Главная \ 6. Микробная биотехнология \ Микробиологический синтез витамина В12

Микробиологический синтез витамина В12

СИНТЕЗ ВИТАМИНА В12 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ PROPIONIBACTERIUM

микробиологический синтез витамина В12

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Получение витамина В12


Из всех витаминов, методом микробиологического синтеза производят в основном витамин В12 и его коферментную форму. Продуцентами в этом процессе служат пропионовокислые бактерии. Для получения кормовых концентратов, содержащих витамин В12, на отходах бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) применяют комплекс метанообразующих бактерий.


Физиология прокариот (бактерий) - центральное направление микробиологии, формирующее целостное представление о жизнедеятельности организма. Изучение физиолого-биохимических свойств практически значимых микроорганизмов актуально в плане решения общечеловеческой задачи - улучшения качества жизни. Пропионовокислые бактерии (ПКБ) имеют разнообразное практическое применение. Достаточно напомнить, что Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii - основная и незаменимая культура, используемая в мировом производстве «твёрдых» сыров, а в России - и в производстве витамина B12, однако области применения ПКБ этим не ограничены. Поэтому биология ПКБ находится под постоянным «прицелом» специалистов разных профилей. Регулярно проводится международный тематический симпозиум "Propionibacteria". В различных исследованиях значительное внимание уделено роли кобальта и кобаламина (истинного витамина В12) в биосинтезе корриноидов - соединений группы витамина В12. Также сегодня весьма актуально и изучение значения ионов кобальта и корриноидов для жизнедеятельности самих пропионовокислых бактерий...

Молекулярная структура кобаламинов (витамина В12)

Витамин B12 - первое органометаллическое соединение, выделенное из биологической системы. Из неполимерных органических соединений имеет наиболее сложное строение, изображенное на рисунке. Молекула состоит из двух почти планарных циклических структур и линейного участка. Металл Со+3 связан с макроциклом, сильно напоминающим порфириновое ядро гема. Это тетрапиррольная структура, но имеющая ту особенность, что вместо метановых мостиков, связывающих 4 пиррольных кольца, кольца А и D непосредственно связаны. Вторая кольцевая структура - азотистое основание - 5,6-диметилбензимидазол (5,6 ДМБ}. 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой системой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ Na-гликозидной связью.Структура витамина В12 не только очень сложная, но содержит некоторые необычные части: 1) корриновая структура ранее не была известна в органической химии (до открытия витамина В12 в 1948 г. независимо Риксом и Смитом); 2) Na-гликозидная связь встречается в природе очень редко и обнаружена лишь в нескольких соединениях, содержащих рибозо-3-фосфат; 3) 5,6 ДМБ тоже принадлежит к уникальным соединениям и встречается в природе только в составе кобаламинов.Атом кобальта имеет 6 координационных связей; 4 из них заняты пиррольными кольцами. Одна - N-3-5,6 ДМБ и последняя - верхним лигандом (у), природа которого может варьировать. В коммерческом витамине В12 (цианкобаламине) лиганд-CN-группа (артефакт процесса выделения). In vivo чаще всего встречаются дезоксиаденозильная группа (Co-B12-I), метильная группа (метилкобаламии, СН3-B12-CoB-II) или оксогруппа (оксокобаламин). Кроме этих соединений, известных как кобаламины, есть другие корриноидные соединения с иным нуклеотид-аным основанием. Нижний лиганд (х) -5,6 ДМБ может быть заменен на аденин {псевдовитамин В12), на гуанин (фактор С), 2-метиладенин (фактор А) и др. Они могут проявлять активность для некоторых микроорганизмов, но неактивны для людей. Из всех витамин В12-подобных соединений только Со-В12-I и Со-В12-II (СНз12) активны на клеточном уровне и как кофакторы вовлекаются в катализ двух типов реакций. Аденозил B12 используется в реакциях, в которых имеет место перестройка углерод-углеродных связей. Метил В12 вовлекается в реакциях переноса метильных групп, например в синтезе метионина из гомоцистеина (Воробьева, 1982).

структура кобаламинов

Продуценты витамина B12.

В природе витамин В12 и родственные корриноидные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В12 в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В12 представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0—8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii M.- 82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. В семействе Propionibacteriaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витаминами В12 в клетках. Это, прежде всего, Eubacterium limosum (Batyribacterium retteerii). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин В12 в значительных количествах синтезирует Nocardia rugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В12. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. purpureae, M. echinospora, M. halophitica, M. fusca, M. chalceae.

Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечено ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена. Корриноиды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. У Clostridium tetanomorphum и Cl. Sticklandii аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образуют витамин В12 ацетогенные клостридии Cl. thermoaceticum, Cl. formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО2. Известны активные продуценты витамина B12 у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans MB-2436 - мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Корриноиды синтезируют Rhodopseudomonas, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphericus , Rh. Capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Chromatium vinosum и ряд других видов. Наряду с витамином В12 они образуют бескобальтовые корриноиды, роль которых для продуцентов не установлена. Значительные количества витамина В12 образует цианобактерия Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus. Продуценты витамина B12 культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья.

Получение и применение витамина В12

Мировая продукция витамина В12 составляет 9 - 11 тыс. кг в год; из них 6,5 тыс кг используют на медицинские цели, а остальное - для животноводства. Производство витамина В12 основано главным образом на культивировании пропионовокислых бактерий (Великобритании, Венгрии), мезофильных и термофильных меганогенных бактерий (Венгрия), а также актиномицетов и родственных форм (Италия).

В СНГ в качестве продуцента витамина В12 используют пропионовокислые бактерии P. shermanii. Для получения витамина B12 бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, который непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч. в среду вносят предшественник - 5,6-ДМБ (5,6-диметилбензимидазол). Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В12 (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин B12 сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 - 5,0 при 85 - 90°С в течение 60 мин. с добавлением в качестве стабилизатора 0,25 % NaNO2.

Водный раствор витамина В12 охлаждают, доводят рН до 6,8-7,0 50%-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Al2(SO4)3* 18Н2О и безводный FeCl3 для коагуляции белков и фильтруют через фильтр - пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с Аl2О3, с окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают 24 - 48 ч. при 3 - 4°С. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над Р2О5. Для предотвращения разложения В12 все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом.

цианокобаламин

Промышленность выпускает различные формы лечебных препаратов кобаламинов: ампулы со стерильным раствором CN – B12, приготовленного на 0,9 % растворе NaCl, таблетки CN - В12 и в смеси с фолиевой кислотой, таблетки, (муковита), содержащие CN - B12 и мукопротеид. Лечебные препараты в ампулах: камполон, антианемин и гепавит содержат водный экстракт печени крупного рогатого скота. Перспективны исследования по мутагенезу пропионовокислых бактерий как один из способов повышения продуктивности штамма, а также проверки и внедрения в производственные условия других продуцентов, растущих на дешевом непищевом сырье.


num-2_color

Подборка информации по технологиям получения витамина В12 из Propionibacterium

цианокобаламин

Общая технология получения витамина В12 из пропионовокислых бактерий по сути везде одна и та же: наращивание микробной массы, концентрирование клеток, выделение целевого продукта (здесь → экстракция эндометаболита), его очистка и кристаллизация. Однако практические подходы к культивированию ПКБ, очистке витамина и т.п. могут отличаться. Приведем еще несколько примеров из литературы:

1) Описание получения витамина В12 из книги М.Е. Бекера "Введение в биотехнологию" - 1974 г. (перевод 1978 г)

Прим.: Для синтеза молекулы витамина В12 в питательной среде должен быть кобальт, а также 5,6-диметилбензимидазол, которые некоторые микроорганизмы синтезируют сами.

Для получения медицинского препарата витамина В12 широко используют P. freudenreichii или P. shermanii, их выращивают по методу глубинной ферментации, на среде, содержащей 1% гидролизата казеина, 1% пептона, 1,25% лактата натрия, 0,3% дрожжевого экстракта, соли кобальта и 5,6-диметилбензимидазол. В анаэробных условиях ферментация культуры Propionibacterium длится 72 часа при температуре 28-30 °C.

За это время в культуральной жидкости накапливается 3000 – 10000 мкг/л витамина В12 (см. рис.).

Образование биомассы культуры Propionibacterium shermanii

Рис.1. Образование биомассы культуры Propionibacterium shermanii: X –биомасса (г/л); P – витамин В12 (мг/л), t – продолжительность ферментации (ч)

Биосинтез витамина В12 может идти и при аэробных условиях, используя актиномицеты, например Actinomyces olivaceus. В этом случае среду готовят из кукурузного экстракта или барды спиртовой промышленности, rидроля, крахмала, глюкозы, сульфата аммония и солей кобальта. Образование активной формы витамина и в этом случае стимулируют добавки 5,6-диметилбензимидазола.

Для получения кристаллов витамина В12 культуральную жидкость центрифугируют и выделяют содержащую витамин клеточную массу. Затем ее гидролизуют и очищают полученный раствор витамина. Очистку витамина В12 из водных растворов можно провести, обрабатывая раствор:

  1. бензиловым спиртом, добавляя к экстракту хлороформ и экстрагируя витамин водой;
  2. гидроокисью цинка;
  3. смесью крезола и тетрахлоруглерода (1 : 1);
  4. хроматографически, пропуская через колонку с Аl2O3 и элюируя витамин 50% смесью вода-ацетон.

Очищенный раствор витамина кристаллизуют. Получают темно-фиолетовые кристаллы витамина В12 с 75-76%-ной степенью чистоты. Выход витамина составляет 67-70%.

Себестоимость витамина, полученного в процессе стерильной ферментации, сравнительно высока, поэтому для нужд животноводства его получают по более простому методу метанового брожения, используя в качестве сырья отходы пищевой промышленности.

2) Описание получения витамина В12 из курса лекций по технологии микробного синтеза (Минск : БГТУ, 2014)

Витамин В12 для медицинских целей можно получать культивированием бактерий Propionibacterium shermanii периодическим методом при температуре 28…30°С в анаэробных условиях с соблюдением правил асептики на питательной среде, содержащей глюкозу (40 г/л), кукурузный экстракт (40 г/л), сульфат аммония (2 г/л) и хлорид кобальта (0,005 г/л); рН среды 6,8–7,0. Ферментация протекает в две фазы. В первой фазе продолжительностью 65–70 ч бактерии интенсивно размножаются с накоплением пропионовой и уксусной кислот, подлежащих нейтрализации, и предшественника витамина В12 – фактора В (без нижнего лиганда). На долю фактора В приходится более 80% от всех синтезированных корриноидов (остальное – цианкобаламин (8–10%), псевдовитамин В12 и фактор А).

Вторая фаза ферментации начинается с момента внесения в среду 5,6-ДМБ (5,6-диметилбензимидазол) в количестве 10–20 г/м3, в результате чего происходит трансформация неактивных аналогов в истинный витамин В12. Продолжительность второй фазы 24 ч. К концу процесса культуральная жидкость содержит около 30 мг/л витамина В12, накопленного в клетках бактерий.

Биомассу отделяют сепарацией и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5–5,0, при температуре 85…90°С в течение часа. После отделения остатка биомассы раствор охлаждают, доводят рН до 6,8–7,0 и осаждают белки коагуляцией в присутствии Al2(SO4)3 или FeCl3. Осадок отделяют фильтрованием, а раствор витамина очищают на ионообменной смоле СГ-1, с которой витамин В12 элюируют водным раствором аммиака. Элюат упаривают и дополнительно очищают на колонке с окисью алюминия (очистка кобаламинов от аналогов). Элюируют витамин В12 водным ацетоном и кристаллизуют из раствора при температуре 3…4°С в течение 24–48 ч. Кристаллы промывают ацетоном, затем диэтиловым эфиром и сушат под вакуумом.

3) Описание получения витамина В12 из учебно-методических пособий профильных ВУЗов

В настоящее время для получения витамина В12 используют следующие микроорганизмы P. freudenreichii ATCC 6207, P. shermanii ATCC 13673, P. shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1 стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирования и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезируют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную мелассу (10 - 100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10 - 100 мг/л), источники азота. В среду добавляют кукурузный экстракт (30 - 70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии культивируют при 30°С, поддерживая рН на уровне 6,5-7,0 путем введения (NH4)OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возможны некоторые вариации в культивировании. Витамин В12 сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:

  1. выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;
  2. выделение неочищенного продукта (80% чистоты), который можно использовать в животноводстве;
  3. дальнейшую очистку до уровня 91-98% (для медицинских целей).

Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80°-120° в течение 10-30 мин при рН 6,1-8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутствии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, Аl2О3, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом, или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом. При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0 - 8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii М-82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода - 216 мг/л.

Дополнительную информацию о 2-стадийном процессе получение витамина В12 на основе пропионовокислых бактерий, способных к самостоятельному синтезу аденозилкобаламина 5,6 ДМБ (коэнзима В12), где в качетсве источника азота применялся (NH4)2SO4 (сульфат аммония) см. по ссылке
***
4) Описание получения витамина В12 (с технологической схемой)
источник: Разговоров, П.Б.. Технология получения биологически активных веществ: учеб. пособие / ИГХТУ, 2010. - 72 с.

Технология получения витамина В12

Витамин В12 получают путем микробиологического синтеза из Propionobacterium, а также Pseudomonas и смешанных структурных бактерий. Основной метод включает использование Propionobacterium. Процесс ведут в реакторе объемом 1 м3 при коэффициенте заполнения 0,65-0,7. Технология получения В12 включает две стадии:

1) перемешивание в реакторе в течение 80-88 ч в анаэробных условиях до полной утилизации сахара, после чего полученную массу центрифугируют;

2) процесс обработки суспензии во втором аппарате, уже при доступе воздуха; расход воздуха составляет 2м3/ч (рис. 6.10). Для питательной среды используют глюкозу, до 10% солей железа, марганца, магния и кобальта (кон­центрация соли колеблется от 10 до 100 мг/л), сульфат аммония. 

Выход кристаллического витамина В12 составляет 40 мг/л.

  Технологическая схема получения витамина В12
********************************************************************

num-3_color

Стратегии биопроцессов для производства витамина B12 методом микробной ферментации и их применение на рынке

бактерии и сыр
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Прим. ред.: Как известно, цианокобаламин получают в промышленных масштабах путем бактериальной ферментации. В результате ферментации различных микроорганизмов образуется смесь метилкобаламина, гидроксокобаламина и аденозилкобаламина. Эти соединения превращаются в цианокобаламин при добавлении цианида калия в присутствии нитрита натрия и нагревании. Поскольку многочисленные виды Propionibacterium не вырабатывают экзотоксинов и эндотоксинов и получили статусы GRAS и QPS, они являются предпочтительными бактериальными продуцентами витамина B12.


Аннотация

Витамин B12 - широко используемое соединение в кормовой и пищевой промышленности, здравоохранении и медицине, которое может быть получено только путем ферментации из-за сложности его химического синтеза. По этой причине поиск лучших штаммов-продуцентов и оптимизация биопроцессов были в центре внимания промышленных производителей в течение последних нескольких десятилетий. В данном обзоре мы приводим исторический обзор исследований витамина B12 и основные биосинтетические характеристики двух семейств микроорганизмов, обычно используемых для его промышленного производства: нескольких штаммов Propionibacterium freudenreichii и штаммов, относящихся к Pseudomonas denitrificans. Далее приводится полный обзор современного состояния промышленного производства витамина B12, а также основных достижений и проблем, связанных с его совершенствованием, с особым акцентом на оптимизацию биопроцесса, направленную не только на увеличение производства, но и на его устойчивость. Кроме того, приводится полный список наиболее важных и значимых патентов для современных промышленных штаммов. Наконец, обсуждаются потенциальные возможности применения витамина B12 на различных рынках.

1. Исторический обзор

Витамин B12, также известный как кобаламин, является водорастворимой молекулой, необходимой для метаболизма многих организмов. Он имеет сложную структуру и сложный биосинтез, включающий более 30 этапов биотрансформации [1]. Этот биосинтетический путь присутствует только в некоторых бактериях и археях (млекопитающие, в т.ч. и человек, не способны синтезировать витамин B12).

Исследования витамина B12 начались в 1920-х годах в связи с заболеванием, впервые описанным в 1824 году, - пернициозной анемией. Основными симптомами этого заболевания были усталость, потеря веса, головные боли, а в тяжелых случаях - слабоумие, потеря памяти, мышечная слабость и периферическая нейропатия, которые без лечения могут привести к летальному исходу. В 1926 году Минот и Мерфи (Minot and Murphy) продемонстрировали, что пациенты с пернициозной анемией могут успешно излечиться от этого заболевания с помощью специальной диеты с большим количеством слегка прожаренного мяса печени и мышц [2]. Они предположили, что лечение было успешным благодаря неизвестному "внешнему фактору", присутствующему в печени животных. За это открытие они были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1934 году, хотя прошло более двух десятилетий, прежде чем так называемый "внешний фактор" был идентифицирован и выделен. Это произошло в 1948 году, когда две исследовательские группы из фармацевтических компаний (Folkers at Merck, Sharp & Dohme, and Smith at Glaxo) почти одновременно выделили из печени животных соединение кобальта, способное самостоятельно излечивать пернициозную анемию [3,4]. Год спустя это же соединение удалось выделить и из других источников, таких как молоко, говядина и несколько бактериальных культур. Это красное кристаллическое октаэдрическое соединение кобальта было названо витамином B12. Интересно, что спустя годы было обнаружено, что это соединение на самом деле является одной из многочисленных изоформ семейства кобаламинов (Cbl) - цианокобаламином (CNCbl), искусственной физиологически неактивной формой кобаламина, полученной в ходе промышленного процесса извлечения и выделения из печени. Кроме того, CNCbl был первой изоформой кобаламина, структура которой была раскрыта в 1955 году Дороти Мэри Кро́уфут-Хо́джкин [5].

В 1957 году той же группой была определена структура аденозилкобаламина (AdoCbl), одной из двух активных форм кобаламина [5]. Эти открытия привели к тому, что в 1960 году Ходжкин была удостоена Нобелевской премии по химии. Два года спустя была открыта еще одна физиологически активная изоформа витамина B12 - метилкобаламин (MetCbl). Было обнаружено, что и AdoCbl, и MetCbl выступают в качестве кофакторов в ряде ферментов, и в последующие годы было выделено и описано множество MetCbl- и AdoCbl-зависимых ферментов. Некоторые из них, такие как метионин-синтаза из Escherichia coli и L-метилмалонил-КоА-мутаза из Propionibacterium shermanii, были кристаллизованы [6,7], как и большинство молекул, отвечающих за транспорт витамина B12 у млекопитающих [8,9,10,11,12,13,14,15].

В 1973 году Вудворд (Woodward) и его коллеги описали полный химический синтез витамина B12 после длительного исследования, которое продолжалось более десяти лет [16]. Процесс был сложным, состоял из более чем 60 стадий, включая реакции защиты и депротекции, и давал очень низкий выход - менее 1% [16,17].

2. Структура производных кобаламина и их функции в качестве кофакторов ферментов

Витамин B12 - это общее название семейства соединений (кобаламинов или Cbl), имеющих одну и ту же общую структуру: тетрапиррольное корриновое кольцо с центральным атомом кобальта, связанным с четырьмя атомами азота. Этот каркас похож на другие простетические группы, такие как гем в гемоглобине или цитохром P450. Такая структура позволяет использовать окислительно-восстановительное состояние центрального атома металла, кобальта, что позволяет молекуле выполнять различные функции.

Как показано на рисунке 1, корриновое кольцо образовано четырьмя пиррольными единицами (C4H5N), соединенными с противоположных сторон метиленовой связью C-CH3, связью C-H с одной стороны и двумя пиррольными единицами, соединенными напрямую, без метинового мостика между субъединицами A и D, присутствующего в других известных порфиринах, таких как гемоглобин. Эта структура отличается от структуры других подобных молекул количеством и типом боковых цепей, степенью окисления и центральным атомом металла.

Схематическое изображение структуры, общей для всех изоформ кобаламина.

Рисунок 1. Схематическое изображение структуры, общей для всех изоформ кобаламина. Также показаны основные группы, которые обычно выступают в качестве верхнего лиганда. 5,6-DMBI: 5,6-диметилбензимидазол.

Помимо четырех атомов N пиррольных единиц, центральный ион Co связан с двумя другими лигандами. Нижний лиганд представляет собой основание 5,6-диметилбензимидазола (DMBI), связанное с центральным ионом Co через атом N7 в α-осевой конформации. DMBI также связан с одной из боковых цепей центральной корриновой структуры: его фосфатная группа присоединяется к аминопропанольной группе, которая связана с боковой цепью пропионовой кислоты пиррольного блока D корринового кольца.

Наконец, шестой лиганд связан с Co в β-осевом положении. Природа этой химической группы может быть различной, она выполняет различные физиологические и каталитические функции. Например, 5-деоксиаденозильная группа в этом положении образует аденозилкобаламин (AdoCbl), а метильная группа - изоформу метилкобаламина (MetCbl). Фактически, связь C-Co в AdoCbl была первой связью такого типа, описанной в биологической молекуле [18]. Хотя именно эти две изоформы проявляют физиологическую активность в качестве кофакторов у человека, существуют и другие формы, такие как гидроксокобаламин (OHCbl) или цианокобаламин (CNCbl), а также менее распространенные верхние лиганды, такие как нитритокобаламин (NitCbl), сульфитокобаламин (SulCbl) или глутатионилкобаламин (GlutCbl) [19].

С одной стороны, MetCbl является кофактором нескольких метилтрансфераз, таких как метионин-синтаза у человека, важный клеточный фермент, функционирующий в двух основных метаболических путях: тетрагидрофолат-зависимый одноуглеродный цикл и конечный этап превращения метионина из гомоцистеина. С другой стороны, AdoCbl используется в качестве кофактора несколькими ферментами, в основном мутазами, хотя у млекопитающих обнаружен только один AdoCbl-зависимый фермент: L-метилмалонил-КоА-мутаза (MMCM), критический фермент для катаболизма пропионата и деградации нечетных цепей жирных кислот, нескольких аминокислот (валина, изолейцина, метионина, треонина) и холестерина.

Как уже говорилось ранее, AdoCbl и MetCbl являются активными изоформами кобаламина, однако известно, что они также чувствительны к свету [20,21]. По этой причине наиболее распространенной коммерческой формой витамина B12 является CNCbl, который более стабилен и легко преобразуется в организме в активную коферментную форму [22].

3. Биосинтез витамина B12: аэробный и анаэробный пути

Открытие структуры и биологических функций различных соединений витамина В12 в 1970-х годах привлекло внимание многих исследователей к путям биосинтеза организмов, продуцирующих Cbl. Структурная сложность, как было установлено позже, была обусловлена большим и запутанным биосинтезом, в котором участвуют более тридцати генов и множество ферментативных стадий для синтеза молекулы “de novo”. Считается, что этот путь является исключительным для некоторых бактерий и архей, поскольку нет генетических свидетельств того, что какой-либо эукариотический организм способен продуцировать какую-либо изоформу Cbl [1,23].

Хотя некоторые промежуточные продукты были обнаружены и выделены ранее [24], полный путь биосинтеза был описан у Pseudomonas denitrificans только в 1990-х годах [25]. Гены, участвующие в синтезе Cbl, получили приставку cob и букву, обозначающую каждое положение гена в опероне. В последующие годы ферменты cob и промежуточные продукты кобаламина из P. denitrificans были охарактеризованы и выделены французской компанией Rhône-Poulenc Santé, ныне Sanofi [26].

Позже гены, участвующие в биосинтезе Cbl, были охарактеризованы и в других организмах, таких как Bacillus megaterium, Salmonella enterica и ранее изученная Propionibacterium freudenreichii. С самого начала было ясно, что путь, найденный в этих организмах, похож на тот, что обнаружен у P. denitrificans, но генетически отличается от него. Ключевые отличия заключались в отсутствии монооксигеназы и другой кобальтохелатазы. Учитывая это, были установлены два различных пути биосинтеза Cbl: (I) аэробный или поздний путь введения кобальта, осуществляемый P. denitrificans [27] и, как выяснилось позже, другими микроорганизмами, такими как Ensifer casida и Sinorhizobium meliloti; и (II) анаэробный или ранний путь введения кобальта, осуществляемый в основном P. freudenreichii, B. megaterium и S. enterica [28].

Независимо от пути биосинтеза, синтез тетрапирролов начинается с синтеза 5-аминолаулиновой кислоты (ALA). После этого превращение ALA в тетрапиррольную макроциклическую структуру происходит в результате трех различных ферментативных реакций. Сначала ALA-дегидратаза (EC 4.2.1.24), Zn2+ и Mg2+-зависимый фермент, катализирует реакцию конденсации между двумя молекулами ALA с образованием порфобилиногена (PBG) [29]. Затем PBG-деаминаза (EC 4.3.1.8) полимеризует четыре молекулы PBG в линейный тетрапиррол. Наконец, синтаза уропорфириногена III (EC 4.2.1.75) способна инвертировать последнюю пиррольную единицу и соединить ее с первой пиррольной единицей линейного тетрапиррола, образуя уропорфириноген III, несимметричный гексагидропорфириновый изомер [30]. Эта молекула является последним промежуточным звеном, общим с другими простетическими группами, такими как группы гема и хлорофилла [31].

Превращение уропорфириногена III в прекоррин-2, первую молекулу на рисунке 2, катализируется метилтрансферазой уропорфириногена III (EC 2.1.1.107), для которой в качестве донора метила требуется S-аденозил-L-метион (SAM). Более конкретно, фермент метилирует С-2 уропорфириногена III, образуя прекоррин I, и после фототрофной таутомеризации тот же фермент способен метилировать С-7, получая прекоррин-2, который является последним общим промежуточным продуктом для кофермента сирогема, Р450 и витамина В12 [31,32].

Краткое описание анаэробного и аэробного биосинтеза аденозилкобаламина.

Рисунок 2. Краткое описание анаэробного и аэробного биосинтеза аденозилкобаламина. Гены, кодирующие белки аэробного и анаэробного путей, показаны синим и красным цветом, соответственно, за исключением белка α, кодирующий ген которого неизвестен.

Основные различия между аэробным и анаэробным путями заключаются в сокращении кольца и хелатировании кобальта (см. рис. 2). С одной стороны, для сокращения кольца в аэробном процессе требуется молекула кислорода плюс монооксигеназа (CobG) для образования прекоррина-3B, промежуточного продукта гидроксилированного γ-лактона, который подвергается скрытой пинаколовой перегруппировке во время сокращения кольца, вытесняя метилированную позицию С20. Затем кольцо полностью сокращается, и в процессе высвобождается молекула уксусной кислоты [28]. С другой стороны, сокращение кольца происходит на более поздней стадии анаэробного пути, когда кобальт уже введен в молекулу. Этот этап катализируется ферментом, кодируемым геном cbiH, при этом молекулярный кислород не требуется. После этого происходит SAM-зависимое метилирование C17, способствующее экструзии уже метилированной позиции C20 и формированию δ-лактонного кольца [28].

Хелатирование кобальта также сильно отличается в обоих путях. При аэробном пути происходит "позднее" присоединение атома кобальта после полного сжатия кольца. Это присоединение катализируется АТФ-зависимым мультиэнзимным комплексом (cobNST) в присутствии магния [28,33]. В анаэробном пути этот этап происходит в более ранней точке маршрута, когда хелатаза кобальта, кодируемая генами cbiX или cbiK, катализирует вставку кобальта, когда кольцо все еще находится в нерасщепленном состоянии [28].

Кроме того, независимо от пути биосинтеза корринового кольца, DMBI производится отдельно для последующего присоединения в α-осевой конформации. Синтез низших лигандов был описан недавно и также представляет собой два четко различающихся пути (аэробный и анаэробный), в зависимости от потребности в кислороде.

С одной стороны, аэробный биосинтез DMBI катализируется 5,6-диметилбензимидазол-синтазой BluB (EC 1.13.11.79), которая осуществляет фрагментацию и сокращение связанного флавин-мононуклеотидного кофактора и расщепление рибитилового хвоста с образованием DMBI и D-эритрозо-4-фосфата в присутствии молекулярного кислорода. Позже фосфорибозилтрансфераза CobU/T (EC 2.4.2.21) вводит DMBI через реакцию нуклеофильного замещения [34]. Этот путь был впервые описан для S. meliloti [35], а затем обнаружен у большинства Cbl-продуцирующих бактерий [36], включая двух наиболее важных промышленных продуцентов - P. freudenreichii [37] и P. denitrificans [38]. Этот факт подчеркивает неспособность P. freudenreichii полностью продуцировать Cbl анаэробным путем без какого-либо внешнего добавления DMBI.

С другой стороны, анаэробный биосинтез DMBI катализируется генными продуктами оперона bzaA-bzaB-cobT-bzaC-bzaD-bzaE, которые способствуют образованию DMBI с 5-гидроксибензимидазолом, 5-метоксибензимидазолом и 5-метокси-6-метилбензимидазолом в качестве промежуточных продуктов. Этот путь был описан у облигатных анаэробных бактерий Eubacterium limosum [39] и Acetobacterium woodii [34].

4. Микробное производство витамина B12: оптимизация биопроцесса для получения цианокобаламина

Спрос на кобаламин со стороны пищевой промышленности, производства напитков, диетических продуктов и нутрицевтиков резко возрос в последние годы в связи с повышением осведомленности населения о здоровье, а также ростом популярности альтернативных диет, таких как веганская и вегетарианская диеты. По этой причине за последние годы было предпринято множество усилий по оптимизации штаммов и процессов для производства цианокобаламина [1,40].

Помимо уже упомянутых форм кобаламина, AdoCbl, MetCbl и CNCbl, существует множество других кобамидов с различными нижнеаксиальными лигандами, которые выступают в качестве ключевых кофакторов для корриноид-зависимых ферментов, важных, например, для микробиоты кишечника [41,42]. Несмотря на их важность, в данном обзоре рассматривается только цианокобаламин - форма, которая может усваиваться и использоваться человеком и которая в настоящее время производится промышленно.

Исторически сложилось так, что для производства кобаламина в промышленных масштабах использовались штаммы с высокой природной продуктивностью, в основном различные штаммы P. freudenreichii и P. denitrificans, а также родственные штаммы, такие как Pseudomonas nitroreducens и E. casida [1,40].

В течение многих лет общей стратегией улучшения этих штаммов было использование методов случайного мутагенеза для повышения продуктивности витамина В12 или устойчивости к токсичным промежуточным продуктам, присутствующим в среде [43]. Тем не менее, сверхэкспрессия генов, участвующих в биосинтезе кобаламина [44], гетерологичная экспрессия чужеродных генов [45] и подавление некоторых генов [46] также привели к появлению более качественных штаммов-продуцентов. Кроме того, стоит отметить появление новых продуктивных штаммов с многообещающими результатами, таких как B. megaterium [47] и Acetobacter pasteurianus [48], а также гетерологичную экспрессию биосинтетического пути в других известных клеточных платформах, таких как E. coli, что подробно рассмотрено в исследовании Fang et al. за 2017 год [40]. Недавно Балабанова и соавт. подробно рассмотрели генетическую и биосинтетическую регуляцию, а также генетические инструменты, которые использовались для улучшения производства кобаламина на различных клеточных фабриках [36].

Напротив, существует множество примеров прогресса в микробном производстве витамина B12 путем оптимизации биопроцесса. В таблице 1 приведены наиболее значимые инновации, реализованные на уровне биопроцессов для увеличения производства Cbl, а также новые стратегии производства Cbl на новых платформах или средах. Исследования, направленные на увеличение производства путем генной инженерии известных штаммов, не представлены, поскольку целью данного раздела является предоставление обновленной информации об основных инновациях в области биопроцессов для биотехнологического производства кобаламина. Приведена краткая информация об условиях культивирования, характеристиках сред, объемах производства и продуктивности.

Таблица 1. Краткое описание зарегистрированных производств с использованием промышленных штаммов, продуцирующих кобаламин.

Микро-организм/штамм
Основные компоненты среды
Емкость
для
среды
Инновации
Объемное производ-ство
Объемная продуктив-ность
(мг/л/ч)
Ref
B. megaterium 
DSM 319
Террифициальная бульонная среда
Колба для встряхивания объемом
250 мл
Добавление прекурсоров и контроль pO2
0.21
мг/л/ c
0.006
мг/л/ч c
[47]
Lactobacillus reuteri ZJ03
Соевое молоко
Колба для встряхивания на 250 мл
Добавление различных источников углерода
0.204
мг/л/
0.003
мг/л/ч
[49]
P. freudenreichii
subsp. shermanii
NRRL-B-4327, 3523 и NRRL-B-3524
Бульон с лактатом натрия
Колба для встряхивания объемом
250 мл
Добавление аналога витамина B12
31
мг/л/
0.51
мг/л/
[50]
P. freudenreichii 
CICC 10019
Глюкоза, CSL a
Резервуар-биореактор
с мешалкой объемом 7 л
Биореактор с расширенным слоем (EBAB) с гидролизатами крахмала сельскохозяйственных культур
47.6
мг/л/
0.18
мг/л/ч
[51]
P. freudenreichii 
CICC 10019
Глюкоза, CSL
Биореактор
с мешалкой объемом 7 л
Биореактор EBAB
43.4
мг/л/
0.27
мг/л/ч
[52]
P. freudenreichii 
CICC 10019
Глюкоза, CSL
Биореактор
с мешалкой объемом
1,5 л
Биореактор EBAB и добавление DMBI
58.8
мг/л/
0.59
мг/л/ч
[53]
P. freudenreichii 
CICC 10019
Глюкоза/
глицерин, CSL
Биореактор
с мешалкой объемом 5 л
Биореактор EBAB, глицерин в качестве источника углерода и гидролизат стеблей сельскохозяйственных культур в качестве источника азота
43
мг/л/
0.36 мг/л/ч
[54]
P. freudenreichii 
DF13
Пермеат молочной сыворотки с добавками
Биореактор
с мешалкой объемом 1 л
Совместное культивирование с Lactobacillus plantarum SM39 для одновременного производства фолатов и Cbl
0.75
мг/л/
0.004
мг/л/ч
[55]
P. freudenreichii 
DSM 20271//Lactobacillus brevis ATCC
14869
Тесто из пшеничных отрубей
n.d. b
Совместная ферментация в тесте из пшеничных отрубей для производства витамина B12 in situ
332
нг/г c
n.d. b
[56]
P. freudenreichii 
IFO 12424//Ralstonia eutropha H16 (ATCC17699)
Полипептон, казеин, дрожжевой экстракт
Биореактор с резервуаром для пере-мешивания объемом 5 л
Система рециркуляции клеток и совместная культура с Ralstonia eutropha для уменьшения ингибирования пропионовой кислотой
8
мг/л/ c
0.14
мг/л/ч c
[57]
P. freudenreichii 
PTCC 1674.
Триптон, дрожжевой экстракт, различные источники углерода
100 см3
Отработанное подсолнечное масло для жарки в качестве источника углерода для производства витамина B12
2.74
мг/л/
0.02
мг/л/ч
[58]
P. freudenreichii
subsp. shermanii 
ATCC 13673
Глюкоза, дрожжевой экстракт
2 л биореактор
с мешалкой
Оптимизация объема закваски, контроля
рН и концентрации субстрата
0.087
мг/л/
0.002
мг/л/ч
[59]
P. freudenreichii
subsp. shermanii 
CICC 10019
Глюкоза, CSL
Ферментер на 100 л
Добавление DMBI именно со стратегией контроля Ado-Cbl
39.15
мг/л/
0.32
мг/л/ч
[60]
P. freudenreichii
subsp. shermanii
Глицерин, триптон, казеин, DMBI
Колба для встряхивания на 200 мл
Оптимизация среды с помощью экспериментальной схемы с использованием сырого глицерина в качестве основного источника углерода
4.01
мг/л/
0.024
мг/л/ч
[61]
P. freudenreichii
subsp. shermanii
Среды на основе сыворотки
пробирки
20 мл
Добавление DMBI, никотинамида и рибофлавина
5.3
мг/л/
0.03
мг/л/ч
[62]
P. freudenreichii
subsp. shermanii
Среды, похожие на пищевые (зерновые матрицы)
n.d.b
Добавление прекурсоров в различные зерноподобные матрицы
1.5
мг/кг
0.009
мг/кг/ч
[63]
P. freudenreichii
subsp. shermanii 
2067
Пропионовая среда на основе сыра/жидкая среда на основе сыворотки
Колба для встряхивания на 50 мл
Производство в пищевых условиях без добавления DMBI
0.124
мг/л/ c
0.0013
мг/л/ч
[64]
P. freudenreichii 
CICC10019
Глюкоза, дрожжевой экстракт, CSL
Колбы на
100 мл
Оптимизация среды с помощью статистического анализа
8.32
мг/л/
0.068
мг/л/ч
[65]
P. freudenreichii 
CICC10019
Глюкоза, CSL
Ферментер объемом 7 л
Мембранная сепарация с сопряженной периодической ферментацией
21.6
мг/л/
0.16
мг/л/ч
[66]
P. denitrificans
Мальтоза, пептон, бетаин
Колба для встряхивания на 250 мл
Добавление ротенона в качестве ингибитора дыхания для увеличения производства
54.7
мг/л/
0.57
мг/л/ч
[67]
P. denitrificans
Свекольная патока, сахароза, бетаин
Ферментер объемом
120 м3
Глюкозо-бетаиновое питание, стратегия контроля рН
214.13
мг/л/ c
1.27
мг/л/ч c
[68]
P. denitrificans
Глюкоза, CSL, бетаин
Ферментер
120 м3
Стратегия пошагового управления скоростью поглощения кислорода
188
мг/л/
1.12
мг/л/ч
[69]
P. denitrificans
Глюкоза, CSL, бетаин
Ферментер
50 л
Влияние удельной скорости потребления кислорода на морфологию клеток и производство
213.1
мг/л/
1.88
мг/л/ч
[70]
P. denitrificans
Мальтоза, пептон, бетаин
Колба для встряхивания 250 мл
Добавка бетаина
58.61
мг/л/
0.48
мг/л/ч
[71]
P. denitrificans
Мальтозный сироп, CSL, бетаин
120 м3 ферментер
Мальтозный сироп и CSL в качестве основных субстратов
198.27
мг/л/
1.10
мг/л/ч
[72]
P. denitrificans
Глюкоза, CSL, бетаин
120 м3 ферментер
Пошаговый контроль pO2
198.80
мг/л/
1.18
мг/л/ч
[73]

Указываются основные микроорганизмы, штаммы, соединения среды, масштабность, а также краткая информация об основных инновациях и объемных характеристиках производствах. Объем производства представлен в мг/л. Объемная продуктивность была рассчитана на основе данных из оригинальных публикаций. a CSL: кукурузный крутой щелок; b n.d.: не определено; c Значения были пересчитаны в мг/л или мг/л/ч на основе данных из оригинальной публикации.


В целом, можно отметить резкие различия в производстве кобаламина разными микроорганизмами-продуцентами. В этом смысле объем производства и продуктивность, полученные с помощью P. denitrificans, явно превосходят аналогичные показатели других продуцентов, в то время как продукция видом P. freudenreichii сильно варьирует между штаммами и условиями культивирования. В случае с последним наиболее эффективными представляются стратегии, основанные на снижении ингибирующего эффекта накапливающейся пропионовой кислоты.

4.1. Микробное производство в Pseudomonas denitrificans

Paracoccus denitrificans (паракоккус денитрификанс) - грамотрицательная бактерия, которая использует аэробный путь биосинтеза для производства витамина B12. Несмотря на то, что паракоккус не имеет общепризнанного безопасного статуса (GRAS), в настоящее время он является основным производителем витамина B12, используемым промышленными предприятиями, такими как Sanofi в Европе [74] или Huarong Pharmacy Corporation в Китае.

С одной стороны, штамм компании Sanofi был изначально был создан с помощью комбинации методов случайного мутагенеза и молекулярной биологии, и, хотя официальной информации о его объемном производстве нет, принимая во внимание другие аэробные штаммы, заманчиво предположить, что он может производить около 200-300 мг/л [72].  Оптимизированный штамм был получен из природного высокопродуктивного штамма, известного как MB-580, впервые описанного и запатентованного в 1962 году (US3018225A). В течение нескольких лет французская компания Rhône-Poulenc амплифицировала несколько генов cob, участвующих в биосинтезе витамина В12, пока не были созданы определенные высокопродуктивные штаммы - SBL27 и, в конечном счете, SC510 [26]. Компания Sanofi, бывшая Rhône-Poulenc, в настоящее время является основным европейским производителем витамина В12.

Однако доминирующие мировые производители витамина B12 на рынке находятся в Китае: North China Pharmaceutical Company, Henan Luyuan Pharmaceutical Company, Hebei Yuxing Bio-Engineering Company и китайская CSPC Huarong Pharmaceutical Company, общий объем производства которых в 2020 году составит около 31,41 тонны, а стоимость - 339,8 миллиона долларов США [75]. Происхождение штаммов, используемых в их промышленных производствах, точно не известно, но предполагается, что это аэробный штамм, что следует из различных публикаций исследовательских групп, связанных с Huarong Pharmaceutical Company [69,73,76], а последние патенты по оптимизации биопроцессов с P. denitrificans, представленные в Китае, утверждают объемное производство до 281 мг/л (см. таблицу 2).

Помимо генетических модификаций, повышение продуктивности витамина B12 в P. denitrificans также было достигнуто за счет оптимизации культуральной (питательной) среды и изменения условий биопроцессинга (биообработки). Например, было протестировано влияние микроэлементов в среде, pH, контроля растворенного кислорода и добавления нескольких добавок. В этом смысле добавление Zn2+, как сообщается, оказывает значительное положительное влияние на синтез ALA и PBG, двух основных предшественников кобаламина, а добавление Co2+ и DMBI, основания, которое включается в нуклеотидную петлю, положительно влияет на производство [77]. Оптимизация начальных количеств этих трех соединений с помощью экспериментальной схемы привела к увеличению производства кобаламина на 13 % [77].

Состав среды влияет на стабильность рН культур и оказывает значительное влияние на производство витаминов. Чтобы лучше контролировать рН, была разработана стратегия питания с глюкозой в качестве источника углерода и бетаином в качестве метилового донора, которая оказалась полезной для производства витаминов при использовании культур в биореакторе объемом 120 м3 [69,73,76]. Более того, хотя хорошо известно, что бетаин действует как донор метила для биосинтеза витамина B12 [78] и усиливает образование нескольких ключевых промежуточных продуктов, таких как ALA, глутамат, глицин и метионин [71], высокие концентрации бетаина могут также ингибировать рост клеток [71,76]. Поэтому в дальнейшем была разработана правильная стратегия подачи бетаина, чтобы сбалансировать негативное влияние на рост клеток и положительное влияние на производство кобаламина, и впоследствии она была успешно реализована в промышленных масштабах [76].

Скорость переноса кислорода (OTR) также была одним из основных предметов оптимизации биопроцесса для P. denitrificans. Более высокие значения OTR на начальных стадиях культивирования способствуют росту клеток, в то время как более низкие OTR на более поздних стадиях оказались критичными для повышения продуктивности [69]. Более поздние исследования показали, что увеличение продукции, наблюдаемое в условиях пониженной оксигенации, может быть связано с изменениями в морфологии клеток, стимулирующими переход от фазы роста клеток к состоянию элонгации, которое обеспечивает более высокую продукцию витамина B12 [70]. Принимая это во внимание, было разработано несколько многоступенчатых стратегий контроля растворенного кислорода, в которых аэрация и перемешивание постепенно снижались до тех пор, пока значения растворенного кислорода не опускались ниже 2%, что позволило повысить производство примерно на 17% [69,73]. Кроме того, добавление ингибиторов дыхательной цепи, таких как ротенон, также может увеличить производство витаминов, несмотря на пагубное воздействие на рост клеток [67].

Наконец, различные источники углерода и азота, такие как глюкоза, мальтозный сироп, свекловичная патока и кукурузный крутой щелок, были протестированы в качестве более дешевой альтернативы более дорогим рафинированным сахарозе и глюкозе. Некоторые из этих соединений могут негативно влиять на стабильность рН и, следовательно, на конечную продукцию витаминов [68]. Тем не менее, сочетание мальтозного сиропа, кукурузного крутого щелока и бетаина было представлено как успешная и более дешевая альтернатива традиционным средам [72].

4.2. Микробное производство В12 в Propionibacterium freudenreichii

Штаммы P. freudenreichii представляют собой грамположительные палочковидные бактерии, названные так из-за их способности синтезировать большое количество пропионовой кислоты по пути Вуда-Веркмана. В отличие от аэробных продуцентов витамина B12, P. freudenreichii обладает преимуществом статуса GRAS, предоставленного FDA, и статуса квалифицированной презумпции безопасности (QPS), предоставленного EFSA.

Некоторые подходы генной инженерии были опробованы на P. freudenreichii для получения более высоких количеств витамина B12. Например, сообщалось, что сверхэкспрессия некоторых основных генов, участвующих в синтезе кобаламина [44], и подход с перетасовкой генома [79] улучшили производство кобаламина. Однако основные промышленные штаммы обычно получали путем случайного мутагенеза с использованием различных мутагенных агентов, таких как ультрафиолетовый свет или химические соединения, для получения лучших продуцентов кобаламина. У P. freudenreichii эти высокопродуктивные штаммы обычно отличаются повышенной толерантностью и устойчивостью к пропионовой кислоте [43].

P. freudenreichii - факультативно-анаэробные штаммы, которые следуют анаэробному биосинтетическому маршруту для производства кобаламина. Несмотря на то, что они дают высокие урожаи кобаламина только в условиях очень низкого содержания кислорода, кислород необходим для синтеза DMBI и его присоединения к корриновому кольцу [80]. По этой причине с культурой обычно работают в два этапа: первый этап, на котором клетки культивируются в полностью анаэробных условиях, и второй этап, обычно после 72-96 ч культивирования [59,62,80], на котором с помощью перемешивания обеспечивается мягкая аэрация для создания микроаэрации, необходимой для синтеза DMBI и производства кобаламина [74].

Статус GRAS этих продуцентов витамина B12 позволил расширить сферу их применения на рынке за счет прямого использования в производстве пищевых продуктов. В этом смысле обогащение продуктов питания P. freudenreichii in situ было успешно протестировано на пищевых средах, таких как среда, имитирующей среду «пропионового» сыра или жидкая среда на основе молочной сыворотки [62,64], зерновые матрицы [63] и при обогащении темпе in situ [81]. Хотя конечная плотность клеток и заявленные уровни производства низки по сравнению с другими, традиционными средами, в контексте обогащения продуктов питания это позволяет увеличить содержание кобаламина, используя нетрадиционные источники, и достичь рекомендуемых ежедневных уровней потребления витамина B12, используя лишь небольшое количество ферментированных продуктов [64].

Как уже упоминалось, эти бактерии способны производить большое количество пропионовой кислоты, которая в конечном итоге становится токсичной и ограничивает рост клеток [52]. Поэтому было опробовано несколько стратегий оптимизации биопроцесса для снижения накопления пропионовой кислоты. В частности, методы удаления продуктов in situ (ISPR) показали многообещающие результаты при одновременном производстве пропионовой кислоты и витамина B12. Среди методов ISPR - использование адсорбционных биореакторов с расширенным слоем (EBAB) с использованием смол с высокой биосовместимостью, таких как ZGA330, которые, как сообщается, обеспечивают объемное производство витамина B12 на уровне от 40 мг/л до 60 мг/л [52].

eba column (колонка EBA)

В EBAB адсорбция происходит при расширении колонки (на расширенном носителе – ред.), что позволяет культуре проходить через хроматографическую колонку без засорения, а пропионовая кислота задерживается в смоле [54]. Различные условия культивирования [54], источники углерода и азота [51] и добавление добавок к среде, таких как DMBI [53], были протестированы для одновременного улучшения производства пропионовой кислоты и витамина B12. В системе EBAB комбинация глюкозы и глицерина [54] и гидросилаты стеблей кукурузы [51] оказались эффективными источниками углерода, при этом объемное производство CNCbl составило 43,2 мг/л и 47,6 мг/л, соответственно.

Другим интересным подходом к снижению концентрации пропионовой кислоты является совместное брожение P. freudenreichii с другими микроорганизмами, способными метаболизировать пропионовую кислоту. Например, совместное культивирование P. freudenreichii и Ralstonia eutropha показало увеличение выработки кобаламина с 6,73 мг/л почти до 19 мг/л [57]. Кроме того, совместная ферментация успешно применяется не только для снижения содержания пропионовой кислоты, но и для одновременного производства более чем одного продукта или для обогащения других клеточных культур. Одновременное получение фолиевой кислоты и витамина В12 было получено при совместном культивировании P. freudenreichii и Lactobacillus plantarum (в настоящее время называется Lactiplantibacillus plantarum [82]) [55], а недавно была запатентована совместная ферментация Basidiomycota и штамма P. freudenreichii для одновременного получения витамина D и В12 [83]. Примером обогащения пищевых продуктов может служить производство витамина В12 in situ в хлебном тесте на основе молочной сыворотки с одновременным культивированием P. freudenreichii и Lactobacillus brevis (в настоящее время называемые Levilactobacillus brevis [82]) для обеспечения микробиологической безопасности и стабильности [56].

Добавление предшественников кобаламина - еще одна распространенная стратегия повышения производительности. Добавление обычных прекурсоров и необходимых соединений, таких как ALA и Co2+, часто описывается как благоприятное для производства витаминов [1]. Хотя все штаммы P. freudenreichii способны самостоятельно синтезировать DMBI, уровень биосинтеза этого основания невысок. Более того, образование DMBI невозможно в строго анаэробных условиях, поскольку для его синтеза необходим кислород [37]. Если доступность DMBI ограничена, активная форма витамина B12 не образуется, и клетки начинают накапливать неполные формы, такие как кобинамид или псевдовитамин B12. Таким образом, добавление DMBI или даже предшественников DMBI, таких как рибофлавин или никотиамид, постоянно сообщается как положительный фактор в производстве кобаламина [1,40,53,60,62,64]. Кроме того, другие группы обнаружили, что добавление аналогов витамина B12 может уменьшить ингибирование обратной связи и увеличить выработку кобаламина [50].

Наконец, культуры P. freudenreichii также интересны в промышленных условиях благодаря их способности расти в широком диапазоне сложных источников углерода и азота и даже в отходах и отработанных средах, таких как меласса [84], сырой глицерин [61], отработанное подсолнечное масло для жарки [58], томатные выжимки [85], жидкий кислый белковый остаток сои [86] и отработанные среды овощных соков [87].

5. Стратегии переработки и постмодификации витамина B12

Получение витамина B12 - хорошо описанный процесс, который, насколько известно авторам, остается неизменным на протяжении последних десятилетий в промышленных масштабах (классическая схема биопроцесса приведена на рисунке 3). Вкратце, культуральный бульон подвергается нескольким этапам разделения и очистки (включая процессы экстракции, фильтрации и адсорбции), которые влияют на общую производительность и осуществимость процесса. Классическая последующая обработка начинается с концентрирования биомассы для значительного уменьшения ее объема, которое обычно выполняется с помощью центрифугирования. Тем не менее, в зависимости от биопроцесса, Cbl может находиться и во внеклеточном состоянии, поэтому очистка может начинаться с цельного бульона.

Классический биопроцесс получения высокочистого цианокобаламина

Рисунок 3. Классический биопроцесс получения высокочистого цианокобаламина. Основной поток CNCbl выделен красным цветом. Промежуточные емкости для хранения опущены для упрощения рисунка. P1 - P11 представляют собой процессы 1 - 11, соответственно. Биопроцесс представлен с использованием программы SuperPro Designer® V9 Academic Site Edition, Intelligen, Inc. (Scotch Plains, NJ, USA).

В любом случае все виды корриноидов экстрагируются путем нагревания при 80-120 °C и рН 6,5-8,5 в течение 10-30 мин. Цианирование может быть проведено в процессе экстракции или после первоначальной фильтрации и адсорбции [74,88]. В обоих случаях различные корриноиды превращаются в CNCbl при добавлении цианида калия или тиоцианата. Этот процесс обычно проводится в присутствии нитрита натрия и тепла [80].

В дальнейшем раствор CNCbl осветляют с помощью одного или нескольких процессов фильтрации (микрофильтрации и/или нанофильтрации) и адсорбции (смола XAD). Если полученный Cbl идет на корм животным, раствор витамина часто обрабатывают хлоридом цинка и осаждают органическими растворителями, например ацетоном, для получения конечного продукта [89]. Если требуется большая чистота, например, для использования в фармацевтике, для получения чистого конечного продукта часто требуются дополнительные стадии адсорбции с использованием различных смол (например, IRA, оксид алюминия). На рисунке 3 представлен классический биопроцесс для получения высокочистого CNCbl.

После очистки витамин B12 может подвергаться различным постмодификациям для использования в качестве пищевой добавки или перорального препарата с целью повышения его биодоступности. Защита этих соединений может быть особенно интересна в случае нефункционирующего внутреннего фактора, который приводит к очень низкой биодоступности Cbl [90,91]. В связи с этим было разработано несколько методов защиты пероральных добавок от специфических условий, возникающих в желудочно-кишечном тракте [92]. Среди них микрокапсулирование, которое уже широко используется в фармацевтической и косметической промышленности [93], позволило повысить стабильность витамина B12 с помощью пищевых эмульсий W1/O/W2 [94,95], липосом [96] или различных пищевых инкапсулирующих агентов, таких как хитозан, арабиновая камедь, альгинат натрия, каррагинан, мальтодекстрин, модифицированный крахмал, цианобактериальный внеклеточный полимер, ксантан и пектин [97,98]. Кроме того, Фидалео и соавторы недавно рассмотрели использование наноносителей как перспективную нанотехнологию, которая может позволить улучшить терапию витамином B12, снизить побочные эффекты и общие затраты, а также улучшить качество жизни пациентов [99].

6. Патенты и уровень техники

Исследования в области производства кобаламина активно патентовались с самого начала, были опубликованы тысячи патентов, хотя большинство из них уже не действуют. Из-за большого количества публикаций и того факта, что в настоящее время большинство производственных и промышленных достижений осуществляется в Китае, представить полный список всех действующих и используемых в настоящее время патентов сложно и не входит в рамки данного обзора. Вместо этого в таблице 2 представлен исторический обзор некоторых из наиболее важных и актуальных патентов для современных промышленных процессов. Мы указываем состояние каждого патента - просроченный, заброшенный или действующий - в дополнение к основным заявленным инновациям и, при наличии, данным об объемном производстве.

В 1962 году одним из первых патентов, относящихся к данной теме, после открытия внешнего фактора стал US3018225A [100], где было описано открытие природного штамма с высокой продуктивностью (P. denitrificans MB580). Этот штамм был широко изучен, и многие высокопродуктивные штаммы, такие как SC510, были получены с помощью методов генной инженерии, как описано в US20060019352A1 [101]. Фактически, исследователи, связанные с компанией Rhône-Poulenc, использовали MB580 и полученные из него штаммы для изучения генов, лежащих в основе аэробного биосинтеза Cbl, и представили полный аэробный биосинтетический путь в 1990 году [26]. В настоящее время точные аэробные штаммы, используемые для промышленного производства кобаламина, неизвестны, но считается, что они тесно связаны с SC510. Более поздние патенты, связанные с аэробными штаммами, охватывают все стадии разработки биопроцесса: (I) скрининг и идентификацию новых штаммов-продуцентов (CN111254173 A [102]), (II) оптимизацию среды и биопроцесса (CN108949866 A [103], CN110205350 A [104], CN109837320 A [105]), а также (III) последующую переработку (CN111808158 A [106]).

С другой стороны, большинство самых ранних патентов, связанных с анаэробами и P. freudenreichii, были посвящены оптимизации штаммов для производства CNCbl. В этом смысле одним из наиболее значимых ранних патентов является US4544633A [43], где описана генерация пропионово-устойчивого штамма-продуцента путем случайного мутагенеза. Помимо улучшения штаммов, более поздние патенты часто фокусировались на оптимизации биопроцессов и использовании биореакторов с расширенным слоем для одновременного производства CNCbl и других соединений, представляющих интерес, таких как пропионовая кислота (US6492141B1 [107]). Кроме того, запатентована возможность использования штаммов P. freudenreichii, продуцирующих Cbl, в качестве пробиотиков (US7427397B2 [108]). Интересно, что последние патенты, связанные с анаэробными штаммами, посвящены стратегиям совместного культивирования (US9938554 [109], US20200149084A1 [83]) или совместного производства (CN206828509U [110], IN201827044769 A [111]). В последнем патенте, IN201827044769 A [111], заявлена объемная продукция 76,13 мг/л, что является максимальной продукцией, зарегистрированной для штамма P. freudenreichii.

Наконец, существует ряд патентов на альтернативные штаммы-продуценты, такие как B. megaterium (US2576932A [112]), несколько штаммов Lactobacillus (WO2011154820A2 [113]), S. meliloti (CN104342390 A [114], CN110804598 A [115]) и даже E. coli (WO2019109975A1 [116]). Уровень продуктивности большинства этих микроорганизмов довольно низок по сравнению с традиционными производителями, и патенты часто направлены на идентификацию штаммов или их усовершенствование путем генной инженерии или гетерологичной экспрессии основных генов, участвующих в биосинтезе Cbl. Однако исключением является штамм S. meliloti (CGMCC 9638), у которого уровень производства витамина B12 находится в диапазоне 50-115 мг/л [115].

Таблица 2. Основные патенты, связанные с производством витамина В12.

Номер патентной заявки (ссылка)
Название
Микро-организм/
штамм
Инновация
Объемное произ-водство
год
Род Propionibacterium
US4544633A
[43](Expired)
Способ получения витамина
В12 методом ферментации и микроорганизм, продуцирующий
витамин В12.
P. freudenreichii 
(IFO 12424, IFO 12391, IFO 12426)
Создание штаммов, устойчивых к пропионовой кислоте (P. freudenreichii FERM-86 и FERM-87), для усиленного производства CNCbl
15
мг/л
1983
US6492141B1 [107] (Expired)
Процесс производства витамина B12
P. freudenreichii 
CBS 929.97
Эффект O2 в производстве во время анаэробной фазы и стратегия "заполни и зачерпни" для увеличения производства
19
мг/л
1999
US6187761B1 [117] (Expired)
Производство и применение композиций, содержащих высокие концентрации активности витамина B12.
P. freudenreichii 
subsp. 
shermanii и 
P. denitrificans
Метод получения витамина B12 и изготовление высоко-концентрированных композиций
10
мг/л
1999
US7427397B2 [108] (Expired)
Пробиотик 
Propionibacterium
Propionibacterium jensenii 702
Propionibacterium jensenii как пробиотик
0.0012
мг/л
2004
EP2376644B1 [118] (Active)
Процесс приготовления ферментационного бульона
Lactobacillus plantarum DSM 22,118 и P. freudenreichii 
DSM 22120
Оптимизация ферментационной среды
и совместное культивирование для производства фолата и витамина B12
1.07
мг/л
2009
CN206828509U [110] (Active)
Устройство для получения пропионовой кислоты и совместного производства витамина В12 методом полунепрерывной
ферментации.
P. freudenreichii
Одновременное производство пропионовой кислоты и витамина B12 в полунепрерывной ферментации с отделением пропионовой кислоты
20.12
мг/л
2017
US9938554
[109]
(Active)
Совместное культивирование пропионибактерий и дрожжей.
P. freudenreichii 
(ATCC 6207) и
клетки дрожжей (DSM 28271)
Совместное культивирование Propionibacterium и пропионово-устойчивых дрожжей для снижения химической кислородной нагрузки (COD) отработанных сред
16
мг/л
2018
US20200149084A1 [83] (Active)
Метод последовательного совместного культивирования для производства пищевого продукта, богатого витаминами и белками.
Basidiomycota и
P. freudenreichii
Совместное культивирование штаммов рода Basidiomycota и штаммов, продуцирующих витамин B12, для обогащения продуктов питания in situ
0.0014
мг/л 1
2020
IN201827044769 A [111] (Active)
Непрерывный процесс совместного производства витамина B12 и органических кислот.
P. freudenreichii 
(ATCC 13673)
Совместное производство витамина B12 и органических кислот в непрерывной ферментации с использованием одного биореактора
76.13
мг/л
2020
WO21041759 A1 [119] (Active)
Модифицированные пропионибактерии и способы применения
P. freudenreichii
 (P. UF 1)
Получение штамма, продуцирующего избыток витамина B12, путем введения мутации, снижающей активность рибосвитча cbiMcbl
n.d. 2
2021
Paracoccus denitrificans
US3018225A [100]
(Expired)
Производство
витамина B12
P. denitrificans 
MB-580
Процесс производства витамина B12 с использованием высокопродуктивного штамма (P. denitrificans MB-580)
2.4
мг/л 1
1962
US20060019352A1 [101] (Abandoned)
Методы увеличения продукции кобаламинов
с использованием
экспрессии гена cob
P. denitrificans
Сверхэкспрессия нескольких генов, участвующих в биосинтезе Cob; получение нескольких штаммов-производителей, таких как SC-510
65
мг/л
1990
US6156545A [120]
(Expired)
Метод биосинтеза, позволяющий получать кобаламины.
P. denitrificans 
G2650
Усиленное производство Cob за счет гетерологичной сверхэкспрессии предшественников, таких как DMBI и O-фосфо-L-треонин
7.9
мг/л
1996
CN101538599A [121] (Active)
Способ повышения выхода денитрифицированного витамина В12 псевдомонад.
P. denitrificans
J741
Повышение производительности Cob путем оптимизации добавления бетаина
177.49
мг/л
2008
CN102399845A [122] (Active)
Процесс управления процессом ферментации витамина B12 на основе концентрации CO2 в отходящих газах
P. denitrificans 
MB-580
Усиленное производство витамина B12 благодаря стратегии управления углекислым газом во время ферментации
164.6
мг/л
2010
CN101748177 A [123] (Active)
Оптимизированный метод получения витамина B12 посредством ферментации P. denitrificans и синтетической среды
P. denitrificans
Разработка и оптимизация сред и условий биопроцесса для улучшения производства витамина B12
77
мг/л
2010
CN102021214 A [124] (Active)
Процесс контроля ферментационного производства витамина
B12 на основе скорости потребления кислорода
P. denitrificans
Оптимизация производства витамина B12 с помощью стратегии контроля кислорода
171,4
мг/л
2011
CN102453740 A [125] (Active)
Культуральная среда для получения витамина B12 путем ферментации P. denitrificans
и способ ее ферментации
P. denitrificans
Использование искусственной мелассы и оптимизация биопроцесса для более стабильного выхода ферментации
198
мг/л
2012
CN108949866 A [103] (Active)
Многоступенчатая система регулирования скорости вращения для улучшения ферментации P. denitrificans
для производства витамина B12.
P. denitrificans
Выработка витамина В12 улучшена за счет оптимизации питательных сред и скорости перемешивания в биопроцессе
246
мг/л 1
2018
CN108913739 A [126] (Active)
Способ получения витамина
В12 с использованием
P. denitrificans, основанный
на контроле значения pH
P. denitrificans
Улучшенная выработка витамина В12 за счет оптимизации биопроцесса с помощью контроля значения рН
248
мг/л
2018
CN110205350 A [104] (Active)
Способ повышения выхода витамина В12, основанный
на регулировании показателя аммиачного азота.
P. denitrificans
Способ улучшения производства Cbl путем добавления дрожжевого экстракта, контролируемого по индексу содержания аммиачного азота
167
мг/л 1
2019
CN109837320 A [105] (Active)
Способ стимулирования
P. denitrificans для выработки витамина B12
P. denitrificans
Оптимизация сред и условий культивирования для улучшения производства витамина B12
198
мг/л
2019
CN111808158 A [106] (Active)
Метод получения
неочищенного продукта витамина B12
P. denitrificans
Усовершенствование процесса выделения AdoCbl
n.d. 2
2020
CN111254173 A [102] (Active)
Метод скрининга и скрининговая культуральная среда для бактериальных штаммов для высокого выхода витамина B12, полученного путем ферментации с P. denitrificans
Несколько высоко-продуктивных штаммов
P. denitrificans
Скрининг штаммов
P. denitrificans, продуцирующих большое количество витамина B12, и скрининг культурной среды для получения большого количества витамина B12
281
мг/л 1
2020
Другие микроорганизмы
US2650896A [127]
(Expired)
Цианид-ионы в производстве витамина B12
Streptomyces
griseus
Влияние цианид-ионов на производство B12
Биологи-ческая проба
1953
US2576932A [112]
(expired)
Процесс ферментации для производства витамина B12.
B. megaterium 
B-938
Получение витамина B12
с помощью B. megaterium на питательной среде с сахарозой
0.45
мг/л
1983
US20050227332A1 [128] (Expired)
Способ получения витамина
В12 из метановых бактерий, метаболизирующих водород
Мезофильная метановая бактерия, полученная из сброженного
ила
Культуру акклиматизируют в среде H2-CO и выращивают в биореакторе с иммобилизованным слоем.
25.2 мг/л
2005
US20060105432A1 [129] (Abandoned)
Способ получения витамина
В12
B. megaterium 
DSMZ509
Генетически модифицированный штамм B. megaterium
0.008
мг/л 1
2006
WO2011154820A2 [113] (Application granted)
Штаммы пробиотических бактерий, продуцирующие витамин B12
Lactobacillus reuteri (DSM 17938, DSM 16143,ATCC 55730)
Обогащение продуктов питания in situ для увеличения производства витамина B12 с помощью штаммов Lactobacillus reuteri
0.018
мг/л 1
2011
CN104342390 A [114] (Active)
Штамм Sinorhizobium meliloti, состав и применение штамма Sinorhizobium meliloti.
S. meliloti 
(CGMCC 9638)
Штамм S. melitolli, способный производить витамин B12, и оптимизация биопроцесса для производства витамина B12
Не менее 50 мг/л
2015
WO2019109975A1 [116] (Active)
Рекомбинантный штамм Escherichia coli для синтеза витамина B12 de novo,
способ его получения и его применение.
E. coli
Рекомбинантная кишечная палочка для синтеза витамина B12 de novo
89 мкг/г сухих клеток
2019
CN110804598 A [115] (Active)
Мутант и мутантный ген прокоррин-2C(20)-метилтрансферазы и его применение для получения витамина B12.
Sinorhizobium 
(CGMCC 9638)
Получение штамма-перепроизводителя витамина B12 путем сверхэкспрессии гена прекоррин-
2C(20)-метил-трансферазы
115
мг/л
2020

1 Значения были пересчитаны в мг/л с использованием данных, имеющихся в оригинальной публикации; 2 n.d.: не определено.


7. Области применения витамина B12 и состояние рынка

Наиболее важным рынком для продуктов, содержащих B12, является кормовая и пищевая промышленность, где его эффективность и безопасность были всесторонне проверены [130], хотя он также широко используется в производстве добавок и фармацевтической промышленности.

В кормовой и пищевой промышленности CNCbl обычно добавляют в корма для птицы, свиней и телят в дозировке от 10 до 30 мг/т почти во всех странах Европы и США [74]. Он также используется в качестве добавки в некоторых пищевых продуктах, например, в зерновых, где его органолептические свойства и химические характеристики, такие как отсутствие запаха, отсутствие вкуса и растворимость в воде, являются преимуществом для обогащения некоторых продуктов. Однако его ярко-красный цвет может стать проблемой для добавления в другие продукты питания, например, в белый хлеб [88].

Что касается использования витамина B12 в индустрии добавок, то в последние годы он становится все более актуальным, особенно с ростом популярности вегетарианской и веганской диеты [131]. CNCbl является наиболее используемой формой в основном из-за его стабильности, цены, доказанной безопасности [22] и схожей эффективности по сравнению с другими формами [22,131]. Несмотря на сообщения о сушеных водорослях, содержащих значительное количество B12 [132], Cbl практически отсутствует в овощах [131], и основными диетическими источниками являются продукты, полученные из животных. Хотя B12 присутствует в молочных продуктах и яйцах (продуктах, подходящих для вегетарианской диеты), его количество довольно мало по сравнению с другими вариантами (примерно 0,4 мкг/100 г в молоке и 1,3 мкг/100 г в яйцах против 9,4 мкг/100 г в некоторых видах мяса, 8,9 мкг/100 г в рыбе и 52,4 мкг/100 г в моллюсках [132]). Этот факт, а также предполагаемая биодоступность только 50% всех Cbl, получаемых из пищевых источников [41], и потери, которые могут происходить при обработке продуктов (приготовление пищи, воздействие света, пастеризация и т.д.) [131], делают достижение рекомендуемой суточной нормы потребления в 2,4 мкг сложной задачей для тех, кто придерживается чисто вегетарианской диеты без добавок витамина B12 [131].

Дефицит витамина B12 также распространен в странах с низким или средним уровнем дохода, где в основном используется растительная диета и низкое потребление мяса [133]. Однако даже в странах с высоким уровнем дохода есть несколько групп населения, подверженных высокому риску дефицита B12. Особенно это касается пожилых людей: по данным NIH, в США и Великобритании от дефицита B12 страдают около 20 % людей старше 60 лет [134]. В случае пожилых людей дефицит в основном обусловлен снижением потребления и высокой распространенностью мальабсорбции, связанной с пищей, вызванной возрастной атрофией желудка и снижением уровня «внутреннего фактора» [41,135].

К группам повышенного риска также относятся беременные и кормящие женщины, дети и пациенты с аутоиммунными заболеваниями, вызывающими желудочные осложнения, такие как атрофический гастрит или снижение секреции желудочной кислоты [132]. Во всех этих случаях рекомендуется увеличить суточное потребление B12, в основном за счет добавок.

Хотя большинство добавок основано на CNCbl, в редких случаях изменений клеточного трафика и обработки белков, вызванных редкими генетическими заболеваниями [136], может потребоваться добавка других форм, таких как MetCbl или OHCbl. Кроме того, добавки CNCbl могут быть непригодны для курильщиков [137,138].

Наконец, следует также отметить, что часто предпочтительнее добавлять B12 отдельно, а не в составе мультивитаминных таблеток, поскольку присутствие витамина C и меди может привести к его разрушению и образованию неактивных побочных продуктов Cbl [131].

Помимо прямого приема, B12 также широко используется для обогащения различных пищевых продуктов. В этом случае CNCbl снова является предпочтительной формой из-за своей большей стабильности при обработке и приготовлении пищи [132]. Продукты, обогащенные B12, широко распространены в США и других странах, где, например, обогащенные B12 крупы и молоко обеспечивают значительную часть общей суточной потребности в Cbl [132]. Рассматривались и другие альтернативы, такие как обогащение муки [139]. В этом смысле некоторые из подходов к обогащению in situ, представленные в данном обзоре [56,63], могут стать интересными и ценными альтернативами в будущем.

Витамин B12 также широко используется в фармакологии, где, помимо CNCbl, производятся и распространяются и другие формы, такие как OHCbl, AdoCbl и MetCbl, благодаря их более высокой усвояемости и более устойчивому уровню в сыворотке крови [74]. Фармакологический B12 представлен в различных формах, таких как назальные спреи, пероральные и сублингвальные препараты и даже прямые инъекции для лечения пернициозной анемии, дефицита B12, отравления цианидами и снижения уровня гомоцистеина. Есть также несколько заявлений о его положительном эффекте у пациентов с болезнью Альцгеймера и в качестве стимулятора иммунной системы, хотя для их подтверждения необходимы дополнительные доказательства [74,140].

Учитывая все эти варианты использования и рынков сбыта, неудивительно, что общий объем производства и рынка витамина B12 в мире неуклонно растет, хотя точные данные о стоимости мирового рынка трудно получить из-за нехватки достоверной информации. Тем не менее, можно с уверенностью предположить, что за последние десятилетия общий объем производства значительно вырос. В 1989 году общий объем производства составлял около 3 тонн в год [74], а к 2005 году он уже вырос до 10 тонн и имел рыночную стоимость около 77 миллионов евро [88]. Как уже упоминалось, в 2020 году производство в Китае достигнет 31,41 тонны с рыночной стоимостью 339,48 млн долларов США [76], а по некоторым прогнозам, к 2027 году рынок витамина B12 достигнет общей стоимости 410 млн долларов США [141]. Постепенное увеличение численности пожилого населения, распространение альтернативных веганских и вегетарианских диет и дефицит продуктов животного происхождения являются факторами, объясняющими столь резкий рост рынка, а также причинами, по которым ожидается, что рынок B12 продолжит расти в будущем.

8. Заключительные замечания

Из опубликованных данных ясно, что промышленное производство витамина B12 с использованием штаммов Propionibacterium freudenreichii сопряжено с рядом проблем и недостатков, которые необходимо преодолеть, чтобы этот метод мог конкурировать с методами, использующими аэробные штаммы. Из всех рассмотренных примеров (табл. 1 и табл. 2) наибольшее объемное производство анаэробного штамма составило 76 мг/л (IN201827044769 A [111]), что явно уступает 250-280 мг/л, о которых сообщалось в различных исследованиях для аэробных штаммов (CN108949866 A [103], CN108913739 A [126], CN111254173 A [102]).

Однако необходимо учитывать особенности рынков, на которые ориентирован витамин B12, например, диетические добавки или обогащенные продукты питания и напитки. Многие конечные потребители витамина B12, помимо пациентов, страдающих пернициозной анемией или другими заболеваниями, являются веганами или вегетарианцами, а также людьми с высоким уровнем здоровья и экологической сознательности. В этом случае статус GRAS Propionibacterium freudenreichii и тот факт, что многие штаммы-производители являются микроорганизмами без ГМО, являются ценными активами, повышающими их рыночную привлекательность. Например, стратегии обогащения in situ могут стать экономически выгодным применением культур Propionibacterium freudenreichii в будущем. Эта возможность подкрепляется перспективными пробиотическими свойствами, описанными для некоторых штаммов Propionibacterium freudenreichii: модуляция микробиоты, иммуномодуляция и производство нескольких нутрицевтических соединений, таких как трегалоза, 1,4-дигидрокси-2-нафтойная кислота и короткоцепочечные жирные кислоты [142].

Кроме того, способность бактерии Propionibacterium freudenreichii синтезировать различные продукты, помимо витамина B12 (в основном пропионовую кислоту и небольшое количество трегалозы), также может повысить ее промышленную привлекательность. В настоящее время большая часть мирового производства пропионовой кислоты получается из сырой нефти в результате нефтехимических процессов, и было проведено множество исследований, направленных на поиск альтернативного процесса производства на биологической основе, который позволил бы маркировать этот продукт как "натуральный консервант" [143]. Таким образом, возможность создания биофабрики Propionibacterium freudenreichii с одновременным производством и извлечением как пропионовой кислоты, так и витамина B12, повысит промышленную и коммерческую целесообразность.

Помимо штаммов Pseudomonas denitrificans и Propionibacterium freudenreichii, широко изучались и другие возможные продуценты, такие как Sinorhizobium meliloti, различные штаммы Lactobacillus и даже E. coli (путем гетерологичной экспрессии биосинтетического пути). Пока что их продукция не является конкурентоспособной, что делает их неподходящей альтернативой для промышленного производства CNCbl. Тем не менее, будущие штаммы и стратегии могут обеспечить более совершенные процессы производства, что повысит их промышленную жизнеспособность, хотя их коммерческий успех может быть затруднен нормативными ограничениями и приемлемостью для потребителей.

Наконец, следует отметить, что в своем нынешнем состоянии производство CNCbl все еще неоптимально, и для дальнейшего развития его потенциала в качестве экономически эффективного и ценного промышленного биопроцесса необходимо преодолеть множество трудностей. Основное препятствие заключается в том, что даже у аэробных штаммов с высокой продуктивностью, таких как Pseudomonas denitrificans, объемные уровни производства часто составляют около 200-300 мг/л - гораздо меньше, чем при аналогичных процессах ферментации, например, для получения витамина B2. Кроме того, циклы ферментации являются длительными и дорогостоящими, в основном из-за необходимости использования дорогостоящих компонентов среды, таких как высокие концентрации комплексных источников азота и добавок, например, бетаина. Подача достаточного количества кобальта в бульон также может быть проблематичной с точки зрения затрат и экологии [144].

Для повышения экономической целесообразности и экологической устойчивости биотехнологического производства витамина В12 необходимо предпринять дальнейшие усилия в области биообработки, последующего производства и оптимизации состава питательных сред (с использованием более дешевых или переработанных компонентов). Однако главной проблемой по-прежнему остается низкая продуктивность имеющихся штаммов-продуцентов, обусловленная в основном жесткой генетической регуляцией производства Cbl: ингибированием оперонов cysG и cbi кобаламиновым рибосвитчем, а также другими процессами даунрегуляции [40,74,144]. Преодоление этого ограничения может потребовать генной инженерии, что может быть плохо воспринято конечными потребителями, в основном веганами и вегетарианцами, которые очень обеспокоены выбором своего рациона и использованием ГМО-организмов.


Дополнительно:

Примечание редактора: Технологии получения цианокобаламина совершенствуются до сих пор. Например, в 2023 г. была описана новая жизнеспособная стратегия для разработки будущих и устойчивых стратегий производства цианокобаламина (CNCbl) с использованием штаммов P. freudenreichii дикого типа без необходимости использования более сложных установок, таких как многофазные непрерывные биопроцессы или адсорбционные биореакторы с расширенным слоем для устранения пропионовой кислоты. Подробнее информация изложена в статье "Разработка стратегии одностадийного непрерывного технологического процесса для производства витамина B12 с помощью Propionibacterium freudenreichii" | См.: Álvaro Calvillo, et al. Developing a single-stage continuous process strategy for vitamin B12 production with Propionibacterium freudenreichii / Microb Cell Fact22, 26 (2023).

См. отдельно:

Литература

  1. Martens, H.; Barg, M.; Warren, D.; Jah, J.-H. Microbial Production of Vitamin B12Appl. Microbiol. Biotechnol. 200258, 275–285. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  2. Minot, G.R.; Murphy, W.P. Treatment of Pernicious Anemia by a Special Diet. J. Am. Med. Assoc. 192687, 1666. [Google Scholar] [CrossRef]
  3. Rickes, E.L.; Brink, N.G.; Koniuszy, F.R.; Wood, T.R.; Folkers, K. Crystalline Vitamin B12Science 1948107, 396–397. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  4. Smith, L. Purification of Anti-Pernicious Anemia Factors from Liver. Nature 1948161, 638–639. [Google Scholar] [CrossRef]
  5. Hodgkin, D.C.; Kamper, J.; Lindsey, J.; Mackay, M.; Pickworth, J.; Robertson, J.H.; Shoemaker, C.B.; White, J.G. The Structure of Vitamin B12. I. An Outline of the Crystallographic Investigation of Vitamin B12Proc. R. Soc. London Ser. A. Math. Phys. Sci. 1957242, 228–263. [Google Scholar] [CrossRef]
  6. Dixon, M.M.; Huang, S.; Matthews, R.G.; Ludwig, M. The Structure of the C-Terminal Domain of Methionine Synthase: Presenting S-Adenosylmethionine for Reductive Methylation of B12Structure 19964, 1263–1275. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  7. Mancia, F.; Keep, N.H.; Nakagawa, A.; Leadlay, P.F.; McSweeney, S.; Rasmussen, B.; Bösecke, P.; Diat, O.; Evans, P.R. How Coenzyme B12 Radicals Are Generated: The Crystal Structure of Methylmalonyl-Coenzyme A Mutase at 2 Å Resolution. Structure 19964, 339–350. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  8. Wuerges, J.; Garau, G.; Geremia, S.; Fedosov, S.N.; Petersen, T.E.; Randaccio, L. Structural Basis for Mammalian Vitamin B12 Transport by Transcobalmin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006103, 4386–4391. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  9. Mathews, F.S.; Gordon, M.M.; Chen, Z.; Rajashankar, K.R.; Ealick, S.E.; Alpers, D.H.; Sukumar, N. Crystal Structure of Human Intrinsic Factor: Cobalamin Complex at 2.6-Å Resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007104, 17311–17316. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  10. Alam, A.; Woo, J.S.; Schmitz, J.; Prinz, B.; Root, K.; Chen, F.; Bloch, J.S.; Zenobi, R.; Locher, K.P. Structural Basis of Transcobalamin Recognition by Human CD320 Receptor. Nat. Commun. 20167, 12100. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  11. Furger, E.; Frei, D.C.; Schibli, R.; Fischer, E.; Prota, A.E. Structural Basis for Universal Corrinoid Recognition by the Cobalamin Transport Protein Haptocorrin. J. Biol. Chem. 2013288, 25466–25476. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  12. Koutmos, M.; Gherasim, C.; Smith, J.L.; Banerjee, R. Structural Basis of Multifunctionality in a Vitamin B12- Processing Enzyme. J. Biol. Chem. 2011286, 29780–29787. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  13. Yamada, K.; Gherasim, C.; Banerjee, R.; Koutmos, M. Structure of Human B12 Trafficking Protein CblD Reveals Molecular Mimicry and Identifies a New Subfamily of Nitro-FMN Reductases. J. Biol. Chem. 2015290, 29155–29166. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  14. Xu, D.; Feng, Z.; Hou, W.T.; Jiang, Y.L.; Wang, L.; Sun, L.; Zhou, C.Z.; Chen, Y. Cryo-EM Structure of Human Lysosomal Cobalamin Exporter ABCD4. Cell Res. 201929, 1039–1041. [Google Scholar] [CrossRef]
  15. Schubert, H.L.; Hill, C.P. Structure of ATP-Bound Human ATP:Cobalamin Adenosyltransferase. Biochemistry 200645, 15188–15196. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  16. Woodward, R. The Total Synthesis of Vitamin B12Pure Appl. Chem. 197333, 145–177. [Google Scholar] [CrossRef]
  17. Eschenmoser, A.; Wintner, C.E. Natural Product Synthesis and Vitamin B12Science 1977196, 1410–1420. [Google Scholar] [CrossRef]
  18. Fink, R.G. Coenzyme B12-Based Chemical Precedent for Co-C Bond Homolysis and Other Key Elementary Steps; Krautler, B., Arigoni, D., Golding, B.T., Eds.; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 1998. [Google Scholar]
  19. Hannibal, L.; Axhemi, A.; Glushchenko, A.V.; Moreira, E.S.; Brasch, N.E.; Jacobsen, D.W. Accurate Assessment and Identification of Naturally Occurring Cellular Cobalamins Luciana. Clin. Chem. Lab. Med. 200846, 1739–1746. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  20. Juzeniene, A.; Nizauskaite, Z. Photodegradation of Cobalamins in Aqueous Solutions and in Human Blood. J. Photochem. Photobiol. B Biol. 2013122, 7–14. [Google Scholar] [CrossRef]
  21. Hogenkamp, H.P.C.; Vergamini, P.J.; Matwiyoff, N.A. The Effect of Temperature and Light on the Carbon43 Nuclear Magnetic Resonance Spectra of Alkylcorrinoids, Selectively Enriched with Carbon-13. J. Chem. SOC. (A) 197523, 2628–2633. [Google Scholar] [CrossRef]
  22. Obeid, R.; Fedosov, S.N.; Nexo, E. Cobalamin Coenzyme Forms Are Not Likely to Be Superior to Cyano- and Hydroxyl-Cobalamin in Prevention or Treatment of Cobalamin Deficiency. Mol. Nutr. Food Res. 201559, 1364–1372. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  23. Roth, J.R.; Lawrence, J.G.; Bobik, T.A. Cobalamin (Coenzyme B12): Synthesis and Biological Significance. Annu. Rev. Microbiol. 199650, 137–181. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
  24. Leeper, F.J. The Biosynthesis of Porphyrins, Chlorophylls, and Vitamin B12Nat. Prod. Rep. 19896, 171–203. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  25. Thibaut, D.; Blanche, F.; Cameron, B.; Crouzet, J.; Debussche, L.; Remy, E.; Vuilhorgne, M. Vitamin B12 Biosynthesis in Pseudomonas denitrificans. In Vitamin B12, and B12-Proteins; Kräutler, B., Arigoni, D., Golding, B.T., Eds.; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 1998; pp. 63–79. [Google Scholar]
  26. Crouzet, J.; Cauchois, L.; Blanche, F.; Debussche, L.; Thibaut, D.; Rouyez, M.C.; Rigault, S.; Mayaux, J.F.; Cameron, B. Nucleotide Sequence of a Pseudomonas Dentrificans 5.4-Kilobase DNA Fragment Containing Five Cob Genes and Identification of Structural Genes Encoding S-Adenosyl-L-Methionine: Uroporphyrinogen III Methyltransferase and Cobyrinic Acid a,c-Diamide Synthase. J. Bacteriol. 1990172, 5968–5979. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
  27. Stamford, N.P.J.; Duggan, S.; Li, Y.; Alanine, A.I.D.; Crouzet, J.; Battersby, A.R. Biosynthesis of Vitamin B12: The Multi-Enzyme Synthesis of Precorrin-4 and Factor IV. Chem. Biol. 19974, 445–451. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  28. Moore, S.J.; Warren, M.J. The Anaerobic Biosynthesis of Vitamin B12Biochem. Soc. Trans. 201240, 581–586. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  29. Jaffe, E.K. The Porphobilinogen Synthase Family of Metalloenzymes. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 200056, 115–128. [Google Scholar] [CrossRef]
  30. Jordan, P.M. The Biosynthesis of 5-Aminolaevulinic Acid and Its Transformation into Uroporphyrinogen III. In New Comprehensive Biochemistry; Krebs, J., Michalak, M., Eds.; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 1991; Volume 19, pp. 1–66. [Google Scholar]
  31. Raux, E.; Schubert, H.L.; Warren, M.J. Biosynthesis of Cobalamin (Vitamin B12): A Bacterial Conundrum. Cell. Mol. Life Sci. 200057, 1880–1893. [Google Scholar] [CrossRef]
  32. Warren, M.J.; Raux, E.; Schubert, H.L.; Escalante-Semerena, J.C. The Biosynthesis of Adenosylcobalamin (Vitamin B12). Nat. Prod. Rep. 200219, 390–412. [Google Scholar] [CrossRef]
  33. Debussche, L.; Couder, M.; Thibaut, D.; Cameron, B.; Crouzet, J.; Blanche, F. Assay, Purification, and Characterization of Cobaltochelatase, a Unique Complex Enzyme Catalyzing Cobalt Insertion in Hydrogenobyrinic Acid a,c- Diamide during Coenzyme B12 Biosynthesis in Pseudomonas denitrificansJ. Bacteriol. 1992174, 7445–7451. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  34. Mathur, Y.; Sreyas, S.; Datar, P.M.; Sathian, M.B.; Hazra, A.B. CobT and BzaC Catalyze the Regiospecific Activation and Methylation of the 5-Hydroxybenzimidazole Lower Ligand in Anaerobic Cobamide Biosynthesis. J. Biol. Chem. 2020295, 10522–10534. [Google Scholar] [CrossRef]
  35. Campbell, G.R.O.; Taga, M.E.; Mistry, K.; Lloret, J.; Anderson, P.J.; Roth, J.R.; Walker, G.C. Sinorhizobium Meliloti BluB Is Necessary for Production of 5,6-Dimethylbenzimidazole, the Lower Ligand of B12Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006103, 4634–4639. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  36. Balabanova, L.; Averianova, L.; Marchenok, M.; Son, O.; Tekutyeva, L. Microbial and Genetic Resources for Cobalamin (Vitamin B12) Biosynthesis: From Ecosystems to Industrial Biotechnology. Int. J. Mol. Sci. 202122, 4522. [Google Scholar] [CrossRef]
  37. Deptula, P.; Kylli, P.; Chamlagain, B.; Holm, L.; Kostiainen, R.; Piironen, V.; Savijoki, K.; Varmanen, P. BluB/CobT2 Fusion Enzyme Activity Reveals Mechanisms Responsible for Production of Active Form of Vitamin B12 by Propionibacterium freudenreichiiMicrob. Cell Factories 201514, 186. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  38. Nguyen-Vo, T.P.; Ainala, S.K.; Kim, J.R.; Park, S. Analysis, Characterization of Coenzyme B12 Biosynthetic Gene Clusters and Improvement of B12 Biosynthesis in Pseudomonas denitrificans ATCC 13867. FEMS Microbiol. Lett. 2018365, fny211. [Google Scholar] [CrossRef]
  39. Hazra, A.B.; Han, A.W.; Mehta, A.P.; Mok, K.C.; Osadchiy, V.; Begley, T.P.; Taga, M.E. Anaerobic Biosynthesis of the Lower Ligand of Vitamin B12Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015112, 10792–10797. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  40. Fang, H.; Kang, J.; Zhang, D. Microbial Production of Vitamin B12: A Review and Future Perspectives. Microb. Cell Fact. 201716, 15. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  41. Sobczyńska-Malefora, A.; Delvin, E.; McCaddon, A.; Ahmadi, K.R.; Harrington, D.J. Vitamin B12 Status in Health and Disease: A Critical Review. Diagnosis of Deficiency and Insufficiency–Clinical and Laboratory Pitfalls. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 202158, 399–429. [Google Scholar] [CrossRef]
  42. Hardlei, T.F.; Obeid, R.; Herrmann, W.; Nexo, E. Cobalamin Analogues in Humans: A Study on Maternal and Cord Blood. PLoS ONE 20138, e61194. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  43. Kojima, I. Process for Producing Vitamin B12 by the Fermentation Technique, and Vitamin B12-Producing Microorganism. U.S. Patent 4,544,633, 1 October 1985. [Google Scholar]
  44. Piao, Y.; Yamashita, M.; Kawaraichi, N.; Asegawa, R.; Ono, H.; Murooka, Y. Production of Vitamin B12 in Genetically Engineered Propionibacterium freudenreichiiJ. Biosci. Bioeng. 200498, 167–173. [Google Scholar] [CrossRef]
  45. Piao, Y.; Kiatpapan, P.; Yamashita, M.; Murooka, Y. Effects of Expression of HemA and HemB Genes on Production of Porphyrin in Propionibacterium freudenreichiiAppl. Environ. Microbiol. 200470, 7561–7566. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  46. Biedendieck, R.; Malten, M.; Barg, H.; Bunk, B.; Martens, J.H.; Deery, E.; Leech, H.; Warren, M.J.; Jahn, D. Metabolic Engineering of Cobalamin (Vitamin B12) Production in Bacillus Megaterium. Microb. Biotechnol. 20103, 24–37. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
  47. Mohammed, Y.; Lee, B.; Kang, Z.; Du, G. Development of a Two-Step Cultivation Strategy for the Production of Vitamin B12 by Bacillus Megaterium. Microb. Cell Factories 201413, 102. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  48. Bernhardt, C.; Zhu, X.; Schütz, D.; Fischer, M.; Bisping, B. Cobalamin Is Produced by Acetobacter Pasteurianus DSM 3509. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019103, 3875–3885. [Google Scholar] [CrossRef]
  49. Gu, Q.; Zhang, C.; Song, D.; Li, P.; Zhu, X. Enhancing Vitamin B12 Content in Soy-Yogurt by Lactobacillus Reuteri. Int. J. Food Microbiol. 2015206, 56–59. [Google Scholar] [CrossRef]
  50. Thirupathaiah, Y.; Rani, C.S.; Reddy, M.S.; Venkateswar Rao, L. Effect of Chemical and Microbial Vitamin B12 Analogues on Production of Vitamin B12World J. Microbiol. Biotechnol. 201228, 2267–2271. [Google Scholar] [CrossRef]
  51. Wang, P.; Shen, C.; Li, L.; Guo, J.; Cong, Q.; Lu, J. Simultaneous Production of Propionic Acid and Vitamin B12 from Corn Stalk Hydrolysates by Propionibacterium freudenreichii in an Expanded Bed Adsorption Bioreactor. Prep. Biochem. Biotechnol. 202050, 763–767. [Google Scholar] [CrossRef]
  52. Wang, P.; Wang, Y.; Liu, Y.; Shi, H.; Su, Z. Novel in Situ Product Removal Technique for Simultaneous Production of Propionic Acid and Vitamin B12 by Expanded Bed Adsorption Bioreactor. Bioresour. Technol. 2012104, 652–659. [Google Scholar] [CrossRef]
  53. Wang, P.; Zhang, Z.; Jiao, Y.; Liu, S.; Wang, Y. Improved Propionic Acid and 5,6-Dimethylbenzimidazole Control Strategy for Vitamin B12 Fermentation by Propionibacterium freudenreichiiJ. Biotechnol. 2015193, 123–129. [Google Scholar] [CrossRef]
  54. Wang, P.; Jiao, Y.; Liu, S. Novel Fermentation Process Strengthening Strategy for Production of Propionic Acid and Vitamin B12 by Propionibacterium freudenreichiiJ. Ind. Microbiol. Biotechnol. 201441, 1811–1815. [Google Scholar] [CrossRef]
  55. Hugenschmidt, S.; Schwenninger, S.M.; Lacroix, C. Concurrent High Production of Natural Folate and Vitamin B12 Using a Co-Culture Process with Lactobacillus Plantarum SM39 and Propionibacterium freudenreichii DF13. Process Biochem. 201146, 1063–1070. [Google Scholar] [CrossRef]
  56. Xie, C.; Coda, R.; Chamlagain, B.; Varmanen, P.; Piironen, V.; Katina, K. Co-Fermentation of Propionibacterium freudenreichiiand Lactobacillus Brevisin Wheat Bran for in Situproduction of Vitamin B12Front. Microbiol. 201910, 1541. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  57. Miyano, K.I.; Ye, K.; Shimizu, K. Improvement of Vitamin B12 Fermentation by Reducing the Inhibitory Metabolites by Cell Recycle System and a Mixed Culture. Biochem. Eng. J. 20006, 207–214. [Google Scholar] [CrossRef]
  58. Hajfarajollah, H.; Mokhtarani, B.; Mortaheb, H.; Afaghi, A. Vitamin B12 Biosynthesis over Waste Frying Sunflower Oil as a Cost Effective and Renewable Substrate. J. Food Sci. Technol. 201552, 3273–3282. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
  59. Pillai, V.V.; Prakash, G.; Lali, A.M. Growth Engineering of Propionibacterium freudenreichii Shermanii for Organic Acids and Other Value-Added Products Formation. Prep. Biochem. Biotechnol. 201848, 6–12. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  60. Wang, P.; Wang, Y.; Su, Z. Improvement of Adenosylcobalamin Production by Metabolic Control Strategy in Propionibacterium freudenreichiiAppl. Biochem. Biotechnol. 2012167, 62–72. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  61. Kośmider, A.; Białas, W.; Kubiak, P.; Drozdzyńska, A.; Czaczyk, K. Vitamin B12 Production from Crude Glycerol by Propionibacterium freudenreichii ssp. Shermanii: Optimization of Medium Composition through Statistical Experimental Designs. Bioresour. Technol. 2012105, 128–133. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  62. Chamlagain, B.; Deptula, P.; Edelmann, M.; Kariluoto, S.; Grattepanche, F.; Lacroix, C.; Varmanen, P.; Piironen, V. Effect of the Lower Ligand Precursors on Vitamin B12 Production by Food-Grade Propionibacteria. LWT-Food Sci. Technol. 201672, 117–124. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  63. Chamlagain, B.; Sugito, T.A.; Deptula, P.; Edelmann, M.; Kariluoto, S.; Varmanen, P.; Piironen, V. In Situ Production of Active Vitamin B12 in Cereal Matrices Using Propionibacterium freudenreichiiFood Sci. Nutr. 20186, 67–76. [Google Scholar] [CrossRef]
  64. Deptula, P.; Chamlagain, B.; Edelmann, M.; Sangsuwan, P.; Nyman, T.A.; Savijoki, K.; Piironen, V.; Varmanen, P. Food-like Growth Conditions Support Production of Active Vitamin B12 by Propionibacterium freudenreichii 2067 without DMBI, the Lower Ligand Base, or Cobalt Supplementation. Front. Microbiol. 20178, 368. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  65. Liu, J.; Liu, Y.; Wu, J.; Fang, H.; Jin, Z.; Zhang, D. Metabolic Profiling Analysis of the Vitamin B12 Producer Propionibacterium freudenreichiiMicrobiologyopen 202110, e1199. [Google Scholar] [CrossRef]
  66. Zhang, Y.; Li, X.; Wang, Z.; Wang, Y.; Ma, Y.; Su, Z. Metabolic Flux Analysis of Simultaneous Production of Vitamin B12 and Propionic Acid in a Coupled Fermentation Process by Propionibacterium freudenreichiiAppl. Biochem. Biotechnol. 2021193, 3045–3061. [Google Scholar] [CrossRef]
  67. Cheng, X.; Chen, W.; Peng, W.; Li, K. Improved Vitamin B12 Fermentation Process by Adding Rotenone to Regulate the Metabolism of Pseudomonas denitrificansAppl. Biochem. Biotechnol. 2014173, 673–681. [Google Scholar] [CrossRef]
  68. Li, K.T.; Liu, D.H.; Li, Y.L.; Chu, J.; Wang, Y.H.; Zhuang, Y.P.; Zhang, S.L. An Effective and Simplified PH-Stat Control Strategy for the Industrial Fermentation of Vitamin B12 by Pseudomonas denitrificansBioprocess Biosyst. Eng. 200831, 605–610. [Google Scholar] [CrossRef]
  69. Wang, Z.; Wang, H.; Li, Y.; Chu, J.; Huang, M.; Zhuang, Y.; Zhang, S. Improved Vitamin B12 Production by Step-Wise Reduction of Oxygen Uptake Rate under Dissolved Oxygen Limiting Level during Fermentation Process. Bioresour. Technol. 2010101, 2845–2852. [Google Scholar] [CrossRef]
  70. Wang, Z.; Shi, H.; Wang, P. The Online Morphology Control and Dynamic Studies on Improving Vitamin B12 Production by Pseudomonas denitrificans with Online Capacitance and Specific Oxygen Consumption Rate. Appl. Biochem. Biotechnol. 2016179, 1115–1127. [Google Scholar] [CrossRef]
  71. Xia, W.; Wei, P.; Kun, C. Interactive Performances of Betaine on the Metabolic Processes of Pseudomonas denitrificansJ. Ind. Microbiol. Biotechnol. 201442, 273–278. [Google Scholar] [CrossRef]
  72. Xia, W.; Chen, W. Industrial Vitamin B12 Production by Pseudomonas denitrificans Using Maltose Syrup and Corn Steep Liquor as the Cost-Effective Fermentation Substrates. Bioprocess Biosyst. Eng. 201538, 1065–1073. [Google Scholar] [CrossRef]
  73. Li, K.T.; Zhou, J.; Cheng, X.; Wei, S.J. Study on the Dissolved Oxygen Control Strategy in Large-Scale Vitamin B12 Fermentation by Pseudomonas denitrificansJ. Chem. Technol. Biotechnol. 201287, 1648–1653. [Google Scholar] [CrossRef]
  74. Vandamme, E.J.; Revuelta, J.L. (Eds.) Industrial Biotechnology of Vitamins, Biopigments, and Antioxidants; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 2016; ISBN 9783527681754. [Google Scholar]
  75. CEIC. China Production: Year to Date: Vitamin E. Available online: https://www.ceicdata.com/en/china/pharmaceuticalproduction-ytd-antiparasitics-vitamins-and-minerals/cn-production-ytd-vitamin-e (accessed on 21 June 2022).
  76. Li, K.T.; Liu, D.H.; Li, Y.L.; Chu, J.; Wang, Y.H.; Zhuang, Y.P.; Zhang, S.L. Improved Large-Scale Production of Vitamin B12 by Pseudomonas denitrificans with Betaine Feeding. Bioresour. Technol. 200899, 8516–8520. [Google Scholar] [CrossRef]
  77. Li, K.T.; Liu, D.H.; Li, Y.L.; Chu, J.; Wang, Y.H.; Zhuang, Y.P.; Zhang, S.L. Influence of Zn2+, Co2+ and Dimethylbenzimidazole on Vitamin B12 Biosynthesis by Pseudomonas denitrificansWorld J. Microbiol. Biotechnol. 200824, 2525–2530. [Google Scholar] [CrossRef]
  78. Kusel, J.; Fa, Y.; Demain, A. Betaine Stimulation of Vitamin B12 Biosynthesis in Pseudomonas denitrificans May Be Mediated by an Increase in Activity of δ-Aminolaevulinic Acid Synthase. J. Gen. Microbiol. 1984130, 835–841. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  79. Zhang, Y.; Liu, J.Z.; Huang, J.S.; Mao, Z.W. Genome Shuffling of Propionibacterium shermanii for Improving Vitamin B12 Production and Comparative Proteome Analysis. J. Biotechnol. 2010148, 139–143. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  80. Gray, M.J.; Escalante-Semerena, J.C. Single-Enzyme Conversion of FMNH2 to 5,6-Dimethylbenzimidazole, the Lower Ligand of B12Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007104, 2921–2926. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  81. Signorini, C.; Carpen, A.; Coletto, L.; Borgonovo, G.; Galanti, E.; Capraro, J.; Magni, C.; Abate, A.; Johnson, S.K.; Duranti, M.; et al. Enhanced Vitamin B12 Production in an Innovative Lupin Tempeh Is Due to Synergic Effects of Rhizopus and Propionibacterium in Cofermentation. Int. J. Food Sci. Nutr. 201869, 451–457. [Google Scholar] [CrossRef]
  82. Zheng, J.; Wittouck, S.; Salvetti, E.; Franz, C.M.A.P.; Harris, H.M.B.; Mattarelli, P.; O’toole, P.W.; Pot, B.; Vandamme, P.; Walter, J.; et al. A Taxonomic Note on the Genus Lactobacillus: Description of 23 Novel Genera, Emended Description of the Genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and Union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 202070, 2782–2858. [Google Scholar] [CrossRef]
  83. Frettloeh Martin Sequential Co-Culturing Method for Producing a Vitamin- and Protein-Rich Food Product. U.S. Patent 2020-0149084 A1, 14 May 2020.
  84. Quesada-Chanto, A.; Afschar, A.S.; Wagner, F. Microbial Production of Propionic Acid and Vitamin B12 Using Molasses or Sugar. Appl. Microbiol. Biotechnol. 199441, 378–383. [Google Scholar] [CrossRef]
  85. Haddadin, M.S.Y.; Abu-Reesh, I.M.; Haddadin, F.A.S.; Robinson, R.K. Utilisation of Tomato Pomace as a Substrate for the Production of Vitamin B12—A Preliminary Appraisal. Bioresour. Technol. 200178, 225–230. [Google Scholar] [CrossRef]
  86. Assis, D.A.D.; Matte, C.; Aschidamini, B.; Rodrigues, E.; Záchia Ayub, M.A. Biosynthesis of Vitamin B12 by Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii ATCC 13673 Using Liquid Acid Protein Residue of Soybean as Culture Medium. Biotechnol. Prog. 202036, e3011. [Google Scholar] [CrossRef]
  87. Gardner, N.; Champagne, C.P. Production of Propionibacterium Shermanii Biomass and Vitamin B12 on Spent Media. J. Appl. Microbiol. 200599, 1236–1245. [Google Scholar] [CrossRef]
  88. Moine, G.; Hohmann, H.-P.; Kurth, R.; Paust, J.; Hähnlein, W.; Pauling, H.; Weimann, B.-J.; Kaesler, B. Vitamins, 6. B Vitamins. In Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry; Wiley-VCH GmbH & Co. KGaA: Weinheim, Germany, 2011. [Google Scholar]
  89. Survase, S.A.; Bajaj, I.B.; Singhal, R.S. Biotechnological Production of Vitamins. Food Technol. Biotechnol. 200644, 381–396. [Google Scholar]
  90. Nielsen, M.J.; Rasmussen, M.R.; Andersen, C.B.F.; Nexø, E.; Moestrup, S.K. Vitamin B12 Transport from Food to the Body’s Cells—A Sophisticated, Multistep Pathway. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 20129, 345–354. [Google Scholar] [CrossRef]
  91. Berlin, H.; Berlin, R.; Brante, G. Oral Treatment of Pernicious Anemia with High Doses of Vitamin B12 without Intrinsic Factor. Acta Med. Scand. 1968184, 247–258. [Google Scholar] [CrossRef]
  92. Gamboa, J.M.; Leong, K.W. In vitro and in vivo Models for the Study of Oral Delivery of Nanoparticles. Adv. Drug Deliv. Rev. 201365, 800–810. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  93. Dhakal, S.P.; He, J. Microencapsulation of Vitamins in Food Applications to Prevent Losses in Processing and Storage: A Review. Food Res. Int. 2020137, 109326. [Google Scholar] [CrossRef]
  94. Matos, M.; Gutiérrez, G.; Iglesias, O.; Coca, J.; Pazos, C. Enhancing Encapsulation Efficiency of Food-Grade Double Emulsions Containing Resveratrol or Vitamin B12 by Membrane Emulsification. J. Food Eng. 2015166, 212–220. [Google Scholar] [CrossRef]
  95. Ramalho, M.J.; Loureiro, J.A.; Pereira, M.C. Poly (Lactic-Co-Glycolic Acid) Nanoparticles for the Encapsulation and Gastrointestinal Release of Vitamin B9 and Vitamin B12ACS Appl. Nano Mater. 20214, 6881–6892. [Google Scholar] [CrossRef]
  96. Bochicchio, S.; Barba, A.A.; Grassi, G.; Lamberti, G. Vitamin Delivery: Carriers Based on Nanoliposomes Produced via Ultrasonic Irradiation. LWT-Food Sci. Technol. 201669, 9–16. [Google Scholar] [CrossRef]
  97. Estevinho, B.N.; Mota, R.; Leite, J.P.; Tamagnini, P.; Gales, L.; Rocha, F. Application of a Cyanobacterial Extracellular Polymeric Substance in the Microencapsulation of Vitamin B12Powder Technol. 2019343, 644–651. [Google Scholar] [CrossRef]
  98. Carlan, I.C.; Estevinho, B.N.; Rocha, F. Study of Microencapsulation and Controlled Release of Modified Chitosan Microparticles Containing Vitamin B12Powder Technol. 2017318, 162–169. [Google Scholar] [CrossRef]
  99. Fidaleo, M.; Tacconi, S.; Sbarigia, C.; Passeri, D.; Rossi, M.; Tata, A.M.; Dini, L. Current Nanocarrier Strategies Improve Vitamin B12 Pharmacokinetics, Ameliorate Patients’ Lives, and Reduce Costs. Nanomaterials 202111, 743. [Google Scholar] [CrossRef]
  100. Long, R.A. Production of Vitamin B12. U.S. Patent 3,018,225, 23 January 1962. [Google Scholar]
  101. Crouzet, J.; Debussche, L.; Schil, S.L.; Thibaut, D. Methods of Increasing the Production of Cobalamins Using Cob Gene Expression. U.S. Patent 2006/0019352 A1, 26 January 2006. [Google Scholar]
  102. Zhendong, L.; Qing, C.; Weikai, X.; Hua, L.; Lulu, Y. Screening Method and Screening Culture Medium for Bacterial Strain for High Yield of Vitamin B12 Produced through Fermentation Production with Pseudomonas denitrificans. CN Patent 111254173 A, 9 June 2020. [Google Scholar]
  103. Yonggan, H.; Yanmao, L.; Hui, L.; Xin, W. Multi-Stage Rotating Speed Regulating Policy for Improving Pseudomonas denitrificans Fermentation for Production of Vitamin B12. CN Patent 108949866 A, 7 December 2018. [Google Scholar]
  104. Wang, J.; Wang, J.; Hanzhong, L.; Yanxia, C.; Mu, Q.; Yingran, L.; Xueran, L.; Jingkun, Z.; Hong, W.; Yuan, Y. Method for Improving Yield of Vitamin B12 Based of Regulation of Ammonia Nitrogen Index. CN Patent 110205350 A, 6 September 2019. [Google Scholar]
  105. Ruiyan, L.; Jiexi, M.; Wei, L.; Caixia, Z.; Fengyu, K. Method for Promoting Pseudomonas denitrificans to Generate Vitamin B12. CN Patent 109837320 A, 4 June 2019. [Google Scholar]
  106. Pengdong, H.; Lizhong, P.; Hongwei, G.; Yi, S.; Qiong, M. Preparation Method of Vitamin B12 Crude Product. CN Patent 111808158 A, 23 October 2020. [Google Scholar]
  107. Hunik, J.H. Process for the Production of Vitamin B12. U.S. Patent 6,492,141 B1, 10 December 2002. [Google Scholar]
  108. Michelle, I.; Adams, C. Probiotic Propionibacterium. U.S. Patent 7.427,397 B2, 23 September 2008. [Google Scholar]
  109. Gregor, K.; Stefan, F.; Mirjan, S.; Hrvoje, P. Co-Cultivation of Propionibacterium and Yeast. U.S. Patent 9,938,554, 10 April 2018. [Google Scholar]
  110. Zhiguo, W.Z.; Guoxia, X.; Liquan, W.; Yunshan, W.S. Device for Producing Propionic Acid and Co-Producing Vitamin B12 by Semi-Continuous Fermentation 2017. CN Patent 206828509 U, 2 January 2018. [Google Scholar]
  111. Mallinath, L.A.; Pillai, V. Continuous Process for Co-Production of Vitamin B12 and Organic Acids. IN Patent 201827044769, 2 October 2020. [Google Scholar]
  112. Garibaldi, J.A.; Kosuke, I.; Lewis, J.C.; Mcginnis, J. Fermentation Process for Production of Vitamin B12. U.S. Patent 2576,932, 4 December 1994. [Google Scholar]
  113. Mogna, G.; Paolo Strozzi, G.; Mogna, L. Vitamin B12 Producing Lactobacillus Reuteri Strains 201. International Patent 2011/154820 A2, 15 December 2011. [Google Scholar]
  114. Dawei, Z.; Miaomiao, X.; Sha, L.; Wenjuan, Z.; Ping, Z.; Huan, F. Sinorhizobium Meliloti Strain and Composition and Application of Sinorhizobium Meliloti Strain. CN Patent 104342390 A, 11 February 2015. [Google Scholar]
  115. Dawei, Z.; Huina, D. Procorrin-2C(20)-Methyltransferase Mutant and Mutant Gene and Application Thereof in Preparing Vitamin B12 2020. CN Patent 110804598 A, 18 February 2020. [Google Scholar]
  116. Zhang, D.; Fang, H. Recombinant Strain of Escherichia Coli for de Novo Synthesis of Vitamin B12, Construction Method Therefor and Application Thereof. International Patent 2019/109975A1, 13 June 2019. [Google Scholar]
  117. Bijl, H.L. Production and Use of Compositions Comprising High Concentrations of Vitamin B12 Activity. U.S. Patent 6,187,761 B1, 13 February 2001. [Google Scholar]
  118. Hugenschmidt, S.; Miescher Schwenninger, S.; Lacroix, C. Process for the Preparation of a Fermentation Broth. EU Patent 2 376 644 B1, 23 April 2014. [Google Scholar]
  119. Mansour, M. Modified Propionibacterium and Methods of Use. International Patent 2021/041759, 4 March 2021. [Google Scholar]
  120. Remy, E.; Examiner, P.; Achutamurthy, P. Biosynthesis Method Enabling the Preparation of Cobalamins. U.S. Patent 6,156,545, 5 December 2000. [Google Scholar]
  121. Zhang, S.; Zhao, Q.; Li, K.; Liu, D.; Hongzhuang, Y.; Wang, Z.; Li, Y. Method for Improving Yield of Denitrified Pseudomonas Vitamin B12. CN Patent 101538599 A, 23 September 2009. [Google Scholar]
  122. Zhang, S.; Chen, X.; Li, Y.; Zhenguo, W.; Xie, L.; Cao, Y.; Tang, L.; Wang, Z.; Zhuang, Y. Vitamin B12 Fermentation Production Control Process Based on CO2 Concentration in Tail Gas. CN Patent 102399845 A, 13 September 2010. [Google Scholar]
  123. Zhang, S.; Zhang, Y.; Wang, Z.; Wang, H.; Zhuang, Y.; Chu, J.; Siliang, Z.; Yiming, Z.; Yinping, Z.; Huiyuan, W.; et al. Optimized Method for Producing Vitamin B12 through Pseudomonas denitrificans Fermentation and Synthetic Medium. CN Patent 101748177 A, 9 December 2008. [Google Scholar]
  124. Wang, H.; Chu, J.; Wang, Z.; Zhuang, Y.; Zhang, S.; Zejian, W.; Huiyan, W.; Yingping, Z.; Siliang, Z.; Ju, C. Oxygen Consumption Rate-Based Vitamin B12 Fermentation Production Control Process. CN Patent 102021214 A, 22 September 2009. [Google Scholar]
  125. Ren, Y.; Leng, X.; Wang, Y.; Qi, N.; Dong, Y.; Xiaohong, L.; Nai, Q.; Yong, R.; Youshan, W.; Yuan, D. Culture Medium for Producing Vitamin B12 by Fermenting Pseudomonas denitrificans and Fermentation Method Thereof. CN Patent 102453740 A, 16 May 2012. [Google Scholar]
  126. Ju, Y.; Yang, H.; Yanmao, L.; Guangyong, Z. Method for Producing Vitamin B12 by Using Pseudomonas denitrificans Based on PH Value Control. CN Patent 108913739 A, 30 November 2018. [Google Scholar]
  127. Mcdaniel, L.E.; Harold, B. Cyanide Ion in Production of Vitamin B12. U.S. Patent 2,650,896, 1 September 1953. [Google Scholar]
  128. Takaaki, M.; Zhenya, Z. Method for Producing Vitamin B12 from Hydrogen-Metabolizing Methane Bacte-Rium. U.S. Patent 2005/0227332 A1, 13 October 2005. [Google Scholar]
  129. Barg, H.; Jahn, D. Method for the Production of Vitamin B12. U.S. Patent 2006/0105432 A1, 18 May 2006. [Google Scholar]
  130. Rychen, G.; Aquilina, G.; Azimonti, G.; Bampidis, V.; Bastos, M.D.L.; Bories, G.; Chesson, A.; Cocconcelli, P.S.; Flachowsky, G.; Gropp, J.; et al. Safety and Efficacy of Vitamin B12 (in the Form of Cyanocobalamin) Produced by Ensifer spp. as a Feed Additive for All Animal Species Based on a Dossier Submitted by VITAC EEIG. EFSA J. 201816, e05336. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  131. Rizzo, G.; Laganà, A.S.; Rapisarda, A.M.C.; la Ferrera, G.M.G.; Buscema, M.; Rossetti, P.; Nigro, A.; Muscia, V.; Valenti, G.; Sapia, F.; et al. Vitamin B12 among Vegetarians: Status, Assessment and Supplementation. Nutrients 20168, 767. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  132. Watanabe, F.; Yabuta, Y.; Tanioka, Y.; Bito, T. Biologically Active Vitamin B12 Compounds in Foods for Preventing Deficiency among Vegetarians and Elderly Subjects. J. Agric. Food Chem. 201361, 6769–6775. [Google Scholar] [CrossRef]
  133. Titcomb, T.J.; Tanumihardjo, S.A. Global Concerns with B Vitamin Statuses: Biofortification, Fortification, Hidden Hunger, Interactions, and Toxicity. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 201918, 1968–1984. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  134. Oh, S.; Cave, G.; Lu, C. Vitamin B12 (Cobalamin) and Micronutrient Fortification in Food Crops Using Nanoparticle Technology. Front. Plant Sci. 202112, 1451. [Google Scholar] [CrossRef]
  135. Pawlak, R.; Rusher, D.R. A Review of 89 Published Case Studies of Vitamin B12 Deficiency. J. Hum. Nutr. Food Sci. 20131, 1008. [Google Scholar]
  136. Watkins, D.; Rosenblatt, D.S. Inborn Errors of Cobalamin Absorption and Metabolism. Am. J. Med. Genet. Part C Semin. Med. Genet. 2011157, 33–44. [Google Scholar] [CrossRef]
  137. Shepherd, G.; Velez, L.I. Role of Hydroxocobalamin in Acute Cyanide Poisoning. Ann. Pharmacother. 200842, 661–669. [Google Scholar] [CrossRef]
  138. Linnell, J.C.; Smith, A.D.; Smith, C.L.; Wilson, M.J.; Matthews, D.M. Effects of Smoking on Metabolism and Excretion of Vitamin B12BMJ 19682, 215–216. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] [Green Version]
  139. Allen, L.; Rosenberg, I.; Oakley, G.; Omenn, S. Considering the Case for Vitamin B12 Fortification of Flour. Food Nutr. Bull. 201031 (Suppl. S1), S36–S46. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  140. Hamel, J. A Review of Acute Cyanide Poisoning with a Treatment Update. Crit. Care Nurse 201131, 72–82. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  141. Reports and Data Vitamin B12 (Cobalamin) Market to Reach USD 409.7 Million By 2027. Available online: https://www.globenewswire.com/news-release/2020/08/26/2084313/0/en/Vitamin-B12-Cobalamin-Market-To-Reach-USD-409-7-Million-By-2027-Reports-and-Data.html (accessed on 22 April 2022).
  142. Rabah, H.; Rosa do Carmo, F.L.; Jan, G. Dairy Propionibacteria: Versatile Probiotics. Microorganisms 20175, 24. [Google Scholar] [CrossRef] [Green Version]
  143. Zhou, X.; Li, Y. (Eds.) Atlas of Oral Microbiology: From Healthy Microflora to Disease; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2015. [Google Scholar]
  144. Acevedo-Rocha, C.G.; Gronenberg, L.S.; Mack, M.; Commichau, F.M.; Genee, H.J. Microbial Cell Factories for the Sustainable Manufacturing of B Vitamins. Curr. Opin. Biotechnol. 201956, 18–29. [Google Scholar] [CrossRef].

Будьте здоровы!

Перейти к ссылкам к основным разделам

ссылки к основным разделам

Этот сайт использует файлы cookie и метаданные. Продолжая просматривать его, вы соглашаетесь на использование нами файлов cookie и метаданных в соответствии с Политикой конфиденциальности.
Продолжить