Главная \ 3. Пробиотики \ Селенпропионикс \ Женская фертильность и микроэлемент селен

Микроэлемент селен помогает забеременеть

ФЕРТИЛЬНОСТЬ ЖЕНЩИН СВЯЗАНА С ДЕТОКСИКАЦИОННЫМ ЭЛЕМЕНТОМ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ – СЕЛЕНОМ

забеременеть можно!

по материалам
School of Chemistry and Physics, The University of Adelaide, SA, Australia

liniya.png

РЕПРОДУКТИВНАЯ ФУНКЦИЯ ЖЕНЩИНЫ ВО МНОГОМ ЗАВИСИТ ОТ СЕЛЕНОВОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА - ВАЖНОГО ФАКТОРА ЗАЩИТЫ ОТ БЕСПЛОДИЯ

 СОДЕРЖАНИЕ:

Рентгеновская флуоресцентная визуализация и другие анализы идентифицируют селен и GPX1 как важные для репродуктивной функции женщины

 

РЕЗЮМЕ

Глутатионпероксидаза 1 (GPx1) - является наиболее распространенным селензависимым ферментом (тетрамерной формы) из семейства глутатионпероксидаз, и обнаружена в цитоплазме практически всех тканей млекопитающих, субстратом GPx1 является как пероксид водорода, так и многие органические гидропероксиды.

Protein GPX1 - Структура Глутатионпероксидазы 1

Protein GPX1 - Структура Глутатионпероксидазы 1

Исследования статуса селена (Se) показывают, что Se необходим для фертильности, но насколько точно неизвестно. Мы стремились показать, что селен играет важную роль в репродуктивной функции крупного рогатого скота. Распределение элементов в яичнике крупного рогатого скота (n = 45 срезов) было идентифицировано с помощью рентгеновской флуоресцентной (XRF) визуализации. Se был последовательно локализован в слое гранулезных клеток крупных (> 10 мм) здоровых фолликулов. Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) выявила десятикратное повышение Se в стенке фолликула крупного рогатого скота по сравнению с желтым телом. Анализ экспрессии генов селенопротеинов GPX1, GPX3, VIMP и SELM в клетках гранулезы крупного рогатого скота показал, что только GPX1 был значительно повышен в больших здоровых фолликулах по сравнению с маленькими здоровыми или атретическими фолликулами (P < 0,05). Вестерн-иммуноблоттинг идентифицировал белок GPX1 в гранулезных клетках крупного рогатого скота здоровых фолликулов, но не малых здоровых фолликулов. Чтобы оценить, важен ли GPX1 в человеческих фолликулах, были собраны кучевые клетки у женщин, перенесших ЭКО / ИКСИ с однократным переносом эмбрионов. Ооциты и эмбрионы культивировали и переносили независимо у 30 пациентов, которым проводился плановый однократный перенос эмбрионов. Экспрессия гена GPX1 была достоверно выше в кучевых клетках человека из кучево-ооцитарных комплексов, дающих беременность (Р < 0,05). Мы представляем первое рентгеновское изображение яичников млекопитающих, показывающее, что Se последовательно локализуется в гранулезных клетках крупных здоровых фолликулов. Мы пришли к выводу, что Se и селенопротеины повышены в больших здоровых фолликулах и могут играть важную роль в качестве антиоксиданта во время позднего фолликулярного развития.

Вступление

Селен повышает фертильность.Селен (Se) является микроэлементом и незаменимым компонентом селенопротеинов, играющих важную роль в таких биологических функциях, как: антиоксидантная защита; образование гормонов щитовидной железы; иммунный ответ; синтез ДНК; фертильность; и, размножение [1,2]. Селенопротеины включают Se ко-трансляционно как остаток селеноцистеина, который действует как очень эффективный окислительно-восстановительный катализатор [3], защищая клетки от активных форм кислорода (АФК или англ. ROS) [4,5]. ROS, такие как анион супероксидного радикала (O2-) и перекись водорода (H2O2) вырабатываются как побочные продукты нормального клеточного метаболизма и могут самопроизвольно реагировать с ДНК, РНК, белком и липидами [6]. Окислительный стресс возникает, когда уровень АФК подавляет антиоксидантную защиту клетки [7]. Хорошо охарактеризованные селенопротеины включают семейства: глутатионпероксидаз; тиоредоксинредуктазы; иодтиронин-дейодиназы. Существенная роль селенопротеинов в деградации перекиси водорода, поддержании клеточного окислительно-восстановительного статуса, регуляции транскрипции и деиодинации тиреоидных гормонов очевидна, но еще предстоит выяснить несколько дополнительных неизвестных биохимических путей [8].

Информации относительно важности Se в женской репродукции очень мало [3]. Тем не менее, снижение рождаемости, возможно, связано с дефицитом Se, даже если целевой орган для действия Se в настоящее время неясен [1,9]. Se был связан с функцией в эпидемиологических исследованиях, но биохимический путь не был идентифицирован. Было продемонстрировано, что ограничение питательных веществ и/или уровень Se в рационе матери влияют на пролиферацию клеток в фолликулах, кровеносных сосудах и стромальных тканях в яичниках плода овец [10], а дефицит Se дополнительно приводит к дегенерации яичников и атрезии фолликулов у крыс [11]. Есть много факторов, которые контролируют рост ооцитов и созревание фолликулов, в том числе: дисбаланс питания; гормональные нарушения; и, физические условия микроокружения, из которых окислительный стресс является важным компонентом [4]. Считается, что повышенные уровни АФК, которые нарушают баланс оксидантов и антиоксидантов в перитонеальной жидкости, приводят к бесплодию у женщин, где другие этиологические факторы не идентифицированы [12].

Функция яичников была широко изучена у крупного рогатого скота. Фолликулы обычно классифицируются в соответствии с их стадией роста как: первичные фолликулы, содержащие ооцит, окруженный одним слоем уплощенных прегранулозных клеток; после активации как первичные фолликулы, с одним слоем кубовидных гранулезных клеток; как преантральные фолликулы с увеличивающимися слоями гранулезных клеток; и, после образования заполненного фолликулярной жидкостью антрального слоя и специализированного фекального слоя, как антральные фолликулы. На антральных стадиях ооцит окружен специализированными клетками, называемыми кучевыми клетками (или кумулюсные клетки). Гранулезные клетки поддерживают рост ооцита, а в позднем фолликулярном развитии выделяют эстрогены, которые необходимы для нормальной репродуктивной функции. Большинство яичниковых фолликулов не созревают до овуляции, а скорее подвергаются атрезии [7]; это характеризуется в первую очередь апоптозом гранулезных клеток. В настоящем исследовании термины «маленький» и «большой» используются для описания антральных фолликулов размером менее 4 мм и более 10 мм соответственно.

Изменения в женском яичнике в течении месячного цикла

Изменения в женском яичнике в течении месячного цикла

Во время фолликулярной волны роста, увеличение уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ или англ. FSH - Follicle-stimulating hormone) вызывает дальнейший рост и дифференцировку когорты фолликулов диаметром более 4 мм. Из этой когорты только один фолликул будет выбран в качестве доминирующего фолликула и продолжит расти за пределы 8 мм. Доминирующий фолликул может овулировать, тогда как все остальные фолликулы подвергаются атрезии [13,14]. Следовательно, когорты фолликулов требуют повышенных концентраций ФСГ, в то время как доминантный фолликул, напротив, имеет более высокую чувствительность к ФСГ, что подтверждается его усиленным ростом и синтезом эстрадиола в среде с низким уровнем ФСГ [15]. В этот момент доминантный фолликул требует частой стимуляции лютеинизирующим гормоном (ЛГ) для продолжения дифференцировки, ведущей к овуляции [16], после чего остатки стенки фолликула трансформируются в желтое тело. Понимание механизмов, с помощью которых один фолликул выбирается для доминирования, и понимание клеточных механизмов, которые позволяют переходить от ФСГ- к ЛГ-зависимой стадии развития в доминирующем фолликуле, имеет важное значение, поскольку состояние яичников, приводящее к ановуляции,  является одной из основных причин бесплодия как у крупного рогатого скота, так и у человека [17,18,19].

Новые технологии, такие как трехмерная ультрасонография и магнитно-резонансная томография, ультразвуковая биомикроскопия и методы на основе синхротрона, могут улучшить для нас картину функции яичников в реальном времени до околоклеточного уровня [20]. Использование синхротронного света в медицинской визуализации редко используется для изображения ткани яичников любого вида, и механизмы распределения Se у млекопитающих не были всесторонне исследованы, за исключением исследования роли глутатионпероксидазы 4 (GPX4) в созревании сперматозоидов у мышей [21,22,23]. Способность зондировать in situ биоаккумуляцию микроэлементов в определенной структуре яичников или типе клеток может обеспечить беспрецедентное понимание биохимии этого органа. Поэтому мы провели рентгенофлуоресцентную визуализацию (англ. XRF-анализ) яичников крупного рогатого скота и сосредоточились на Se. С помощью дополнительных исследований мы выявили основной селенопротеин в яичниках и определили возможную роль этого селенопротеина.

Материалы и методы

Сбор образцов для анализа XRF

Яичники были получены из скотобойни T & R Pastoral, Мюррей Бридж, Южная Австралия. Яичники были собраны у небеременных телок одомашненного подвида Bos Taurus (n = 32) и попарно собраны в ледяной сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) и доставлены во льду в лабораторию. Для рентгенофлуоресцентной визуализации срезы были разрезаны продольно пополам, заморожены и сохранены в OCT компаунде (ProSciTech, Thuringowa, QLD, Австралия) при -80°C до секционирования.

Сбор образцов для анализа ICP-MS

Пара яичников была взята от небеременной телки на скотобойне T&R Pastoral, Murray Bridge, Южная Австралия и впоследствии рассечена для получения образцов ткани, представляющих желтое тело и фолликулярную стенку (гранулезы и текальные клетки (тека клетки)). Первый яичник иссекали для получения трех репрезентативных образцов желтого тела (стадия III). Второй яичник иссекали для получения клеток тека / гранулезы из всех его фолликулов, причем первый образец содержал слои тека / гранулезы из одного 9 мм фолликула, а второй образец содержал объединенные слои клеток тека / гранулезы из четырех оставшихся фолликулов: 6 мм, 7 мм, 7 мм и 10 мм. Образцы взвешивали, регистрировали влажный вес, а затем высушивали сублимацией в течение шести часов, после чего регистрировали сухой вес.

Гистология и подготовка ткани для анализа XRF

Каждый OCT-встроенный яичник был разрезан на толщину 30 мкм для XRF-анализа и на смежные срезы 6 мкм для H&E-окрашивания. Секционирование проводили на криостате Leica CM1800 (Adeal Pty. Ltd., Altona North, Vic, Австралия). Каждая секция XRF была перенесена на тонкую пленку Ultralene (SPEX SamplePrep, Нью-Джерси, США), прикрепленную к фотографической слайд-рамке 24 × 36 мм с помощью пинцета из нержавеющей стали и синтетической кисти типа Filbert. Затем ткань сушили в эксикаторе в вакууме в течение ночи и хранили в эксикаторе до анализа. Срезы, предназначенные для окрашивания H&E, устанавливали на предметные стекла, обработанные 0,01% поли L-орнитин гидробромидом (Sigma-Aldrich Pty. Ltd., Касл-Хилл, Новый Южный Уэльс, Австралия), и хранили при -20°C до использования.

Классификация фолликулов

Окрашенные H&E срезы фолликулов наблюдали с помощью световой микроскопии и оценивали как здоровые или атретические на основании морфологии гранулезной оболочки и процента пикнотических ядер, как описано ранее [24,25].

Рентгеновская флуоресцентная визуализация

Распределение элементов по выбранным 30 мкм срезам яичников крупного рогатого скота отображали на рентгенограмме XFM в австралийском синхротроне, Clayton, VIC, Австралия. Падающий пучок рентгеновских лучей с энергией 15,75 кэВ (килоэлектронвольт) был выбран для того, чтобы вызвать ионизацию K-оболочки элементов с атомными номерами ниже 37 (Z ≤ Rb), обеспечивая при этом адекватное отделение пиков Рэлея и Комптона от интересующей элементной флуоресценции, то есть Se.  Падающий пучок фокусировался на пятно ~2 мкм (тонкое сканирование) или ~6 мкм [грубое сканирование (полная ширина при половинном максимуме)] с использованием пары зеркал Киркпатрика-Баэза, и образцы были отсканированы «на лету» через рентгеновский фокус. Полученный XRF был получен в режиме событий с использованием 384-канального детектора Maia XRF с малой задержкой (расположенного в геометрии обратного рассеяния), и полные спектры XRF были использованы для восстановления элементных карт образца с использованием виртуального размера пикселя 2 или 6 мкм (точное и грубое сканирование соответственно).

Эффективное время задержки на пиксель для тонкого и грубого сканирования составило 7,81 мс или 2,44 мс соответственно, и наибольшее сканирование, изображенное в этой рукописи, имело размер 1291 × 1579 пикселей. Одноэлементные фольгированные Mn- и Pt-пленки (Micromatter, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) были отсканированы в той же геометрии и использовались в качестве справочных материалов для установления количественного содержания элементов.  Деконволюция данных Maia была выполнена с использованием GeoPIXE v6.5h (CSIRO, Австралия), который включает матрицу линейного преобразования для выполнения спектральной деконволюции [26]. Спектры были откалиброваны с использованием измерений металлической фольги и поправок, сделанных для самопоглощения в образце, поглощения в воздухе и эффективного отклика детектора [27]. Обнаруженные рентгеновские фотоны из каждого пикселя были связаны с выходом флуоресценции расчетной модели для предполагаемого состава и толщины образца. Состав и толщина пленки Ultralene были известны из спецификаций производителя, а состав и средняя плотность, типичные для высушенного органического материала (C22H10N2O4 и 1,42 г см-3 соответственно), использовались для моделирования ткани. Эффекты поглощения для XRF от элемента с наименьшим атомным номером, относящегося к этому исследованию (Ca Kα), были незначительными для этого типа образца.

ICP-MS гранулезных и текальных клеток и желтого тела

Три образца вместе с двумя образцами стандартной говяжей печени NIST 1577b (Гейтерсберг, Мэриленд, США) были взяты в лабораторию Земли и Воды CSIRO (Glen Osmond, SA, Австралия) для кислотного расщепления с помощью микроволнового излучения. Вкратце, образцы подвергали холодному перевариванию в течение ночи в 7 мл концентрированной азотной кислоте (Fisher Scientific AR Grade 70%, VIC, Австралия) и в 3 мл концентрированной H2O2 (Chem Supply AR Grade 30%, SA, Австралия). Все растворы подвергались стандартизированному 105-минутному перевариванию в лабораторной микроволновой печи, при этом температура постепенно увеличивалась до 180°C, а затем поддерживалась при этой температуре для обеспечения полного переваривания. После адекватного охлаждения полученные дайджесты разбавляли до 50 мл с использованием MilliQ-воды. Затем дайджесты аккуратно пропускали через раствор прибора ICPMS (Agilent 7500cs with Octopole Reaction System, Mulgrave, VIC, Австралия) с обнаружением второго по распространенности изотопа Se, а именно 78Se, избегая помех от 40Ar2. Калибровочные стандарты, составленные из многоэлементного раствора, были проведены до образцов крупного рогатого скота, и результирующая кривая дала коэффициент корреляции 0,9993 для 78Se. Концентрации были указаны в мг / кг относительно сухого веса материала.

Анализ микромассивов (микрочипов)

Ранее собранные данные микрочипов [28], депонированных в GEO (Омнибусе Экспрессии Генов) под инвентарными номерами GSE39589 и GSE49505, были исследованы для сравнения значений средней интенсивности для экспрессии 19 различных селенопротеинов как в текальных, так и в гранулезных клетках малых здоровых, больших здоровых и малых атретических яичников крупного рогатого скота (дополнительный набор данных 2). На основании анализа данных XRF стало очевидно, что представляющие интерес виды Se локализованы в клетках гранулезы и имеют заметно более высокие концентрации в крупных здоровых фолликулах. Дополнительная таблица 1 содержит сводную информацию о селенопротеинах, рассмотренных для дальнейшего анализа, с подробной легендой, указывающей наиболее вероятных кандидатов для видов, изображенных с помощью XRF.

Краткий список потенциальных белков Se, регулируемых в гранулезных клетках здоровых крупных фолликулов, был определен из анализа микрочипов как: GPX1, GPX3, SEP15, VIMP, SELK, SELT, SELM и SEPHS2. Список был дополнительно сужен за счет исключения тех селенопротеинов, для которых up-регуляция (повышение) была незначительной (указано курсивом) в обеих группах (SEP15) или незначительной в одной группе и умеренной (отмечено подчеркиванием) в другой (SELK, SELT и SEPHS2), оставляя : GPX1, GPX3, VIMP и SELM.

Экстракция РНК и синтез кДНК

Общая РНК была выделена из клеток гранулезы с использованием реагента «Тризол» в соответствии с инструкциями производителя. Количество общей РНК определяли спектрофотометрически (поглощение при 260 Нм; 1000v 3.3 спектрофотометр, NanoDrop Technologies Inc., Уилмингтон, Делавэр, США).  Два микрограмма РНК обрабатывали ДНКазой (DNA-free, Ambion, Supplied by Applied Biosystems, Мельбурн, VIC, Австралия). Комплементарную ДНК (кДНК, 20 мкл) синтезировали в соответствии с инструкциями производителя, используя 500 нг случайных гексамеров (GeneWorks, Adelaide, SA, Австралия), смесь 10 нМоль dNTP, 20U RNaseOUT и 200U Superscript III RT (Life Technologies, Mulgrave, VIC, Австралия). РНК, случайные гексамеры и dNTPs (дезоксинуклеотидтрифосфаты) предварительно инкубировали при 65°C в течение 5 мин перед добавлением к реакционной смеси, включающей 4 мкл 5-кратного буфера первой цепи, 1 мкл 0,1М дитиотреитола, 4U ингибитор РНКазы (RNaseOUT) (Life Technologies) и фермент, с последующей инкубацией при 50°С в течение 60 мин, а затем при 70°С в течение 15 мин для инактивации ферментов перед полимеразной цепной реакцией (ПЦР или англ. PCR).

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR) в реальном времени

Для идентификации видов Se, визуализированных в гранулезе с помощью XRF, количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией ОТ-ПЦР (или англ.RT-PCR) в реальном времени для GPX1, GPX3, VIMP и SELM проводили на клетках гранулезы, полученных из маленьких здоровых (n = 5), маленьких атретических (n = 5) и крупных здоровых (n = 5) фолликулов. Все праймеры были разработаны с использованием программного обеспечения «Primer Express» (Life Technologies) (дополнительная таблица 2). Экспрессия для каждого гена была нормализована до экспрессии гена 18S рРНК, и наши результаты выражены как фмоль мРНК на нмоль 18S рРНК.  ПЦР проводили с использованием Corbett Rotor Gene 6000 (Qiagen, Hilden, Germany) с 2 мкл разведенной кДНК в SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Каждый прогон выполняли с водяными заготовками и РНК с обратной транскрипцией в качестве отрицательного контроля. Образцы амплифицировали в двух экземплярах с начальной денатурацией при 95°С в течение 10 мин, затем последовало 40 циклов 2-ступенчатой амплификации при 95°С в течение 15 С и 60°С в течение 60 С. Концентрацию каждой мишени получали из значения КТ (Ct) и стандартной кривой (эффективность амплификации > 0,9) и нормировали к концентрации 18S рибосомной РНК в каждом образце (рассчитывали по КТ и стандартной кривой для 18S). Для каждой реакции ПЦР проводили анализ кривой расплава для подтверждения правильности амплификации продукта на основе исходного гель-электрофореза и секвенирования ДНК.

Статистический анализ

Все статистические расчеты были выполнены с использованием SPSS версии 20 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США). Для данных ICP-MS результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для сравнения уровня экспрессии генов между гранулезными клеточными группами использовался односторонний анализ ANOVA Крускала-Уоллиса и специальные тесты Манна-Уитни.

Иммуногистохимия

Части ранее собранных коровьих яичников использовали для локализации с использованием метода непрямой иммунофлюоресценции. Замороженные участки ткани высушивали под вакуумом в течение 5 мин, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 5 мин и трижды промывали в течение 5 мин в гипертоническом забуференном физиологическом натрий-фосфатном  растворе (PBS) (10 Мm фосфат натрия / калия с 0,274 М NaCl и mМ KCl, рН 7,2) перед обработкой блокирующим раствором (10% нормальная ослиная сыворотка [D-9663; Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA] в разбавителе антител, содержащем 0,55 М NaCl и 10 mМ фосфата натрия, рН 7,1) в течение 30 мин при комнатной температуре. В качестве первичных антител использовали поликлональный кроличий анти-человеческий VIMP (разведение 1:100; NBP1- 89558; Novus Biologicals, распространяемый Sapphire Bioscience Pty. Ltd., Waterloo, NSW, Australia) в сочетании с крысиным антимышиным Perlecan A7L6 (разведение 1:100; Millipore Pty. Ltd., Kilsyth, VIC, Australia). Срезы яичников инкубировали с первичными антителами в течение ночи при комнатной температуре. После трех промывок PBS срезы яичников инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с FITC-конъюгированным ослиным анти-крысиным AffiniPure (#712-096-153) и биотин-SP-конъюгированным ослиным анти-кроличьим IgG AffiniPure (#711-065-152) ) и после трех промывок PBS, затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с Cy3-конъюгированным стрептавидином (# 016-160-084). Все вторичные антитела и конъюгированные стрептавидины были приобретены в Jackson ImmunoResearch Laboratories (распространяется Abacus ALS Australia, Brisbane, QLD, Australia) и использовались в разведениях 1:100. Наконец, срезы обрабатывали раствором ядерного красителя 4',6-диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорида (DAPI) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) для идентификации ядер клеток. Покровные стекла были прикреплены с помощью монтажной среды для флуоресценции (S3023; Dako, Carpinteria, CA, USA) и сфотографированы с помощью микроскопа Olympus BX50 (Olympus, Токио, Япония) с насадкой для эпифлуоресценции и цифровой камерой Spot RT (диагностические инструменты, Sterling Heights, Мичиган, США).

Экстракция белка и вестерн-иммуноблоттинг

После сбора (ранее описанного) фолликулы иссекали из каждого яичника и измеряли диаметр. Небольшой кусочек стенки фолликула, приблизительно 1 мм3, удаляли и фиксировали в 2,5% глутаральдегиде в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,25) для последующей классификации состояния здоровья фолликула [29]. ​​Клетки гранулезы удаляли из оставшейся части фолликулов. Cолевой раствор Хэнка HBSS без Mg2+ и Ca2+, содержащий клетки гранулезы, центрифугировали при 500×g в течение 7 минут при 4°C, среду удаляли аспирацией и клетки дважды промывали в PBS pH 7,4, а затем замораживали при -80°C.

После фиксации в течение ночи части стенки фолликула каждого фолликула промывали несколько раз 0,1 M PBS, рН 7,25, после фиксации в 2% (v/v) водном тетроксиде осмия в течение 1 ч при 4°C и заделывали в эпоксидную смолу, как описано ранее [30]. Для светового микроскопического исследования эпоксидные срезы толщиной 0,5 мкм были разрезаны с использованием стеклянного ножа и ультрамикротома Richert-Jung Ultracut E (Leica Microsystems Pty Ltd., VIC, Австралия), окрашенных 1% (w/v) водным метиленовым синим и исследовали с помощью микроскопа Olympus BX50 (Olympus Australia Pty Ltd., МТ Уэверли, Виктория, Австралия). Здоровые и атретические фолликулы идентифицировали, как описано ранее [24,31], где здоровые фолликулы имели менее 5% клеток апоптотической гранулезы, а атретические фолликулы имели более 5% клеток апоптотической гранулезы. Только гранулезные клетки из здоровых фолликулов были исследованы на экспрессию GPX1.

Для вестерн-блоттинга использовали девять образцов клеток гранулезы (маленькие здоровые фолликулы, n = 4, 3-5 мм и большие здоровые фолликулы, n = 5, 13,5 мм ± 0,8 мм) от девяти различных животных. Общий белок экстрагировали из образцов с использованием буфера RIPA [1 % NP-40, 1% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,15 M хлорида натрия, 50 mM Трис-соляной кислоты и 1 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA)], содержащего 1 мкл коктейля ингибиторов протеаз (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) на 100 мкл. Клетки в буфере RIPA разрушали с помощью импульса в течение 5 с при 3500 об / мин, используя гомогенизатор MO BIO Powerlyzer 24 (MO BIO, Carlsbad, Ca, USA). Гомогенаты центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут, чтобы осадить нерастворимый материал, и супернатанты отбирали для анализа. Белки определяли количественно с использованием метода Брэдфорда (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) и 20 мкг белка для каждого образца разделяли на 4-15% градиенте SDS-PAGE-геле и затем переносили в течение ночи при 4°C на поливинилиденфторидную (PVDF) трансферную мембрану (Amersham Hybond TM-P, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) при постоянном напряжении (33 В). Все промывки и инкубации мембран проводили при комнатной температуре. Мембрану PVDF трижды промывали в течение 5 минут трисбуферизованным солевым раствором, содержащим 0,1% Твин-20 (TBS-T; 50 мМ Трис, 100 мМ хлорид натрия, рН 7,5, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Неспецифическое связывание ингибировали путем инкубации с 10% обезжиренного молока в TBS-T в течение 1 часа. Для обнаружения GPX, мембраны затем инкубировали с кроличьим анти-GPX1-антителом (ab22604, Abcam, Cambridge, UK) в течение 2 часов при разведении 1 на 1000 в 10% обезжиренном молоке / TBS-T. После инкубации мембраны снова промывали и затем инкубировали (в течение 1 часа) с козьим анти-кроличьим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, разведенным 1:10 000 в 10% солевом растворе обезжиренного молока / трис-буфере и Tween (TBS-T), затем промывали пять раз (3 × 30 с, 1 × 5 минут и 1 × 10 минут мытья) с TBS-T. Для обнаружения актина мембраны инкубировали в течение 2 ч с моноклональным анти-β-актин-пероксидазным антителом (A3854, Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), разведенным 1:20 000 в 10% обезжиренном молоке / TBS-T. Затем мембраны промывали пять раз (3 × 30 с, 1 × 5 минут и 1 × 10 минут при комнатной температуре) в трис-буферном солевом растворе с 0,5% Твин-20 и 0,1% SDS. Наконец, все мембраны инкубировали с реагентом для определения блоттинга ECL ClarityTM Western в течение 5 минут и подвергали воздействию Amersham HyperfilmTM ECL (GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания) для обнаружения белка методом хемилюминесценции.

ЭКО и Кучевые Клетки Человека

Детали сбора клеток кумулюса человека были такими же, как и ранее, за исключением того, что выделение РНК было другим [32]. Этическое разрешение на использование образцов человека было получено в Комитете по этике исследований женской и детской больницы, Аделаида, Австралия и Научно-консультативного комитета Repromed, Аделаида, Австралия. Письменное согласие на использование клеток кумулюса для исследований было получено от тридцати пациентов, перенесших процедуру ЭКО / ИКСИ с однократным переносом эмбрионов (SET) с использованием их собственных гамет в Репромед, Далвич, Южная Австралия. Пациентки с клиническими проявлениями синдрома поликистозных яичников в данное исследование не включались. Всех пациенток стимулировали с использованием длительного протокола подавления, включающего введение аналога гонадотропин-рилизинг-гормона (Nafarelin (Synarel), Organon, Австралия), подтвержденного уровнем эстрогена в крови ниже 0,2 нМ / л. Рекомбинантный ФСГ (Gonal-F, Сероно, Сидней, Австралия или Puregon, Органон, Сидней, Австралия) вводили в течение 9-12 дней под контролем ультразвука, пока ведущий фолликул не достигал размера 18 мм. Затем пациентам вводили 5000 МЕ хорионического гонадотропина человека (Прегнил, Органон, Сидней, Австралия) через 36 часов. Кумулюс-ооцитные комплексы из фолликулов размером более 14 мм собирали с использованием трансвагинального ультразвука и иглы 17-го калибра.

Культивирование проводили при 37°C, 6% CO2, 5% O2, 89% N2, в увлажненной атмосфере, при этом манипуляции проводили при 37°C, 6% CO2. Кумулюс-ооцитные комплексы промывали в среде GFERTplus с добавлением глюкозы (2,5 мМ глюкозы) и хранили в 1 мл той же среды в течение 3 ч после сбора ооцитов как для ЭКО, так и для ИКСИ-осеменения. Наружные слои клеток кумулюса (кучевых клеток) обрезали иглой 30 калибра и собирали индивидуально перед осеменением и хранили при -80°С. Ооциты, подвергающиеся ИКСИ, подвергали воздействию гиалуронидазы 75 мЕ (Hyalase®, Aventis Pharma Pty Ltd, Lane Cove, Австралия) в GFERT с добавлением глюкозы, а затем проводили ИКСИ в среде G1.3 plus и культивировали отдельно в каплях 10 мкл той же среды под маслом для 16-18 ч. Ооциты, перенесшие ЭКО, имели внутренние слои кумулюса, оставшиеся неповрежденными, и их совместно инкубировали с 1000 подвижных сперматозоидов в 10 мкл капель среды GFERT-plus с добавлением глюкозы под маслом в течение 17-19 часов. Все ооциты культивировали индивидуально, оплодотворение оценивали через 16-19 ч после осеменения, и эмбрионы с двумя пронуклеусами продолжали культивировать индивидуально в 10 мкл капель среды G1.3 Plus под маслом в течение следующих 48 часов. Эти эмбрионы затем тщательно промывали в среде G2.3 Plus и культивировали еще 48 часов, а затем переносили в свежую среду G2.3 для последних 24 часов культивирования.

Перенос эмбрионов осуществляли на 2/3-й день или 4/5-й день для расширенной культуры. Для отбора эмбрионов для переноса использовали стандартизированные морфологические оценки качества эмбрионов на 2-й день, и во всех случаях переносили один эмбрион самого высокого морфологического качества. На 2-й день после стадии оплодотворения оценка морфологии была основана на количестве клеток, степени фрагментации и наличии многоядерных клеток. Клиническая беременность определялась наличием сердцебиения плода через 6 недель после переноса эмбрионов. Результаты родов были получены от акушера, ответственного за уход за пациентом. Акушеры указали даты родов, вес при рождении, пол и наличие каких-либо вмешательств или осложнений со стороны матери или новорожденного.

Выделение РНК из клеток кумулюса человека и ОТ-ПЦР в реальном времени

Все реагенты для выделения РНК, синтеза кДНК и ПЦР в реальном времени были приобретены у Life Technologies (Уэверли, Вик, Австралия), если не указано иное. РНК кумулюсных клеток экстрагировали с использованием Тризола в соответствии с инструкциями изготовителя с включением 7,5 мкг гликолевой кислоты во время осаждения в течение ночи при -20°С. Тотальную РНК элюировали в 20 мкл буфера для элюции, затем обрабатывали 2 ед. ДНКазы I в течение 30 мин при 37°С для удаления геномной ДНК. Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из 30–300 нг общей РНК с использованием случайных гексамерных праймеров (Geneworks, Adelaide, Australia) и обратной транскриптазы Superscript III. Тесты экспрессии генов Taqman, содержащие специально разработанные праймеры и FAM-меченный зонд, были приобретены для генов человека MRPL19 (# Hs00608519_m1) и GPX1 (# Hs00608519_m1). ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в двух экземплярах для каждого образца на Corbett Rotor Gene 6000 (Corbett Life Science, Qiagen). В каждой реакции добавляли кДНК (эквивалентную 5 нг общей РНК), 0,2 мкл анализа Taqman и 5 мкл мастер-смеси Taqman с добавлением H2O до конечного объема 10 мкл. Условия циклирования ПЦР составляли 95°С в течение 10 мин, после чего следовали 40 циклов амплификации при 95°С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин. Контроли включали пропуск матрицы кДНК или фермента RT в завершенных реакционных смесях; каждый из них не показывал признаков амплификации продукта. Экспрессия GPX1 была нормализована к гену MRPL19 путем вычисления отношения 2-ΔCt. Значения, полученные для беременных и небеременных групп, сравнивали статистически с помощью двустороннего T-критерия Стьюдента, предполагая равную дисперсию в SPSS v 20.

Результаты

Рентгенография фолликулов крупного рогатого скота

Пилотное исследование, в ходе которого были собраны изображения элементного распределения XRF для всего разреза одного яичника, привело к гипотезе, что Se активно мобилизовался в область клеток тека / гранулезы крупных фолликулов (рис. 1). Рентгенофлуоресцентная визуализация была впоследствии использована для получения изображения ключевых структурных особенностей в поперечных срезах яичников крупного рогатого скота 45 различных животных, включая: гранулезу и текальные клетки исходных, первичных, преантральных и антральных фолликулов, включая здоровые фолликулы и те, которые подвергаются атрезии; желтое тело на разных стадиях развития [стадии от I (ранние) до IV (регрессивные)] [33]; corpus albicans (регрессирующая форма желтого тела); артериолы; сосуды; и, капилляры. Качественные тренды распределения элементов были определены для Fe, Zn и Se, причем все яичники демонстрировали сильные сигналы и отчетливые локализации первых двух элементов. Zn постоянно присутствовал во всей ткани яичника, но повышался вокруг артериол и капилляров, тогда как Fe был сконцентрирован в желтом телеце и кровеносных сосудах (неопубликованные наблюдения).

Распределение Zn, Fe и Se в срезе яичника крупного рогатого скота по изображению μ-XRF

Рис. 1.  Распределение Zn, Fe и Se в срезе яичника крупного рогатого скота по изображению μ-XRF. Сравнение с соседней свежезамороженной тканью (а) показывает, что области высокой интенсивности Zn (b, розовый) соответствуют артериолам и капиллярам; высокое Fe (с, розовый) соответствует желтым телам; и высокий Se (d, розовый) локализуется в гранулезных клеточных слоях двух крупнейших здоровых фолликулов. Максимальные значения пикселей для Zn, Fe и Se составляют 63,7, 329 и 3,61 ppm соответственно. Знак ∇ указывает на атретический фолликул; * указывает на здоровый антральный фолликул; ----- указывает на желтое тело; ← указывает на сосудистую систему. Шкала: 4 мм.


Было обнаружено, что Se локализован в слое гранулезных крупных здоровых клеток фолликулов (Рис. 2b), с регулярностью и интенсивностью, которая не наблюдались у мелких (< 4 мм), мелких-средних (4 - 8 мм), средних-крупных (8-10 мм) или, наоборот, крупных атретических аналогов (Рис. 2d). Сигналы Se в больших фолликулах наблюдались у 100% здоровых (n = 10), тогда как только 30% атретических фолликулов (n = 10) показали Se. Сигнал Se не наблюдался в больших регрессирующих фолликулах (n = 2) (дополнительный набор данных 1).

Локализация Zn, Fe и Se в крупных антральных фолликулах

Рис. 2. Локализация Zn, Fe и Se в крупных антральных фолликулах. (а) H&E окрашенный серийный срез здорового фолликула диаметром 15 мм. (b) Соответствующее изображение RGB было сгенерировано из карт распределения элементов XRF и показывает распределение Zn (зеленый), Fe (красный) и Se (синий). Размер виртуального пикселя для этого тонкого сканирования составлял 2 мкм с эффективным временем задержки на пиксель 7,81 мс. Максимальные значения пикселей для Zn, Fe и Se составляют 22,4, 189 и 5,19 ppm соответственно. (c) H&E окрашенный серийный срез атретического фолликула 11 мм. (d) Соответствующее изображение RGB было сгенерировано из карт распределения элементов XRF и показывает распределение Zn (зеленый) и Fe (красный). Se не был обнаружен. Максимальные значения пикселей для Zn и Fe составляют 87 и 343 ppm соответственно. Размер виртуального пикселя для этого тонкого сканирования составлял 5 мкм с эффективным временем задержки на пиксель 2,44 мс. * указывает на сосудистую сеть; ----- указывает на разделение между гранулезным слоем и текальным слоем; gc обозначает гранулезные клетки. Масштабная линейка: 500 мкм.

Количественное определение Se с использованием ICP-MS

Для подтверждения повышенных уровней Se, наблюдаемых с помощью рентгеновской визуализации, у небеременной телки отбирали пару неплодородных яичников и затем препарировали с получением образцов, представляющих желтое тело (n = 3) и стенку фолликула (гранулезу и текальные клетки) (n = 2). В качестве стандарта концентрации использовали говяжью печень Национального института стандартов и технологий (NIST) (1577b). Одни только клетки гранулезы могли обеспечить недостаточную массу для пищеварения, и, таким образом, была рассечена вся стенка фолликула (слои теки и гранулезы). Все образцы были высушены вымораживанием (сублимацией) и подвергнуты кислотному расщеплению при СВЧ-воздействии до растворенной фазы ICP-MS. Было обнаружено, что концентрация Se, определенная в печени NIST (1577b), составляет 0,8 ± 0,03 ppm, что находится в пределах диапазона сертификации. Средняя концентрация Se для образцов Corpus lutea («желтого тела») составила 2,6 ± 1,3 ppm по сравнению со средней экспериментально определенной концентрацией для стенки фолликула 26 ± 5,0 ppm. Этот результат поддерживает качественное наблюдение XRF, что большие здоровые фолликулы содержат богатый Se компонент в отличие от желтых тел, для которых этот элемент не был обнаружен.

Анализ данных микрочипов

Ранее собранные данные микрочипов, депонированные в Омнибусе Экспрессии Генов (GEO) под регистрационными номерами GSE39589 и GSE49505,28 были исследованы для идентификации кандидатов селенопротеинов (дополнительный набор данных 2), которые могли бы объяснить высокие уровни Se, наблюдаемые в экспериментах XRF и ICPMS. Мы определили четыре потенциальных кандидата, которые были дифференциально выражены между малыми и большими здоровыми фолликулами, а также малыми атретическими и большими здоровыми фолликулами: GPX1, GPX3, VIMP и SELM (дополнительная таблица 1).

ПЦР гранулезной кДНК

Количественная ОТ-ПЦР для GPX1, GPX3, VIMP и SELM в клетках гранулезы из маленьких здоровых (n = 5) и атретических (n = 5) и крупных здоровых (n = 5) фолликулов показала только значительную активацию GPX1 у крупных здоровых фолликулы по сравнению с маленькими здоровыми или атретическими фолликулами (P <0,05) (рис. 3).

Иммуногистохимическая локализация VIMP в срезах яичников

Иммуногистохимия селенопротеина VIMP (VCP-interacting membrane selenoprotein) в крупных фолликулах групного рогатого скота показала, что он экспрессируется в слое гранулезных клеток крупных здоровых фолликулов (Рис. 4b) и в меньшей степени в слое гранулезных клеток крупных атретических фолликулов (Рис. 4d). Кроме того, VIMP также экспрессируется в слое текальных клеток крупных здоровых фолликулов.

Обнаружение GPX1 в различных типах фолликулярных клеток

На Рис.5 изображен вестерн-иммуноблоттинг белков клеток гранулезы. Рис. 5a и b показывают, что ни один из образцов клеток малых фолликулярных гранулез не имел измеримых уровней GPX1, в то время как три из пяти образцов больших фолликулов были положительными в отношении GPX1.

GPX1 в кучевых клетках из ооцитов человека

Было обнаружено, что экспрессия GPX1 значительно выше в клетках кумулюса, выделенных из комплексов кумулюсных ооцитов человеческих фолликулов, где ооцит (яйцеклетка) дал успешную беременность (рис. 6).

Средние уровни мРНК селенопротеина

Рис. 3. Средние уровни мРНК селенопротеина. Средние уровни ± SEM (a) GPX1, (b) GPX3, (c) VIMP и (d) мРНК SELM относительно рибосомальной РНК 18S в клетках гранулезы, полученных из маленьких здоровых, маленьких атретических и крупных здоровых фолликулов (n = 5 фолликулов на группа). * обозначает статистически значимое различие между группами (P <0,05).

Иммуноокрашивание VIMP в крупных фолликулах

Рис. 4. Иммуноокрашивание VIMP в крупных фолликулах. (а) H&E серийного разреза большого здорового фолликула диаметром 15 мм. Квадрат показывает площадь, показанную в (b). Масштабная линейка: 250 мкм. (b) VIMP (красный) локализуется в слое гранулярных клеток (g) и слое текальных клеток (t). an указывает на антральную полость. Базальная пластинка (------), разделяющая два клеточных слоя, окрашивается на перлекан (зеленый). Ядра контрастируют с DAPI (синий). Масштабная линейка: 100 мкм. (c) H&E непрерывного последовательного разреза в большом 17 мм атретическом фолликуле. Квадрат идентифицирует область, показанную в (d). Масштабная линейка: 500 мкм. (d) VIMP (красный) локализуется в слое гранулярных клеток (g) и слое текальных клеток (t). Базальная пластинка (------), разделяющая два клеточных слоя, окрашивается на перлекан (зеленый). Масштабная линейка: 100 мкм.

Вестерн-иммуноблоттинг GPX1 в клетках гранулезы из мелких и крупных здоровых фолликулов

Рис. 5. Вестерн-иммуноблоттинг GPX1 в клетках гранулезы из мелких и крупных здоровых фолликулов. Каждая полоса маркирует экстракты клеток гранулезы из отдельных фолликулов. (а) Экспрессия GPX1 (отмечена стрелкой, 20 кДа) в клетках гранулезы мелких здоровых фолликулов (n = 4, 3-5 мм). (b) экспрессия GPX1 (отмечена стрелкой, 20 кДа) в клетках гранулезы крупных здоровых фолликулов (n = 5, 13,5 мм ± 0,8 мм). (c) Соответствующая экспрессия актина (отмечена стрелкой, 37 кДа) в том же пятне, что и (a). (d) Экспрессия актина (отмечена стрелкой, 37 кДа) в том же пятне, что и (b).

Экспрессия GPX1 в кучевых клетках (клетках кумулюса)

Рис. 6. Экспрессия GPX1 в кучевых клетках (клетках кумулюса), выделенных из кумулюс-ооцитных комплексов ооцитов в программе ЭКО / ИКСИ, которая при переносе эмбриона либо приводила (n = 12), либо не приводила (n = 18) к беременности. * обозначает статистически значимое различие между группами (P <0,05).

Обсуждение

Экспрессия GPX1 зависит от состояния питания

Здесь мы представляем первую рентгенограмму яичников млекопитающих, показывающую, что Se постоянно локализован в клетках гранулезы крупных здоровых фолликулов. Последующие эксперименты, включая количественную ОТ-ПЦР в реальном времени и вестерн-иммуноблоттинг, идентифицируют источник Se как селенопротеин GPX1, повсеместный гомотетрамерный цитозольный фермент, экспрессируемый многими типами клеток у млекопитающих [3,34]. Экспрессия GPX1 была исследована в кучевых клетках, выделенных из кучево-ооцитарных комплексов ооцитов, подвергшихся ЭКО/ИКСИ, и обнаружена повышенной там, где ооциты дали успешную беременность.

GPX1 обильно содержится в печени и эритроцитах, причем его концентрация зависит от состояния питания Se. Он также является одним из наиболее высокочувствительных селенопротеинов, который изменяется с состоянием Se. Уровни мРНК и белка резко снижаются в условиях низкого уровня Se [35]. Однако следует отметить, что предыдущие исследования показали, что степень регуляции GPX1 варьируется от органа к органу при дефиците Se [36]. Помимо статуса Se, на экспрессию GPX1 влияют и другие факторы, включая окислительный стресс. Синтез GPX1, GPX3 и тиоредоксинредуктазы 1 (TR1) также регулируется в процессе синтеза тиреоидных гормонов, обеспечивая тироцитам значительную защиту от пероксидативного повреждения [3].

Селенопротеины, такие как GPX, могут бороться с окислительным стрессом во время развития фолликулов

Хотя роль Se в регуляции функции яичников у плода неясна [10], во взрослых яичниках было продемонстрировано, что прием Se может модулировать пролиферацию гранулезных клеток и синтез эстрадиола-17β in vitro [9,10,37]. Кроме того, его эффект может быть опосредованным, по крайней мере частично, посредством ингибирования оксида азота. Было показано, что культивирование преантральных фолликулов в присутствии селенита натрия повышает активность GPX и снижает уровни АФК, тем самым улучшая скорость развития фолликулов мыши in vitro [4]. Что касается тека, существуют данные, свидетельствующие о том, что антиоксиданты, такие как витамин Е и эбселен способны индуцировать апоптоз в клетках яичника крысы [38]. Это открытие может иметь важное клиническое значение для синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), состояния, связанного с чрезмерным ростом и активностью клеток кисты яичка [38]. Это состояние влияет на 5-10% женщин репродуктивного возраста, и появляются свидетельства того, что у женщин с СПКЯ на низком уровне часто наблюдается хроническое воспаление с возможным эффектом усиления окислительного стресса [39]. Недавнее исследование турецких женщин с СПКЯ показало, что уровни Se в плазме этих женщины были значительно ниже контрольных групп, что свидетельствует о том, что Se может играть роль в патогенезе этого состояния. Однако эти результаты следует противопоставить гораздо более ранним исследованиям, в которых предполагалось, что ингибирование окислительного стресса подавляет апоптоз гранулезных клеток в культивируемых фолликулах, что указывает на то, что воздействие антиоксидантов на апоптоз зависит от типа клеток [38,41]. Изучение потенциальной связи между фолликулостимулирующим гормоном ФСГ и глутатионом показало, во-первых, что наступлению апоптоза в преовуляторных фолликулах предшествует повышение фолликулярного АФК и, во-вторых, что лечение ФСГ повышает содержание фолликулярного глутатиона и подавляет уровни АФК [7]. Эти исследования дают веские основания для обоснования дальнейших исследований добавок селена у женщин, страдающих бесплодием.

Экспрессия GPX кажется уникальной для крупных фолликулов

Связь присутствия Se с размером фолликула и состоянием здоровья указывает на важную биологическую роль, наиболее вероятной функцией которой является то, что селенопротеины обеспечивают защиту от окислительного стресса и неизбежной атрезии или повреждения ДНК в ооците. В частности, самые высокие уровни Se и GPX1 наблюдались в клетках гранулезы крупных фолликулов, которые, как известно, экспрессируют более высокие уровни цитохрома P450s (расщепление боковой цепи холестерина и ароматазы) [42], что позволяет крупным доминантным фолликулам синтезировать прогестерон и эстрадиол-17β. Ферменты цитохрома P450 вырабатывают супероксидные анионы свободных радикалов и H2O2 как часть их механизмов [43], и, следовательно, их активация может представлять собой окислительный стресс, что требует экспрессии GPX для противодействия этому. Пытаясь охарактеризовать регуляцию апоптотической гибели клеток гранулезы в доминантных фолликулах крупного рогатого скота во время первой волны развития фолликула, исследователи пришли к выводу, что экспрессия GPX была самой высокой на 8-й день по сравнению с 4-м и 6-м днем ​​in vivo [44]. Однако в работе нет конкретного упоминания о форме идентифицированного GPX, что заставляет нас неохотно проводить сравнения с результатами нашей собственной количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Другие авторы сообщают, что GPX1 имеет самый высокий уровень экспрессии в клетках гранулезы самого эстрогенного фолликула до появления доминантного фолликула, а затем после появления доминантного фолликула имеет более высокие уровни, чем у подчиненных фолликулов [15]. Еще одно исследование, в котором использовались комбинация микрочипов и количественного ПЦР-анализа в реальном времени в попытке идентифицировать дифференциально экспрессируемые гены между самыми большими и вторыми по величине фолликулами, обнаружило активацию GPX3 в доминантном фолликуле, но не сообщала об уровнях GPX1 [45]. Эти экспериментальные наблюдения привели некоторых исследователей к гипотезе о том, что ферменты фолликулярного окислительного стресса экспрессируются в зависимости от стадии, поскольку экспрессия мРНК других ферментов антиоксидантного стресса в клетках гранулезы крупного рогатого скота была увеличена в атретических доминантных фолликулах по сравнению со здоровыми доминантными фолликулами  [44-45]. Тот факт, что экспрессия GPX1 была так сильно связана с крупными фолликулами в наших экспериментах, говорит о том, что этот антиоксидант может быть вовлечен в сигнальный процесс, ведущий к доминированию, или что он просто очищает АФК, которые в противном случае ускоряли бы атрезию в конкурирующих фолликулах, или что он защищает ооциты от повышения уровня АФК, связанного с увеличением стероидогенеза в созревающих фолликулах. Последнее подтверждается нашими результатами, показывающими повышенные уровни GPX1 в кучевых клетках, связанных с ооцитами с большей способностью вызывать беременность.

VIMP может играть роль в развитии фолликулов КРС

Человеческий селенопротеин VIMP (VCP-Interacting Membrane Selenoprotein или VCP-взаимодействующий мембранный селенопротеин) / SelS (селенопротеин S) локализуется на мембране эндоплазматического ретикулума (ER) и участвует в процессе ER-ассоциированной деградации (ERAD). Данные показывают, что селеноцистеин позволяет селенопротеину S (SelSVIMP) поддерживать активность при окислительном стрессе.

Иммуноокрашивание для селенопротеина VIMP показало, что он в основном локализован в клетках гранулезы крупных здоровых и атретических фолликулов, а также экспрессируется в текальных слоях. Это не противоречит низким уровням экспрессии, наблюдаемым в экспериментах с ПЦР, но предполагает, что этот селенопротеин обеспечивает небольшой вклад в сильную специфическую флуоресценцию гранулезных клеток, которую мы наблюдаем при визуализации XRF. Выравнивание последовательности антител VIMP с Bos taurus GPX1 показывает только 2% идентичности последовательности, исключая возможность того, что это антитело перекрестно реагирует с более распространенными членами семейства GPX. Взятые вместе с нашими результатами экспрессии генов в результате количественной ОТ-ПЦР в реальном времени, мы заключаем, что VIMP не локализован исключительно на гранулезе крупных фолликулов (различия в экспрессии генного сигнала между маленькими здоровыми, маленькими атретическими и крупными здоровыми гранулезами были не были значительными), и при этом он недостаточно выражен по сравнению с GPX1. Это говорит о том, что другие селенопротеины присутствуют на фоновых уровнях по всей ткани яичника, но только GPX1 находится в достаточно высоких концентрациях, чтобы их можно было наблюдать с помощью рентгеновской визуализации. Кроме того, экспрессия VIMP не сильно зависит от стадии фолликулярного развития.

Вычислительный анализ вторичной структуры показывает, что VIMP представляет собой единую трансмембранную спираль, а электронно-микроскопическое иммуноокрашивание показывает, что этот вид представляет собой мембранный белок плазмы и эндоплазматического ретикулума (ER) [46,47]. Было предложено участвовать в удалении неправильно свернутых белков из просвета ER для деградации [48] и защищать клетки от окислительного повреждения [49] и стресс-индуцированного апоптоза ER [50]. Дальнейшие экспериментальные результаты приводят к заключению, что селеноцистеиновая часть белка может снижать восприимчивость липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) к окислению [49]. Отрицательная ассоциация была обнаружена между VIMP и бактериальной липополисахарид-индуцированной продукцией АФК, что указывает на то, что VIMP играет важную роль в воздействии на воспалительный ответ [51]. В недавней попытке определить его ферментативную функцию был сделан вывод, что VIMP является главным образом тиоредоксин-зависимой редуктазой, способной восстанавливать H2O2, но не является эффективной пероксидазой широкого спектра действия [52].

Выводы

счастливая молодая мама

Селеновый статус нужен не только маме :)

Рентгеновская визуализация позволила нам установить возможные связи между клеточным специфическим накоплением Se и репродуктивными эффектами специфических селенопротеинов в ткани яичников крупного рогатого скота [22].

Представленные результаты демонстрируют экспрессию GPX1VIMP) в клетках гранулезы крупных здоровых фолликулов. Учитывая, что аналогичное распределение GPX1 не наблюдалось в меньших фолликулах, наши результаты показывают, что этот селенопротеин играет роль в достижении доминирования фолликула, таким образом подтверждая результаты экспрессии генов в других исследованиях.

Тот факт, что многие авторы показали заметное снижение экспрессии гена GPX1 в условиях снижения содержания Se в рационе, приводит к выводу о том, что расстройства яичников могут быть в определенной степени улучшены с помощью добавления Se. Наши результаты могут быть использованы для руководства эпидемиологическими исследованиями в отношении диетического потребления Se, экспрессии GPX1 in vivo и частоты возникновения нарушений овуляции.

Дополнительная информация:

Источник: M.J. Ceko, et alX-Ray fluorescence imaging and other analyses identify selenium and GPX1 as important in female reproductive function. Metallomics, 2014, 00, 1-3 | 11

 

Литература:

1. Y. Mehdi, J. L. Hornick, L. Istasse, I. Dufrasne, Selenium in the Environment, Metabolism and Involvement in Body Functions. Molecules 2013, 18. 3292-3311.
2. J. Lu, A. Holmgren, Selenoproteins. Journal of Biological Chemistry 2009, 284. 723-727.
3. G. J. Beckett, J. R. Arthur, Selenium and endocrine systems. Journal of Endocrinology 2005, 184. 455-465.
4. A. Abedelahi, M. Salehnia, A. A. Allameh, D. Davoodi, Sodium selenite improves the in vitro follicular development by reducing the reactive oxygen species level and increasing the total antioxidant capacity and glutathione peroxide activity. Human Reproduction 2010, 25. 977- 985.
5. M. A. Reeves, P. R. Hoffmann, The human selenoproteome: recent insights into functions and regulation. Cellular and Molecular Life Sciences 2009, 66. 2457-2478.
6. J. F. Turrens, Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology-London 2003, 552. 335-344.
7. M. Tsai-Turton, U. Luderer, Opposing effects of glutathione depletion and follicle-stimulating hormone on reactive oxygen species and apoptosis in cultured preovulatory rat follicles. Endocrinology 2006, 147. 1224-1236.
8. J. Kohrle, F. Jakob, B. Contempre, J. E. Dumont, Selenium, the thyroid, and the endocrine system. Endocr. Rev. 2005, 26. 944-984.
9. G. Basini, C. Tamanini, Selenium stimulates estradiol production in bovine granulosa cells: possible involvement of nitric oxide. Domest. Anim. Endocrinol. 2000, 18. 1-17.
10. A. T. Grazul-Bilska, J. S. Caton, W. Arndt, K. Burchill, C. Thorson, E. Borowczyk, J. J. Bilski, D. A. Redmer, L. P. Reynolds, K. A. Vonnahme, Cellular proliferation and vascularization in ovine fetal ovaries: effects of undernutrition and selenium in maternal diet. Reproduction 2009, 137. 699-707.
11. M. Grabek, Z. Swies, A. Borzecki, The influence of selenium on the reproduction of rats. Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska. Sectio D: Medicina 1991, 46. 103-5.
12. A. Agarwal, S. Gupta, L. Sekhon, R. Shah, Redox considerations in female reproductive function and assisted reproduction: From molecular mechanisms to health implications. Antioxid. Redox Signal. 2008, 10. 1375-1403.
13. S. J. Sunderland, M. A. Crowe, M. P. Boland, J. F. Roche, J. J. Ireland, Selection, dominance and atresia of follicles during the estrouscycle of heifers. Journal of Reproduction and Fertility 1994, 101. 547- 555.
14. O. J. Ginther, K. Kot, L. J. Kulick, M. C. Wiltbank, Emergence and deviation of follicles during the development of follicular waves in cattle. Theriogenology 1997, 48. 75-87.
15. M. Mihm, P. J. Baker, L. M. Fleming, A. M. Monteiro, P. J. O'Shaughnessy, Differentiation of the bovine dominant follicle from the cohort upregulates mRNA expression for new tissue development genes. Reproduction 2008, 135. 253-265.
16. Z. L. Liu, R. S. Youngquist, H. A. Garverick, E. Antoniou, Molecular Mechanisms Regulating Bovine Ovarian Follicular Selection. Mol. Reprod. Dev. 2009, 76. 351-366.
17. T. Child, Optimising the management of patients with infertility. The Practitioner 2013, 257. 19-22.
18. A. M. Propst, G. W. Bates, Evaluation and Treatment of Anovulatory and Unexplained Infertility. Obstet. Gynecol. Clin. N. Am. 2012, 39. 507- 519.
19. S. W. J. Van Rensburg, The role of delayed ovulation and anovulatory oestrus in the aetiology of functional infertility in bovines. Papers. 3rd Internat. Congr. Anim. Reprod. 1956. 52-53.
20. J. Singh, G. P. Adams, R. A. Pierson, Promise of new imaging technologies for assessing ovarian function. Animal Reproduction Science 2003, 78. 371-399.
21. M. Malinouski, S. Kehr, L. Finney, S. Vogt, B. A. Carlson, J. Seravalli, R. Jin, D. E. Handy, T. J. Park, J. Loscalzo, D. L. Hatfield, V. N. Gladyshev, High-Resolution Imaging of Selenium in Kidneys: A Localized Selenium Pool Associated with Glutathione Peroxidase 3. Antioxid. Redox Signal. 2012, 16. 185-192.
22. R. Evens, K. A. C. De Schamphelaere, B. De Samber, G. Silversmit, T. Schoonjans, B. Vekemans, L. Balcaen, F. Vanhaecke, I. Szaloki, K. Rickers, G. Falkenberg, L. Vincze, C. R. Janssen, Waterborne versus Dietary Zinc Accumulation and Toxicity in Daphnia magna: a Synchrotron Radiation Based X-ray Fluorescence Imaging Approach. Environmental Science & Technology 2012, 46. 1178-1184.
23. D. Su, S. V. Novoselov, Q. A. Sun, M. E. Moustafa, Y. Zhou, R. Oko, D. L. Hatfield, V. N. Gladyshev, Mammalian selenoprotein thioredoxin-glutathione reductase - Roles in disulfide bond formation and sperm maturation. Journal of Biological Chemistry 2005, 280. 26491- 26498.
24. H. F. Irving-Rodgers, I. L. van Wezel, M. L. Mussard, J. E. Kinder, R. J. Rodgers, Atresia revisited: two basic patterns of atresia of bovine antral follicles. Reproduction 2001, 122. 761-775.
25. L. J. Clark, H. F. Irving-Rodgers, A. M. Dharmarajan, R. J. Rodgers, Theca interna: The other side of bovine follicular atresia. Biol. Reprod. 2004, 71. 1071-1078.
26. C. G. Ryan, Quantitative trace element imaging using PIXE and the nuclear microprobe. International Journal of Imaging Systems and Technology 2000, 11. 219-230.
27. C. G. Ryan, Developments in dynamic analysis for quantitative PIXE true elemental imaging. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms 2001, 181. 170-179.
28. N. Hatzirodos, K. Hummitzsch, H. F. Irving-Rodgers, M. L. Harland, S. E. Morris, R. J. Rodgers, Transcriptome profiling of granulosa cells from bovine ovarian follicles during atresia. BMC Genomics 2014, 15. 24
29. H. F. Irving-Rodgers, K. D. Catanzariti, M. Master, P. A. Grant, P. C. Owens, R. J. Rodgers, Insulin-like growth factor binding proteins in follicular fluid from morphologically distinct healthy and atretic bovine antral follicles. Reprod. Fertil. Dev. 2003, 15. 241-248.
30. H. F. Irving-Rodgers, K. D. Catanzariti, W. J. Aspden, M. J. D'Occhio, R. J. Rodgers, Remodeling of extracellular matrix at ovulation of the bovine ovarian follicle. Molecular Reproduction and Development 2006, 73. 1292-1302.
31. R. J. Rodgers, H. F. Irving-Rodgers, Morphological classification of bovine ovarian follicles. Reproduction 2010, 139. 309-318.
32. K. M. Gebhardt, D. K. Feil, K. R. Dunning, M. Lane, D. L. Russell, Human cumulus cell gene expression as a biomarker of pregnancyoutcome after single embryo transfer. Fertility and sterility 2011, 96. 47- 52 e2.
33. J. J. Ireland, R. L. Murphee, P. B. Coulson, Accuracy of predicting stages of bovine estrous cycle by gross appearance of the corpus luteum. J. Dairy Sci. 1980, 63. 155-160.
34. S. Gromer, J. K. Eubel, B. L. Lee, J. Jacob, Human selenoproteins at a glance. Cellular and Molecular Life Sciences 2005, 62. 2414-2437.
35. R. A. Sunde, A. M. Raines, K. M. Barnes, J. K. Evenson, Selenium status highly regulates selenoprotein mRNA levels for only a subset of the selenoproteins in the selenoproteome. Bioscience Reports 2009, 29. 329-338.
36. G. Bermano, F. Nicol, J. A. Dyer, R. A. Sunde, G. J. Beckett, J. R. Arthur, J. E. Hesketh, Tissue specific regulation of selenoenzyme geneexpression during selenium deficiency in rats. Biochemical Journal 1995, 311. 425-430.
37. R. K. Parshad, Effects of selenium toxicity on oestrous cyclicity, ovarian follicles, ovulation and foetal survival in rats. Indian Journal of Experimental Biology 1999, 37. 615-617.
38. I. J. Rzepczynska, N. Foyouzi, P. C. Piotrowski, C. Celik-Ozenci, A. Cress, A. J. Duleba, Antioxidants Induce Apoptosis of Rat Ovarian Theca-Interstitial Cells. Biol. Reprod. 2011, 84. 162-166.
39. S. Gupta, N. Malhotra, D. Sharma, A. Chandra, A. Ashok, Oxidative Stress and its Role in Female Infertility and Assisted Reproduction: Clinical Implications. Int. J. Fertil. Steril. 2009, 2. 147-164.
40. A. Coskun, T. Arikan, M. Kilinc, D. C. Arikan, H. C. Ekerbicer, Plasma selenium levels in Turkish women with polycystic ovary syndrome. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2013, 168. 183-186.
41. J. L. Tilly, K. I. Tilly, Inhibitors of oxidative stress mimic the ability of Follilce Stimulating Hormone to suppress apoptosis in cultured rat ovarian follicles. Endocrinology 1995, 136. 242-252.
42. H. F. Irving-Rodgers, M. L. Harland, T. R. Sullivan, R. J. Rodgers, Studies of granulosa cell maturation in dominant and subordinate bovine follicles: novel extracellular matrix focimatrix is co-ordinately regulated with cholesterol side-chain cleavage CYP11A1. Reproduction 2009, 137. 825-834.
43. C. M. Krest, E. L. Onderko, T. H. Yosca, J. C. Calixto, R. F. Karp, J. Livada, J. Rittle, M. T. Green, Reactive Intermediates in Cytochrome P450 Catalysis. Journal of Biological Chemistry 2013, 288. 17074- 17081.
44. K. E. Valdez, S. P. Cuneo, A. M. Turzillo, Regulation of apoptosis in the atresia of dominant bovine follicles of the first follicular wave following ovulation. Reproduction 2005, 130. 71-81.
45. K. G. Hayashi, K. Ushizawa, M. Hosoe, T. Takahashi, Differential genome wide gene expression profiling of bovine largest and secondlargest follicles: identification of genes associated with growth of dominant follicles. Reprod. Biol. Endocrinol. 2010, 8. 11.
46. G. V. Kryukov, S. Castellano, S. V. Novoselov, A. V. Lobanov, O. Zehtab, R. Guigo, V. N. Gladyshev, Characterization of mammalian selenoproteomes. Science 2003, 300. 1439-1443.
47. Y. Gao, K. Walder, T. Sunderland, L. Kantham, H. C. Feng, M. Quick, N. Bishara, A. de Silva, G. Augert, J. Tenne-Brown, G. R. Collier, Elevation in tanis expression alters glucose metabolism and insulin sensitivity in H4IIE cells. Diabetes 2003, 52. 929-934.
48. Y. H. Ye, Y. Shibata, C. Yun, D. Ron, T. A. Rapoport, A membrane protein complex mediates retro-translocation from the ER lumen into the cytosol. Nature 2004, 429. 841-847.
49. Y. Gao, J. Pagnon, H. C. Feng, N. Konstantopolous, J. B. Jowett, K. Walder, G. R. Collier, Secretion of the glucose-regulated selenoprotein SEPS1 from hepatoma cells. Biochem Biophys Res Commun 2007, 356. 636-641.
50. J. E. Curran, J. B. M. Jowett, K. S. Elliott, Y. Gao, K. Gluschenko, J. M. Wang, D. M. A. Azim, G. W. Cai, M. C. Mahaney, A. G. Comuzzie, T. D. Dyer, K. R. Walder, P. Zimmet, J. W. MacCluer, G. R. Collier, A. H. Kissebah, J. Blangero, Genetic variation in selenoprotein S influences inflammatory response. Nature Genetics 2005, 37. 1234-1241.
51. J. Zeng, S. Du, J. Zhou, K. Huang, Role of SelS in lipopolysaccharide-induced inflammatory response in hepatoma HepG2 cells. Arch Biochem Biophys 2008, 478. 1-6.
52. J. Liu, F. Li, S. Rozovsky, The Intrinsically Disordered Membrane Protein Selenoprotein S Is a Reductase in Vitro. Biochemistry 2013, 52. 3051-3061.
БУДЬТЕ ЗДОРОВЫ!

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

  1. ПРОБИОТИКИ
  2. ДОМАШНИЕ ЗАКВАСКИ
  3. БИФИКАРДИО
  4. КОНЦЕНТРАТ БИФИДОБАКТЕРИЙ ЖИДКИЙ
  5. ПРОПИОНИКС
  6. ЙОДПРОПИОНИКС
  7. СЕЛЕНПРОПИОНИКС
  8. БИФИДОБАКТЕРИИ
  9. ПРОПИОНОВОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ
  10. ПРОБИОТИКИ И ПРЕБИОТИКИ
  11. СИНБИОТИКИ
  12. АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА
  13. АНТИОКСИДАНТНЫЕ ФЕРМЕНТЫ
  14. АНТИМУТАГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ
  15. МИКРОФЛОРА КИШЕЧНОГО ТРАКТА
  16. МИКРОФЛОРА И ФУНКЦИИ МОЗГА
  17. ПРОБИОТИКИ И ХОЛЕСТЕРИН
  18. ПРОБИОТИКИ ПРОТИВ ОЖИРЕНИЯ
  19. МИКРОФЛОРА И САХАРНЫЙ ДИАБЕТ
  20. ПРОБИОТИКИ и ИММУНИТЕТ
  21. ПРОБИОТИКИ и ГРУДНЫЕ ДЕТИ
  22. ДИСБАКТЕРИОЗ
  23. МИКРОЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ
  24. ПРОБИОТИКИ С ПНЖК
  25. ВИТАМИННЫЙ СИНТЕЗ
  26. АМИНОКИСЛОТНЫЙ СИНТЕЗ
  27. АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА
  28. СИНТЕЗ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
  29. СИНТЕЗ БАКТЕРИОЦИНОВ
  30. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ
  31. АЛИМЕНТАРНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
  32. ПРОБИОТИКИ ДЛЯ СПОРТСМЕНОВ
  33. ПРОИЗВОДСТВО ПРОБИОТИКОВ
  34. ЗАКВАСКИ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
  35. НОВОСТИ