Главная \ 2. Закваски домашние \ Технология получения бактериальных концентратов \ Жизнеспособность бифидобактерий после распылительной и сублимационной сушки

Жизнеспособность бифидобактерий после сушки

Жизнеспособность бифидобактерий после распылительной и сублимационной сушки

лабораторное оборудование для сублимационной сушки

На рисунке лаб. оборудование: 1. Роторные концентраторы вакуума для фарм. исследований; 2. Системы сублимационной сушки для исследований, с ледовым конденсатором емкостью от 2 до 24 кг; 3. Пилотные системы сублимационной сушки для оптимизации технологических процессов, с ледовым конденсатором емкостью от 4 до 16 кг.


Вступление

Бифидобактерии, преобладающий род в стуле грудных детей, прошли долгий путь [1]. Он широко используется в качестве пробиотических пищевых добавок с полезными для здоровья свойствами. Бифидобактерии широко используются в йогуртах, кисломолочных напитках, сырах или в качестве пищевых добавок в форме сухих продуктов [2].

Для того чтобы пробиотик приносил пользу здоровью хозяина, жизненно важное значение имеет жизнеспособность штамма [3,4]. Рекомендуемое минимальное количество живых микроорганизмов в пробиотических продуктах составляет 106 на грамм (в др. рекомендациях109 на грамм – ред.) [3,4]. Обычный метод использования исходных культур с несколькими стадиями субкультивирования для приготовления «сыпучих заквасок» занимает много времени с более высоким риском загрязнения. С прогрессом в технологии клеточного массового производства разработка концентрированных заквасочных культур в лиофилизированных и распылительных формах для прямой инокуляции продукта в резервуаре оказалась лучшей альтернативой [2].


Прим. ред.: Распылительная сушка - способ удаления растворителя из растворов и суспензий, основанный на впрыскивании капель жидкости в поток газа-носителя, обычно воздуха, нагретого до температур100-300°С, с последующей сепарацией твёрдых частиц. Лиофилизация – способ мягкой сушки веществ, при котором высушиваемый препарат замораживается, а потом помещается в вакуумную камеру, где и происходит возгонка (сублимация) растворителя.


Обезвоживание является обычной практикой для сохранения биологических материалов, чтобы они были стабильными в долгосрочной перспективе [5]. Среди многих методов сохранения клеток распылительная сушка широко используется в промышленности, поскольку она экономична, особенно в больших масштабах [6]. Несмотря на то, что распылительная сушка является более рентабельной, многие микроорганизмы не могут переносить процесс сушки из-за высокой температуры. Некоторые из многих факторов, влияющих на выживаемость во время распылительной сушки, включают штамм, фазу роста, используемую защитную среду, температуру на выходе распылительной сушилки и предадаптационную обработку культуры [7-10]. Сообщается, что тепловая адаптация, также известная как обработка тепловым шоком, увеличивает термостойкость бактериальных клеток во время сушки распылением [8,11]. Таким образом, применение технологии тепловой адаптации перед распылительной сушкой приобрело популярность.

Сублимационная сушка, сублимация льда из замороженных препаратов является популярным методом консервации молочнокислых бактерий (МКБ) [5]. Хотя сублимационная сушка широко используется, микроорганизмы также чувствительны к различным стрессам (таким как замораживание и осмотический стресс), которые приводят к повреждению клеток (таким как повреждение мембран и клеточных стенок). Поэтому обычно добавляют криопротекторы, чтобы минимизировать повреждение клеток. Обезжиренное молоко является популярным средством для сушки и защитным средством, поскольку он содержит белок, который предотвращает повреждение клеток [12] и способствует регидратации путем создания пористой структуры в лиофилизированном порошке [13]. Многие другие соединения, такие как дисахариды, полиолы, витамины и белки, также были протестированы для улучшения выживаемости МКБ во время лиофилизации [12].


Прим. ред.: Криопротекторы (для микробных культур) - вещества, защищающие живые клетки микроорганизмов от повреждающего действия замораживания. Криопротекторы используют при криоконсервации - низкотемпературном хранении живых клеток (другими словами, при замораживании клеточных культур). При замораживании на живые клетки воздействуют два повреждающих фактора: формирование внутриклеточного льда и обезвоживание. Помещение живых клеток в растворы криопротекторов и замораживание этих растворах снижает или полностью формирование внутриклеточного льда и обезвоживание. Криопротекторы бывают проникающими внутрь клетки (препятствуют формированию кристаллов льда за счёт образования водородных связей с молекулами воды, например, глицерин) и непроникающими (являются как правило дополнительными - в частности, используются олигосахариды, например, трегалоза и сахароза).


Это исследование было проведено для определения подходящего метода консервации для бифидобактерий. В частности, использовался штамм B. pseudocatenulatum G4, который демонстрирует потенциальную пробиотическую активность [14]. Чтобы улучшить выживаемость этих бактерий во время сублимационной сушки и распылительной сушки были проведены различные обработки - криопротектором на основе молока и адаптацией к нагреванию при различных температурах воздуха на выходе.

Материалы и методы

Микроорганизмы и подготовка культуры

Bifidobacteria pseudocatenulatum

На рисунке: Bieidobacteria pseudocatenulatum

B. pseudocatenulatum G4 был получен из Пробиотической Лаборатории факультета пищевых наук и технологий Университета Путра Малайзии (Universiti Putra Malaysia). Штамм был ранее выделен из вскармливаемых грудью детей [15,16]. Штамм хранили при -20°С в бульоне с Триптиказа-Фитон-Дрожжевым экстрактом (Trypticase Phytone Yeast или TPY): глицерин (20:80) в качестве исходной культуры. Для эксперимента очищенный штамм культивировали в бульоне TPY (Scharlau-Chemie, Испания) при 37°С в течение ночи в анаэробных условиях. Клетки на ранней стадии стационарной фазы собирали центрифугированием с помощью высокоскоростной программируемой лабораторной центрифуги с охлаждением для угловых и поворотно-откидных роторов Sigma Sartorious 3–18 K с ротором 12171 при 3000 об/мин в течение 15 минут при 4°C.

Термоадаптация культуры перед распылительной сушкой

New-Zealand-Skimmed-Milk-Powder-25kg-forСобранные клеточные осадки ресуспендировали в стеклянных бутылках (SCHOTT DURAN®, Майнц, Германия), содержащих 1000 мл 10% (мас./об., т.е. по доле сухого вещества – ред.) стерильного обезжиренного молока (сухое обезжиренное молоко NZMP, Новая Зеландия - не рис. слева). Образцы в стеклянных бутылках переносили в термостатированные водяные бани, в которых устанавливали 45°С и 60°С. Бутылки были погружены так, чтобы уровень воды находился на горлышке бутылок и выдерживался здесь в течение 30 минут. Образцы, которые не подвергались тепловой адаптации, рассматривались как контрольные.

Распылительная сушка при различной температуре воздуха на выходе

Образцы высушивали распылением в лабораторной распылительной сушилке (Anhydro, Дания) с центробежным распылением. Горячий воздух для сушки был введен в камеру при постоянной температуре воздуха на входе 160°С. Этот горячий воздух непрерывно смешивался с туманом распыленной жидкости с последующим мгновенным испарением. Расход подаваемого раствора регулировали для получения температуры воздуха на выходе 75±2°С и 85±2°С. Высушенные распылением порошки собирали и тщательно перемешивали стерильным шпателем. Высушенные порошки хранили в плотно закрытых стерильных стеклянных бутылках.

Добавление различных защитных сред перед сублимационной сушкой

Собранные клетки ресуспендировали в стерильной защитной среде, состоящей из стерильного обезжиренного молока (10% или 18%, мас./об.) с добавлением различных растворов сахара (5% глюкозы, 5% лактозы или 5% сахарозы). В качестве контроля использовали дистиллированную воду. Защитные среды стерилизовали автоклавированием при 121°С в течение 15 мин. Комбинации обработки описаны в таблице 1.

Состояние сушки вымораживанием

Культуры в разных криопротекторах сначала помещали в разные стерильные металлические лотки и равномерно распределяли для получения толщины приблизительно в 1 см. Затем культуры замораживали при -80°C и затем лиофилизировали в лиофильной сушилке (Christ® Epsilon 1–80, Германия) при 35°C в течение 24 часов при давлении 1,65 мбар. Во время заключительной стадии сушки давление снижали до 0,01 мбар, чтобы обеспечить полное удаление влаги и газа. После сушки вымораживанием высушенные порошки были равномерно перемешаны с использованием стерильного шпателя и хранились в плотно закрытых стерильных стеклянных бутылках.

Регидратация и подсчет B. pseudocatenulatum G4

1 г высушенного порошка ресуспендировали в 9 мл 10% обезжиренного молока для регидратации образцов. Образцы выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, как сообщалось ранее Valdez et al [17]. Серийные разведения каждого образца делали с использованием 0,1% стерильной пептонной воды и высевали на агаре TPY в двух экземплярах. За этим следовала анаэробная инкубация при 37°С в течение 48 часов. Жизнеспособные клетки подсчитывали перед сушкой (начальный подсчет) и сразу после процесса сушки.

 Таблица 1. Различные защитные среды, используемые до сублимационной сушки B. pseudocatenulatum G4.

Обработка
Защитная среда
1
Дистиллированная вода
2
10% обезжиренного молока
3
18% обезжиренного молока
4
10% обезжиренного молока + 5% раствора глюкозы
5
10% обезжиренного молока + 5% раствора сахарозы
6
10% обезжиренного молока + 5% раствора лактозы
7
18% обезжиренного молока + 5% раствора глюкозы
8
18% обезжиренного молока + 5% раствора сахарозы
9
18% обезжиренного молока + 5% раствора лактозы

Процент выживаемости рассчитывали по методу Хьюна и Шина [10]:

Процент выживания (%) = N/No х 100 (1)

No = количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) х (отношение объема до FD или SD / вес после FD или SD) (2)

где N представляет количество жизнеспособных клеток после FD или SD (КОЕ/г); No  представляет начальное количество жизнеспособных клеток до FD или SD (КОЕ/г); FD представляет лиофилизацию; SD представляет собой распылительную сушку.

Анализ содержания влаги

Содержание влаги в распылительных или лиофилизированных порошках определяли сушкой в печи при 102°С [18]. Содержание влаги анализировали путем определения разницы в массе до и после сушки, выраженной в процентах от первоначальной массы порошка.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием MINITAB версии 13 (Minitab Inc., США). Эксперименты были повторены дважды. Различия в значениях между значениями находятся на уровне P<0,05 с использованием T-критерия.

Результаты и обсуждение

Распылительная сушка

лабораторная распылительная сушилка Anhydro В таблице 2 показаны жизнеспособность, процентная выживаемость и содержание влаги в высушенной распылением биомассе B. pseudocatenulatum G4, обработанной при различной температуре воздуха на выходе распылительной сушилки и температуре тепловой адаптации. Первоначальное количество жизнеспособных клеток до распылительной сушки составляло 109 КОЕ/г. После распылительной сушки было зафиксировано снижение популяции на 2,454–3,346 log, при этом выжившая бактериальная популяция составила 5,797–6,871 log10 КОЕ/г. Высокие показатели гибели клеток также были отражены в процентах выживаемости, где все виды обработки дали низкую выживаемость - 0,05%-0,36%. Следовательно, термоадаптирующая обработка, применяемая при обеих температурах на выходе, рассматривалась как неэффективная.

Выживаемость микроорганизмов при распылительной сушке зависит от их термостойкости и применяемой температуры [19]. Поэтому температура воздуха на выходе распылительной сушилки является важным фактором, влияющим на жизнеспособность бактерий. Исследователи использовали различный диапазон температуры воздуха на выходе: 95–105°C [20]; 85–90°C [21], 75–95°C [6] и 70–100°C [22]. Поскольку температура выше 90°C приводила к гибели клеток в результате денатурации белка и разрушения ДНК [19], в этом исследовании использовались температуры на выходе 75±2°C и 85±2°C.

При температуре на выходе 75±2°C высушенный распылением порошок имел остаточную влажность в диапазоне от 8,62% до 9,27%. При сушке распылением при более высокой температуре на выходе (85±2°C) было получено значительно более низкое содержание влаги между 5,25 и 6,31%. Это соответствовало исследованию Ananta et al., в котором содержание остаточной влаги было обратно пропорционально температуре на выходе [23]. Поскольку содержание влаги в высушенной культуре является решающим фактором в определении стабильности и срока годности культуры, важно получить правильное соотношение между температурой на выходе и остаточной влажностью [21].

Бактерии постоянно сталкиваются с неблагоприятными изменениями окружающей среды, и им приходится адаптироваться к новым условиям. Было выдвинуто предположение, что бактерии реагируют на эти изменения посредством метаболического перепрограммирования, которое может впоследствии повысить их устойчивость к стрессу окружающей среды [22]. Их устойчивость развивается при воздействии сублетального стресса, который в дальнейшем вызывает большую толерантность к тому же стрессу [24]. Повышенная термостойкость многих микроорганизмов связана с выработкой белков теплового шока (Heat Shock Proteins - HSPs) при воздействии условий повышенной температуры [25].

Белки теплового шока действуют как молекулярные шапероны в защите клеток от теплового повреждения, связываясь с клеточными белками таким образом, чтобы сохранить их первоначальную конформацию и уменьшить денатурацию [9]. Это привело к интенсификации исследований по тепловой адаптации для увеличения выживаемости клеток бактерий во время распылительной сушки.

Использование метода тепловой адаптации было успешно применено для распылительной сушки B. longum BB 536, в которой была получена высокая жизнеспособность 8,300 log10 КОЕ/г, когда культура была адаптирована к нагреванию при 45°C в течение 30 минут для температуре на выходе 75°С [11]. В аналогичной работе с Lactobacillus paracasei сообщалось о 300-кратном увеличении термотолерантности, когда бактерии подвергались тепловой адаптации при 52°C в течение 15 минут [8]. В этом же исследовании применение тепловой адаптации не было успешным, так как конечное число жизнеспособных клеток было очень низким с потерей жизнеспособности более 99%. Таким образом, был сделан вывод, что бифидобактерии B. pseudocatenulatum G4 особенно чувствительны к сильному нагреву, возникающему во время сушки распылением, и применение термического шока для повышения термостойкости не подходит для этого штамма.

Таблица 2. Жизнеспособность, процент выживаемости и влажность высушенного распылением B. pseudocatenulatum G4.

Обр.
Температ. на выходе (oC)
Тепловая адаптация,
Температура (oC)
Жизнеспособность до
распылительной сушки (log10 КОЕ/г)
Жизнеспособность после
распылительной сушки (log10 КОЕ/г)
Выживание (%)
Содержание влаги (%)
A
75 ± 2
9.38 ± 0.02ad
6.79 ± 0.01ac
0.26 ± 0.01ac
9.17 ± 0.24a
B
85 ± 2
9.14 ± 0.03b
5.80 ± 0.01b
0.05 ± 0.01b
6.24 ± 0.30b
C
75 ± 2
45
9.42 ± 0.02a
6.84 ± 0.04a
0.26 ± 0.04ac
9.27 ± 0.49a
D
85 ± 2
45
9.29 ± 0.08abd
6.84 ± 0.01a
0.36 ± 0.08a
5.25 ± 0.35b
E
75 ± 2
60
9.60 ± 0.01c
6.87 ± 0.04a
0.19 ± 0.02cb
8.62 ± 0.51a
F
85 ± 2
60
9.24 ± 0.05bd
6.74 ± 0.01c
0.32 ± 0.04ac
6.31 ± 0.27b

Результаты показаны как среднее значение ± стандартное отклонение из 2 экспериментов.

Значения в одном и том же столбце с разными надстрочными знаками существенно различаются (Р<0,05)

Сублимационная сушка

Для сравнения, лиофилизированные клетки проявляли более высокую жизнеспособность, чем клетки, высушенные распылением, независимо от используемой защитной среды (таблица 3). Первоначальное количество жизнеспособных клеток до лиофильной сушки составляло 109 КОЕ/г. Т.е. после сушки вымораживанием жизнеспособность оставалась в той же единице, что соответствует рекомендуемой минимальной норме 109 живых организмов на г пробиотического продукта [3,4]. Однако при контрольной обработке, где в качестве защитного средства использовалась дистиллированная вод, наблюдалось значительное снижение количества жизнеспособных микроорганизмов.

лиофильная сушилка Christ Epsilon

Что касается выживаемости в процентах, высокая выживаемость составила 71,65–82,07%, когда в качестве защитного средства использовались различные комбинации обезжиренного молока и сахара. Однако значения существенно не отличались друг от друга. Следовательно, добавление сахара не способствовало повышению клеточной защиты от сушки вымораживанием. Следовательно, для этого штамма мы рекомендуем использовать в качестве криопротектора 10% обезжиренного молока.

Обычно эффективность сушки вымораживанием этого штамма считалась удовлетворительной, поскольку после процесса сушки был получен высокий процент выживаемости. Для сравнения, Wang et al. сообщали о более низком проценте выживаемости лиофилизированных бифидобактерий (43,1–51,9%) в ферментированном соевом молоке [26]. В другом исследовании Lactobacillus salivarius было получено 83-85% выживаемости, когда микроорганизмы были высушены в обезжиренном защитном молоке с трегалозой и сахарозой [14].

Что касается содержания влаги, лиофилизированный порошок имел более низкие процентные значения в диапазоне от 3,72% до 5,10% (таблица 3). Хотя микроорганизмы обычно демонстрируют более высокую выживаемость в условиях низкой влажности, чрезмерное высыхание может быть вредным для выживания организмов. Экстремальная сушка вызывает удаление трех типов клеточной воды; свободной, промежуточной и структурированной воды, что может повредить клеточные белки [27]. Для более высокой выживаемости в высушенных культурах должно оставаться минимальное количество воды, которое, в свою очередь, зависит от среды для сушки и условий лиофильной сушки. Zayed и Roos  [28]сообщили, что оптимальное содержание влаги для лиофилизированного L. salivarius варьировалось от 2,80% до 5,60%. Влажность выше 5,60% привела к потере жизнеспособности клеток. Поэтому, из-за отсутствия информации об оптимальном содержании влаги для сохранения бифидобактерий, в качестве эталона был выбран рекомендуемый уровень содержания влаги для L. salivarius в диапазоне 2,80–5,60%. Следовательно, 10% обезжиренного молока, содержание влаги в котором составляет 4,41%, находится в допустимых пределах (см. табл. 3).

Таблица 3. Жизнеспособность, процентная выживаемость и влажность лиофилизированной B. pseudocatenulatum G4.

Обр.
Защитная среда
Жизнеспособность перед сублимационной сушкой (log10 КОЕ/г)
Жизнеспособность после сублимационной сушки (log10 КОЕ/г)
Выживание (%)
Влажность (%)
1
Дистиллированная вода
9.50 ± 0.01ab
8.587 ± 0.16a
12.68 ± 4.67a
0.87 ± 0.05a
2
10% обезжиренного молока
9.45 ± 0.02a
9.364 ± 0.02b
82.07 ± 1.54b
   4.41 ± 0.44bcde
3
18% обезжиренного молока
9.51 ± 0.01ab
  9.415 ± 0.01b
80.35 ± 0.74b
3.72 ± 0.11b
4
10% обезжиренного молока + 5% глюкозы
9.43 ± 0.03a
9.335 ± 0.01b
80.06 ± 3.06b
4.20 ± 0.03bce
5
10% обезжиренного молока + 5% сахарозы
9.56 ± 0.03b
9.445 ± 0.04b
77.06 ± 1.73b
4.64 ± 0.18cde
6
10% обезжиренного молока + 5% лактозы
9.56 ± 0.03b
9.472 ± 0.02b
81.08 ± 0.78b
  5.10 ± 0.16d
7
18% обезжиренного молока + 5% глюкозы
9.55 ± 0.03bc
9.430 ± 0.01b
76.41 ± 6.89b
  4.06 ± 0.23bc
8
18% обезжиренного молока + 5% сахарозы
9.46 ± 0.02ac
9.319 ± 0.004b
71.65 ± 3.67b
4.92 ± 0.26de
9
18% обезжиренного молока + 5% лактозы
9.59 ± 0.01b
9.487 ± 0.06b
  80.08 ± 9.97b
  4.21 ± 0.13bc

Результаты показаны как среднее значение ± стандартное отклонение из 2 экспериментов.

Значения в одном и том же столбце с разными надстрочными знаками существенно различаются (Р<0,05)

Признано, что организмы, сохраненные методами сушки, подвергаются различным клеточным стрессам, которые могут привести к повреждению клеток или даже к гибели клеток. Скорость выживания зависит от штамма и зависит от используемого метода сушки. Наши результаты были в соответствии с исследованиями Wang et al., в которых они сообщили, что бифидобактерии лонгум и инфантис (B. longum и B. infantis), которые были подвергнуты сублимационной сушке, показали более высокую выживаемость по сравнению с сушкой распылением [26]. Johnson и Etzel также сделали подобное наблюдение, где лиофилизированный штамм Lactobacillus helveticus CNRZ-32 выжил лучше, чем распыленные клетки  [6]. Это показывает, что Lactobacillus helveticus CNRZ-32 не переносит высокую температуру, возникающую во время распылительной сушки, но лучше переносит процесс сублимационной сушки. Следует отметить, что лиофилизация может привести к потерям жизнеспособности клеток из-за таких факторов, как образование внутриклеточных кристаллов льда, повреждение мембран, вызванное высокими концентрациями внутренних растворенных веществ, и денатурация чувствительных белков [29]. Согласно Fonseca at al [30] при более высокой площади поверхности клеток риск повреждения мембран выше из-за образования внеклеточных кристаллов льда. Следовательно, маленькие сферические клетки более устойчивы к сублимационной сушке, чем палочки, как в случае бифидобактерий и лактобацилл. Таким образом, были протестированы различные протекторы для повышения стабильности микроорганизмов во время сублимационной сушки [12].

Многие исследователи настоятельно рекомендуют добавлять сахара в качестве криопротектора для ингибирования образования свободных радикалов [31,32]. Это связано с тем, что сахар является пищевым, легко доступным и экономически эффективным. Сахара увеличивают стабильность клеточного белка, образуя с ним водородные связи, тем самым снижая риск воздействия окружающей среды [12]. Они должны присутствовать на обеих сторонах мембраны, чтобы поддерживать структуру белка клетки в сухом состоянии [33]. Между тем, Carvalho at al.. продемонстрировали, что криопротекторное действие сахаров в сушильной среде зависит от сахара, ранее обнаруженного в питательной среде [34]. Однако в этом исследовании не наблюдалось существенных различий в процентах выживаемости при использовании различных комбинаций обезжиренного молока и сахаров. Это может быть связано с наличием в молоке природного белка и лактозы, которые обеспечивают необходимую защиту этого штамма. Следовательно, включение дополнительных сахаров в обезжиренное молоко не приводило к увеличению выживаемости при лиофилизации. King и Su [35] также сообщили о подобном открытии, в котором не наблюдалось значительного различия в защитном эффекте 10% обезжиренного сухого молока, добавленного с сахарозой и другими соединениями к лиофилизированной культуре Lactobacillus acidophilus. Следовательно, эффективность криопротектора зависит от штамма.

Выводы

Чтобы успешно включаться в функциональные пищевые применения, культура должна выдерживать суровые условия во время консервации клеток. Это исследование продемонстрировало, что B. pseudocatenulatum G4 более чувствителен к высокой температуре, применяемой в процессе распылительной сушки, с потерями жизнеспособности более 99%. По полученным данным выживаемость этого штамма выше после лиофилизации (~109 КОЕ/г). Таким образом, лиофилизация была рекомендована как лучший способ сохранения этого микроорганизма с использованием обезжиренного молока в качестве защитной среды. Добавление различных сахаров не увеличивало выживаемость в процессе лиофильной сушки. Использование 10% обезжиренного молока в качестве защитной среды при лиофилизации представляется оптимальным. Используя вышеупомянутое условие, была достигнута удовлетворительная выживаемость и остаточная влажность 4,41% ± 0,44%.

Источник: Stephenie Wong et al. Viability of Bifidobacterium Pseudocatenulatum G4 after spray-Drying and Freeze-Drying. Microbiology Insights 2010:3 37–43

К разделу: Технология получения сухих заквасок

Дополнительно см.: Сублимация как способ сохранения жизнеспособности молочнокислых бактерий в кисломолочных продуктах (pdf)

 

Литература:

  1. Mackie RI, Sghir A, Gaskins HR. Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract. American Journal of Clinical Nutrition. 1999;69:1035S–45S.
  2. Ross RP, Desmond C, Fitzgerald GF, Stanton C. A Review. Overcoming the technological hurdles in the development of probiotic foods. Journal of Applied Microbiology. 2005;98:1410–7.
  3. Samona A, Robinson RK. Effect of yogurt cultures on the survival of bifidobacteria in fermented milks. Journal of the Society of Dairy Technology. 1994;47:58–60.
  4. Vinderola CG, Bailo N, Reinheimer JA. Survival of probiotic microflora in Argentinian yoghurts during refrigerated storage. Food Research International. 2000;33:97–102.
  5. Roos YH. Phase and state transitions in dehydration of biomaterials and food. In: Dehydration of products of biological origin, ed. A.S. Mujumdar, pp 3–22. Enfield, New Hampshire, USA: Science Publishers, Inc. 2004.
  6. Johnson JAC, Etzel MR. Properties of Lactobacillus helveticus CNRZ-32 attenuated by spray-drying, freeze-drying, or freezing. Journal of Dairy Science. 1995;78:761–8.
  7. Lian WC, Hsiao HC, Chou CC. Survival of bifidobacteria after spraydrying. International Journal of Food Microbiology. 2002;74:79–86.
  8. 8. Desmond C, Stanton C, Fitzgerald GF, Collins K, Ross RP. Environmental adaptation of probiotic lactobacilli towards improvement of performance during spray drying. International Dairy Journal. 2002;12:183–90.
  9. Corcoran BM, Ross RP, Fitzgerald GF, Stanton C. Comparative survival of probiotic lactobacilli spray-dried in the presence of prebiotic substances. Journal of Applied Microbiology. 2004;96:1024–39.
  10. Hyun CK, Shin HK. Utilization of bovine plasma obtained from a slaughterhouse for economic production of probiotics. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1998;86:34–7.
  11. Kabeir BM. Nutritional quality of fermented spray dried Medida formulated from malted brown rice with Bifidobacterium longum BB 536. MSc Thesis, Universiti Putra Malaysia, Malaysia. 2004.
  12. Champagne CF, Gardner N, Brochu E, Beaulieu Y. The freeze-drying of lactic acid bacteria. A review Canadian Institute of Food Science and Technology Journal. 1991;24:118–28.
  13. Abadias M, Benabarre A, Teixidó N, Usall J, Viñas I. Effect of freezedrying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake. International Journal of Food Microbiology. 2001;65:173–82.
  14. Wong S, Wendy YK, Kabeir BM, Shuhaimi M, Rosfarizan M, Yazid AM. Survival of Bifidobacterium pseudocatanulatum strains isolated from breast-fed infants to simulated gastric pH environment. Malaysian Applied Biology. 2006;35:57–62.
  15. Shuhaimi M, Ali AM, Norihan MS, Khatijah Y, Yazid AM. Differentiation of the Bifidobacterium pseudocatenulatum isolates from faeces of infant by RAPD. Bioscience Microflora. 2001;20:89–94.
  16. Shuhaimi M, Ali AM, Norihan MS, Yazid AM. Classification of Bifidobacterium isolates from infant faeces using PCR-based and 16S rDNA Partial Sequences Analysis Methods. Bioscience Microflora. 2002;21:155–61.
  17. Valdez GF, Giori GS, Ruiz Holgado AP, Oliver G. Effect of rehydration medium on the recovery of freeze-dried lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 1985;50:1339–41.
  18. AOAC. Official Methods of Analysis, 14th ed, Arlington, VA: Association of Official Analytical Chemists, Inc. Arlington, Virginia 22201, USA. 1984.
  19. Teixeira P, Castro H, Kirby R. Spray drying as a method for preparing concentrated cultures of Lactobacillus bulgaricus. Journal of Applied Microbiology. 1995;78:456–62.
  20. Craig EA, Gambill BD, Nelson RJ. Heat shock proteins: molecular chaperones of protein biogenesis. Microbiological and Molecular Biology Reviews. 1993;57:402–14.
  21. Clementi F, Rossi J. Effect of drying and storage conditions on survival of Leuconostoc oenos. American Journal of Enology and Viticulture. 1984;35: 183–6.
  22. Abee T, Wouters JA. Microbial stress response in minimal processing. International Journal of Food Microbiology. 1999;50:65–91.
  23. Ananta E, Volkert M, Knorr D. Cellular injuries and storage stability of spray-dried Lactobacillus rhamnosus GG. International Dairy Journal. 2005;15:399–409.
  24. Pichereau V, Hartke A, Auffray Y. Starvation and osmotic induced multiresistances. Influence of extracellular compounds. International Journal of Food Microbiology. 2000;55:19–25. Yura T, Nakahigashi K. Regulation of the heat-shock response. Current Opinion Microbiology. 1999;2:153–8.
  25. Wang YC, Yu RC, Chou CC. Viability of lactic acid bacteria and bifidobacteria in fermented soymilk after drying, subsequent rehydration and storage. International Journal of Food Microbiology. 2004;93:209–17.
  26. Mellor JD. Fundamentals of freeze-drying. Academic Press, London. 1978.
  27. Zayed G, Roos YH. Influence of trehalose and moisture content on survival of Lactobacillus salivarius subjected to freeze-drying and storage. Process Biochemistry. 2004;39:1081–6.
  28. Thammavongs B, Corroler D, Panoff JM, Auffray Y, Boutibonnes P. Physiological response of Enterococcus faecalis JH2-2 to cold shock: growth at low temperatures and freezing/ thawing challenge. Letters in Applied Microbiology. 1996;23:398–402.
  29. Fonseca F, Béal C, Corrieu G. Method for quantifying the loss of acidification activity of lactic acid starters during freezing and frozen storage. Journal of Dairy Research. 2000;67:83–90.
  30. Roberto M, Samantha RV, Novella B, Roberto LS. Fenton-Dependent Damage to Carbohydrates: Free Radical Scavenging Activity of Some Simple Sugars. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2003;51(25): 7418–25.
  31. Yong HL, Marc BB, Tahir N, Quader A, Gary PM. Effects of Sucrose and Trehalose on the Preservation of the Native Structure of Spray-Dried Lysozyme. Pharmaceutical Research. 2004;9(12):1847–53.
  32. Leslie SB, Israeli E, Lighthart B, Crowe JH, Crowe LM. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying. Applied and Environmental Microbiology. 1995;61:3592–7.
  33. Carvalho AS, Silva J, Ho P, Teixeira P, Malcata FX, Gibbs P. Effect of different sugars added to the growth and drying medium upon thermotolerance
  34. and survival during storage of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Biotechnology Progress. 2003;20:248–54.
  35. King VAE, Su JT. Dehydration of Lactobacillus acidophilus. Process Biochemistry. 1993;28:47–52. Teixeira P, Castro H, Mohasi-Farkas C, Kirby R. Identification of sites of injury in Lactobacillus bulgaricus during heat stress. Journal of Applied Microbiology. 1997;83:219–26.