Главная \ 3. Пробиотики \ Пропионовокислые бактерии \ Эффективность пропионовокислых бактерий в лечении колита

Молочные пропионибактерии снижают остроту колита

Эффективность пропионовокислых бактерий в лечении колита

пропионибактерии в лечении колита 

Молочная Propionibacterium freudenreichii снижает остроту колита путем стимуляции экспрессии MUC2 в бокаловидных клетках кишечника на модели крыс с DSS-индуцированным колитом

Seongho Ma, Jiah Yeom & Young-Hee Lim
Dairy Propionibacterium freudenreichii ameliorates acute colitis by stimulating MUC2 expression in intestinal goblet cell in a DSS-induced colitis rat model
Scientific Reports volume10, Article number: 5523 (2020)
liniya.png

Резюме. Интактный слой слизи играет важную роль в лечении воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК). Молочные пропионовокислые бактерии Propionibacterium freudenreichii обладают пробиотическим потенциалом, продуцируют пропионовую кислоту и, как известно, способствуют укреплению здоровья. Целью данного исследования была оценка влияния P. freudenreichii на улучшение состояния больных колитом. Для исследования индуцированной P. freudenreichii стимуляции продукции муцина in vitro и in vivo использовали  слизь-продуцирующие бокаловидные клетки LS 174T и модель крысы с колитом, вызванным декстраном сульфата натрия (DSS). Уровень экспрессии мРНК и белка MUC2, основного компонента кишечной слизи, повышался в SPFC-обработанных LS 174 клетках (SPFCsupernatant of P. freudenreichii culture - супернант кльтуры P. freudenreichii. Супернант - это жидкая фаза, остающаяся после того, как нерастворимые вещества, в частности клетки, осаждаются в процессе центрифугирования или осаждения). SPFC и живые P. freudenreichii (LPF) снижали индекс активности болезни (DAI) у крыс с DSS-индуцированным колитом. После лечения SPFC или LPF у крыс с DSS-индуцированным колитом уровень мРНК типичных провоспалительных цитокинов снижался, а воспалительное состояние гистологически улучшалось. Обработка SPFC и LPF увеличила уровни экспрессии генов и белков MUC2 у крыс с DSS-индуцированным колитом по сравнению с уровнями экспрессии у крыс с отрицательным контролем, а иммуногистохимия (IHC) показала увеличение уровня кишечного MUC2. Кроме того, SPFC и LPF увеличивали уровень пропионата в фекалиях крыс с DSS-индуцированным колитом. В заключение следует отметить, что P. freudenreichii может улучшить состояние острого колита, восстанавливая количество бокаловидных клеток и стимулируя экспрессию MUC2 в бокаловидных клетках кишечника.

ВСТУПЛЕНИЕ

В качестве защитной реакции воспаление необходимо для защиты организма от повреждений. Хотя воспаление удаляет вредные вещества, чтобы дать возможность организму восстановиться1, важно избегать недостаточного или чрезмерного воспаления с помощью регуляции со стороны хорошо развитой иммунной системы. Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) возникает из-за неконтролируемой иммунной системы слизистой оболочки2,3,4,5. Гомеостаз кишечника регулируется сложными факторами, такими как иммунные клетки, эпителиальные клетки и микробиота в кишечнике, и вместе эти факторы влияют на целостность слоя кишечной слизи6. Гомеостатический дисбаланс в кишечнике вызывает ВЗК, и заболеваемость ВЗК постепенно увеличивается по всему миру. Кишечные расстройства, возникающие в результате гомеостатического дисбаланса, в основном возникают в результате трех факторов7: во-первых, факторов окружающей среды, таких как курение, гигиена и индустриализация; во-вторых, генетических факторов, которые включают множество неизвестных факторов, генов и сложных сетей8; и в-третьих, дисбактериоза в толстой кишке9. Любые вредные факторы в кишечнике, такие как клиндамицин и эритромицин, уменьшают разнообразие кишечной микробиоты, что приводит к уменьшению специфических комменсальных бактерий, таких как Фирмикуты (Firmicutes), и к увеличению Бактериоидетов (Bacteroidetes)10. Впоследствии повреждается эпителий кишечника, усиливается микробная инфильтрация, повышается уровень воспаления, снижается синтез и секреция муцина11.

Муцины  это сильно гликозилированные О-гликопротеины, которые вырабатываются секреторными эпителиальными клетками, и они составляют слой слизи, который функционирует как физический барьер против патогенов, вредных агентов и колоректальных заболеваний в кишечнике12. Муцины также играют решающую роль в профилактике ВЗК13. Среди по меньшей мере 20 человеческих Муцинов MUC2 является основным компонентом муцина в толстой кишке14,15. MUC2 является единственным гелеобразующим муцином, экспрессируемым в кишечнике на физиологически значимом уровне; однако существуют и другие гелеобразующие муцины в других органах, таких как MUC5AC, MUC5B и MUC614. Кроме того, у генетически модифицированных мышей (MUC2−/−), т.е. у мышей без MUC2, развился колит и колоректальные опухоли16. ВЗК характеризуется снижением синтеза и секреции MUC217; таким образом, восстановление уровня MUC2 и образование твердого слоя слизи может улучшить ВЗК.

Были изучены многие аспекты взаимосвязи между микробиотой и здоровьем человека, например, различия в микробиомах кишечника тучных и худых мышей18 и кишечно-мозговой оси19,20. Стресс ранней жизни, вызванный материнским разлучением, вызывает различные изменения в микробиоте кишечника, что вызывает развитие таких заболеваний, как синдром раздраженного кишечника (СРК)21. СРК приводит к дисбалансу кишечной микрофлоры и чрезмерной стрессовой реакции22. Иммунная система хозяина также подвержена влиянию микробиоты кишечника. Комменсальная бактериальная ДНК повышает резистентность хозяина к специфическим паразитам, тогда как уменьшение микрофлоры кишечника вследствие лечения антибиотиками повышает восприимчивость к инфекциям паразитами23. Однако исследования взаимосвязи между микробиотой кишечника и здоровьем человека являются недостаточными; таким образом, имеется мало информации, позволяющей использовать полезные микроорганизмы для альтернативной терапии ВЗК.

Короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs), главным образом ацетат, пропионат и бутират, стимулируют бокаловидные клетки LS 174T выделять MUC224. Среди SCFAs пропионат является наиболее эффективным соединением в стимулировании выработки муцина. Propionibacterium freudenreichii, пробиотический кандидат, известен тем, что производит пропионат в качестве побочного продукта ферментации лактата. P. freudenreichii - это бактерия с общепризнанным безопасным статусом (GRAS). В этом исследовании мы выдвинули гипотезу, что введение P. freudenreichii, которая продуцирует пропионат в качестве основного метаболита, может восстанавливать бокаловидные клетки кишечника, тем самым способствуя увеличению экспрессии кишечного MUC2 и улучшению DSS-индуцированного острого колита. Для изучения защитного эффекта перорального введения живых бактерий P. freudenreichii (LPF) против повреждения слоя кишечной слизи у крыс с DSS-индуцированным острым колитом мы сначала оценили цитотоксичность супернатанта культуры P. freudenreichii (SPFC) и его стимулирующее влияние на синтез и секрецию MUC2 в бокаловидных клетках LS 174T человека in vitro. Впоследствии SPFC и LPF перорально вводили крысам на модели острого колита, вызванного DSS, и исследовали уровень экспрессии MUC2, предотвращение вызванного DSS повреждения кишечника и уменьшение воспаления in vivo.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цитотоксичность SPFC в бокаловидных клетках LS 174T

Для определения цитотоксического действия SPFC на клетки LS 174T был проведен МТТ-анализ. В качестве экспериментального контроля использовали RCM-культивированные P. freudenreichii. Относительная жизнеспособность клеток, обработанных RCM и SPFC (10%, v/v), составила 100,2±3,2% и 101,3±0,8%, соответственно, по сравнению с жизнеспособностью NC (100%) (рис. 1). Таким образом, SPFC в концентрации 10% (v/v) не оказывал цитотоксического действия на клетки.

Цитотоксическое действие SPFC на бокаловидные клетки LS 174T

Рисунок 1. Цитотоксическое действие SPFC на бокаловидные клетки LS 174T. Цитотоксичность SPFC оценивали методом МТТ-анализа. Клетки обрабатывали RCM или SPFC (10%, v/v) и инкубировали в течение 48 ч. Данные выражены в виде среднего значения ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах. NC: отрицательная контрольная группа; RCM: усиленная клостридиальная среда-обработанная группа; SPFC: супернатант культуры P. freudenreichii-обработанная группа.

Влияние SPFC на уровни экспрессии гена и белка MUC2 в клетках LS 174T

Стимулирующее влияние SPFC на экспрессию MUC2 в клетках LS 174T измеряли методом количественной ПЦР - qPCR (уровень мРНК), а также методом иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноцитохимии (уровень белка). Уровень экспрессии гена MUC2 был нормализован до уровня экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ген GAPDH).

Неожиданно, RCM-обработанные клетки LS 174T показали повышенный уровень экспрессии MUC2 по сравнению с уровнем экспрессии в NC. Уровень экспрессии MUC2 в обработанных SPFC клетках достоверно повышался в 2,20 и 3,88 раза по сравнению с уровнем экспрессии в обработанных RCM клетках и NC соответственно (Рис. 2А). Результаты ИФА уровня экспрессии белка показали, что секретируемый белок MUC2 в обработанных SPFC клетках достоверно увеличивался в 1,46- и 1,66 раза по сравнению с экспрессией в обработанных RCM клетках и NC соответственно (Рис. 2B). Кроме того, мы измерили влияние SPFC на экспрессию белка MUC2 в клетках LS 174T методом иммунофлуоресцентного окрашивания (Рис. 2С). Интенсивность флуоресценции была количественно оценена и нормализована к NC (установленному как 1) (Рис. 2D). Как показано в экспрессии генов, клетки, обработанные RCM, показали увеличение интенсивности флуоресценции по сравнению с интенсивностью флуоресценции NC. Однако интенсивность флуоресценции клеток, обработанных SPFC, значительно увеличилась в 2,95 и 3,93 раза по сравнению с клетками, обработанными RCM, и NC, соответственно. Результаты показали, что SPFC значительно стимулировал экспрессию MUC2 на транскрипционном и трансляционном уровнях.

Уровни экспрессии мРНК и белка MUC2 в обработанных SPFC клетках LS 174T 

Рисунок 2. Уровни экспрессии мРНК и белка MUC2 в обработанных SPFC клетках LS 174T. Клетки обрабатывали RCM или SPFC (10%, v/v) и инкубировали в течение 48 ч. (A) уровень экспрессии мРНК определяли методом qPCR; (B) концентрацию MUC2 в супернатанте клеточной культуры определяли методом ИФА; (C) изображения иммунофлуоресцентно окрашенных клеток; (D) результаты количественного определения продукции MUC2 методом иммуноцитохимии. Уровни экспрессии мРНК были нормализованы до референтного гена GAPDH. Каждое значение указывает на среднее значение ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах. Значимость различий определялась с помощью t-критерия Стьюдента. NC: отрицательная контрольная группа; RCM: усиленная клостридиальная среда-обработанная группа; SPFC: супернатант культуры P. freudenreichii-обработанная группа.

LPF и SPFC защищают эпителиальный слой и сохраняют бокаловидные клетки в криптах толстой кишки у крыс с острым колитом, вызванным DSS

Для изучения защитного действия LPF и SPFC на разрушение структуры крипты, которое могло бы привести к уменьшению количества интактных бокаловидных клеток, LPF и SPFC перорально вводили крысам с острым колитом, индуцированным 5% DSS (w/v) (дополнительный рис. S1). Средние участки дистального отдела толстой кишки каждой крысы были рассечены и окрашены гематоксилином и эозином (H&E) и альциановым синим (AB), а потеря поверхностного эпителия, разрушение криптовых структур и инфильтрация воспалительных клеток оценивались по данным дополнительной таблицы S1. В модельной группе был обнаружен серьезно поврежденный поверхностный эпителий, искаженная криптоструктура и преимущественно инфильтрирующие воспалительные клетки (рис. 3А); таким образом, гистопатологический балл группы составил 7,30±0,92 (рис. 3B). Кроме того, на дистальных отделах толстой кишки модельной группы наблюдался частичный абсцесс или изъязвление. Группа RCM показала такую же степень повреждения, как и модельная группа (оценка гистопатологии: 8,65±0,76). Однако группа LPF (гистопатологический балл: 2,03±0,45) показала те же гистологические характеристики, что и группа NC (гистопатологический балл: 2,18±0,07). В дистальных отделах толстой кишки крыс группы SPFC наблюдалось незначительное разрушение криптовых структур и усиление инфильтрации воспалительных клеток в незначительной степени (гистопатологический балл: 4,17±0,66).

Влияние LPF и SPFC на облегчение воспаления у крыс с DSS-индуцированным острым колитом

Рисунок 3. Влияние LPF и SPFC на облегчение воспаления у крыс с DSS-индуцированным острым колитом. Средние части дистальных отделов толстой кишки окрашивали H&E (A) и оценивали гистопатологический балл (B) у крыс с DSS-индуцированным острым колитом (n = 6 на группу, по меньшей мере 5 частей оценивали для каждого образца). Баллы выражены как среднее значение ± SD (стандартное отклонение). Тест Манна-Уитни был выполнен. Черные стрелки указывают на инфильтрированные клетки. NC: отрицательная контрольная группа; Модель: группа 5% DSS-индуцированного колита; LPF: группа с 5% DSS и обработкой живыми P. freudenreichii; RCM: группа с 5% DSS и обработкой усиленной клостридиальной средой (RCM); SPFC: группа с 5% DSS и обработкой супернатантом культуры P. freudenreichii.

Количество интактных бокаловидных клеток в крипте у крыс с острым колитом, вызванным DSS, подсчитывали методом окрашивания AB. В модельных группах и группах RCM наблюдалось достоверно меньшее количество бокаловидных клеток (7,50±0,73 и 7,08±1,02 соответственно) по сравнению с количеством бокаловидных клеток в группе NC (24,78 ± 1,35) (рис. 4). С другой стороны, количество бокаловидных клеток в группах LPF и SPFC составило 26,72±2,51 и 21,32±1,16 соответственно, что было аналогично количеству клеток в группе NC. Полученные результаты свидетельствуют о том, что лечение LPF и SPFC предотвращало разрушение эпителиального слоя толстой кишки у крыс с острым колитом, индуцированным DSS.

Защитные эффекты LPF и SPFC от разрушения бокаловых клеток у крыс с DSS-индуцированным острым колитом

Рисунок 4. Защитные эффекты LPF и SPFC от разрушения бокаловых клеток у крыс с DSS-индуцированным острым колитом. Средние части дистальных отделов толстой кишки окрашивали альциановым синим (A), а количество бокаловидных клеток в криптах подсчитывали (B) у крыс с DSS-индуцированным острым колитом. (n = 6 на группу, по крайней мере 5 частей были оценены для каждого образца). Количество бокаловидных клеток/крипт выражается как среднее значение ± SD (стандартное отклонение). Тест Манна-Уитни был выполнен. NC: отрицательная контрольная группа; Модель: группа 5% DSS-индуцированного колита; LPF: группа с 5% DSS и обработкой живыми P. freudenreichii; RCM: группа с 5% DSS и обработкой усиленной клостридиальной средой (RCM); SPFC: группа с 5% DSS и обработкой супернатантом культуры P. freudenreichii.

LPF и SPFC стимулируют экспрессию MUC2 у крыс с DSS-индуцированным острым колитом

После наблюдения за сохранением бокаловидных клеток в группах LPF и SPFC измеряли уровень экспрессии MUC2 для подтверждения защитного эффекта LPF и SPFC от острого колита. Уровни экспрессии гена и белка MUC2 измеряли с помощью qPCR и IHC соответственно. Результаты IHC показали, что экспрессия белка MUC2 в модельной и RCM-группах снизилась до 61,93±8,91% и 73,32±7,04%, соответственно, по сравнению с экспрессией в группе NC (100±1,27%) (рис. 5A, B). Экспрессия MUC2 в группе LPF (101,48±1,32%) была аналогична экспрессии в группе NC, а экспрессия MUC2 в группе SPFC значительно увеличилась до 120,34±0,96% по сравнению с экспрессией в группе NC. Экспрессия MUC2 увеличилась в 1,64 раза в группах как LPF, так и SPFC по сравнению с экспрессией в модельной и RCM группах. Экспрессия гена MUC2 была снижена в 0,79 и 0,67 раза в модели и в группах RCM по сравнению с экспрессией в группе NC, тогда как экспрессия в группах LPF и SPFC увеличилась в 1,5 и 1,32 раза соответственно по сравнению с экспрессия в группе NC (рис. 5C). Экспрессия MUC2 увеличилась в 1,90 и 1,97 раза в группах LPF и SPFC, соответственно, по сравнению с экспрессией в модельной и RCM группах. Результаты соответствовали сохранению бокаловидных клеток в ободочной кишке крыс с острым колитом, вызванным DSS.

LPF- и SPFC-индуцированные повышения уровня экспрессии MUC2 в толстой кишке у крыс с DSS-индуцированным острым колитом

Рисунок 5. LPF- и SPFC-индуцированные повышения уровня экспрессии MUC2 в толстой кишке у крыс с DSS-индуцированным острым колитом. Средние участки дистальных отделов толстой кишки анализировали на экспрессию MUC2 методом IHC (A), а интенсивность экспрессии MUC2 определяли количественно (B) (n = 6 в группе, по крайней мере 5 частей оценивали для каждого образца). Уровни экспрессии гена MUC2 измеряли с помощью количественной ПЦР (qPCR) (C). Полученные данные выражаются в виде среднего значения ± SD. Был проведен тест Манна-Уитни. NC: отрицательная контрольная группа; Модель: группа 5% DSS-индуцированного колита; LPF: группа с 5% DSS и обработкой живыми P. freudenreichii; RCM: группа с 5% DSS и обработкой усиленной клостридиальной средой (RCM); SPFC: группа с 5% DSS и обработкой супернатантом культуры P. freudenreichii.

LPF и SPFC облегчают DSS-индуцированный острый колит у крыс

Для оценки DAI ежедневно наблюдали массу тела, консистенцию стула и ректальное кровотечение после добавления DSS в питьевую воду, и эксперимент был прекращен на 8-й день после добавления DSS, поскольку группа, получавшая только DSS (модельная группа), показала тяжелую диарею и кровотечение. Во всех группах, кроме группы NC, наблюдалось снижение массы тела через 3 дня после лечения DSS, однако через 3 дня масса тела во всех группах постепенно увеличивалась (Рис. 6А). Крысы с DSS-индуцированным колитом, получавшие лечение LPF или SPFC, показали больший прирост массы тела, чем крысы в модельных группах и группах RCM. Состояние стула и состояние кровотечения наблюдались ежедневно и оценивались в соответствии с дополнительной таблицей S2. Фекальные гранулы в модельной группе начали становиться водянистыми на 3-й день, а у некоторых крыс была тяжелая диарея на 6-й день после добавления DSS (рис. 6B). У крыс с DSS-индуцированным колитом, которых лечили LPF или SPFC, была меньшая диарея, чем у крыс в модельной и RCM группах. Крысы в модельной и RCM-группах представлены кровью в фекалиях на 3-й день после добавления DSS (рис. 6C). Эти симптомы стали агрессивно усиливаться в модельной и RCM группах, тогда как в группах LPF и SPFC не было никаких серьезных симптомов. Основываясь на результатах изменения массы тела, консистенции стула и ректального кровотечения, баллы DAI в группах NC, Модель, RCM, LPF и SPFC составили 0, 6.33, 7.83, 2.50 и 1.33 соответственно на 8-й день после приема добавок DSS (рис. 6D). Полученные результаты показали, что LPF и SPFC могут улучшить состояние острого колита, вызванного DSS, у крыс.

Болеутоляющие эффекты LPF и SPFC у крыс с ДСС-индуцированным колитом

Рисунок 6. Болеутоляющие эффекты LPF и SPFC у крыс с ДСС-индуцированным колитом. Суточные изменения массы тела (A), консистенции стула (B) и ректального кровотечения (C) у всех крыс наблюдались и оценивались в течение периода лечения DSS. Массы тела рассчитывались путем деления массы тела в каждый день на исходную массу тела в первый день до лечения DSS и выражались в виде среднего группового процента ± SD (n = 6 в группе). Индекс активности заболевания (DAI) оценивался путем суммирования баллов по трем параметрам (D). Эти значения выражаются в виде среднего значения ± SD (n = 6 в каждой группе). Отмечена значимость массы тела, консистенции стула, ректального кровотечения и DAI на 8-й день. Был проведен тест Манна-Уитни. *p < 0,05, ***p < 0,001 по сравнению с группой NC; #p < 0,05 по сравнению с модельной группой; $p < 0,05, $$p < 0,01 и $$$p < 0,001 по сравнению с группой RCM. NC: отрицательная контрольная группа; Модель: группа 5% DSS-индуцированного колита; LPF: группа с 5% DSS и обработкой живыми P. freudenreichii; RCM: группа с 5% DSS и обработкой усиленной клостридиальной средой (RCM); SPFC: группа с 5% DSS и обработкой супернатантом культуры P. freudenreichii.

Защитные эффекты LPF и SPFC против уменьшенной длины толстой кишки у крыс с DSS-индуцированным острым колитом

Длина толстой кишки крыс в модельной и RCM группах, 10,47±1,53 см и 12,25±0,76 см соответственно, была значительно короче, чем у крыс с группой NC (14,78±0,97 см). Однако длина толстой кишки крыс в группах LPF и SPFC восстановилась до 15,12±1,66 см и 15,97±0,31 см соответственно (дополнительный рис. S2A, B). Эти результаты показали, что LPF и SPFC восстановили длину толстой кишки до нормального диапазона. Полученные результаты показали, что лечение LPF и SPFC уменьшало повреждение толстой кишки у крыс с DSS-индуцированным острым колитом.

LPF и SPFC снижают уровень экспрессии провоспалительных цитокинов, а SPFC повышает уровень экспрессии противовоспалительного цитокина у крыс с DSS-индуцированным острым колитом

Так как при окрашивании H&E наблюдалось воспаление у крыс с DSS-индуцированным острым колитом, для оценки ингибирующего действия LPF и SPFC на экспрессию типичных провоспалительных цитокинов, TNF-α, IL-6 и IL-1β и стимулирующее влияние LPF и SPFC на экспрессию IL-10, противовоспалительного цитокина, уровни экспрессии мРНК цитокинов в дистальных отделах толстой кишки крыс в каждой группе измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qPCR). Уровни экспрессии TNF-α, IL-6 и IL-1 в модельной группе были значительно повышены в 1,82, 2,64 и 2,27 раза соответственно по сравнению с уровнями экспрессии в группе NC, тогда как уровни экспрессии TNF-α, IL-6 и IL-1 в группе LPF были в 1,19, 1,00 и 1,06 раза выше по сравнению с уровнями экспрессии в группе NC (рис. 7А-С). Уровни экспрессии TNF-α, IL-6 и IL-1β в группе LPF снизились на 35,0%, 62,1% и 53,5% соответственно по сравнению с уровнями экспрессии в модельной группе. Уровни экспрессии TNF-α, IL-6 и IL-1β в группе RCM были значительно увеличены в 1,73, 2,23 и 2,03 раза соответственно по сравнению с уровнями экспрессии в группе NC, тогда как уровни экспрессии TNF-α, IL-6 и IL-1 в группе SPFC были ниже, чем в группе RCM (в 1,67, 1,05 и 1,03 раза соответственно). Уровни экспрессии TNF-α, IL-6 и IL-1β в группе SPFC снизились на 3,5%, 52,9% и 49,3% соответственно по сравнению с уровнями экспрессии в группе RCM. Результаты показали, что LPF и SPFC обладают противовоспалительной активностью. Хотя уровень экспрессии IL-10 не был значительным, уровень экспрессии увеличился в 1,22 раза в LPF по сравнению с модельной группой и увеличился в 2,73 раза в группе SPFC по сравнению с группой RCM (рис. 7D).

LPF- и SPFC-индуцированное снижение провоспалительных цитокинов и увеличение противовоспалительных цитокинов в дистальном отделе толстой кишки крыс с DSS-индуцированным колитом

Рисунок 7. LPF- и SPFC-индуцированное снижение провоспалительных цитокинов и увеличение противовоспалительных цитокинов в дистальном отделе толстой кишки крыс с DSS-индуцированным колитом. Уровни экспрессии провоспалительных цитокинов (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-1β и противовоспалительного цитокина (D) IL-10 измеряли с помощью qPCR. Данные выражены как среднее значение ± SD (n = 6 на группу). NC: отрицательная контрольная группа; Модель: группа 5% DSS-индуцированного колита; LPF: группа с 5% DSS и обработкой живыми P. freudenreichii; RCM: группа с 5% DSS и обработкой усиленной клостридиальной средой (RCM); SPFC: группа с 5% DSS и обработкой супернатантом культуры P. freudenreichii.

Изменения в SCFAs в фекалиях крыс с DSS-индуцированным острым колитом после лечения LPF или SPFC

P. freudenreichii является пропионат-продуцирующей бактерией; таким образом, чтобы исследовать влияние LPF и SPFC на продукцию SCFA в толстых кишках экспериментальных крыс, проводили высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с фекалиями крыс с DSS-индуцированным острым колитом. Концентрация ацетата до того, как крысам давали DSS, была выше в группах LPF и SPFC (690,52 ± 15,61 и 581,26 ± 13,50 мкмоль / г фекалий соответственно), чем в группе NC (486,45 ± 47,63 мкмоль / г фекалий), модельной группе (561,30 ± 1,72 мкмоль / г фекалий) и группе RCM (447,54 ± 14,79 мкмоль / г фекалий) (рис. 8А). Хотя концентрация ацетата увеличилась в группах LPF и SPFC, только группа SPFC показала значительное увеличение по сравнению с концентрацией в группе RCM. После введения DSS концентрация ацетата во всех группах снизилась, и не было значительного различия в концентрации ацетата между группами. Концентрации пропионата в группах LPF и SPFC значительно увеличились до 19,01 ± 1,14 мкмоль / г фекалий и 34,99 ± 3,18 мкмоль / г фекалий соответственно по сравнению с концентрацией в группе NC (11,32 ± 1,66 мкмоль / г фекалий) до DSS администрации (рис. 8B). После того, как крысам давали DSS, концентрации пропионата у крыс во всех группах, кроме группы NC, были ниже, чем у крыс до введения DSS. Концентрации пропионата в модельной и РКМ группах составляли 1,88 ± 0,32 мкмоль / г фекалий и 4,04 ± 0,94 мкмоль / г фекалий соответственно, тогда как группы LPF (17,31 ± 1,93 мкмоль / г фекалий) и SPFC (24,07 ± 8,05 мкмоль / г фекалий) показали более высокие концентрации пропионата, чем модельная и RCM группы, соответственно. До того как крысам давали DSS, концентрации бутирата в фекалиях в группах NC, Модельной, LPF, RCM и SPFC составляли 36,89 ± 5,43 мкмоль / г фекалий, 34,62 ± 0,52 мкмоль / г фекалий, 37,55 ± 6,76 мкмоль / г фекалий, 23,24 ± 0,02 мкмоль / г фекалий и 40,29 ± 2,00 мкмоль / г фекалий соответственно (рис. 8C), что выявило одинаковую концентрацию бутирата во всех группах, кроме группы RCM. После обработки DSS концентрации бутирата в модельной (19,71 ± 0,27 мкмоль / г фекалий) и RCM (11,77 ± 1,92 мкмоль / г фекалий) группах значительно снизились по сравнению с концентрациями в группе NC (40,94 ± 2,37 мкмоль / г фекалий), тогда как группы LPF (37,21 ± 2,53 мкмоль / г фекалий) и SPFC (22,27 ± 2,06 мкмоль / г фекалий) показали значительно более высокие концентрации, чем группы модели и RCM, соответственно. Ацетат снизился в группах NC и LPF после лечения DSS. В отличие от ацетата уровни пропионата и бутирата в модельной и RCM-группах значительно снижались у крыс с DSS-индуцированным острым колитом по сравнению с уровнями у крыс в группе NC, тогда как уровни пропионата и бутирата в группах LPF и SPFC были значительно выше, чем в модельной и RCM группах соответственно. SPFC содержал пропионат, который может влиять на повышение концентрации фекального пропионата у крыс, получавших SPFC.

Концентрация SCFA повышалась в толстой кишке крыс, получавших лечение LPF и SPFC с острым колитом, индуцированным DSS

Рисунок 8. Концентрация SCFA повышалась в толстой кишке крыс, получавших лечение LPF и SPFC с острым колитом, индуцированным DSS. Концентрации SCFA в фекалиях крыс измеряли методом ВЭЖХ, и полученные данные выражали в виде среднего значения ± SD (мкмоль/г фекалий). Концентрации ацетата (A), пропионата (B) и бутирата (C) до (слева) и после (справа) лечения DSS. NC: отрицательная контрольная группа; Модель: группа 5% DSS-индуцированного колита; LPF: группа с 5% DSS и обработкой живыми P. freudenreichii; RCM: группа с 5% DSS и обработкой усиленной клостридиальной средой (RCM); SPFC: группа с 5% DSS и обработкой супернатантом культуры P. freudenreichii.

Количество Propionibacterium в кишечнике после введения LPF

Для подтверждения того, что перорально введенные LPF достигали и оседали в кишечнике, колонии Propionibacterium в фекалиях группы LPF подсчитывали с использованием селективной среды с дрожжевым экстрактом лактатного агара (YELA). Были использованы образцы дней 7, 14, 21 и 29. Количество Propionibacterium на 7-й день, последний день адаптационного периода, было ниже обнаруживаемого диапазона (дополнительный рис. S3). Однако после того, как 108 КОЕ LPF вводили перорально в течение 7 дней (день 14), количество пропионибактерии быстро увеличивалось до 1,24×105 КОЕ/г фекалий. До 21 дня бактерия поддерживалась на почти постоянном уровне (1,16×105 КОЕ/г фекалий). В последний день 5%-ного DSS-лечения для индукции колита, на 29-й день, количество пропионибактерии слегка увеличилось до 3,80×105 КОЕ/г фекалий. Хотя на среде YELA наблюдался некоторый рост других бактерий, результаты показали, что перорально введенные LPF достигли кишечника и стали устойчивыми.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время, учитывая интерес к взаимодействию между хозяином и кишечной микробиотой, широко распространены исследования, показывающие положительное влияние пробиотиков на здоровье человека. Однако механизм полезных улучшений, вызванных бактериями при различных заболеваниях, до сих пор неясен.

Пробиотики Lactobacillus plantarum и Lactobacillus rhamnosus индуцируют увеличение экспрессии гена муцина в эпителиальных клетках кишечника человека НТ-29, что приводит к ингибированию адгезии энтеропатогенных кишечных палочек к кишечным эпителиальным клеткам25. В отличие от этого, эпителиальные клетки HT-29 толстой кишки не продуцируют муцин in vitro26. Сыры, приготовленные из закваски, содержащей P. freudenreichii ITG P20 (CIRM-BIA 129), снижают степень острого колита, вызванного тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), за счет противовоспалительной активности и снижения окислительного стресса в толстой кишке и повреждения эпителиальных клеток27. В этом исследовании была использована линия муцин-продуцирующих бокаловидных клеток, и P. freudenreichii увеличивал экспрессию MUC2 in vitro и in vivo. Кроме того, бактерия GRAS, P. freudenreichii, увеличила экспрессию MUC2 на транскрипционном и трансляционном уровнях in vivo и восстановила количество бокаловидных клеток кишечника, что привело к улучшению острого колита, вызванного DSS. Кроме P. freudenreichii, некоторые молочные производители пропионата оказывают благотворное влияние на здоровье человека. Lactobacillus mucosae может прилипать к кишечной слизи и подавлять рост патогена в желудочно-кишечном тракте, тем самым рассматриваясь как потенциальный пробиотический кандидат28. Вид Phascolarctobacterium faecium, обильно колонизированный в желудочно-кишечном тракте человека, ассоциируется с положительным метаболическим состоянием и настроением человека. С другой стороны, повышенное обилие некоторых продуцирующих пропионат бактерий, таких как Veillonella parvula, Bacteroides eggerthii, Bacteroides fragilis, Ruminococcus bromii и Eubacterium dolichum, может быть связано с рецидивирующим полихондритом - воспалительным заболеванием в хрящевых тканях всего организма, вызванным стимуляцией кишечных Th17-клеток и индукцией дисбаланса Th17/Treg-клеток в кишечнике30.

Нарушение слизистого слоя кишечника индуцирует колит, который сопровождается воспалением; таким образом, восстановление слизистого слоя улучшает колит и обычно сопутствующее воспаление. В этом исследовании LPF и SPFC восстанавливали количество бокаловидных клеток кишечника, сопровождая увеличение продукции MUC2, которая была повреждена DSS, и снижали экспрессию генов воспалительных цитокинов, что указывает на то, что LPF и SPFC улучшали колит. DAI показал последовательные результаты; LPF и SPFC улучшили колит у крыс с DSS-индуцированным острым колитом. Следовательно, P. freudenreichii защищает окружающую среду кишечника хозяина от вызванного DSS острого колита и также производит противовоспалительное действие. Кишечная железа покрыта эпителиальным слоем, который содержит различные типы клеток, включая бокаловидные клетки, которые производят муцин. Бокаловидные клетки располагаются в криптах толстой кишки, которые являются структурой кишечной железы в толстой кишке. ВЗК приводит к прогрессирующему разрушению кишечной крипты, что индуцирует уменьшение количества бокаловидных клеток и разрушение слоя кишечной слизи. В этом исследовании LPF и SPFC способствовали сохранению структуры крипты толстой кишки, что позволило бокаловидным клеткам экспрессировать и секретировать белок MUC2.

Во многих исследованиях SCFAs бутират в основном выделяется из-за его разнообразных ролей и видов деятельности, таких как действие в качестве источника энергии, поддержание кишечного гомеостаза и ингибирование активности гистоновой деацетилазы31,32. Пропионат – это хорошо известный вид SCFA, который улучшает кишечное воспаление33, а пропионат, производимый кишечной микробиотой, способствует различным составляющим здоровья человека, которые выходят за пределы кишечника. Было показано, что пропионат ингибирует биосинтез холестерина в печени, регулирует потребление пищи и ожирение и вызывает гипофагию, которые связаны с метаболизмом и энергетическим гомеостазом34,35. Пропионат также снижает риск липогенеза и канцерогенеза, защищает от гипертонического поражения сердечно-сосудистой системы и улучшает рассеянный склероз 36,37,38. Однако, вероятно, что здоровьесберегающие эффекты пропионата менее изучены, чем эффекты бутирата. С другой стороны, пропионат проявляет гепатотоксичность при концентрации более 70 мкм39. Таким образом, введение высокой концентрации пропионата может не быть эффективным методом для получения полезных эффектов. Введение LPF является альтернативным методом обеспечения устойчивого поступления пропионата в кишечник. P. freudenreichii главным образом используется как стартерная бактерия в приготовлении твердого сыра и производит ацетат и пропионат как субпродукты. В этом исследовании группы LPF и SPFC показали более высокие уровни пропионата, чем группа NC. При этом концентрация пропионата в кишечнике в группах LPF и SPFC была ниже, чем концентрации, индуцирующие гепатотоксичность.

Пребиотические волокна проявляют много полезных эффектов, включая улучшение воспаления в толстой кишке, и SCFAs, производимые из волокон SCFA-продуцирующей кишечной микробиотой, вносят свой вклад в благотворное воздействие. Хотя известно, что SCFAs, особенно бутират, благотворно влияют на колит, недавнее исследование показало отрицательное влияние бутирата на колит в исследованиях на животных40. Ферментируемые волокна изменяли состав микробиоты, что вызывало избыточное производство бутирата и приводило к обострению ВЗК. Таким образом, положительная роль SCFA при колите, по-видимому, колеблется в зависимости от изменений в микробиоме кишечника. В этом исследовании концентрация бутирата у крыс, получавших LPF- и SPFC-терапию, не превышала концентрацию отрицательного контроля. В дальнейшем нам необходимо проанализировать изменение состава микробиоты кишечника при обработке LPF и SPFC.

В этом исследовании некоторые компоненты RCM могут быть перенесены в SPFC; таким образом, RCM был использован для экспериментального контроля. Хотя это не было статистически значимым, RCM продемонстрировал слабую способность увеличивать уровень экспрессии MUC2 in vitro. RCM содержит ацетат (3 г/л), а ацетат также немного увеличивает экспрессию MUC2 в клетках LS 174T; это действие могло вызвать небольшое повышение уровня экспрессии MUC2. Хотя оценки DAI для групп LPF и SPFC существенно не отличались, другие результаты были различны между ними с точки зрения оценки гистопатологии и экспрессии цитокинов, особенно отсутствие ингибирующего эффекта SPFC на экспрессию TNF-α.

SlpB, поверхностный белок P. freudenreichii, играет роль в адгезии бактерии к клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека HT-2926. Пероральное введение LPF увеличивало количество пропионибактерий в кишечнике группы LPF, что означает, что LPF будет производить пропионат в кишечнике, что приведет к увеличению его уровня в группе LPF по сравнению с таковым в группе NC. В этом исследовании были использованы специфические беспатогенные крысы (SPF), что означает, что, хотя существует некоторое колебание в составе микробиоты, микробиота в их кишечнике уже установлена. Хотя колонии, выращенные на среде, селективной к пропионибактериям, увеличились в кишечнике группы LPF, неясно, что на этой среде были выращены только P. freudenreichii. Поэтому, чтобы убедиться, что вид P. freudenreichii был установлен в кишечнике и что он вызывает улучшение при остром колите, необходимы дальнейшие исследования с использованием животных, не содержащих микробов. Кроме того, хотя LPF и SPFC показали незначительную разницу в индуцировании улучшений при остром колите, вызванном DSS, их введение улучшило острый колит. Поэтому в ходе дальнейших исследований следует определить эффективный фактор(ы) в LPF и SPFC.

Бутират и пропионат увеличивают экспрессию мРНК MUC2 в клетках LS 174T за счет ацетилирования/метилирования гистонов на промоторе MUC235. P. freudenreichii убивает клетки из клеточных линий колоректальной карциномы человека, HT-29 и Caco-2, путем апоптоза, который индуцируется пропионатом и ацетатом, которые продуцируются бактерией в качестве основных цитотоксических агентов43. Как LPF, так и SPFC проявляют сходные эффекты в улучшении DSS-индуцированного колита, что означает, что LPF и SPFC могут содержать или не содержать общие факторы. P. freudenreichii производит несколько полезных метаболитов, включая SCFAs, особенно пропионат. В этом исследовании группы LPF и SPFC показали более высокие уровни пропионата и бутирата после индукции колита DSS, чем модельные и RCM группы соответственно. Уровень бутирата не снижался в группе NC после введения DSS, что может быть связано со многими бактериями, продуцирующими бутират в кишечнике44. В отличие от уровней бутирата, уровни пропионата в группах LPF и SPFC значительно увеличились по сравнению с уровнями в группе NC. Таким образом, пропионат в SPFC и пропионат, полученный при введении LPF, могут быть одним из общих факторов, которые способствовали восстановлению числа бокаловидных клеток, что привело к улучшению острого колита путем стимуляции экспрессии MUC2 и уменьшения воспаления.

В заключение следует отметить, что молочные продукты P. freudenreichii обладают пробиотическими свойствами, в том числе способностью убивать раковые клетки толстой кишки. Кроме того, в этом исследовании было представлено новое объяснение влияния P. freudenreichii на облегчение колита. В данной работе подчеркивается потенциал P. freudenreichii в качестве пробиотика для безопасного и эффективного улучшения ВЗК путем восстановления количества бокаловидных клеток кишечника, сопровождающегося повышением экспрессии MUC2, а также оказывающего противовоспалительное действие в дистальном отделе кишечника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Среда RPMI-1640, фетальная бычья сыворотка (FBS) и пенициллин/стрептомицин для культивирования клеток были получены из компании HyClone (Logan, UT, США). Усиленная клостридиальная среда (RCM) была приобретена у компании Oxoid (Hampshire, Великобритания), 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT) был получен из компании Amresco (Solon, OH, США), а декстран сульфат натрия (DSS, MW 36,000–50,000 Da) был приобретен у MP Biomedicals (Solon, OH, США). Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)-оценка ацетата, пропионата и бутирата; диметил сульфоксид (DMSO); и 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) были получены из компании Sigma (Сент-Луис, штат Миссури, США).

Клеточная культура

Бокаловидные клетки человека LS 174 T, полученные из корейского банка клеточных линий (Сеул, Корея), культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C в атмосфере 5% CO2 и 95% воздуха, а среду заменяли свежей каждые два дня.

Подготовка LPF и SPFC

Штамм P. freudenreichii KCTC 1063 (корейская коллекция типовых культур, Jeongeup-si, Корея) выращивали в RCM при 37°C в течение 36-40 ч в анаэробной камере с контейнерной системой BD GasPak ™ EZ (Becton Dickinson, Sparks, MD, США). После 3 периодов активации живые клетки P. freudenreichii (LPF) собирали центрифугированием при 3000×g в течение 5 мин при 4°C, дважды промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и разбавляли PBS до концентрации 10колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Супернатант культуры P. freudenreichii (SPFC) доводили до рН 7,0±0,1 с использованием небольшого количества 5М NaOH и фильтровали с помощью мембранного фильтра (размер пор 0,22 мкм) (Sartorius, Геттинген, Германия). Концентрация пропионата в SPFC составила 32,7 мм, а хроматограмма показана на дополнительном рис. S4. Для экспериментального контроля RCM инкубировали и обрабатывали таким же образом, как SPFC, чтобы исключить возможное влияние любых факторов, полученных из RCM, на клетки LS 174T.

Измерение цитотоксичности SPFC в клетках LS 174T

Предварительно слитые клетки LS 174 Т высевали в 96-луночные планшеты и обрабатывали 10% (v/v) SPFC или RCM в среде RPMI в течение 48 часов. Среду отсасывали и клетки инкубировали в МТТ, разведенном средой RPMI, в течение 1 часа при 37°С. Затем полученные кристаллы формазана растворяли в 100 мкл DMSO в течение 1 часа при комнатной температуре. Поглощение измеряли при 540 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов SpectraMax 340 (Molecular Devices Corp., Саннивейл, Калифорния, США). Относительную жизнеспособность клеток (%) рассчитывали по следующему уравнению: жизнеспособность клеток (%) = [OD (экспериментальная группа) / OD (контрольная группа)] × 100.

ELISA

Для измерения секретируемого MUC2 супернатанты клеточной культуры LS 174 готовили центрифугированием при 1000×g при 4°C. Концентрацию белка MUC2 в супернатантах измеряли в соответствии с инструкциями из набора ELISA для человеческого MUC2, полученного от Elabscience (E-EL-H0632, Хьюстон, Техас, США).

Иммуноцитохимия

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и пермеабилизировали 0,1% Тритоном Х-100 в течение 10 минут. После блокирования с 10% нормальной ослиной сывороткой клетки инкубировали с первичным антителом против MUC2 (1: 1000, GTX100664, Genetex, Irvine, CA, USA) при 4°C в течение ночи. Козлиные анти-кроличьи IgG (H+L), DyLight 488 (1:1000, 35552, Thermo Scientific) использовали в качестве вторичного антитела, а DAPI (1: 10000) применяли для противодействия окрашиванию ядер в течение 10 минут при комнатной температуре. Образцы промывали буферным раствором PBS три раза в течение 5 минут, и покровные стекла помещали на предметные стекла и устанавливали с использованием VECTASHIELD® (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Изображения получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Nikon C1 plus (Nikon, Токио, Япония).

DSS-индуцированная модель острого колита крыс

Самцы крыс Спрег-Доули в возрасте 5 недель со средним весом 147,50 ± 5,53 г были приобретены в компании Koatech (Пхенчхан, Корея). Крыс помещали и содержали при постоянной температуре 24±1 °С и влажности 55% в стандартных клетках с циклом 12 ч-12 ч света-темноты. Все животные имели свободный доступ к воде и стерилизованной диете Чау (Harlan diet 2018S, Koatech, Pyeongtaek, Gyeonggi-do, Korea). Все экспериментальные процедуры были одобрены комитетом по институциональному уходу и использованию животных Корейского Университета (номер разрешения: KUIACUC-2017-32) и соответствовали руководству по уходу и использованию лабораторных животных (публикация NIH № 85-23, 1996). Схема эксперимента, использованная для исследования на животных, показана на дополнительном рисунке S1. Крысам давали семидневный период адаптации, а затем случайным образом делили на пять групп (n = 6) и перорально вводили LPF (1×10КОЕ) или SPFC (1 мл) ежедневно в течение 22 дней. Чтобы вызвать острый колит, крысам давали 5% DSS в их питьевой воде в течение последних 8 дней эксперимента16. Крысам I группы (отрицательный контроль [NC]) давали нормальную питьевую воду и перорально вводили 1 мл PBS. Крыс II группы (модельная группа) кормили и лечили так же, как и I группу, за исключением того, что им давали 5% DSS в питьевой воде в течение последних 8 дней эксперимента, чтобы вызвать острый колит. Крысам III группы (Группа LPF), IV группы (Группа RCM) и V группы (Группа SPFC) перорально вводили живые P. freudenreichii (1×108 КОЕ), RCM (1 мл) и SPFC (1 мл) соответственно, начиная с 8-го дня после адаптации к концу эксперимента на животных, причем эти группы получали воду с 5% DSS в течение последних 8 дней эксперимента. Фекалии всех крыс собирали и хранили при температуре -80 °С до момента использования.

Гистологические анализы и IHC

Средние участки дистальных отделов толстой кишки каждой крысы фиксировали в 4% нейтральном буферном формалине (NBF) и погружали в парафин, а затем получали срезы размером 3 мкм. Слайды были окрашены H&E или AB. Для оценки повреждения толстой кишки слайды, окрашенные H&E, наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа (LEICA ICC50, Wetzlar, Германия) и оценивали по параметрам, приведенным в дополнительной таблице S145. Бокаловидные клетки в криптах подсчитывали вместе с окрашенными AB образцами. Для IHC антиген извлекали с помощью буфера Tris-EDTA (рН 9,0), а процедуру детекции проводили с помощью системы обнаружения большого объема UltraVision LP: HRP Polymer (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Использовали первичное антитело против MUC2 (sc-7314, Санта-Круз, Даллас, Техас, США), а изображения, полученные с помощью фазово-контрастного микроскопа (LEICA ICC50), анализировали с помощью ImageJ.

Оценка индекса активности заболевания (DAI) и длины толстой кишки

Для оценки DAI у крыс наблюдали потерю массы тела, консистенцию фекальных гранул и признаки ректального кровотечения, при этом им давали 5% DSS. Система подсчета баллов DAI была создана с параметрами, описанными в дополнительной таблице S2, с незначительными модификациями46. Оценка потери массы тела (%) проводилась следующим образом: [(масса тела каждого дня после введения крысам 5% DSS)/(масса тела непосредственно перед введением крысам 5% DSS)] × 100. Значение DAI рассчитывалось путем суммирования показателей потери массы тела, консистенции стула и ректального кровотечения; общий балл составил от 0 (нормальный) до 12 (тяжелый колит).

Толстую кишку каждой крысы в последний день эксперимента собирали и измеряли по длине (см) перед выдержкой образцов при температуре -80°С для использования в дальнейших анализах.

Измерение экспрессии генов методом qPCR

Общую РНК каждого образца экстрагировали с использованием 1 мл реагента Тризол (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Общая РНК была количественно определена с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, США) и преобразована в кДНК с помощью набора для синтеза кДНК первой нити RevertAid (Thermo Fisher Scientific). Количественная ПЦР (qPCR) была выполнена с использованием Kapa SYBR Fast qPCR kit (Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA) с количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) StepOnePlus™ System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Последовательности праймеров ПЦР приведены в дополнительной таблице S3. Образец qPCR предварительно нагревали до 95°C в течение 10 мин с последующим 40 циклами 95°C в течение 15 С, 60°C в течение 15 С и 72°C в течение 20 С. В качестве гена внутреннего контроля использовали GAPDH. Данные были проанализированы на основе метода 2−ΔΔCt (контроль GAPDH был установлен на 1)47. Для образцов животных остаточный DSS в извлеченной общей РНК из образцов толстой кишки удаляли с помощью 8M LiCl, чтобы предотвратить возможное перенос DSS из образцов толстой кишки обработанных DSS крыс48, поскольку DSS, остающийся в образцах толстой кишки, может ингибировать активность обратной транскриптазы. Общая РНК была количественно определена и преобразована в кДНК с помощью той же процедуры, описанной выше, за исключением того, что в качестве гена внутреннего контроля использовался β-актин.

ВЭЖХ

Для анализа содержания SCFAs в фекалиях крыс фекалии высушивали, суспендировали в ВЭЖХ-градуированной воде с соотношением разведения 1:3 (w:v) и центрифугировали при 12 000×g в течение 10 мин при 4°C. Супернатант фильтровали шприцевым фильтром с размером пор 0,45 мкм (ADVANTEC, Токио, Япония). Ацетат, пропионат и бутират служили эталонами для калибровки, и их концентрации в каждом образце определялись с помощью системы UltiMate 3000 Rapid Separation LC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США). Колонку для исключения ионов Aminex® HPX-87H (300 мм×7,8 мм, Bio-Rad, Hercules, CA, США) использовали при температуре 55°C. В качестве подвижной фазы использовали изократически отфильтрованную и дегазированную 0,005 м H2SO4 (серную кислоту) со скоростью потока 0,6 мл/мин. Общее время работы составило 50 мин, а SCFAs были обнаружены на длине волны 210 Нм. Концентрации SCFAs в каждом образце были выражены в виде среднего значения мкмоль / г фекалий. Профили ВЭЖХ для ацетата, пропионата и бутирата показаны на дополнительном рис. S5.

Propionibacterium-селективные среды

Чтобы оценить, был ли вид P. freudenreichii установлен в кишечнике, использовали среду YELA, содержащую 1% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 0,025% K2HPO4, 0,005% MnSO4, 1% лактата натрия и 1,5% агара (pH 7,0±0,05) для подсчета количества пропионибактерий в фекалиях49. Фекалии группы LPF в дни 7, 14, 21 и 29 собирали и суспендировали в PBS с коэффициентом разбавления 1:3. Затем образцы распределяли по среде YELA и инкубировали при 30°C в течение 6 дней в анаэробной камере с системой GasPak (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Коричневые колонии (≥1 мм в диаметре) были подсчитаны как колонии Propionibacterium на YELA.

Статистический анализ

Все статистические анализы были выполнены с использованием пакета программного обеспечения «Статистический пакет для социальных наук» (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США), версия 24.0. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD) трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах in vitro, и как среднее ± SD экспериментов, выполненных in vivo. Значимость различий определяли по критерию Стьюдента для экспериментов in vitro. Значимость различий между группами определяли по критерию Манна-Уитни. Значение P <0,05 считалось значимым.

Дополнительная информация (таблицы, рисунки)

Дополнительно см.:

Литература

  1. Hakansson, A. & Molin, G. Gut microbiota and inflammation. Nutrients 3, 637–682 (2011).
  2. Strober, W., Fuss, I. & Mannon, P. The fundamental basis of inflammatory bowel disease. The Journal of Clinical Investigation 117, 514–521 (2007).
  3. Singh, P., Ananthakrishnan, A. & Ahuja, V. Pivot to Asia: inflammatory bowel disease burden. Intestinal Research 15, 138–141 (2017).
  4. Ng, S. C. et al. Incidence and phenotype of inflammatory bowel disease based on results from the Asia-pacific Crohn’s and colitis epidemiology study. Gastroenterology 145, 158–165 (2013).
  5. Ananthakrishnan, A. N. The new face of IBD in Inflammatory Bowel Disease (ed. Cohen, R. D.) 1‒11 (Springer, 2017).
  6. Maloy, K. J. & Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature 474, 298–306 (2011).
  7. Baumgart, D. C. & Carding, S. R. Inflammatory bowel disease: cause and immunobiology. Lancet 369, 1627–1640 (2007).
  8. Jostins, L. et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature 491, 119–124 (2012).
  9. Mukhopadhya, I., Hansen, R., El-Omar, E. M. & Hold, G. L. IBD—what role do Proteobacteria play? Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology 9, 219–230 (2012).
  10. Adler, C. et al. The alternative role of enterobactin as an oxidative stress protector allows Escherichia coli colony development. Plos One 9, e84734 (2014).
  11. Van der Sluis, M. et al. Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that MUC2 is critical for colonic protection. Gastroenterology 131, 117–129 (2006).
  12. Moniaux, N., Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P. & Batra, S. K. Structural organization and classification of the human mucin genes. Frontiers in Bioscience 6, D1192–1206 (2001).
  13. Qin, X. Damage of the Mucus Layer: The Possible Shared Critical Common Cause for Both Inflammatory Bowel Disease (IBD) and Irritable Bowel Syndrome (IBS). Inflammatory Bowel Diseases 23, E11–E12 (2017).
  14. Corfield, A. P. Mucins: a biologically relevant glycan barrier in mucosal protection. Biochimica et Biophysica Acta 1850, 236–252 (2015).
  15. Johansson, M. E., Larsson, J. M. & Hansson, G. C. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(Suppl 1), 4659–4665 (2011).
  16. Schreiber, O. et al. iNOS-dependent increase in colonic mucus thickness in DSS-colitic rats. Plos One 8, e71843 (2013).
  17. Boltin, D., Perets, T. T., Vilkin, A. & Niv, Y. Mucin function in inflammatory bowel disease: an update. Journal of Clinical Gastroenterology 47, 106–111 (2013).
  18. Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L. & Gordon, J. I. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell Host & Microbe 3, 213–223 (2008).
  19. Dinan, T. G. & Cryan, J. F. The Microbiome-Gut-Brain Axis in Health and Disease. Gastroenterology Clinics of North America 46, 77–89 (2017).
  20. Quigley, E. M. M. Microbiota-Brain-Gut Axis and Neurodegenerative Diseases. Current Neurology and Neuroscience Reports 17, 94 (2017).
  21. Murakami, T. et al. Changes in Intestinal Motility and Gut Microbiota Composition in a Rat Stress Model. Digestion 95, 55–60 (2017).
  22. O’Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G. & Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain–gut axis dysfunction. Psychopharmacology 214, 71–88 (2011).
  23. Round, J. L. & Mazmanian, S. K. The gut microbiome shapes intestinal immune responses during health and disease. Nature reviews Immunology 9, 313–323 (2009).
  24. Burger-van Paassen, N. et al. The regulation of intestinal mucin MUC2 expression by short-chain fatty acids: implications for epithelial protection. The Biochemical Journal 420, 211–219 (2009).
  25. Mack, D. R., Michail, S., Wei, S., McDougall, L. & Hollingsworth, M. A. Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. The American Journal of Physiology 276, G941–950 (1999).
  26. do Carmo, F. L. R. et al. Propionibacterium freudenreichii Surface Protein SlpB Is Involved in Adhesion to Intestinal HT-29 Cells. Frontiers in Microbiology 8, 1033 (2017).
  27. Plé, C. et al. Single-strain starter experimental cheese reveals anti-inflammatory effect of Propionibacterium freudenreichii CIRM BIA 129 in TNBS-colitis model. Journal of Functional Foods 18, 575–585 (2015).
  28. London, L. E. E. et al. Characterization of a bovine isolate Lactobacillus mucosae DPC 6426 which produces an exopolysaccharide composed predominantly of mannose residues. Journal of Applied Microbiology 117, 509–517 (2014).
  29. Li, L. et al. Gut microbes in correlation with mood: case study in a closed experimental human life support system. Neurogastroenterology & Motility 28, 1233–1240 (2016).
  30. Shimizu, J. et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. Plos One 13, e0203657 (2018).
  31. Andoh, A. Physiological Role of Gut Microbiota for Maintaining Human Health. Digestion 93, 176–181 (2016).
  32. van der Beek, C. M., Dejong, C. H. C., Troost, F. J., Masclee, A. A. M. & Lenaerts, K. Role of short-chain fatty acids in colonic inflammation, carcinogenesis, and mucosal protection and healing. Nutrition Reviews 75, 286–305 (2017).
  33. El Hage, R., Hernandez-Sanabria, E., Calatayud Arroyo, M., Props, R. & Van de Wiele, T. Propionate-Producing Consortium Restores Antibiotic-Induced Dysbiosis in a Dynamic in vitro Model of the Human Intestinal Microbial Ecosystem. Frontiers in Microbiology 10, 1206 (2019).
  34. Allen, M. S., Bradford, B. J. & Oba, M. Board Invited Review: The hepatic oxidation theory of the control of feed intake and its application to ruminants. Journal of Animal Science 87, 3317–3334 (2009).
  35. Burger-van Paassen, N. et al. The regulation of intestinal mucin MUC2 expression by short-chain fatty acids: implications for epithelial protection. The Biochemical Journal 420, 211–219 (2009).
  36. Fernandes, J., Su, W., Rahat-Rozenbloom, S., Wolever, T. M. & Comelli, E. M. Adiposity, gut microbiota and faecal short chain fatty acids are linked in adult humans. Nutrition & Diabetes 4, e121 (2014).
  37. Haase, S., Haghikia, A., Gold, R. & Linker, R. A. Dietary fatty acids and susceptibility to multiple sclerosis. Multiple Sclerosis 24, 12–16 (2018).
  38. Bartolomaeus, H. et al. Short-Chain Fatty Acid Propionate Protects From Hypertensive Cardiovascular Damage. Circulation 139, 1407–1421 (2019).
  39. Di Nunzio, M. et al. Is cytotoxicity a determinant of the different in vitro and in vivo effects of bioactives? BMC Complementary and Alternative Medicine 17, 453 (2017).
  40. Singh, V. et al. Microbiota fermentation-NLRP3 axis shapes the impact of dietary fibres on intestinal inflammation. Gut 68, 1801–1812 (2019).
  41. Zagato, E. et al. Lactobacillus paracasei CBA L74 metabolic products and fermented milk for infant formula have anti-inflammatory activity on dendritic cells in vitro and protective effects against colitis and an enteric pathogen in vivoPlos One 9, e87615 (2014).
  42. Sisto, A. et al. Effect of Lactobacillus paracasei Culture Filtrates and Artichoke Polyphenols on Cytokine Production by Dendritic Cells. Nutrients 8, e635 (2016).
  43. Jan, G. et al. Propionibacteria induce apoptosis of colorectal carcinoma cells via short-chain fatty acids acting on mitochondria. Cell Death and Differentiation 9, 179–188 (2002).
  44. Huang, X. et al. Evaluating the contribution of gut microbiome to the variance of porcine serum glucose and lipid concentration. Scientific Reports 7, 14928 (2017).
  45. Araki, Y., Mukaisyo, K.-I., Sugihara, H., Fujiyama, Y. & Hattori, T. Increased apoptosis and decreased proliferation of colonic epithelium in dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Oncology Reports 24, 869–874 (2010).
  46. De Fazio, L. et al. Longitudinal analysis of inflammation and microbiota dynamics in a model of mild chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. World Journal of Gastroenterology 20, 2051–2061 (2014).
  47. Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402–408 (2001).
  48. Viennois, E., Tahsin, A. & Merlin, D. J. B.-p Purification of Total RNA from DSS-treated Murine Tissue via Lithium Chloride Precipitation. Bio-protocol 8, e2829 (2018).
  49. Thierry, A. & Madec, M. Enumeration of propionibacteria in raw milk using a new selective medium. Le Lait 75, 315–323 (1995).

Будьте здоровы!

 

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

  1. ПРОБИОТИКИ
  2. ДОМАШНИЕ ЗАКВАСКИ
  3. БИФИКАРДИО
  4. КОНЦЕНТРАТ БИФИДОБАКТЕРИЙ ЖИДКИЙ
  5. ПРОПИОНИКС
  6. ЙОДПРОПИОНИКС
  7. СЕЛЕНПРОПИОНИКС
  8. БИФИДОБАКТЕРИИ
  9. ПРОПИОНОВОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ
  10. ПРОБИОТИКИ И ПРЕБИОТИКИ
  11. СИНБИОТИКИ
  12. АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА
  13. АНТИОКСИДАНТНЫЕ ФЕРМЕНТЫ
  14. АНТИМУТАГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ
  15. МИКРОФЛОРА КИШЕЧНОГО ТРАКТА
  16. МИКРОФЛОРА И ФУНКЦИИ МОЗГА
  17. ПРОБИОТИКИ И ХОЛЕСТЕРИН
  18. ПРОБИОТИКИ ПРОТИВ ОЖИРЕНИЯ
  19. МИКРОФЛОРА И САХАРНЫЙ ДИАБЕТ
  20. ПРОБИОТИКИ и ИММУНИТЕТ
  21. ПРОБИОТИКИ и ГРУДНЫЕ ДЕТИ
  22. ДИСБАКТЕРИОЗ
  23. МИКРОЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ
  24. ПРОБИОТИКИ С ПНЖК
  25. ВИТАМИННЫЙ СИНТЕЗ
  26. АМИНОКИСЛОТНЫЙ СИНТЕЗ
  27. АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА
  28. СИНТЕЗ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
  29. СИНТЕЗ БАКТЕРИОЦИНОВ
  30. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ
  31. АЛИМЕНТАРНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
  32. ПРОБИОТИКИ ДЛЯ СПОРТСМЕНОВ
  33. ПРОИЗВОДСТВО ПРОБИОТИКОВ
  34. ЗАКВАСКИ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
  35. НОВОСТИ