Ученые устранили антагонистические отношения между бактериями

УЧЕНЫЕ УСТРАНИЛИ АНТАГОНИЗМ НЕСКОЛЬКИХ КИШЕЧНЫХ БАКТЕРИЙ

Инжиниринг нескольких штаммов бактерий устраняет антагонистические взаимодействия и приводит к более сбалансированным консорциумам

Бактерии, как и люди, имеют сложные отношения: они могут быть дружелюбными, нейтральными или антагонистическими по отношению друг к другу, и эти отношения могут меняться в зависимости от ситуаций, в которых они оказываются. В последние годы возрос интерес к выявлению видов бактерий, присутствующих в микробиоме человека, которые способствуют как здоровью, так и болезням, поэтому предпринимаются попытки понять, как взаимодействуют эти различные виды бактерий. Эти знания могут позволить создать бактериальную терапию и инструменты, которые можно использовать для улучшения здоровья людей, производства ценных веществ или восстановления микробных экосистем. Однако выявление взаимосвязей, возникающих одновременно между несколькими видами в консорциуме бактерий в сложной среде, такой как кишечник человека, оказалось серьезной проблемой.

Теперь наука приблизилась к этой цели, благодаря усилиям команды исследователей из Института биологической инженерии Wyss, Гарвардской Медицинской школы (HMS) и Женской больницы Бригхэма (BWH). В новой статье, опубликованной в mSystems, они сообщают, что им удалось успешно манипулировать четырьмя различными штаммами бактерий в консорциуме, так что их взаимодействия стали полезными, а не антагонистическими, и их соответствующие численности стали более сбалансированными в средах различной сложности, включая кишечник живых мышей.

«Всякий раз, когда есть несколько видов, сосуществующих в одном и том же пространстве и использующих одни и те же ресурсы, они, вероятно, будут антагонистичны друг к другу, потому что они все пытаются выжить", - рассказывает первый автор исследования Марика Зисак (Ph.D., Marika Ziesack), научный сотрудник Института Wyss и HMS. "Подталкивая бактерии к более взаимовыгодному взаимодействию, мы в конечном итоге можем сделать весь консорциум видов более «здоровым» и устойчивым, и, надеюсь, однажды сможем разработать синтетические консорциумы, оптимально настроенные для различных применений в области кишечного здоровья человека и производстве биопродукции».

Чтобы заставить бактерии хорошо взаимодействовали друг с другом, исследователи модифицировали их геномы так, чтобы каждый вид не мог производить три аминокислоты, необходимые для его функционирования, и перепроизводил четвертую аминокислоту (метионин,  гистидин, триптофан, аргинин, на рисунке соотв. - Meth., His., Trp., Arg. – ред.). Таким образом, каждый вид мог процветать только в том случае, если другие три вида присутствовали в сообществе и производили аминокислоты, которых ему не хватало, что побудило бактерии принять правило «живи и давай жить другим».

Такой перекрестный обмен метаболитами между видами является обычным явлением в природе - люди не могут производить девять из 20 аминокислот, необходимых для поддержания нашего организма, поэтому мы должны потреблять разнообразную диету, чтобы получить эти необходимые строительные блоки. Многие бактерии также зависят от других видов в отношении соединений, которые они не способны производить, и считается, что такая совместная зависимость помогает сделать бактериальные консорциумы более разнообразными, что, в свою очередь, помогает им противостоять доминированию какого-либо одного вида или потере важного члена, который может привести к краху консорциума.

Все четыре вида бактерий, выбранные командой для создания своего искусственного консорциума, обнаружены в кишечнике млекопитающих: Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides fragilis. Каждый штамм был генетически модифицирован для перепроизводства метионина, гистидина, триптофана или аргинина, и его способность продуцировать три другие аминокислоты была исключена (методом нокдауна – ред.).

Прим. ред.: Нокдаун гена  - методика обратной генетики, позволяющая снизить экспрессию одного или нескольких генов при помощи изменения соответствующей последовательности нуклеотидов, либо при помощи короткого олигонуклеотида, комплементарного соответствующей молекуле мРНК.

Чтобы оценить, удалось ли каждому штамму «спасти» другие штаммы, в которых был дефицит аминокислоты, которую он перепроизводил, исследователи последовательно изолировали соединения, секретируемые каждым штаммом, и выращивали другие штаммы в присутствии этих соединений. По сравнению с контрольной группой, в которую были добавлены соединения из непроизводящего штамма, каждый из перепроизводителей был способен в разной степени спасать другие штаммы в зависимости от того, сколько данной аминокислоты необходимо выращивать каждому штамму.

Рисунок 1. Инженерные требования к перепроизводству и росту метаболитов. (а) Консорциум-дизайн. Каждый штамм является ауксотрофным по трем аминокислотам и перепроизводит одну. (b) Количественная оценка потребности в перепроизводстве и росте (EC₅₀). Перепроизводство в каждом сконструированном штамме измеряли с помощью LC-MS с соответствующим аминокислотным стандартом. Потребность в росте метаболита EC₅₀ измеряли в среде с полным добавлением двух аминокислот и различных количеств друг друга. (c) Возможности перекрестного кормления каждого штамма оценивали путем тестирования для спасения роста ауксотрофов в супернатантах, полученных от сверхпроизводителей. (d) Анализ роста ауксотрофных штаммов. Штаммы ауксотрофов выращивали в среде без добавления и с добавлением всех перекрестно питающихся аминокислот (левая сторона графиков, - / +), что служило ориентиром. Каждый штамм также выращивали в свежей среде без добавок и супернатанта сконструированных сверхпроизводителей или аналога WT (WT - дикий тип – ред.) в соотношении 1:1. Показаны три биологических копии с медианами, обозначенными горизонтальными линиями (правая сторона графика, по 3 штамма из St, Bt, Bf, Ec – ред.).

Чтобы увидеть, как четыре модифицированных штамма взаимодействовали вместе как консорциум, исследователи культивировали их все вместе и обнаружили, что они росли примерно в тех же пропорциях, но в меньшем общем количестве, чем неинженерные версии тех же штаммов, выращенных вместе, показывая, что все дефицитные штаммы были в состоянии получить достаточно аминокислот от других, чтобы выжить и размножаться. Затем команда повторила этот эксперимент несколько раз, каждый раз уменьшая начальную популяцию одного штамма в десять раз, чтобы увидеть, как консорциум будет реагировать на потерю одного члена. Они обнаружили, что в консорциумах неинженерных бактерий указанный штамм не восстанавливался, в то время как в консорциумах инженерных бактерий S. Typhimurium и B. thetaiotaomicron он восстанавливал свои нормальные уровни. Ни E.coli, ни B. fragilis не смогли восстановиться после нокдауна, и потеря B. fragilis привела к тому, что весь консорциум вырос до половины своего нормального размера.

Рисунок 2. Инженерный консорциум демонстрирует добавленные полезные взаимодействия и снижение антагонистических взаимодействий. (a и b) Траектории роста в анаэробных периодических сокультурах для WT (a) и инженерных (b) консорциумов. Все штаммы инокулировали в равных соотношениях и выращивали анаэробно при 37°С в течение 27 часов в синтетической питательной минимальной среде М9 (источником энергии и углерода является глюкоза, а азота — хлорид аммония), без добавления какой-либо из перекрестно подаваемых аминокислот и с 0,5% крахмала и 0,5 % глюкозы в качестве источников углерода.  Инженерный консорциум растет на порядок ниже плотности, чем аналог WT. (c и d) Траектории роста консорциумов с уменьшением каждого инокулята штамма в 10 раз по сравнению с WT (c) и инженерными (d) консорциумами. Эти объединенные данные были использованы для определения сетевого взаимодействия с использованием алгоритма MDSINE. (e и f) Предполагаемые сети взаимодействия для консорциумов WT (e) и инженерных (f). Консорциумы WT показывают в основном отрицательные взаимодействия с крупными байесовскими факторами. Отрицательные взаимодействия инженерных консорциумов уменьшили байесовские факторы, а позитивные взаимодействия с сильными байесовскими факторами произошли между B. fragilis и E.coli и S. Typhimurium.

Эксперименты по нокдауну также выявили взаимосвязи между различными штаммами как в неинженерных, так и инженерных консорциумах. В неинженерном консорциуме отсутствие определенных штаммов привело к чрезмерному росту других, что указывает на то, что эти штаммы естественным образом конкурируют друг с другом. Однако в инженерном консорциуме нокдаун одного вида существенно не изменил пропорции остальных видов, и фактически нокдаун B. fragilis оказал негативное влияние как на S. Typhimurium, так и на E. coli, что указывает на то, что присутствие B. fragilis стало полезным для этих видов.

Исследователи также обнаружили, что консорциумы инженерных бактерий демонстрировали большую равномерность - примерно одинаковое количество каждого вида - чем неинженерные консорциумы как in vitro, так и когда консорциумы были инокулированы в кишечник мышей, свободных от бактерий. Эта тенденция также присутствовала, когда бактерии выращивались в средах с низким содержанием аминокислот, что указывает на то, что сконструированные бактерии были способны успешно кормить друг друга аминокислотами для создания стабильного сообщества.

Рисунок 4. Проектирование консорциума повышает равномерность популяции в кишечнике млекопитающих в зависимости от рациона питания. Четыре группы безмикробных мышей (n = 5, за исключением второй группы слева, то есть n = 4) получали либо низкобелковую диету, либо стандартную диету и инокулировали либо инженерным, либо бактериальным консорциумом WT. Образцы фекалий через 10 дней после инокуляции анализировали с помощью штамм-специфичной qPCR для оценки концентраций каждого вида консорциума. Популяционная равномерность консорциумов была рассчитана. Тест Манна-Уитни показал значительно увеличенную популяцию инженерных консорциумов у мышей, которым давали низкобелковую диету, по сравнению с консорциумами в трех других группах (значения P, 0,024, 0,032 и 0,015). Обозначено: желтый, E. coli; фиолетовый, S. Typhimurium; зеленый, B. thetaiotaomicron; синий, B. fragilis.

Рисунок 3. Инженерные консорциумы демонстрируют повышенную равномерность популяции in vitro. WT и инженерные консорциумы выращивали анаэробно в периодической сокультуре в течение 24 ч, анаэробно в модифицированной среде М9, с добавлением и без добавления 1 mM  перекрестно подаваемых аминокислот и 0,2% крахмала и 0,5% глюкозы в качестве источников углерода. (Верхняя панель) Средний состав популяций через 24 часа. (Нижняя панель) Количественная равномерность Pielou. Инженерный консорциум имеет более высокую равномерность популяций с добавлением аминокислот или без него, чем консорциум WT.

«Как и ожидалось в сложной сети видов, не все бактериальные штаммы взаимодействовали друг с другом одинаково; инженерные E. coli и S. Typhimurium, по-видимому,  «поглощали» виды Bacteroides, не предоставляя столько же преимуществ другим членам, поэтому будущие исследования могут сосредоточиться на оптимизации того, насколько каждый вид перепроизводит свою данную аминокислоту и потребляет другие, чтобы улучшить общую работоспособность консорциума без ущерба для равномерности видов», - сказала соавтор исследования Памела Сильвер (Ph.D., Pamela A. Silver), профессор биохимии и системной биологии Гарвардской Медицинской школы.

Другие потенциальные направления для этого исследования включают введение каскадов взаимодействий так, чтобы каждый бактериальный штамм принимал соединение от другого штамма, модифицировал его и "передавал" другому штамму для дальнейшей обработки, чтобы создать более эффективную сборочную линию биопродукции для создания химических веществ, представляющих фармацевтический или промышленный интерес.

«Мы в конечном счете заинтересованы в рациональном проектировании консорциумов полезных бактерий, которые могут функционировать в сложных средах, включая кишечник человека, для медицинских целей. Введение "дружественных" взаимодействий между бактериями является важным шагом на пути к тому, чтобы иметь возможность контролировать эти консорциумы, чтобы они не проявляли чрезмерного роста или потери видов и могли выполнять свои предполагаемые функции», - сказал соавтор исследования Георг Гербер, (Georg K. Gerber), доктор медицинских наук, который также является руководителем отдела вычислительной патологии в Женской больнице Бригхэма (BWH) и доцентом в HMS, а также содиректором Массачусетского хост-микробиомного центра в Бригаме.

«Возможность конвертировать один тип бактериального консорциума в другое стабильное сообщество, является сегодня одной из основных проблем в микробиомной медицине, и эта работа Пэм Сильвер и ее сотрудников представляет собой важный первый шаг к разработке способов создания этого переключателя контролируемым путем», - сказал учредительный директор Института Wyss Дональд Ингбер (Donald Ingber), доктор медицинских наук, который также является профессором по биологии сосудов в HMS и программе по биологии сосудов в Бостонской детской больнице, а также профессором биоинженерии в Гарвардской школе инженерии и прикладных наук Джона А. Полсона SEAS.

Источник: Материалы предоставлены Институтом биологической инженерии Wyss Гарвардского университета

Статья в журнале: Pamela A. Silver, Marika Ziesack, Georg K. Gerber, et al. Engineered Interspecies Amino Acid Cross-Feeding Increases Population Evenness in a Synthetic Bacterial Consortium. mSystems, 2019; 4 (4)