• В настоящее время разработано большое число методов иммобилизации, многие из которых повторяют приемы иммобилизации ферментов. Методы иммобилизации можно разделить на группы согласно используемому физическому процессу: прикрепление, внедрение, включение и агрегация.
• Необходимо различать методы иммобилизации, в результате которых клетки становятся неподвижными при естественном росте на предоставленной подходящей поверхности, и те, при которых выращенная клеточная популяция «активно» обрабатывается для достижения иммобилизации. «Активные» методы более широко распространены и могут быть использованы для клеток в любом физиологическом состоянии. «Естественные» методики, в общем, более доступны и дешевы, так как не требуют никаких дополнительных затрат.
• Клеточная иммобилизация как прокариотических, так и эукариотических клеток позволяет создавать биочастицы любого размера, объема и плотности. Одной из важнейших особенностей процесса клеточной иммобилизации является возможность достижения чрезвычайно высокой концентрации клеток, что, наряду с легкостью отделения иммобилизованных клеток от жидкой фазы, обусловливает ряд преимуществ и способов усовершенствования процесса.

---

Известны многочисленные эффективные лечебные препараты в сухой форме, созданные адсорбцией молочнокислых и бифидобактерий на частицах с высокой сорбционной активностью, таких как уголь, различные биоволокна. В России создан ряд иммобилизованных пробиотиков: «Бифидумбактерин форте», «Флорин форте», «Экофлор» и др. В качестве сорбционной составляющей в основном используются активированные угли и углеродоминеральный сорбент [4].

Завершающей стадией технологий получения таких препаратов является процесс иммобилизации выращенных клеток бифидо- и молочнокислых бактерий на сорбционном носителе, в результате которой часть бактерий гибнет [5].

В отличие от известных способов предлагается принципиально новый метод иммобилизации бифидобактерий при их непосредственном культивировании в среде с твердым субстратом – адсорбентом, кедровым шротом. В данном случае размножение клеток бифидобактерий будет проходить не в суспензии, а на поверхности субстрата, что должно повысить степень стрессоустойчивости при воздействии различных неблагоприятных факторов. Кедровый шрот характеризуется высоким содержанием белков, углеводов, минеральных и других биологически активных веществ, имеет высокий химический потенциал и может рассматриваться в качестве сырьевого источника для производства широкого ассортимента продуктов функционального питания.

Целью данной работы является разработка технологии получения биологически активной добавки (БАД) с синбиотическими свойствами путем гетерофазного культивирования бифидобактерий в среде с твердой фазой, кедровым шротом.

Материалы и методы

Объектами исследований служил кедровый шрот – белково-углеводный остаток, полученный при извлечении кедрового масла из семян сосны сибирской (кедровых орехов) экстракцией этиловым спиртом в электромагнитном поле сверх высоких частот (ЭМП СВЧ) ТУ 9146-032-02069473-2002, штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum B379M, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика, активизированный биотехнологическим методом, разработанным в ВСГУТУ [6].

О жизнеспособности бифидобактерий судили по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве клеточных суспензий из соответствующих разведений на среду ГМК [7].

Численность адгезированных клеток определяли после десорбции частиц шрота как разницу между общим числом клеток и числом клеток в культуральной жидкости. Десорбцию клеток проводили методом трипсинизации, добавляя к гетерофазной культуре трипсин 200 ед./мл культуральной жидкости, с последующей выдержкой в течение 15 мин при температуре 37⁰С.

Устойчивость бифидобактерий определяли после замораживания и лиофильной сушки и длительного хранения клеточных суспензий с последующим подсчетом числа КОЕ.

Все опыты проводили в 3-кратной повторности. Полученные данные обработаны с ис-пользованием пакета статистических программ Excel с использованием критерия Манна - Уитни. Обсуждаются статистически достоверные различия при р<0,05

Результаты и обсуждение

При создании БАД в последние годы отдается предпочтение использованию натурального сырья. Одним из интересных материалов для иммобилизации клеток бифидобактерий является кедровый шрот, потенциальные возможности которого раскрыты не полностью и могут быть расширены при создании современных биологически активных добавок.

Ранее при исследовании химического состава кедрового шрота, полученного методом СВЧ-экстракцией этиловым спиртом, установлено, что он характеризуется высокой пищевой и биологической ценностью [8].

Кроме того, биологическая обработка шрота позволит повысить усвояемость белков, подвергнутых воздействию денатурирующих факторов, и минеральных веществ.

Для получения субстрата кедровый шрот увлажняли двумя способами: молоком и водой. Одним из условий развития микроорганизмов является наличие в среде свободной влаги. Поэтому было исследовано влияние степени увлажнения кедрового шрота на динамику кислотообразования и рост бифидобактерий.

Увлажнение кедрового шрота осуществляли двумя способами: обезжиренным молоком и водой. После достижения определенной влажности в шрот вносили 5% закваски бифидобактерий. Результаты исследований представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Влияние степени увлажнения кедрового шрота обезжиренным молоком на динамику кислотообразования:

Данные, представленные на рисунке 1, показывают, что с увеличением степени увлажнения повышается кислотообразующая способность. Интересен тот факт, что такая же динамика кислотообразования наблюдается и при увлажнении шрота водой. Это свидетельствует о том, что кедровый шрот является хорошей питательной средой для развития бифидобактерий и без молочной основы.

Бифидобактерии начинают развиваться в первые часы культивирования и через 6-8 ч количество клеток составляет 10¹⁰КОЕ в 1 г и различается в образцах, в зависимости от влажности, только титром бифидобактерий (рис. 2). С учетом дальнейшего гранулирования ферментированной БАД оптимальным является увлажнение шрота до массовой доли влаги 40%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что шрот кедрового ореха обладает бифидогенными свойствами и стимулирует рост бифидобактерий. В наших исследованиях факт адгезии бифидобактерий на твердых носителях кедрового шрота подтверждается высокой популяцией клеток бифидобактерий – 10¹⁰КОЕ/г в ферментированном продукте (см. рис. 2).

Рисунок 2 - Развитие бифидобактерий в процессе ферментации кедрового шрота

Таким образом, методом увлажнения кедрового шрота водой создана гипоаллергенная питательная среда, не содержащая лактозы и белков молока и обеспечивающая активный рост бифидобактерий.

В настоящее время сублимационная сушка является наиболее прогрессивным методом обезвоживания, который обеспечивает максимальное сохранение и наилучшую восстанавливаемость при гидратации высушенных продуктов. Кроме того, сублимированные продукты в соответствующей упаковке можно сохранить длительное время без существенных изменений их качества (на рис. ниже: морозилка и субл. сушилка - ред.).

В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали возможность сохранения качества ферментированного кедрового шрота в процессе длительного хранения

Температурный режим сушки выбирали с учетом термоустойчивости бифидобактерий. Начальная температура сушки замороженного ферментированного шрота составляла минус 18⁰С, досушивание проводили при 40–45⁰С. Продолжительность сушки контролировали по остаточной влажности (не более 5%). Сухой ферментированный шрот оценивали по следующим показателям: остаточная влажность, растворимость, количество жизнеспособных клеток бифидобактерий.

Высушиванию подвергали два варианта ферментированного шрота: с защитной средой и без нее. Установлено, что более высокая выживаемость бифидобактерий (90%) наблюдается при использовании защитной среды. Без защитной среды также сохраняется высокая выживаемость клеток, составляя 86%. Поэтому предложен более экономичный способ подготовки ферментированного шрота без защитной среды.

Как показали исследования, иммобилизация бифидобактерий, высокое содержание углеводов и белков, которые являются естественными криопротекторами, полностью защищают бифидобактерии от необратимых изменений в процессе замораживания и высушивания, и, вероятно, этим можно объяснить высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий в сухом ферментированном шроте.

Выживаемость бифидобактерий зависит от количества оставшейся внутриклеточной воды и равномерности обезвоживания. А это, в свою очередь, находится в прямой зависимости от продолжительности высушивания. Установлено, что оптимальные значения остаточной влажности 5% и количество клеток бифидобактерий (8-9)x10⁹ КОЕ в 1 г наблюдались через 5-6 ч сушки. Качественная характеристика биологически активной добавки представлена в таблице.

Таблица 1. Качественная характеристика БАД

Показатель	БАД при увлажнении шрота молоком	БАД при увлажнении шрота водой
Внешний вид	сухие пористые гранулы размером 10-20 мм	сухие пористые гранулы размером 10-20 мм
Вкус и запах	чистый, кисломолочный с выраженным привкусом кедрового ореха	чистый, с привкусом кедрового ореха
Цвет	кремовый	кремовый
Массовая доля влаги, %	4 ± 0,6	4 ± 0,5
Гидрофильность, %	80 ± 1	82 ± 2
Количество клеток бифидобактерий, КОЕ/г, не менее	(9-10)x109	(8-9)x109
Бактерии группы кишечных палочек в 2,0 г	отсутствуют
E. coli в 5,0 г	отсутствуют
S. aureus в 2,0 г	отсутствуют
Плесени в 10 г	отсутствуют
Дрожжи в 10 г	отсутствуют

Как следует из данных таблицы, увлажнение молоком и последующая ферментация повышают органолептические свойства готового продукта. Высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий придает БАД дополнительные свойства – пробиотика, регулирующего состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.

На основании проведенных исследований создана комплексная БАД – «синбиотик», включающая пробиотик - бифидобактерии и пребиотические вещества - пищевые волокна, полисахариды и олигосахариды, а также микронутриенты, содержащиеся в кедровом шроте.

Известно, что действие синбиотиков основано на синергизме комбинаций пробиотиков и пребиотиков, за счет которого наиболее эффективно не только имплантируются вводимые микроорганизмы (пробиотики) в желудочно-кишечный тракт хозяина, но и стимулируется его собственная микрофлора.

Известно, что повреждение клеток и инактивация части микробной популяции происходит не только во время обезвоживания, но и при хранении сухих продуктов.

В связи с этим проведена оценка сухого ферментированного шрота в процессе хранения по таким показателям, как количество жизнеспособных клеток и влажность.

Анализу был подвергнут сухой ферментированный шрот, заложенный на хранение в течение 12 мес при температуре 4-6⁰С. Одним из важных показателей резистентности клеток при хранении является их количество или выживаемость. Данный показатель зависит от остаточной влажности и условий хранения продукта. Изменение количества клеток бифидобактерий в процессе хранения показано на рисунке 3.

Рисунок 3 - Выживаемость бифидобактерий при хранении БАД

Анализ полученных данных показал, что показатель выживаемости коррелирует со значениями массовой доли влаги сухого ферментированного шрота. Коэффициент корреляции составляет 0,95. Функциональная зависимость рассматриваемых величин имеет следующее математическое выражение:

y = (-0,029x² – 0,115x + 7,27)*10¹⁰,

где y – выживаемость клеток бифидобактерий, %; х – влажность препарата, %.

Полученные данные свидетельствуют о том, что по истечении 6 мес. хранения количество клеток в концентрате уменьшилось на 9,8%. При дальнейшем хранении отмечалось снижение количества клеток и через 12 мес. хранения показатель выживаемости составил 80,4% (рис. 3).

Однако абсолютное значение жизнеспособных клеток бифидобактерий осталось на высоком уровне – 7x10⁹ КОЕ в сухом ферментированном шроте, полученном при увлажнении молоком, и 5x10⁹ КОЕ - при увлажнении водой. Через 12 мес. эти значения снизились до 3x10⁹ и 2x10⁹ КОЕ соответственно (рис. 4).

Высокая выживаемость клеток бифидобактерий в процессе технологической обработки и при хранении обусловлена иммобилизацией бифидобактерий, которые при культивировании в кедровом шроте адгезируются на поверхности пищевых волокон и формируют структурированное микробное сообщество, что снижает их чувствительность к экстремальным условиям роста. Известно, что адгезия на твердых поверхностях является универсальной реакцией, повышающей защищенность микроорганизмов при неблагоприятных условиях, например в желудочно-кишечном тракте, они быстро адаптируются и возобновляют активный метаболизм [9].

Таким образом, продемонстрирована возможность гетерофазного культивирования бифидобактерий на кедровом шроте. Установлено, что иммобилизация бифидобактерий на кедровом шроте способствует повышению стрессоустойчивости бифидобактерий при технологической обработке и сохраняет в жизнеспособном состоянии клетки при длительном хранении.

Рисунок 4 - Изменение количества клеток бифидобактерий в процессе хранения

Полученные результаты согласуются с известной способностью бифидобактерий закрепляться и образовывать микроколонии на поверхности частиц пищи при их прохождении через желудочно-кишечный тракт, что облегчает бактериям потребление питательных веществ [10].

Связывание бифидобактерий с носителем благодаря специфическим адгезинам было показано на примере адгезии бифидобактерий на гранулированных частицах крахмала [11].

Выводы

В результате проведенных исследований сконструированы сухие формы иммобилизованных синбиотиков, содержащих в качестве пробиотика бифидобактерии, а пребиотика – кедровый шрот, который является уникальным природным источником биологически активных веществ.

Доказана высокая биохимическая активность бифидобактерий при ферментации кедрового шрота, что свидетельствует о его пребиотических свойствах.

Выбраны оптимальные технологические параметры получения БАД, обеспечивающие высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий в готовом продукте.

Установлена высокая выживаемость иммобилизованных на кедровом шроте бифидобактерий при лиофильной сушке ферментированного шрота и в процессе длительного хранения.

Создание и внедрение в повседневную жизнь разработанных синбиотиков открывают широкие перспективы для обеспечения специального контингента, работающего в экстремальных условиях функциональными продуктами: спортсменов, военнослужащих, а также людей, находящихся в длительных экспедициях на Крайнем Севере.

Источник: И.С. Хамагаева, А.Г. Хантургаев, О.Г. Богданова. Создание иммобилизованной формы сухого синбиотика. // Вестник ВСГУТУ. 2019. № 3 (74) – С.11-18.

Библиография

1. Weichselbaum E. Probiotics and health: a review of the evidence // Nutr. Bull. – 2009. –Vol. 34. – P. 340-373.
2. Grosso C.R.F., Favaro-Trindade C.S. Stability of free and immobilized Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in acidified milk and of immobilized B. lactis in yoghurt // Braz. J. Microbiol. – 2004. – Vol. 35. – P. 151-156.
3. Aslim B., Alp G. The effect of immobilization on some probiotic properties of Streptococcus thermophilus strains // Ann. Microbiol. – 2009. – Vol. 59, N 1. – P. 127-132.
4. Иванова В.В. Комплексный подход к восстановлению микрофлоры. Современный взгляд на коррекцию дисбиозов / под ред. А.В. Молокеева. - Новосибирск: Изд-во «Вектор-БиАльгам», 2007. – 48 с.
5. Guergoletto K.B., Magnania M., San Martinb J. et al. Survival of Lactobacillus casei (LC-1) adhered to prebiotic vegetal fibers // Innov. Food Sci. Emerg. Technol. – 2010. – Vol. 11, N 2. – P. 415-421.
6. Хамагаева И.С. Научные основы биотехнологии кисломолочных продуктов для детского и диетического питания: монография. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005. – 279 с.
7. Khamagaeva I.S., Tsybikova A.H., Zambalova N.A. et al. Producing of bacterial concentrates with high cholesterol lowering activity // Foods and Raw Materials, Kemerovo Institute of Food Science and Technology. - 2016. - Vol. 4, N 1. - Р. 27-35.
8. Khanturgaev A.G., Zambalova N.A., Boiarineva I.V. et al. Creating a biologically active supplement with synbiotic properties // Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. – India. - 2018. - Vol. 10 (7). - Р. 1683-1687.
9. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. - Т. 40, № 4. – С. 387-397.
10. MacFarlane S., MacFarlane G.T. Composition and Metabolic Activities of Bacterial Biofilms Сolonizing Food Residues in the Human Gut // J. Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – Vol. 72, N 9. – P. 6204-6211.
11. Crittenden R., Laitila A., Forssell P. et al. Adhesion of Bifidobacteria to Granular Starch and Its Implications in Probiotic Technologies // J. Appl. Environ. Microbiol. – 2001. – Vol. 67, N 8. – P. 3469-3475.

Будьте здоровы!